ШТАММ КЛЕТОК CHO-SE-9/4 - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЭРИТРОПОЭТИНА ЧЕЛОВЕКА И ХИМЕРНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ДАННЫМ ШТАММОМ Российский патент 2020 года по МПК C07K16/26 C12N5/07 C12N5/10 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению антител к эритропоэтину человека. Изобретение может быть использовано для выделения и/или очистки рекомбинантного эритропоэтина человека из культуральной жидкости методом иммуноаффинной хроматографии.

Продукция красных кровяных клеток, эритроцитов, необходимых для транспорта кислорода, постоянно происходит в клетках костного мозга и регулируется специфическим гормоном - эритропоэтином. Эритропоэтин представляет собой кислый гликопротеин с молекулярным весом около 34000 Да, синтезируемый в почках. Функцией эритропоэтина является стимулирование пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников эритроцитарного ряда [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины, С-Пб, 2008].

В обычных условиях, когда ткани здорового организма получают достаточное количество кислорода, эритропоэтин содержится в плазме крови в очень низких концентрациях (10-15 мМЕ/мл). Эта низкая концентрация достаточна для поддержания воспроизводства красных кровяных телец взамен выбывающих в процессе старения.

Однако концентрация эритропоэтина в крови многократно возрастает в условиях гипоксии, когда снижается перенос кислорода кровяными клетками. Гипоксия может быть вызвана, например, потерей большого количества крови при кровотечениях, разрушением эритроцитов вследствие радиоактивного облучения, снижением потребления кислорода при нахождении в высоких слоях атмосферы, а также при анемиях [Симбирцев А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека С-Пб, 2018].

В медицинской практике рекомбинантный эритропоэтин, полученный с использованием генно-инженерных технологий, применяют при анемиях, патологиях почек, кровопотерях и на поздних стадиях онкологических заболеваний. Рекомбинантный эритропоэтин получают путем культивирования клеток-продуцентов эритропоэтина с его последующей очисткой. Очистка эритропоэтина производится хроматографическими методами, которые могут включать стадию иммуноаффинной хроматографии с применением иммобилизованных моноклональных антител к эритропоэтину.

Известны моноклональные антитела к эритропоэтину (US 4558005 А, 10.12.1985; ЕР 0116446 В1, 22.08.1990; RU 2151184 С1, 20.06.2000; RU 2145610 С1, 20.02.2000, RU 2451071 С1, 02.05.2012). Описанные антитела могут применяться при очистке эритропоэтина, однако все они являются мышиными. Применение для очистки эритропоэтина мышиных моноклональных антител нежелательно из-за возможности развития иммунного ответа на мышиные антитела или их фрагменты, которые могут контаминировать препарат эритропоэтина вследствие протеолиза используемых для его очистки иммобилизованных антител.

Этого недостатка в значительной степени можно избежать за счет использования для очистки эритропоэтина химерного (мышь-человек) антитела к эритропоэтину, в котором константные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела мыши заменены на аналогичные области антитела человека.

Из патента RU 2513689 известно химерное антитело 6-4A3him. В примере 4 упомянутого патента представлено конструирование последовательностей ДНК (генов), кодирующих тяжелую и легкую цепи химерного антитела 6-4A3him, вставка полученных генов в экспрессионные векторы, трансфекция данными векторами клеток СНО линии DG-44, культивирование трансфицированных клеток в течение 7 дней с очисткой и определением свойств полученного химерного антитела. Известно, что в течение 1-2 недель трансфицированные плазмидными ДНК клетки продуцируют рекомбинантные белки, но данная продукция в дальнейшем многократно снижается вследствие генетической нестабильности трансфицированных клеток и так называемого «замолкания» промотора [Jia J., Hou C., Hughes В.S., Smede M., Leung K.M., Levine K., Rigby S., Gray P.P., Munro T.P. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system // New Biotechnology, 2014, 31(3): 214-220]. Однако внедрение химерного антитела в производственную практику требует создания штамма клеток - стабильных продуцентов такого антитела. В RU 2513689 такая задача не была решена.

Для выделения из пулов первично трансфицированных клеток стабильных штаммов-продуцентов применяют генетические и селекционные методы [там же; Nair A.R., Xie Jinger X., Hermiston Т.W. Effect of different UCOE-promoter combinations in creation of engineered cell lines for the production of Factor VIII // BMC Research Notes, 2011, 4:178].

Для удовлетворения растущих потребностей медицины в препаратах эритропоэтина существует необходимость в совершенствовании технологии его получения, в том числе в создании штамма клеток - стабильных продуцентов химерного антитела к эритропоэтину.

