БИОСЕНСОРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ БЫСТРОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ КОМПОНЕНТОВ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 G01N33/53 C07K14/735 G01N33/536 G01N33/569 C07K14/725 C07K14/36 C07K16/12 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая патентная заявка испрашивает приоритет Предварительной заявки на патент США серийный номер 62/140920, поданной 31 марта 2015 года, под названием «Система быстрого обнаружения определяемых компонентов» и Предварительной патентной заявки США серийный номер 62/245595, поданной 23 октября 2015 года, под названием «Системы и устройства для быстрого обнаружения определяемых компонентов», раскрытие которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме и является частью настоящей заявки на выдачу патента США на изобретение для всех целей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[002] В общем, описанное изобретение относится к системам, устройствам и способам обнаружения различных определяемых компонентов в биологических образцах или других типах образцов, а более конкретно, к системе на основе биосенсора для обнаружения и идентификации представляющих интерес определяемых компонентов в реальном времени на основе испускания обнаружимого сигнала при реакции биосенсора с представляющим интерес определяемым компонентом в исследуемом образце.

[003] В общих терминах биосенсор представляет собой систему или устройство для обнаружения определяемого компонента, которое объединяет чувствительный биологический компонент с физико-химическим детекторным компонентом. Компоненты типичной биосенсорной системы включают в себя биологический элемент, преобразователь или детекторный элемент, а также связанные электронные или сигнальные процессоры, которые отображают результаты испытаний значимым и полезным способом. Биологический элемент обычно содержит биологический материал, такой как ткань, микроорганизмы, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, антитела, нуклеиновые кислоты и т.п., которые могут быть созданы известными методами биологической инженерии. Механизм действия преобразователя или детекторного элемента является физико-химическим (например, оптическим, пьезоэлектрическим и/или электрохимическим) и состоит в преобразовании сигнала, полученного в результате взаимодействия определяемого компонента с биологическим элементом, в другой сигнал, который можно с большей легкостью измерить и определить количественно. Биосенсоры возникли в результате интеграции молекулярной биологии и информационных технологий (например, микросхем, оптических волокон и т.д.) для идентификации или количественного определения взаимодействия биомолекулы-определяемого компонента, такого как взаимодействие антитела-антигена. Учитывая, что существует большой спрос на быстрые, чувствительные, простые в обращении и эффективные с точки зрения затрат инструменты для обнаружения инфекционных агентов, патогенов и/или токсинов в пище (см., например, Mead et al., Food Related Illness and Death in the United States, Emerging Infectious Diseases; Vol. 5, No. 5, September-October 1999 (607-625), включенную в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме), существует настоятельная потребность в применении биосенсоров в переносных устройствах и приборах для обнаружения и идентификации инфекционных агентов, патогенных микроорганизмов, токсинов и других загрязняющих веществ в пищевых продуктах и многих других предметах в реальном времени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[004] Ниже приведено краткое описание некоторых типичных вариантов реализации настоящего изобретения. Это резюме не является обширным обзором и не предназначено для определения ключевых или критических аспектов или элементов настоящего изобретения или для определения его объема.

[005] В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается первая система для быстрого обнаружения определяемых компонентов. Примерный вариант реализации указанной первой системы содержит живую генно-модифицированную клетку биосенсора, которая получена из клеточного компонента иммунной системы млекопитающего; репортерный белок, который встроен внутрь и вырабатывается живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой и который испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные, заранее заданные изменения в цитозоле живой генно-модифицированной биосенсорной клетки; путь передачи сигнала, встроенный или естественным образом присутствующий в живой генно-модифицированной биосенсорной клетке, который контролирует биологический процесс в цитозоле живой генно-модифицированной биосенсорной клетки, причем биологический процесс, когда он происходит, заставляет репортерный белок испускать поддающийся обнаружению сигнал; по меньшей мере один тип детекторной молекулы, и при этом каждая детекторная молекула адаптирована для связывания с конкретным определяемым компонентом; по меньшей мере один определяемый компонент, который связывается с детекторной молекулой специфичным для этого определяемого компонента образом; множество трансмембранных, элементов, не являющихся антителами, эксрессируемых живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, причем каждый элемент, передающий сигнал, адаптирован для восприятия детекторной молекулы; и, при этом, при связывании достаточного количества определяемых компонентов с достаточным количеством детекторных молекул, которые в свою очередь связаны с трансмембранными элементами, передающими сигнал, не являющимися антителами, на поверхности биосенсорной клетки происходит агрегация передающих сигнал элементов, активируется путь передачи сигнала, происходит биологический процесс, и репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал.

[006] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается вторая система для быстрого обнаружения определяемых компонентов. Примерный вариант реализации указанной второй системы содержит живую, генно-модифицированную биосенсорную клетку, причем живая генно-модифицированная биосенсорная клетка получена из клеточного компонента иммунной системы млекопитающего и, при этом, живая генно-модифицированная биосенсорная клетка экспрессирует множество рецепторных молекул по меньшей мере одного, заранее заданного типа на своей поверхности; репортерный белок, и при этом репортерный белок встроен внутрь и экспрессируется живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, причем репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные, заранее заданные изменения в цитозоле живой генно-модифицированной клетки; путь передачи сигнала, генно-модифицированный или естественным образом присутствующий в живой генно-модифицированной биосенсорной клетке, и при этом путь передачи сигнала контролирует биологический процесс внутри цитозоля живой генно-модифицированной биосенсорной клетки, и. при этом, биологический процесс, когда это происходит, вызывает испускание репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала; по меньшей мере один тип детекторной молекулы, причем каждая детекторная молекула адаптирована для связывания с конкретным определяемым компонентом; по меньшей мере, один определяемый компонент, и, при этом, по меньшей мере один определяемый компонент связывается с детекторной молекулой, которая является специфичной для этого определяемых компонентов; множество растворимых элементов, не являющихся антителами, передающих сигнал, причем каждый растворимый элемент, передающий сигнал, адаптирован для связывания с молекулой-рецептором и детекторной молекулой; и, при этом, при связывании достаточного количества определяемого компонента с достаточным количеством детекторных молекул с достаточным количеством элементов, не являющихся антителами, передающих сигнал, которые непосредственно связаны с рецепторными молекулами на клеточной поверхности, происходит агрегация рецепторных молекул, активируется путь передачи сигнала, происходит биологический процесс, и репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал.

[007] В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается биосенсор для быстрого обнаружения определяемых компонентов в образце. Указанный биосенсор содержит живую генно-модифицированную клетку, причем живая генно-модифицированная клетка получена из клеточного компонента иммунной системы млекопитающего (т.е. иммуноцита); репортерный белок, и при этом репортерный белок встроен внутрь и экспрессируется живой генно-модифицированной клеткой, и при этом репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные заранее заданные изменения в цитозоле живой генно-модифицированной клетки; канал передачи сигнала, генно-модифицированный или естественным образом присутствующий в живой генно-модифицированной клетке, причем путь передачи сигнала контролирует биологический процесс внутри цитозоля живой генно-модифицированной биосенсорной клетки, и при этом биологический процесс, когда он происходит, вызывает испускание репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала; и множество элементов, не являющихся антителами, передающих сигнал, которые прямо или опосредованно связываются с определяемым компонентом в анализируемом образце, и при этом связанные элементы, не являющиеся антителами, передающие сигнал, далее взаимодействуют с биосенсорной клеткой, чтобы прямо или косвенно активировать путь передачи сигнала.

[008] Дополнительные признаки и аспекты настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения и понимания нижеследующего подробного описания типичных вариантов реализации изобретения. Как будет понятно специалисту в данной области техники, возможны дополнительные варианты реализации изобретения без выхода за пределы изобретения. Соответственно, графические материалы и сопутствующее описание необходимо рассматривать как иллюстративные, но не ограничивающие.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[009] Сопроводительные графические материалы, которые включены в описание и составляют его часть, схематически иллюстрируют один или несколько иллюстративных вариантов реализации изобретения и вместе с общим описанием, приведенным выше, и подробным описанием, приведенным ниже, служат целям объяснения принципов изобретения, причем:

[0010] Фиг. 1а-b иллюстрируют первый биосенсор в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором Т-клетки Jurkat были модифицированы для выработки экворина и для экспрессии трансмембранного, неантителообразующего элемент IgGbp-CD3ζ, передающего сигнал;

[0011] Фиг. 2а-b иллюстрируют второй биосенсор в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором тучные клетки МС/9 были модифицированы для выработки экворина, причем клетки МС/9 экспрессируют нативный рецептор FcεRI, который связывается с растворимым неантителообразующим элементом IgGbp-IgE, передающим сигнал;

[0012] Фиг. 3а-b иллюстрируют третий биосенсор в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором тучные клетки МС-9 модифицированы для выработки экворина, причем клетки МС/9 экспрессируют нативный рецептор FcεRI, который связывается с растворимым неантителообразующим элементом IgGbp-IgE, передающим сигнал, выделенным тучными клетками МС/9;

[0013] Фиг. 4 иллюстрирует четвертый биосенсор в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором биосенсорные клетки модифицированы для выработки экворина и для экспрессии трансмембранного элемента mSA-CD3ζ, передающего сигнал, который связывается с биотинилированным детекторным элементом; а также

[0014] Фиг. 5 иллюстрирует пятый биосенсора в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором биосенсорные клетки модифицированы для получения экворина и для экспрессии трансмембранного неантителообразующего элемента mSA-CD3ζ, передающего сигнал, который связывается с биотинилированным детекторным элементом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0015] Иллюстративные варианты реализации настоящего изобретения в дальнейшем описаны со ссылкой на графические материалы. Хотя нижеследующее подробное описание в целях иллюстрации содержит множество признаков, специалисту в данной области техники будет понятно, что множество вариантов и модификаций следующих деталей находится в пределах изобретения. Соответственно, следующие варианты реализации изобретения излагаются без какой-либо потери общности и без ограничения заявленного изобретения.

[0016] Настоящее изобретение в общем относится к системам, устройствам и способам обнаружения различных определяемых компонентов в биологических образцах или других образцах, а более конкретно к системе на основе биосенсора для обнаружения и идентификации в реальном времени представляющих интерес определяемых компонентов на основе испускания поддающегося обнаружению сигнала при реакции биосенсора с представляющим интерес определяемым компонентом в исследуемом образце. Генно-модифицированные клетки по настоящему изобретению представляют собой в высокой степени чувствительные и эффективные биосенсори, и поскольку указанные биосенсорные клетки обладают внутренней способностью обнаружения, они обеспечивают универсальную систему, которая может быть легко адаптирована для обнаружения широкого спектра различных инфекционных агентов или других мишеней путем простого выбора альтернативных растворимых детекторных молекул (например, антитела), обладающих специфичностью в отношении конкретного возбудителя или другой интересующей мишени. Кроме того, система по настоящему изобретению может быть легко сконфигурирована для мультиплексного обнаружения нескольких инфекционных агентов или других определяемых компонентов в одном анализе, что обеспечивает высокую степень гибкости и применимости. Универсальность настоящего изобретения является результатом уникальной комбинации элементов и, в частности, комбинации универсальной биосенсорной клетки с конкретным растворимым детектором (например, антителом). Универсальная биосенсорная клетка способна реагировать на присутствие практически любой молекулы-мишени, которая может быть распознана детекторной молекулой. Поскольку в некоторых вариантах реализации детектор или детекторное антитело добавляют в систему в качестве растворимого фактора, система может быть сконфигурирована для обнаружения альтернативной мишени путем простого выбора соответствующего альтернативного детектора или детекторного антитела. Специфичность раскрытой системы определяется детекторной молекулой, которая выбирается, исходя из ее специфичности и сродства к молекуле-мишени, характерной для инфекционного агента или другого целевого определяемого компонента. Кроме того, комбинация указанной универсальной биосенсорной клетки и растворимого детектора позволяет создавать мультиплексные анализы путем простого введения множества детекторных молекул (например, антител) в тест-систему, причем целевые молекулы отбирают в зависимости от их специфичности в отношении альтернативных инфекционных агентов или других определяемых компонентов.

[0017] Генетическое манипулирование и модификация типов биосенсорных клеток, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, обычно включают применение надлежащим образом отобранных носителей для введения генов, которые содержат генетические элементы, эффективно функционирующие в выбранном типе клеток. Например, подходящим будет применение промоторного элемента, который направляет экспрессию высокого уровня введенных трансгенов в конкретно выбранной биосенсорной клетке. В типичном варианте реализации настоящего изобретения такой промоторный элемент может быть получен непосредственно из самой биосенсорной клетки, а затем применен для экспрессии целевого трансгена. В другом варианте реализации настоящего изобретения подходящий элемент может быть определен эмпирически путем сравнения функции альтернативных промоторных элементов в контексте альтернативных носителей для введения генов с целью определения эффективных промоторных, трансгенных, векторных комбинаций для выбранного типа клеток. Трансгены, такие как ген, кодирующий люминесцентный репортерный белок, могут быть введены в биосенсорную клетку с применением стандартных методов, таких как электропорация или химические реагенты для трансфекции, такие как, например, липофектамин. Другие методы генной инженерии, известные специалистам в данной области техники, также совместимы с настоящим изобретением.

[0018] В общем варианте реализации настоящего изобретения предлагается система и способ для быстрого обнаружения определяемых компонентов, которые содержат следующие компоненты: (i) живую, генно-модифицированную биосенсорную клетку, причем живая инженерная биосенсорная клетка является компонентом иммунной системы млекопитающих; (ii) репортерный белок, причем репортерный белок экспрессируется живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, и при этом репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные, заранее заданные изменения в цитозоле живой генно-модифицированной клетки; (iii) путь передачи сигнала, экспрессируемый живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, причем путь передачи сигнала контролирует биологический или биохимический процесс внутри цитозоля живой генно-модифицированной биосенсорной клетки, и при этом биологический или биохимический процесс, когда он происходит, вызывает испускание поддающегося обнаружению сигнала репортерным белком; (iv) по меньшей мере один тип детекторной молекулы, причем каждая детекторная молекула адаптирована для связывания с конкретным определяемым компонентом; (v) по меньшей мере один определяемый компонент, причем по меньшей мере один определяемый компонент связывается с детекторной молекулой, которая является специфичной в отношении этого определяемого компонента; (vi) множество элементов, передающих сигнал, не являющихся антителами, экспрессируемые живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой или активно связываются с рецептором или рецепторным компонентом, экспрессируемым живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, причем каждый элемент, передающий сигнал, адаптирован для восприятия детекторной молекулы. При связывании достаточного количества определяемых компонентов с достаточным количеством детекторных молекул, которые сами по себе связаны с элементами, передающими сигнал, не являющимися антителами, на поверхности клетки происходит агрегация элементов, передающих сигнал, активируется путь передачи сигнала, происходит биохимический процесс, и репортерный белок испускает обнаруживаемый сигнал. Указанная система может дополнительно содержать устройство для смешивания живых клеток с растворимыми компонентами и образец, содержащий целевое определяемый компонент или инфекционный агент, при этом сохраняя жизнеспособность и функциональность живой биосенсорной клетки, и детектор для обнаружения сигнала, испускаемого биосенсорной клеткой.