Задачей настоящего изобретения является создание штамма культивируемых клеток - стабильных продуцентов химерного антитела к эритропоэтину.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм культивируемых клеток яичников китайского хомячка CHO-SE-9/4 - продуцент химерного антитела SE-9/4 к эритропоэтину человека.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Штамм клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus (авторское наименование штамма - CHO-SE-9/4) - продуцент рекомбинантного химерного антитела против эритропоэтина человека.

Родословная штамма: Родительская клеточная линия CHO^dhfr-. Котрансфекция плазмидами pTVK4g/hybEpo-H и pTVK4d/hybEpo-L с последовательным отбором стабильного высокопродуктивного клона на среде без гипоксантина/тимидина с метотрексатом и на среде с генетицином. Плазмида pTVK4g/hybEpo-H несет последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, ген устойчивости к генетицину и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК тяжелой цепи химерного антитела к эритропоэтину и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина. Плазмида pTVK4d/hybEpo-L несет последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, ген устойчивости к метотрексату и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК легкой цепи химерного антитела против эритропоэтина человека и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина.

Культуральные свойства: Суспензионное культивирование в пробирках, колбах или 6-луночных планшетах на орбитальном шейкере с частотой вращения 130-180 об/мин, либо в биореакторе (ферментере). Посевная доза 0,3⋅10⁶-0,5⋅10⁶ клеток/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 24-26 часов. Устойчив к 5 мкг/мл метотрексата и к 0,2 мг/мл генетицина.

Стандартные условия выращивания: Среда CDM4 СНО (HyClone) без гипоксантина/тимидина с 6 мМ глутамина, 5 нМ метотрексата, 37°С, 5% CO₂.

Характеристика культивирования в организме животного: культивирование в организме животного не применяется.

Характеристики полезного вещества, продуцируемого штаммом: Рекомбинантное химерное (мышь-человек) антитело (изотип IgG1, каппа) к эритропоэтину человека (оценка с помощью иммуноферментного анализа, вестерн-блота).

Характеристика биосинтеза полезных продуктов: Рекомбинантное химерное антитело к эритропоэтину человека, секретируется в культуральную среду в количестве не менее 20 пг на клетку в сутки. Стабильность продукции антитела сохраняется после 30 пассажей в неселективных условиях.

Способ криоконсервирования: 45% свежей среды CDM4 СНО, 45% кондиционной среды, 10% DMSO, 3⋅10⁶-5⋅10⁶ клеток/мл, заморозка до -70°C со скоростью 1°C/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта составила 90% (с трипановым синим).

Продуцируемое химерное антитело характеризуется наличием следующих отличительных признаков:

а) аминокислотная последовательность тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12;

б) аминокислотная последовательность легкой цепи по SEQ ID NO: 14;

в) аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность антитела:

CDRH-1 по SEQ ID NO: 5, CDRH-2 по SEQ ID NO: 6, CDRH-3 по SEQ ID NO: 7;

CDRL-1 по SEQ ID NO: 8, CDRL-2 no SEQ ID NO: 9, CDRL-3 по SEQ ID NO: 10;

г) константа диссоциации с рекомбинантным эритропоэтином K_d=6,3-10^-8 M;

д) изоэлектрическая точка в диапазоне pI от 7,86 до 8,53;

е) молекулярный вес 160 кД.

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.

На Фиг. 1 представлены схемы плазмид pTVK4d/hybEpo-L (А) и pTVK4g/hybEpo-H (Б), где

CMV Promoter - промотор предранних белков цитомегаловируса;

hybEpo-L - последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела к эритропоэтину человека (SEQ ID NO: 13);

hybEpo-H - последовательность ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела к эритропоэтину человека (SEQ ID NO: 11);

TKpolyA - сайт полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;

SV40 Promoter - промотор ранних белков вируса SV40;

DHFR - ген дигидрофолатредуктазы;

Neo - ген устойчивости к неомицину;

SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;

pUC Ori - точка начала репликации;

Amp - ген бактериального фермента β-лактамазы;

UCOE - регуляторный элемент, усиливающий экспрессию целевого гена.

На Фиг. 2 представлена динамика накопления химерного антитела SE-9/4 (мкг/мл) и числа жизнеспособных клеток (млн/мл) штамма-продуцента CHO-SE-9/4.

На Фиг. 3 представлены результаты электрофореза антитела SE-9/4 в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. 1 - восстанавливающие условия, 2 - маркеры молекулярной массы, 3 - невосстанавливающие условия.

На Фиг. 4 представлено изофокусирование антитела SE-9/4. Фракция в - pI 8,53; фракция г - pI 8,49; фракция д - pI 8,37; фракция е - pI 8,17; фракция ж - pI 8,00; фракция з - pI 7,91 и фракция и - pI 7,86.

На Фиг. 5 представлен анализ связывания антитела SE-9/4 с эритропоэтином методом поверхностного плазмонного резонанса. Концентрация эритропоэтина: к - 200 нМ, л - 100 нМ, м - 50 нМ, н - 25 нМ, о - 12,5 нМ.

На Фиг. 6 представлены результаты аффинной хроматографии рекомбинантного эритропоэтина человека на колонке с иммобилизованным антителом SE-9/4. 4 - элюция посторонних белков 1 М раствором NaCl, 5 - элюция рекомбинантного эритропоэтина человека 0,1 М раствором лимонной кислоты, 6 - очистка колонки от загрязнений.

Подробное описание изобретения

Для создания химерного антитела против эритропоэтина человека первоначально была получена мышиная гибридома, секретирующая моноклональное антитело к эритропоэтину человека. Из клеток данной гибридомы была выделена РНК, на матрице которой была синтезирована кДНК, которая, в свою очередь, была использована в качестве матрицы для синтеза ДНК, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела. Данные ДНК были слиты с последовательностями, кодирующими, соответственно, константные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина G человека с получением генов тяжелой и легкой цепей химерного (мышь-человек) антитела SE-9/4. Было показано, что экспрессия химерных цепей антитела в клетках СНО приводит к секреции антитела, эффективно связывающего эритропоэтин человека. Рекомбинантное антитело по настоящему изобретению имеет аффинность к эритропоэтину с константой диссоциации Кd=6,3⋅10^-8 М, вычисленной по результатам связывания SE-9/4 с эритропоэтином, установленным методом поверхностного плазмонного резонанса, и может быть использовано для аффинной хроматографии эритропоэтина.

На основе химерного антитела SE-9/4 могут быть также получены одноцепочечные и гуманизированные антитела к эритропоэтину человека.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение гибридомы мыши, продуцирующей моноклональное антитело против эритропоэтина человека.

Мышей линии Balb/c иммунизировали рекомбинантным эритропоэтином человека в полном адъюванте Фрейнда в концентрации 10 мкг/мышь в апоневроз задних конечностей. На 28 день мышам повторно вводили антиген в неполном адъюванте Фрейнда в дозе 5 мкг/мышь. Еще через 21 день мышей иммунизировали в дозе 10 мкг/мышь внутривенно. Далее проводили выделение клеток селезенки и их слияние с клетками миеломы SP2/0 по стандартной процедуре [Pandey S. Hybridoma Technology For Production Of Monoclonal Antibodies // International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 2010, 1(2): 017]. После отбора на селективной НАТ-среде в образцах культуральной жидкости определяли наличие антител к эритропоэтину методом твердофазного иммуноферментного анализа. Позитивные клоны подвергали дальнейшему клонированию и скринингу. В результате был отобран клон гибридных клеток, стабильно продуцирующих моноклональное антитело к эритропоэтину человека. С помощью иммуноферментного набора ISO-2 kit 072K4849 (Sigma, США) был установлен изотип тяжелой цепи продуцируемого антитела (G1) и легкой цепи (каппа). С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что данное антитело не связывается с белками сыворотки крови и селезенки мышей, а также с белками сыворотки крови человека и растворимыми белками гомогената культивируемых клеток яичников китайского хомячка (СНО).

Пример 2. Выделение кДНК и секвенирование вариабельных областей легкой и тяжелой цепей.

Из клеток полученной гибридомы была выделена тотальная РНК. 100 нг полученной РНК подвергали обратной транскрипции с набором случайных гексануклеотидных праймеров.

На матрице полученной кДНК с помощью наборов синтетических праймеров были амплифицированы фрагменты генов, кодирующие вариабельные области тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей антитела. Полученные фрагменты генов были вставлены в вектор pAL-TA (Евроген, Москва) и секвенированы со стандартных праймеров M13F и M13R. Последовательности ДНК, кодирующие VH и VL, представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, вычисленные аминокислотные последовательности VH и VL представлены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Анализ последовательностей аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела производили с помощью программы IMGTACQUEST (Immunogenetics Information System, http://www.imgt.org). Это позволило выделить участки мышиного моноклонального антитела, определяющие комплементарность к антигену для тяжелой цепи: CDR-H1, CDR-Н2 и CDR-H3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, и легкой цепи: CDRL-1, CDRL-2 и CDRL-3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно.