Живая, генно-модифицированная биосенсорная клетка

[0019] Типичные варианты реализации настоящего изобретения включают живую, генно-модифицированную биосенсорную клетку, которая обычно является компонентом иммунной системы млекопитающего, например иммуноцитом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорная клетка представляет собой В-клетку человека или мыши. В-клетки или В-лимфоциты, представляют собой тип лейкоцитов подтипа лимфоцитов, которые функционируют в компоненте гуморального иммунитета адаптивной иммунной системы путем секреции антител. В других вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорная клетка является Т-клеткой человека или мыши. Т-клетки или Т-лимфоциты представляют собой другой тип лимфоцитов, которые играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете как часть адаптивной иммунной системы. Т-клетки отличаются от других лимфоцитов присутствием Т-клеточного рецептора на поверхности клетки. В других вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорная клетка представляет собой тучную клетку. Тучная клетка также представляет собой тип лейкоцитов, известный как гранулоцит, который образуется из миелоидной стволовой клетки, являющейся частью иммунной и нейроиммунной систем. С настоящим изобретением совместимы другие типы клеток, включая базофилы, которые представляют собой другой тип лейкоцитов и которые по внешнему виду и функциям сходны с тучными клетками.

Репортерный белок

[0020] Иллюстративные варианты реализации настоящего изобретения включают репортерный элемент, такой как репортерный белок или фермент, который вырабатывается или экспрессируется живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой. Репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные, заранее заданные изменения в цитозоле живой генно-модифицированной биосенсорной клетки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения репортерный белок представляет собой биолюминесцентный фотобелок, такой как экворин, который получен из гидроида Aequorea Victoria. Экворин ранее применялся для создания живых биосенсорных клеток с целью получения световых сигналов в ответ на активацию широкого спектра путей передачи сигналов; таким образом, специалистам в данной области техники хорошо известны различные способы манипулирования выработкой экворина в живых клетках. В частности, квалифицированный специалист может выбрать и применить любой подходящий носитель для введения гена, такой как, например, бактериальные плазмидные векторы или вирусные векторы, для введения соответствующего генетического материала в биосенсорную клетку. Выработка репортерного белка в биосенсорной клетке будет контролироваться экспрессией введенного генетического материала. Кроме того, обычному специалисту в данной области техники будет понятно, что другие фотобелки или другие типы репортерных белков, ферментов и молекул могут быть включены и применены с различными альтернативными вариантами реализации настоящего изобретения.

Путь передачи сигнала

[0021] Иллюстративные варианты реализации настоящего изобретения включают в себя путь передачи сигнала, экспрессируемый живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой. Путь передачи сигнала контролирует, по меньшей мере, один биологический процесс внутри цитозоля живой генно-модифицированной клетки, и по меньшей мере один биологический процесс, когда он возникает, вызывает испусканием репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения путь передачи сигнала представляет собой любой биохимический путь, в котором вызывается повышение внутриклеточной концентрации Са2+ в ответ на активацию передающей сигнал молекулы на поверхности клетки, такой как рецепторный белок. Биосенсорные клетки, применяемые в настоящем изобретении, могут быть выбраны из множества живых клеток, способных индуцировать цитоплазматический Са2+ в ответ на активацию передающей сигнал молекулы на поверхности клетки. Например, В-клетки, Т-клетки и тучные клетки обладают способностью индуцировать увеличение концентрации Са2+ в ответ на активацию передающих сигнал молекул на поверхности клетки, таких как В-клеточный рецептор, Т-клеточный рецептор и рецептор Fc эпсилон (тучные клетки), соответственно.

[0022] Поскольку клетки млекопитающих, растущие в культуре, обычно генерируют популяции клеток, в которых отдельные индивидуальные клетки могут иметь различную способность к индукции повышения концентрации Са2+, полезно выбрать или провести скрининг субпопуляции клеток или клональных клеточных линий, которые обладают надежной способностью к генерации сигнала Са2+. Это может быть достигнуто путем анализа индукции, например, индуцированной экворином вспышки. В частности, трансфектанты, созданные путем введения трансгенов в клетку, представляют собой смешанную популяцию клеток, полученную в результате большого количества независимых событий введения генов. Таким образом, при создании биосенсорной клетки полезно провести скрининг или выбрать определенные подмножества клеток или клональные клеточные линии, которые обладают эффективными возможностями передачи сигнала наряду с подходящими уровнями экспрессии введенных трансгенов. Особенно полезно применять технологию сортировки клеток с активированной флуоресценцией (СКАФ) для выбора субпопуляций клеток с высокой экспрессией или для создания клональных клеточных линий для этой цели.

[0023] Как было указано ранее, экворин до этого применялся для генно-модифицированных живых биосенсорных клеток с целью получения световых сигналов в ответ на активацию широкого спектра путей передачи сигнала, особенно в тех случаях, когда такие пути передачи сигнала приводят к повышению уровня цитоплазматических ионов Са2+ в пределах живой клетки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биосенсорные клетки, которые вырабатывают экворин в качестве репортерного белка, нагружают коэлентеразином (КТЗ) перед их применением в анализе обнаружения. На этой стадии нагрузки экворин ковалентно связывается с гидрофобной простетической группой (например, КТЗ), и при связывании с кальцием (Са2+), КТЗ вступает в необратимую реакцию, которая включает конформационное изменение, и испускает синий свет (при 469 нм).

Детекторная молекула

[0024] Иллюстративные варианты реализации настоящего изобретения содержат, по меньшей мере, один тип детектора, такого как детекторная молекула, причем каждая детекторная молекула адаптирована для связывания с конкретным целевым определяемым компонентом. Детекторная молекула может быть растворимым антителом, которое никоим образом не экспрессируется биосенсорными клетками. Конкретную детекторную молекулу, применяемую в соответствии с настоящим изобретением, выбирают, исходя из ее способности однозначно идентифицировать целевое определяемый компонент. В иллюстративном варианте реализации детекторная молекула представляет собой растворимое антитело, такое как коммерчески доступный IgG, специфичный в отношении конкретного определяемого компонента, такого как инфекционный агент. В другом иллюстративном варианте реализации детекторная молекула представляет собой биотинилированную молекулу (или молекулу на основе стрептавидина), которая является специфичной в отношении заданного определяемого компонента, такую как, например, биотинилированная молекула аутоантигена, которая является специфичной в отношении анти-аутоантигенового антитела. Детекторная или целевая молекула в соответствии с настоящим изобретением может включать аутоантиген или аутоантител, связанные с аутоиммунным заболеванием. Типичные аутоиммунные заболевания или расстройства включают ревматоидный артрит (РА), ювенильный РА (ЮРА), сахарный диабет 1 типа, системную красную волчанку, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, склеродермию, целиакию, болезнь Крона, язвенный колит, синдром Шегрена, рассеянный склероз, синдром Гудпасчуре, болезнь Аддисона, гранулематоз Вегенера, первичный билиарный цирроз, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, полимиалгию ревматическую, височный артериит / гигантскоклеточный артериит и синдром Гийена-Барре. Кроме того, детекторные или целевые молекулы могут содержать опухолеспецифичное или связанные с опухолью антигены или антитела к таким антигенам; или биологически активные молекулы, такие как EGF, пептидные гормоны, включая инсулин и гормон роста, цитокины, интерлейкины, интерфероны, TNF и т.д. или антитела к таким биологически активным молекулам.