Пример 3. Конструирование химерного антитела SE-9/4 к эритропоэтину.

С помощью полимеразной цепной реакции последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, были состыкованы с последовательностями ДНК, кодирующими константную область тяжелой цепи IgG1 человека и константную область легкой каппа цепи иммуноглобулина G человека соответственно.

Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая тяжелую цепь химерного (мышь-человек) антитела, представлена в SEQ ID NO: 11, последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела - в SEQ ID NO: 12.

Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая легкую цепь химерного антитела, представлена в SEQ ID NO: 13, последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела - в SEQ ID NO: 14. Сконструированное химерное антитело получило название SE-9/4.

Пример 4. Создание штамма-продуцента химерного антитела SE-9/4 против эритропоэтина человека.

Полученные в примере 3 ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи химерного антитела, удлиняли путем постановки ПЦР с праймерами, содержавшими сайты рестрикции XbaI и NotI, обрабатывали данными рестриктазами и лигировали с рестрицированными XbaI и NotI плазмидными векторами серии pTVK4. В результате были получены плазмиды pTVK4g/hybEpo-H (Фиг. 1Б) и pTVK4d/hybEpo-L (Фиг. 1А). Плазмида pTVK4g/hybEpo-H несет последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, промотор цитомегаловируса, сайт полиаденилирования, ген устойчивости к генетицину и элемент UCOE из генома мыши, длиной 2990 нуклеотидов, обеспечивающий преимущественную интеграцию вектора в транскрипционно активные участки хроматина [Jia J. Hou C., Hughes В.S., Smede M., Leung K.M., Levine K., Rigby S., Gray P.P., Munro T.P. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system // New Biotechnology, 2014, 31(3): 214-220; Nair A. R., Xie Jinger X., Hermiston T.W. Effect of different UCOE-promoter combinations in creation of engineered cell lines for the production of Factor VIII // BMC Research Notes, 2011, 4:178]. Плазмида pTVK4d/hybEpo-L несет последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, промотор цитомегаловируса, сайт полиаденилирования, ген дигидрофолатредуктазы, обеспечивающий устойчивость к метотрексату, и элемент UCOE из 5'-нетранслируемой области гена RPS3 мыши, длиной 2990 нуклеотидов.

Для постоянной трансфекции использовали клетки линии яичников китайского хомячка, дефицитные по гену дигидрофолатредуктазы (CHO^dhfr-), ранее адаптированные к суспензионному росту в бессывороточных условиях (Biaggio R.T., Abreu-Neto M.S., Covas D.T., Swiech K. Serum-free suspension culturing of human cells: adaptation, growth, and cryo-preservation // Bioprocess Biosyst Eng., 2015, 38(8): 1495-1507).

Клетки культивировали в среде CDM4CHO (HyClone, США) с добавлением 4 мМ аланилглутамина, 0,1 мМ гипоксантина, 0,016 мМ тимидина и 0,1% Pluronic F-68 (Sigma, США) в микробиореакторах типа TubeSpin 50 (ТРР, Швейцария) на орбитальном шейкере Sanyo MIR-S100C (200 об/мин), который был помещен в СО₂-инкубатор, обеспечивающий содержание в воздухе 5% СО₂ и температуру 37°С.

Трансфекцию проводили с помощью липосомального реагента «Free-style» (Life Technologies, США) по инструкции производителя, используя смесь из 3,6 мкг плазмиды pTVK4g/hybEpo-H и 2,4 мкг плазмиды pTVK4d/hybEpo-L на 5-10⁶ клеток. Через 48 часов после трансфекции клетки переводили на среду без гипоксантина/тимидина с добавлением 5 мкг/мл метотрексата. В последующие дни среду меняли с интервалом 3 суток. Выросшие клетки затем пересевали на среду, содержавшую 0,2 мг/мл генетицина. Через 15 суток клетки переносили в колбы Эрленмейера в культуральную среду для последующего наращивания, после чего производили клонирование путем высева клеток в плотности одна клетка на лунку 96-луночного планшета. Таким образом было засеяно 20 планшетов по 96 лунок в каждом. Через 12 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон. Всего было идентифицировано 500 клонов. Через 3 суток культивирования с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) оценивали содержание иммуноглобулинов человека в образцах культуральной среды индивидуальных клонов.