Анализируемое вещество и исследуемый образец

[0025] Целевое применение настоящего изобретения заключается в обнаружении различных определяемых компонентов, которые присутствуют или могут присутствовать в образцах, подлежащих анализу. В типичном варианте реализации настоящего изобретения анализируемый объект, который должен быть обнаружен, будет связываться с детекторной молекулой, такой как растворимое антитело, которое является специфичным в отношении этого определяемого компонента. Образец, подлежащий анализу, может быть получен из большого количества источников пищи, включая: (i) мясо, такое как говядина, свинина, баранина, бизон, птица и морепродукты; и (ii) растения и овощи. Кроме того, образец, подлежащий анализу, может быть получен из многих других источников, таких как вода, бытовые жидкости, жидкости с консервантами и биологические жидкости, такие как кровь. Анализы, которые могут быть проведены, включают в себя практически все, в которых будет происходить специфичное связывание с детектором или детекторной молекулой, например, анализы на химические вещества, токсины и инфекционные агенты, такие как вирусы, бактерии и другие биологические материалы или агенты. В иллюстративном варианте реализации настоящего изобретения конкретным инфекционным агентом является Escherichia coli, хотя другие инфекционные агенты (такие как Salmonella, Listeria и Campylobacter) и загрязняющие вещества могут быть обнаружены в соответствии с настоящим изобретением. Escherichia coli O157 Н7, O26, O45, O103, O111, O121 и O145, как в анализах отдельных веществ, так и в мультиплексированных анализах, могут быть потенциально обнаружены с применением настоящего изобретения.

[0026] Настоящее изобретение позволяет обнаруживать множество различных определяемых компонентов, включая патогены мяса, и те, которые содержатся на шпинате, листьях салата и других овощах и пищевых продуктах. Анализируемое вещество может содержать один или несколько эпитопов антигена или аллергена, включая как линейные, так и конформационные эпитопы; кроме того, оно может содержать один или несколько лигандов или рецепторов, распознаваемых реципрокными рецепторами или лигандами. Примеры определяемых компонентов включают бактерию, такую как Bacillus (например, В. anthracis), Enterobacteriaceae (например, Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella и Shigella), Yersinia (например, Y. pestis или Y. enterocolitica), Staphylococcus (например, S. aureus), Streptococcus, Gonorrheae, Enterococcus (например, E. faecalis), Listeria (например, L. monocytogenes), Brucella (например, В. abortus, В. melitensis или В. suis), Vibrio (например, V. cholerae), Corynebacterium diphdieria, Pseudomonas (например, P. pseudomallei или P. aeruginosa), Burkholderia (например, В. mallei или В. pseudomallei), Shigella (например, S. dysenteriae), Rickettsia (например, R. Rickettsii, R. prowazekii или R. typhi), Francisella tularensis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Mycoplasma (например, M. mycoides) и т.д.; аллергены, такие как арахисовая пыль, микотоксины, споры плесени или бактериальные споры, такие как Clostridium botulinum и C. perfringens; токсины, такие как рицин, микотоксин, тетродотоксин, токсин сибирской язвы, ботулинический токсин, стафилококковый энтетоксин В или сакситоксин; вирус, такой как Adenoviridae (например, аденовирус), Arenaviridae (например, вирус Мачупо), Bunyaviridae (например, хантавирус или вирус лихорадки долины Рифт), Coronaviridae, Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа), Filoviridae (например, вирус Эболы и вирус Марбург), Flaviviridae (например, вирус японского энцефалита или вирус желтой лихорадки), Hepadnaviridae (вируса гепатита В), Herpesviridae (например, вирусы простого герпеса), Papovaviridae (например, вирусы папилломы), Paramyxoviridae (например, респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори, вирус эпидемического паротита или вирус парагриппа), Parvoviridae, Picornaviridae (например, полиовирусы), Poxviridae (например, вирусы натуральной оспы), Reoviridae (например, ротавирусы), Retroviridae (например, лимфотропные вирусы Т-клеток человека (ЛВТЧ) и вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ)), Rhabdoviridae (например, вирус бешенства) и Togagihdae (например, вирусы энцефалита, вирус желтой лихорадки и вирус краснухи); простейшие, такие как Cryptosporidium parvum, Encephalitozoa, Plasmodium, Toxoplasma gondii, Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Leishmania или Trypanosoma (например, Т. brucei и Т. Cruzi); гельминт, такой как цестоды (ленточные черви), трематоды (сосальщики) или нематоды (круглые черви, например, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus или Ancylostoma duodenale); паразит (например, любые простейшие или гельминты, описанные в настоящем документе); гриб, такой как Aspergilli, Candidae, Coccidioides immitis и Cryptococci; загрязнитель окружающей среды; добавка к воде; сельскохозяйственный маркер; нуклеиновая кислота (например, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, нуклеотиды, нуклеозиды, молекулы ДНК или молекулы РНК, включая хромосому, плазмиду, вирусный геном, праймер или ген); белок (например, гликопротеин, металлопротеин, фермент, прион или иммуноглобулин); метаболит; сахар; липид; липополисахарид; соль; или ион. Кроме того, мишени включают пищевые патогены, такие как сальмонелла (например, Salmonella typhimurium), патогенные штаммы Е. coli (например, O157:Н7), Bacillus (например, В. cereus), Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, Yersinia (например, Y. enterocolitica), норовирус (например, вирус Норуолк), Shigella, Staphylococcus aureus, Toxoplasma gondii, Vibrio (например, V. vulnificus, V. cholera, V. parahaemolyticus), Campylobacter jejuni и Clostridium perfringens; и растительные патогены, такие как Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Brucella (например, В. suis), Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Shigella, Clostridium botulinum, Variola (например, V. major), Filoviridae (например, вирус Эболы и вирус Марбург), Arenaviridae (например, вирус Ласса и вирус Мачупо), Clostridium perfringens, любой пищевой патоген (например, виды сальмонеллы, Escherichia coli O157:Н7 или Shigella), Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Staphylococcal aureus, Rickettsia (например, R. prowazekii или R. rickettsii), альфавирус (например, вирус венесуэльского конского энцефалита, вирус восточного конского энцефалита или вирус западного конского энцефалита), Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum, хенипавирус (например, вирус Нипа), Bunyaviridae (например, хантавирус или вирус лихорадки долины Рифт), Flaviviridae (например, вирус японского энцефалита и вирус желтой лихорадки) и виды Coccidioides.

[0027] Эпитопы, которые могут быть обнаружены в виде определяемых компонентов или частей определяемого компонента, обычно представляют собой антигендетерминирующие сайты на антигене, с которыми может специфично связываться иммуноглобулин (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут быть образованы как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, которые сближаются в результате свертывания белка в третичную структуру. Эпитопы можно найти на Fab (вариабельной) области иммуноглобулинов (называются «идиотипическими детерминантами»), причем они определяют «идиотип» иммуноглобулина. Эпитоп и антиген могут иметь природное происхождение или могут быть получены искусственным путем. В зависимости от природы эпитопа или антигена они могут быть выделены или очищены от матрикса или субстанции происхождения, синтезированы или получены, например, рекомбинантным способом. Эпитопы и антигены, пригодные в качестве определяемых компонентов, могут быть получены из организма человека или животного, растения, бактерий, простейших, паразита, вируса и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, углевод, гликопротеин, липид, липопротеин, гликолипид или молекулу небольшого размера. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент выбирают из ракового антигена, аутоантигена, аллергена, эндогенного антигена, антигена инфекционного агента, антигена лекарственного средства (молекулы небольшого размера), токсина, яда, биологического антигена, экологического антигена, трансплантационного антигена и имплантационного антигена.

[0028] Определяемый компонент может содержать эпитоп ракового антигена. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент является связанным с опухолью антигеном. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент является опухолеспецифичном антигеном. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой связанный с опухолью антиген (TAA), а ТАА представляет собой углеводный антиген, содержащий одну или несколько посттрансляционных модификаций, которые отличаются от белка дикого типа, содержит область слияния белка в результате слияния гена, который присутствует в злокачественных клетках, но отсутствует в незлокачественных клетках, и/или если ТАА содержит рецепторную тирозинкиназу (РТК), которая дерегулирована и/или дисфункциональна в опухолевых клетках из-за аутокринной активации, хромосомной транслокации, повышенной экспрессии РТК или мутации с усилением функции в гене РТК или белке. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой иммуноглобулин, экспрессируемый злокачественным новообразованием В-клеток. Примеры злокачественных новообразований В-клеток включают, но не ограничиваясь этим, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому мантийных клеток и множественную миелому. Примеры В-клеточных злокачественных новообразований включают, например, В-клеточной полиморфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарный лейкоз, лимфому маргинальной зоны селезенки, лимфому маргинальной зоны (внеузловую и узловую), новообразования плазматических клеток (например, миелома плазматических клеток, плазмацитома, заболевания с отложением моноклональных иммуноглобулинов, болезни тяжелой цепи) и фолликулярную лимфому (например, классы I, П, III или IV).

[0029] В некоторых вариантах реализации определяемый компонент представляет собой связанный с опухолью антиген, полученный из опухолевых клеток, которые получены от субъекта. В некоторых вариантах реализации связанный с опухолью антиген представляет собой один или несколько антигенов, выбранных из 17-1А, 707-АР, AFP, аннексина П, ART-4, BAGE, BAGE-1, .бета.-катенина, BCG, bcr/abl, Bcr/abl e14a2 химерного соединения, bcr-abl (b3a2), bcr-abl (b3a2), bcr-abl p190 (e1a2), bcr-abl p210 (b2a2), bcr-abl p210 (b3a2), bcr-abl p210 (b3a2), антигена буллезного пемфигоида-1, CA19-9, CA125, CA215, CAG-3, CAMEL, антигена рака яичка, каспазы-8, CCL3, CCL4, CD16, CD20, CD3, CD30, CD55, CD63, CDC27, CDK-4, CDR3, CEA, кластера 5, кластера-5А, циклинзависимой киназы-4, Сур-В, DAM-10, DAM-6, деккаина, Е7, EGFR, EGFRvIII, EGP40, ELF2 М, EpCAM, FucGMl, G250, GA733, GAGE, GAGE-1-8, связанного с раком гастринового антигена, GD2, GD3, globoH, гликофорина, GM1, GM2, GM3, GnTV, Gn-TV, gplOO, Her-2/neu, HERV-K-ME, высокомолекулярного антигена, высокомолекулярного протеогликана (ВМПГ), HPV-16 E6, HPV-16 E7, HPVE6, HSP70-2M, HST-2, hTERT, человеческого хорионического гонадотропина (ЧХГ), глобулы молочного жира человека (ГМЖЧ), iCE, KIAA0205, KK-LC-1, KM-HN-1, L6, LAGE-1, Lcose4Cer, LDLR/FUT, Lewis A, Lewis v/b, М-белка, MAGE-1, MVC, MAGE-A1-12, MAGE-C2, MAHGE-3, MART-1/Melan-A, MC1R, ME491, MUC1, MUC2, муцина, MUM-1, MUM-2, MUM-3, мутантного p53, миозина, MZ2-E, N9 нейраминидазы, NA88, NA88-A, антигена назофарингеальной карциномы, NGA, NK1/c-3, новых bcr/ablk химерных BCR-экзонов 1, 13, 14 с экзонами ABL 4, NY-ESO-1/LAGE-2, NY-ESO-lb, OC125, связанного с остеосаркомой антигена-1, Р15, pl90 минорного bcr-abl (ela2), р53, Pm1/RARa, полисиаловой кислоты, PRAME, PSA, PSM, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, сиалил LeA, Spl7, SSX-2, SSX-4, поверхностный иммуноглобулин, TAG-1, TAG-2, TEL/AML1, TPI, TRAG-3, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP2-INT2, HTRT, связанного с опухолью гликопротеина-72 (TAG-72), тирозиназы, u-PA, WT1 и XAGE-lb, или иммуногенного фрагмента любого из вышеуказанных антигенов. В некоторых вариантах реализации связанный с опухолью антиген идентифицируют методом SEREX (серологический анализ рекомбинантной библиотеки экспрессии кДНК) или на основе серологического скрининга библиотеки экспрессии кДНК, генерируемой из опухолевых тканей различного происхождения или линий раковых клеток, и идентификации иммуногенных опухолевых белков на основе их способности реагировать с аутологичными сыворотками пациентов. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой связанный с опухолью антиген, который представляет собой безуглеводный антиген, содержащий одну или несколько посттрансляционных модификаций, которые отличаются от белка дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения связанный с опухолью антиген содержит химерную область белка, являющуюся результатом слияния генов, которая присутствует в злокачественных клетках, но отсутствует в незлокачественных клетках. В некоторых вариантах реализации изобретения связанный с опухолью антиген содержит рецепторную тирозинкиназу, регуляция которой нарушена и/или которая является дисфункциональной в опухолевых клетках из-за аутокринной активации, хромосомных транслокаций, чрезмерной экспрессии РТК или мутаций с усилением функции гена или белка РТК.

[0030] Определяемый компонент может содержать эпитоп антигена инфекционного или неинфекционного агента, который может быть патогенным или непатогенным для субъекта. Определяемый компонент может быть получен из мутуалистических, паразитных или условно-патогенных микроорганизмов, включая любые микроорганизмы в биоме животного или растительного происхождения, такие как пробиотические или условно-патогенные микроорганизмы в пищеварительном тракте человека, на поверхностях слизистых оболочек или эпителии. В некоторых вариантах реализации изобретения бактериальный патоген выбран из Acinetobacter baumannii (ранее Acinetobacter calcoaceticus), Actinobacillus, Actinomyces pyogenes (ранее Corynebacterium pyogenes), Actinomyces israelii, Nocardia asteroids, N. brasiliensis, Aeromonas hydrophila, Amycolata autotrophica, Archanobacterium haemolyticum (ранее Corynebacterium haemolyticum), Arizona hinshawii все серотипы, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bartonella henselae, B. quintana, B. vinsonii, Bordetella включая В. pertussis, Borrelia recurrentis, B. burgdorferi, Burkholderia (ранее Pseudomonas species), за исключением перечисленных в BSL III), Campylobacter coli, C. fetus, C. jejuni, Chlamydia psittaci, C. trachomatis, C. pneumonia, Clostridium botulinum (вырабатывающий нейротоксин вид), нейротоксинов Clostridium botulinum, Cl. chauvoei, Cl. haemolyticum, Cl. histolyticum, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. Tetani, эпсило-токсина Cl. perfirngens, Corynebacterium diphtheriae, C. pseudotuberculosis, C. renale, Dermatophilus congolensis, Edwardsiella tarda, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli - всех энтеропатогенных, энтеротоксигенных, энтероинвазивных штаммов и штаммов, несущих антиген K1, включая Е. coli O157:H7, Haemophilus ducreyi, Н. influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella - всех видов. За исключением K. oxytoca (RG1), Legionella включая L. pneumophila, Leptospira interrogans - всех серотипов, Listeria, Moraxella, Mycobacterium (за исключением перечисленных в BSL III), включая М. avium complex, М. asiaticum, штамма вакцины БЦЖ М. bovis, М. chelonei, М. fortuitum, М. kansasii, М. leprae, М. malmoense, М. marinum, М. paratuberculosis, М. scrofulaceum, М. simiae, М. szulgai, М. ulcerans, М. xenopi, Mycoplasma, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitides, Nocardia asteroides, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum, N. transvalensis, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Rhodococcus equi, Salmonella, включая S. arizonae, S. cholerasuis, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum, S. meleagridis, S. paratyphi, А, В, C, S. typhi, S. typhimurium, Shigella, включая S. boydii, S. dysenteriae, тип 1, S.flexneri, S. sonnei, Sphaerophorus necrophorus, Staphylococcus aureus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus, включая S. pneumoniae, S. pyogenes, Treponema pallidum, T. carateum, Vibrio cholerae, V. parahemolyticus, V. vulnificus, Yersinia enterocolitica, Bartonella, Brucella, включая В. abortus, В. canis, В. suis, В. melitensis, Burkholderia (Pseudomonas) mallei, B. pseudomallei, Coxiella burnetii, Francisella tularensis, Mycobacterium bovis (за исключением штамма БЦЖ, BSL II - бактериальные агенты, включая Chlamydia), М. tuberculosis, нетуберкулезных микобактерий (НТМБ), Pasteurella multocida тип В - «буффало» и других вариантных штаммов, Rickettsia akari, R. australis, R. canada, R. conorii, R. prowazekii, R. rickettsii, R, siberica, R. tsutsugamushi, R. typhi (R. mooseri), Yersinia pestis.