Для дальнейшей работы было отобрано 18 клонов, обеспечивших накопление иммуноглобулинов человека в концентрации более 1200 нг/мл. Отобранные клоны были целиком перенесены в 48-луночные планшеты. Через 48 часов культивирования был проведен повторный анализ концентрации иммуноглобулинов в образцах культуральной среды. По результатам второго анализа было отобрано 9 клонов с максимальной волюметрической продукцией рекомбинантных антител, концентрация иммуноглобулинов в культуральной среде которых была более 6000 нг/мл. Далее клетки каждого клона высевали в 12-луночные планшеты по 0,5⋅10⁶ клеток на лунку в 2 мл среды и культивировали в тех же условиях. Продукцию антител оценивали на 5 сутки после посева. В результате были отобраны 7 клонов с максимальной продукцией антитела на 5 сутки.

Полученные клоны культивировали на шейкере в микробиореакторах типа TubeSpin 50 в 5 мл культуральной среды. Начальная плотность культуры составляла 0,5⋅10⁶ клеток/мл, пересев проводили с интервалом 3 суток. После третьего пассажа клетки высевали в плотности 0,5⋅10⁶ клеток/мл в 5 мл среды без метотрексата и генетицина и анализировали продукцию антител и динамику роста клеток. На основании полученных данных рассчитывали удельную продуктивность клеток клонов, которая оказалась наилучшей у клона 41.

Далее клетки клона 41 последовательно адаптировали к росту на среде с 5 нМ метотрексата (МТХ). После 7 пассажей в среде с МТХ клетки субклонировали в 96-луночные планшеты в среде с 5 нМ МТХ, при этом был получен 61 субклон. В результате анализа их продуктивности было показано, что субклон 9/4 обладает наилучшими ростовыми характеристиками и продуктивностью: на 6 сутки культивирования плотность жизнеспособных клеток составила 4,3⋅10⁶ клеток/мл при жизнеспособности 90%, а максимальная волюметрическая продукция рекомбинантных антител - 20 мкг/мл. Субклон 9/4 был помещен в клеточный банк ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» под названием CHO-SE-9/4.

Клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 рассевали в мини-биореакторы, содержавшие по 5 мл среды CDM4CHO (HyClone, США), в которую добавляли 4 мМ аланил-глутамина (Applichem, Германия), 0,1% Plutonic F-68 (Sigma, США) и 5% EX-CELL^® CD Hydrolysate Fusion (HyClone, США). Исходная концентрация клеток составляла 0,6⋅10⁶ клеток/мл. Культивирование проводили на шейкере-инкубаторе LT-X (Kuhner, Швейцария), со скоростью вращения 200 об/мин и амплитудой 50 мм при 5% СО₂. В первые трое суток культивирования поддерживали температуру 37 С, затем ее понижали до 32 С. Дальнейшее культивирование проводили при 32 С. Начиная с четвертых суток, в мини-биореакторы ежедневно добавляли питательные добавки Cell Boost 7а и Cell Boost 7b (HyClone, США) по 2% и 0,2% от первоначального объема культуры соответственно. Культивирование продолжали до 14 суток, достигнув максимальной плотности клеток более 9⋅10⁶/мл и концентрации химерного антитела 1200 мкг/мл (Фиг. 2). Удельная продукция целевого антитела, рассчитанная по методике, описанной в статье Chusainow J., Yuan Sheng Yang Y.S., J.H.M. Yeo, Toh C.P., Asvadi P., Wong N.S.C, Yap M.S.G. A Study of Monoclonal Antibody-Producing CHO Cell Lines: What Makes a Stable High Producer? // Biotechnol. Bioeng., 2009, 102:1182-1196, составила 20 пг антитела SE-9/4 на клетку в сутки. Для оценки стабильности продукции химерного антитела клетки штамма CHO-SE-9/4 последовательно культивировали в 5 мл среды CDM4CHO без добавления метотрексата и генетицина в течение 3 суток, после чего пересевали в 5 мл аналогичной среды. Данную процедуру повторяли 30 раз, после чего вновь культивировали клетки в мини-биореакторе с добавлением питательных добавок и понижением температуры до 32°С на 4-е сутки культивирования. Концентрация химерного антитела в культуральной среде на 14 сутки культивирования составила 1150±100 мкг/мл. Таким образом, клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 сохранили первоначальную продуктивность после 30 пассажей в неселективных условиях культивирования, что говорит о стабильности полученного штамма-продуцента.

Пример 5. Очистка химерного антитела SE9/4 и определение его свойств.

Клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 культивировали в 5 колбах Эрленмейера емкостью 1 л, заполненных 50 мл среды. Состав среды, питательные добавки и режим культивирования использовали, как в примере 4. Накопление в среде культивирования химерного моноклонального антитела SE-9/4 определяли методом иммуноферментного анализа. В результате на 12 сутки культивирования было получено 200 мл культуральной среды, которую наносили на колонку, содержавшую 5 мл сефарозы с иммобилизованным белком A (GE Healthcare Life Sciences, США), промывку колонки и элюирование антитела проводили по инструкции изготовителя. В результате был получен лабораторный образец очищенного рекомбинантного химерного антитела SE-9/4 против эритропоэтина человека в количестве 80 мг.

Анализ химерного антитела SE-9/4 методом электрофореза в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия показал, что оно имеет молекулярный вес примерно 160 кД в невосстанавливающих условиях, в восстанавливающих условиях антитело диссоциирует на белки с молекулярной массой 49 и 24 кДа, что соответствует ожидаемым показателям для тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (Фиг. 3). Изоэлектрическое фокусирование антитела SE-9/4 в мочевине при 20 С проводили с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» (Люмэкс, Россия), в нейтральном капилляре длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм, используя амфолиты «Pharmalyte 3-10» (GE, США) и пептидные маркеры с известными изоэлектрическими точками («Beckman Coulter», США). Результаты регистрировали по светопоглощению при длине волны 280 нм с последующей обработкой в программе «Эльфоран» (Фиг. 4). Антитело SE-9/4 имеет изоэлектрические точки в диапазоне pI от 7,86 до 8,53, что может быть связано с гетерологичным гликозилированием. Основная фракция (фракция е), содержащая 74,89% материала, соответствует изоточке с pI=8,17, кроме того, наблюдаются другие фракции: фракция в имеет pI 8,53; фракция г - pI 8,49; фракция д - pI 8,37; фракция ж - pI 8,00; фракция з - pI 7,91 и фракция и - pI 7,86. (Фиг. 4).

Для определения аффинности антитела SE-9/4 к рекомбинантному эритропоэтину человека был использован метод поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора «Biacore X100» с двойной проточной ячейкой (GE-Healthcare, США). После иммобилизации антитела против IgG человека (Abeam, США) в ячейке прибора (4,9 нг на 1 мм² поверхности ячейки) в ячейку добавляли раствор антитела SE-9/4 (50 нМ), промывали от несвязавшегося антитела, вводили раствор эритропоэтина человека в концентрации от 12,5 нМ до 200 нМ, после чего диссоциацию комплекса антиген-антитело проводили путем промывки ячейки буферным раствором (Фиг. 5). Равновесная константа диссоциации K_d комплекса SE-9/4-эритропоэтин была определена по зависимости установившегося значения ответа (RU) от концентраций эритропоэтина (ЕРО), при этом полученные данные соответствовали уравнению Ленгмюра для модели одноцентрового связывания:

где R_eq - ответ (RU) при достижении равновесия, R_max - ответ (RU) при насыщении поверхности антителом SE-9/4. K_d - равновесная константа диссоциации комплекса антитела SE-9/4 с эритропоэтином, [ЕРО] -концентрация эритропоэтина. Было получено значение K_d=63 нМ.

Пример 6. Применение химерного антитела SE-9/4 для очистки рекомбинантного эритропоэтина человека.

Химерное антитело SE-9/4 очищали из среды культивирования с помощью хроматографии на белок А-сефарозе. Выделенное антитело в количестве 5 мг иммобилизовывали на 2 мл CNBr-активированной матрицы Sepharose FF (GE Healthcare, США) по методике изготовителя и помещали в хроматографическую колонку. На колонку, предварительно уравновешенную фосфатным буфером, наносили 20 мл кондиционной культуральной среды, содержащей рекомбинантный эритропоэтин человека (Фиг. 6). После промывки колонки фосфатным буфером, содержащим 1 М хлористого натрия и 0,02% неионного детергента (пик 4 на Фиг. 6), сорбированный эритропоэтин человека элюировали 0,1 М раствором лимонной кислоты (пик 5 на Фиг. 6). рН полученного раствора эритропоэтина человека доводили до значения 7,5 дробным добавлением 0,1 М раствора NaOH, после чего анализировали свойства эритропоэтина. По данным электрофореза в полиакриламидном геле чистота эритропоэтина, очищенного с помощью иммобилизованного антитела SE-9/4, составила 95%, выход не менее 80%. Биологическая активность полученного эритропоэтина, определяемая по приросту ретикулоцитов в крови мышей после подкожного введения, составила 1,2⋅10⁵ МЕ/мг белка.

Штамм-продуцент CHO-SE-9/4 был помещен на хранение в музей ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России. Удельная продуктивность клеток штамма CHO-SE-9/4 составляет не менее 20 пг антитела SE-9/4 на клетку в сутки, время удвоения от 24 до 26 часов.