[0031] Определяемый компонент может происходить из вирусного патогена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент получают из вирусного патогена, выбранного из числа аденовирусов человека - всех типов, альфавирусов (тогавирусов), вируса восточного конского энцефалита, вируса восточного конского энцефаломиелита, штамма вакцины против венесуэльского конского энцефаломиелита ТС-83, вируса западного конского энцефаломиелита, аренавирусов, вируса лимфоцитарного хориоменингита (не-нейротропные штаммы), комплекса вируса Такарибе, буньявирусов, вируса Буньямвера, штамма вируса лихорадки долины Рифт MP-12, кальцивирусов, коронавирусов, флавивирусов (тогавирусов) - группа В арбовирусов, серотипов вируса денге 1, 2, 3 и 4, штамма вируса 17D вируса желтой лихорадки, вирусов гепатита А, В, С, D и Е, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр, вирусов простого герпеса типа 1 и 2, вируса опоясывающего лишая, вирусов герпеса 6 и 7, вирусов гриппа типа А, В и С, паповавирусов, вирусов папилломы, вируса болезни Ньюкасла, вируса кори, вируса паротита, вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4, полиомавирусов (вирус JC, вирус BK), респираторного синцитиального вируса, парвовируса человека (В 19), вирусов Коксаки типа А и В, эховирусов, полиовирусов, риновирусов, аластрима (вирус белой оспы), оспы (вирус натуральной оспы), реовирусов белой оспы, колтивируса, ротавируса и орбивируса человека (вирус колорадской лихорадки), вируса бешенства, вируса везикулярного стоматита, рубивируса (краснуха), вируса леса Семлики, вируса энцефалита Сент-Луиса, вируса венесуэльского конского энцефалита, вируса венесуэльского конского энцефаломиелита, аренавирусов (также вирус южно-американской геморрагической лихорадки), Флексал, вируса лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ) (нейротропные штаммы), хантавирусов, включая вирус Хантаан, вируса лихорадки долины Рифт, вируса японского энцефалита, вируса желтой лихорадки, вируса обезьяньей оспы, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 и 2, лимфотропного вируса Т-клеток человека (ЛВТЧ) типа 1 и 2, вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), вируса везикулярного стоматита, вируса Гуанарито, вируса лихорадки Ласса, вируса Джунин, вируса Мачупо, вируса Сабиа, конго-крымской геморрагической лихорадки, вирусов Эбола, вируса Марбурга, комплекса вируса клещевого энцефалита (флавивируса), включая центрально-европейский клещевой эндефалит, дальневосточный клещевой энцефалит, Ханзалова, Хипр, Kumlinge, болезнь Кьясанурского леса, омскую геморрагическую лихорадку и вирусы российского весенне-летнего энцефалита, Herpesvirus simiae (герпес В или обезьяний вирус В), герпесвируса мартышковых 1 (вирус герпеса В), конского морбилливируса (вирус Хендра и Хендра-подобный вирус), вируса Нипа, вируса натуральной оспы (вирус оспы), вируса белой оспы (аластрим) вируса африканской чумы свиней, вируса болезни лошадей, вирус Акабане, вируса птичьего гриппа (высокопатогенный), вируса африканской катаральной лихорадки, вируса верблюжьей оспы, вируса классической чумы свиней, Cowdria ruminantium (коудриоз), вируса ящура, вируса козьей оспы, вируса японского энцефалита, вируса нодулярного дерматоза, вируса злокачественной катаральной лихорадки, вируса Менангле, вируса болезни Ньюкасла (ВБН), вируса чумы мелких жвачных животных, вируса жвачных животных, вируса овечьей оспы, вируса везикулярной болезни свиней, вируса везикулярного стоматита (экзотический).

[0032] Определяемый компонент может происходить из организма паразита. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент получают из организма паразита, выбранного из возбудителей анкилостомоза человека, включая A. duodenale, A. ceylanicum, Ascaris, включая Ascaris lumbricoides suum, Babesia, включая В. divergens, В. microti, червя Brugia filaria, включая В. malayi, В. timori, кокцидий, криптоспоридий, включая С. parvum, Cysticercus cellulosae (гидатидная киста, личинка Т. solium), Echinococcus, включая E. granulosis, Е. multiocularis, Е. vogeli, Entamoeba histolytica, Enterobius, Fasciola, включая F Gigantica, F. hepatica, Giardia, включая G. lamblia, Heterophyes, Hymenolepis, включая H. diminuta, H. nana, Isospora, Leishmania, включая L. braziliensis, L. donovani, L. etbiopia, L. major, L. mexicana, L. peruvania, L. tropica, филярии Лоа-лоа, Microsporidium, Naegleria fowleri, возбудителей анкилостомоза человека Necator, включая N. americanus, червей Onchocerca filaria, включая О. volvulus, Plasmodium cynomologi, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, Sarcocyst, включая S. sui hominis, Schistosoma, включая S. haematobium, S. intercalatum, S. japonicum, S. mansoni, S. mekongi, Strongyloides, включая S. stercoralis, Taenia solium, Toxocara, включая Т. canis, Toxoplasma, включая Т. gondii, Trichinella spiralis, Trypanosoma, включая Т. brucei brucei, T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, T. cruzi или филярий Wuchereria bancrofti.

[0033] Определяемый компонент может быть грибковым патогеном. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент получают из грибкового патогена, выбранного из Aspergillus fumigates, Blastomyces dermatitidis, Cladosporium bantianum, Candida albicans, С. (Xylohypha) trichoides, Cryptococcus neoformans, Dactylaria galopava (Ochroconis gallopavum), Epidermophyton, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Fonsecaea pedrosoi, Microsporum, Paracoccidioides braziliensis, Penicillium marneffei, Pneumocystis carinii, Sporothrix schenckii, Trichophyton, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum, H. capsulatum подвид duboisii.

[0034] Определяемый компонент может быть токсином. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой токсин, выбранный из абринов, нейротоксинов ботулина, эпсилон-токсина Clostridium perfringens, конотоксинов, диацетоксисирпенола, рицина, сакситоксина, сигалоподобных рибосомных инактивирующих белков, сигатоксина, стафилококковых энтеротоксинов, токсина Т-2 и тетродотоксина.

[0035] В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент выбран из поверхностного антигена гепатита В (HBsAg), В. burgdorferi OspA, HPV LI, белка RSV F, гемагглютинина гриппа, области «петля-на-стебле» вируса гриппа, М2 гриппа, поверхностного белка 1-10 мерозоита P. falciparum, GLURP, SERA, S-антигена, семейства 6-цис, АМА1, ЕВА175, 140, 181, MTRAP, PTRAMP, ASP, Rh1, 2a, 2b, 4, 5, RAP1, 2, 3, RAMA, RHOPH1, 2, 3, белка спорозоита P. vivax, поверхностного белка спорозоита 2, SSP2/TRAP, CSP-N, CSP-R, CSP-C, MSP-1, MSP-9, DBPRIII, AMA-1, Pvs25, Pvs28, капсулярного полисахарида S. aureus, поли-N-ацетилглюкозамина, HIV gp120, gp41 и консервативных участков вируса денге.

[0036] В другом варианте реализации изобретения определяемый компонент содержит по меньшей мере один эпитоп аллергена. Аллергены могут быть природными или искусственными, такими как аллергены, содержащиеся в аллергологических вакцинах. Примеры аллергенов включают, но не ограничиваясь этим, продукты животного происхождения (например, Feld1, меховая перхоть, чашечки тараканов, шерсть, экскременты пылевых клещей), лекарственные средства (например, пенициллин, сульфонамиды, салицилаты, местные анестетики), продукты питания (например, листовой и корневой сельдерей, кукуруза, яйца (например, альбумин), фрукты, бобовые (например, фасоль, горох, арахис, соя), молоко, морепродукты (например, моллюски), кунжут, соя, древесные орехи (например, орехи пекан, миндаль), пшеница, яд насекомых (например, огненные муравьи, яд жала пчелы, яд жала осы), латекс, металл, растительная пыльца (например, трава (например, плевел, тимофеевка, сорняки (например, амброзия, подорожник, крапива, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, щавель) и деревья (например, береза, ольха, орешник, граб, каштан, ива, тополь, платан, липа, олива, можжевельник).

[0037] В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой аллерген, полученный из латексного белка, например необработанного латексного сока, неочищенного латекса, содержащего аммиак, или готового латексного продукта, в котором белки подвергаются воздействию химических веществ и высоких температур. В некоторых вариантах реализации изобретения аллерген представляет собой аллерген клеща, например Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Acarus siro, Blomia tropicalis, Chortoglyphus arcuatas, Euroglyphus cannei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae или Glyphagus demesticus. В некоторых вариантах реализации изобретения аллерген получен из яда, например, видов Bombus, Vespa crabro, Apis mellifera, видов Dolichovespula, видов Polistes, видов Vespula, Dolichovespula maculata или Dolichovespula arenaria. В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент представляет собой аллерген из организма насекомого, например, Camponotus pennsylvanicus, Solenopsis invicta, Solenopsis richteri, Periplaneta americana, Blattella germanica, Blatta orientails, видов Tebanus, Musca domestica, видов Ephemeroptera, вида Culicidae или вида Heterocera.

[0038] В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый аллерген представляет собой эпителий, перхоть или волосы организма, например, Serinus canaria, Felis catus (domesticus), Bos taurus, Gallus gallus (domesticus), Canis familiaris, Arias platyrhynchos, Meriones unguiculatus, Capra hircus, Anser domesticus, Cavia porcellus (cobaya), Mesocrietus auratus, Sus scrofa, Equus caballus, Mus musculus, Psittacidae, Columba fasciata, Oryctolagus cuniculus, Rattus norvegicus или Ovis aries.

[0039] В некоторых вариантах реализации изобретения источником определяемых аллергенов являются грибы, например, Cephalosporium acremonium, Alternaria tenuis, Aspergillus glaucus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulan (Pullularia pullulans), Drechslera sorokiniana, Helminthosporium sativum, Botrytis cinerea, Candida albicans, Chaetomium globosum, Cladosporium herbarum, Cladosporium sphaerospennum (Homodendrum hordei), Drechslera spicifera (Curvularia spicifera), Epicoccum nigrum (Epicoccum purpurascens), Epidermophyton floccosum, Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Gliocladium viride, Helminthosporium solani, Microsporum canis, Mucor circinelloidesf circinelloides, Mucor circinelloidesf lusitanicus, Mucor plumbous, Mycogone perniciosa, Neurospora intermedia, Nigrospora oryzae, Paecilomyces variotii, Penicillum brevicompactum, Penicillum camembertii, Penicillum chrysogenum, Penicillum digitatum, Penicillum expansum, Penicillum notatum, Penicillum roquefortii, Phoma betae, Phoma herbarum, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Scopulariopsis brevicaulis, Serpula lacrymans, Setosphaeria rostrata, Stemphylium botryosum, Stemphylium solani, Trichoderma harzianum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum или Trichothecium roseum. В некоторых вариантах реализации изобретения источником аллергена является головневый гриба, например, Ustilago nuda, Ustilago cynodontis, Ustilago candis, Sporisorium cruentum, Ustilago avenae или Ustilago tritici.

[0040] В некоторых вариантах реализации источником определяемого аллергена является трава, например, Paspalum notatum, Cynodon dactylon, Poa compressa, Bromus inennis, Phalaris arundinacea, Zea cans, Elytrigia repens (Agropyron repens), Sorghum haelpense, Poa pratensis, Festuca Pratensis (elatior), Avena sativa, Dactylis glomerata, Agrostis gigantea (alba), Secale cereale, Leymus (Elymus) condensatus, Lolium perenne подвид Multiflorum, Lolium perenne, Anthoxanthum odoratum, Phleum pratense, Holcus lanatus, Triticum aestivum или Elymus (Agropyron) smithii.

[0041] В некоторых вариантах реализации источником определяемого аллергена является сорняк, например, Atriplex polycarpa, Baccharis halimifolia, Baccharis sarothroides, Hymenoclea salsola, Amaranthus hybridus, Xanthium strumarium (commune), Rumex crispus, Eupathium capillifolium, виды Solidago, Amaranthus tuberculatus (Acnida tamariscina), Allenrolfea occidentalis, Chenopodium botrys, Kochia scoparia, Chenopodium album, Iva xanthifolia, Iva angustifolia, Chenopodium ambrosioides, Artemisia vulgaris, Artemisia ludoviciana, Urtica dioica, Amaranthus spinosus, Plantago lanceolata, Iva axillaris, Atriplex lentiformis, Ambrosia dumosa, Ambrosia acanthicarpa, Ambrosia trifida, Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia confertiflora, Ambrosia bidentata, Ambrosia psilostachya, Salsola kali (pestifer), Artemisia californica, Artemisiafrigida, Artemisia tridentata, Atriplex wrightii, Atriplex confertifolia или Artemisia annua.

[0042] В некоторых вариантах реализации источником определяемого аллергена является дерево, например, виды Acasia, Alnus glutinosa, Alnus rubra, Alnus incana подвид rugosa, Alnus rhombifolia, Fraxinus velutina, Fraxinus pennsylvanica, Fraxinus latifolia, Fraxinus americana, Populus tremuloides, Myrica cerifera, Fagus grandifolia (americana), Casuarina equisetifolia, Betula lenta, Betula pendula, Betula nigra, Betula occudentalis (fontinalis), Betula populifolia, Acer negundo, Cryptomeria japonica, Juniperus ashei (sabinoides), Juniperus virginiana, Tamarix gallica, Populus balsamifera подвид trichocarpa, Populus deltoides, Populusfremontii, Populus wislizeni, Populus monilifera (sargentii), Cupressus arizonoca, Taxodium distichum, Cupressus sempervirens, Ulmus americana, Ulmus crassifolia, Ulmus pumila, Eucalyptus globulus, Celtis occidentalis, Corylus americana, Corylus avellana, Carya ovata, Carya laciniosa, Carya alba, Juniferus monosperma, Juniperus princhotii, Juniperus scopulorum, Juniperus occidentalis, Robinia pseudoacacia, Mangifera indica, Acer macrophyllum, Acer rubrum, Acer saccharum, Melaleuca quinquenervia (левкодендрон), Prosopis glandulosa (juliflora), Broussonetia papyrifera, Morus rubra, Morums alba, Quercus gambelii, Quercus velutina, Quercus macrocarpa, Quercus kelloggii, Quercus agrifolia, Quercus lobata, Quercus ilex, Quercus stellata, Quercus rubra, Quercus dumosa, Quercus virginiana, Quercus nigra, Quercus garryana, Quercus alba, Olea europaea, Elaegnus angustifolia, Citrus sinensis, Arecastrum romanzoffianum (Cocos plumosa), Carya illnoensis, Schinus molle, Schinus terebinthifolius, Pinus taeda, Pinus strobus, Pinus palustris, Pinus ponderosa, Pinus elliottii, Pinus virginiana, Pinus monticola, Pinus echinata, Populus nigra, Populus alba, Ligustrum vulgare, Liquidambar styraciflua, Platanus occidentalis, Platanus orientalis, Platanus racemosa, Platanus acerifolia, Juglans nigra, Juglans californica, Juglans regia, Salix lasiolepsis, Salix nigra или Salix discolor. В некоторых вариантах реализации изобретения источником аллергена является цветок, например, Chrysanthemum leucanthemum, Taraxacum officinale или Helianthus annuus. В некоторых вариантах реализации изобретения источником аллергена является сельскохозяйственное растение, например, Medicago sativa, Ricinus communis, Trifolium pratense, виды Brassica или Beta vulgaris.

[0043] В некоторых вариантах реализации источником определяемого аллергена является растительный пищевой продукт (съедобное растение), например, Prunus dulcis, Malus pumila, Prunus armeniaca, Musa paradisiaca (sapientum), Hordeum vulgare, Phaseolus lanatus, Phaseolus vulgaris, вид Phaseolus, вид Phaseolus, Phaseolus vulgaris, Rubus allegheniensis, вид Vaccinium, Brassica oleracea сорт botrytis, Fagopyrum esculentum, Brassica oleracea сорт capitata, Theobroma cacao, Cucumis melo, Daucus carota, Brassica oleracea сорт botrytis, Apium graveolens сорт dulce, вид Prunus, Cinnamomum verum, Coffea arabic, Zea cans, Vaccinium macrocarpon, Cucumis sativus, Allium sativum, Zingiber officinale, вид Vitis, Citrus paradisi, Humulus lupulus, Citrus limon, Lactuca sativa, Agaricus campestris, вид Brassica, Myristica fragrans, Avena sativa, Olea europaea, Allium сера сорт сера, Citrus sinensis, Vigna unguiculata, Pisum sativum, Prunus persica, Pyrus communis, Piper nigrum, Capsicum annuum сорт annuum, Ananas comosus, Ipomoea batatas, Solanum tuberosum, Rubus idaeus сорт idaeus, Oryza sativa, Secale cereale, Sesamum orientate (indicum), Glycine max, Spinacia oleracea, Cucurbita pepo сорт melopepo, Fragaria chiloensis, Lycopersicon esculentum (lycopersicum), Brassica rapa сорт rapa, Vanilla planifolia, Citrullus lanatus сорт lanatus или Triticun aestivum.

[0044] В некоторых вариантах реализации источником определяемого аллергена являются рыба или моллюски, например, вид Micropterus, Ictalurus punctatus, Mercenaria mercenaria, Gadus morhua, Callinectes sapidus, вид Platichthys, вид Hippoglossus, Homarus americanus, Scomber scombrus, Crassostrea virginica, Sebastes marinus, Salmo salar, Clupeiformes, Pecten magellanicus, вид Penaeus, вид Salvelinus или вид Thunnus. В некоторых вариантах реализации изобретения источником аллергена является пищевой продукт животного происхождения, например, полученный от Bos taurus, Ovis aries или Sus scrofa. В некоторых вариантах реализации аллерген представляет собой продукт из птицы, например, продукты из курицы (Gallus gallus) или индейки (Meleagris gallopavo). В некоторых вариантах реализации источником аллергена является молочный продукт, например, казеин жвачных животных или коровье молоко. В некоторых вариантах реализации изобретения аллергеном является орех, например, Bertholletia excelsa, Anacardium oceidentale, Cocos nucifera, Corylus americana, Arachis hypogaea, Carya illinoensis, Juglans nigra или Juglans regia. В некоторых вариантах реализации аллергеном является пыль, например пыль зерна ячменя, пыль зерна кукурузы, домашняя пыль, пыль матраца, пыль зерна овса, пыль зерна пшеницы, пыль обивки или латексная пыль.

[0045] В некоторых вариантах реализации определяемый антигенный компонент представляет собой аутоантиген, связанный с аутоиммунным расстройством. В некоторых вариантах аутоиммунное расстройство представляет собой клеточно- или органоспецифическое аутоиммунное расстройство, определяемый аутоантигенный компонент выбирают из: ацетилхолинового рецептора (миастения), актина (хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз), аденин-нуклеотидного транслокатора (АНТ) (дилатационная кардиомиопатия, миокардит), бета-адренорецептора (дилатационная кардиомиопатия), декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (аутоиммунный полиэндокринный синдром типа I (АПС-1)), асиалогликопротеинового рецептора (аутоиммунный гепатит), бактерицидного / повышающего проницаемость белка (Bpi) (муковисцидозные васкулиты), рецептор чувствительности к кальцию (приобретенный гипопаратиреоз), фермента расщепления боковой цепи холестерина (CYPIIa) (АПС-1), альфа-цепи коллагена IV типа (синдром Гудпасчуре), цитохром Р450 2D6 (CYP2D6) (аутоиммунный гепатит), десмина (болезнь Крона, заболевание коронарных артерий), десмоглеина 1 (эксфолиативная пузырчатка), десмоглеина 3 (обыкновенная пузырчатка), F-актина (аутоиммунный гепатит), GM ганглиозида (синдром Гийена-Барре), глутаматдекарбоксилазы (GAD65) (диабет 1 типа, синдром мышечной скованности), глутаматного рецептора (GLUR) (энцефалит Расмуссена), H/K АТФазу (аутоиммунный гастрит), 17-альфа-гидроксилазу (CYP17) (АПС-1), 21-гидроксилазу (CYP21) (болезнь Аддисона), IA-2 (ICA512) (диабет 1 типа), инсулина (диабет 1 типа, инсулин-гипогликемический синдром (болезнь Хирата), резистентность к инсулину типа В, акантоз, системная красная волчанка (СКВ)), внутреннего фактора типа 1 (пернициозная анемия), лейкоцитарного функционально-связанного антигена (LFA-1) (резистентный к лечению артрит Лайма), миелин-ассоциированного гликопротеина (МАГ) (полиневропатия), основного белка миелина (рассеянный склероз, демиелинизирующее заболевание), миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) (рассеянный склероз), миозина (ревматическая лихорадка), р-80-коилина (атопический дерматит), комплекса пирувадегидрогеназы-Е2 (КПД Е2) (первичный билиарный цирроз), симпортера йодида натрия (СЙН) (болезнь Грейвса, аутоиммунный гипотиреоз), SOX-10 (витилиго), общего для щитовидной железы и глазных белка (аутоиммунный тиреоидит), пероксидазы щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит Хашимото), тиреотропинового рецептора (болезнь Грейвса), тканевой трансглутаминазы (целиакия), коактиватора транскрипции р75 (атопический дерматит), триптофангидроксилазы (АПС-1), тирозиназы (витилиго, метастатическая меланома) и тирозингидроксилазы (АПС-1), причем связанное(ые) аутоиммунное(