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Штамм клеток CHO-SE-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.

--->

Перечень последовательностей нуклеотидов

<110> Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства

Federal State Unitary Enterprise «State Research Institute of Ultra Pure Biologicals» of the Federal Medical and Biological Agency

<120> Штамм клеток СНО SE-9/4 — продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом

<130>

<160> 14

<210> 1

<211> 358

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<220>

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела мыши к эритропоэтину человека

<400> 1

CAG GTT CAG CTG CAA CAA TCT GGG GCT GAG CTG GTG AGG 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

1 5 10

CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TTG GGC 78

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly

15 20 25

TAC ACT TTT ACT GAC TAT GAA ATG CAC TGG GTG AAG CAG 117

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln 30 35

ACA CCT GTG CAT GGC CTG GAA TGG ATT GGA GCT ATT TAT 156

Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 40 45 50

CCA GGA AGT GGT GGT ACT GTC TAC AAT CAG AAG TTC AAG 195

Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 55 60 65

GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA 234

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 70 75

GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT 273 Gly Lys Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

80 85 90

GCT GTC TAT TAC TGT ACA AGA ATA GGG ATT ATG ACA GGG 312 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly

95 100

TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 351 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

105 110 115

TCG AGC G 358

Ser Ser 119

<210> 2

<211> 336

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(336)

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела мыши к эритропоэтину человека

<400> 2

GAT GTT TTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 39 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

1 5 10

AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT 78 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 15 20 25 CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA 117 Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 30 35 TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG 156 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 40 45 50 ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC 195 Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp

55 60 65

AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC 234 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 70 75 AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT 273 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 80 85 90 TAC TGT TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA 312 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 95 100

GGG GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA 336 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

105 110 112

<210> 3

<211> 119

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(119)

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

1 5 10

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly

15 20 25

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln 30 35 Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 40 45 50 Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 55 60 65 Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 70 75

Gly Lys Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

80 85 90

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly

95 100

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

105 110 115

Ser Ser 119

<210> 4

<211> 112

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(112)

<223> Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 4

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

1 5 10

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 15 20 25 Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 30 35 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 40 45 50 Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp

55 60 65

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 70 75 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 80 85 90 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 95 100

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

105 110 112

<210> 5

<211> 8

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(8)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-1 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu 1 5 8

<210> 6

<211> 8

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(8)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-2 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 6

Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr 1 5 8

<210> 7

<211> 12

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(12)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-3 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 7

Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 12

<210> 8

<211> 11

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(11)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-1 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 8

Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 11

<210> 9

<211> 3

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(3)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-2 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 9

Lys Val Ser 1 3

<210> 10

<211> 9

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<222> (1)…(9)

<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-3 моноклонального антитела к эритропоэтину человека

<400> 10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 9

<210> 11

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(1347)

<223> ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела SE-9/4

<400> 11

CAG GTT CAG CTG CAA CAA TCT GGG GCT GAG CTG GTG AGG 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 1 5 10 CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TTG GGC 78 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly 15 20 25 TAC ACT TTT ACT GAC TAT GAA ATG CAC TGG GTG AAG CAG 117 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln 30 35 ACA CCT GTG CAT GGC CTG GAA TGG ATT GGA GCT ATT TAT 156 Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 40 45 50 CCA GGA AGT GGT GGT ACT GTC TAC AAT CAG AAG TTC AAG 195 Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 55 60 65 GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA 234 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 70 75 GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT 273 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 80 85 90 GCT GTC TAT TAC TGT ACA AGA ATA GGG ATT ATG ACA GGG 312 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly 95 100 TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 351 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 105 110 115 TCG AGC GCT TCT ACC AAG GGC CCC TCC GTG TTC CCT CTG 390 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 120 125 130 GCC CCT TCC AGC AAG TCT ACC TCT GGC GGC ACA GCC GCT 429 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 135 140 CTG GGC TGC CTC GTG AAG GAC TAC TTC CCC GAG CCC GTG 468 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 ACA GTG TCC TGG AAC TCT GGC GCT CTG ACC TCC GGC GTG 507 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 160 165 CAC ACC TTC CCG GCG GTG CTG CAG AGC AGC GGC CTG TAT 546 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 AGC CTG AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCG AGC AGC AGC CTG 585 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 185 190 195 GGC ACC CAG ACC TAT ATT TGC AAC GTG AAC CAT AAA CCG 624 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 AGC AAC ACC AAA GTG GAT AAA AAA GTG GAA CCG AAA AGC 663 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 TGC GAT AAA ACC CAT ACC TGC CCG CCG TGC CCG GCG CCG 702

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 GAA CTG CTG GGC GGC CCG AGC GTG TTT CTG TTT CCG CCG 741 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 235 240 245 AAA CCG AAA GAT ACC CTG ATG ATT AGC CGT ACC CCG GAA 780 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 250 255 260 GTG ACC TGC GTG GTG GTG GAT GTG AGC CAT GAA GAT CCG 819 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 265 270 GAA GTG AAA TTT AAC TGG TAT GTG GAT GGC GTG GAA GTG 858 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 CAT AAC GCG AAA ACC AAA CCG CGT GAA GAA CAG TAT AAC 897 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 AGC ACC TAT CGT GTG GTG AGC GTG CTG ACC GTG CTG CAT 936 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 300 305 310 CAG GAT TGG CTG AAC GGC AAA GAA TAT AAA TGC AAA GTG 975

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 315 320 325

AGC AAC AAA GCG CTG CCG GCG CCG ATT GAA AAA ACC ATT 1014 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 330 335 AGC AAA GCG AAA GGC CAG CCG CGT GAA CCG CAG GTG TAT 1053 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 ACC CTG CCG CCG AGC CGT GAT GAA CTG ACC AAA AAC CAG 1092 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 GTG AGC CTG ACC TGC CTG GTG AAA GGC TTT TAT CCG AGC 1131 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 GAT ATT GCG GTG GAA TGG GAA AGC AAC GGC CAG CCG GAA 1170 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 380 385 390 AAC AAC TAT AAA ACC ACC CCG CCG GTG CTG GAT AGC GAT 1209 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 GGC AGC TTT TTT CTG TAT AGC AAA CTG ACC GTG GAT AAA 1248 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 AGC CGT TGG CAG CAG GGC AAC GTG TTT AGC TGC AGC GTG 1287 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 ATG CAT GAA GCG CTG CAT AAC CAT TAT ACC CAG AAA AGC 1326 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 430 435 440

CTG AGC CTG AGC CCG GGC AAA 1347

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 445 449

<210> 12

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(449)

<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела SE-9/4

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 1 5 10 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly 15 20 25 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln 30 35 Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 40 45 50 Pro Gly Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 55 60 65 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 70 75 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 80 85 90 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Ile Met Thr Gly 95 100 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 105 110 115 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 120 125 130 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 160 165 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 185 190 195 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 235 240 245 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 250 255 260 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 300 305 310

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 315 320 325

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 380 385 390 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 430 435 440

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 445 449

<210> 13

<211> 660

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(660)

<223> ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела SE-9/4

<400> 13

GAT GTT TTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 39 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10 AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT 78 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 15 20 25 CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA GAA 117 Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 30 35 TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG 156 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 40 45 50 ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC 195 Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp 55 60 65 AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC 234 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 70 75 AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT 273 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 80 85 90 TAC TGT TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA 312 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 95 100 GGG GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA 351 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 105 110 115 CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG 390 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 120 125 130 AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC 429 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 135 140 TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT 468 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 145 150 155 AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA 507 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 160 165 GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC 546 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 170 175 180 ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA 585 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195 GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG 624

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

200 205

CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG 660

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *** 210 215 219 220

<210> 14

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(219)

<223> Последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела SE-9/4

<400> 14

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 15 20 25 Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 30 35 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 40 45 50 Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp 55 60 65 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 70 75 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 80 85 90 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 95 100 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 105 110 115 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 120 125 130 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 145 150 155 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 160 165 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 170 175 180 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *** 210 215 219

<---

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, способное специфически связываться с эритропоэтином человека. Также рассмотрен штамм-продуцент такого антитела. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в выделении и/или очистке рекомбинантного эритропоэтина человека методом иммуноаффинной хроматографии. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

1. Антитело, способное специфически связываться с эритропоэтином человека, имеющее последовательность вариабельной области тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12 и последовательность вариабельной области легкой цепи по SEQ ID NO: 14.

2. Штамм - продуцент антитела по п. 1, представляющий собой культивируемые клетки Cricetulus griseus линии CHO-SE-9/4, трансформированные плазмидой pTVK4g/hybEpo-H, несущей последовательность ДНК SEQ ID NO: 11, ген устойчивости к генетицину и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК тяжелой цепи химерного антитела к эритропоэтину и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина, и плазмидой pTVK4d/hybEpo-L, несущей последовательность ДНК SEQ ID NO: 13, ген устойчивости к метотрексату и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК легкой цепи химерного антитела против эритропоэтина человека и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина.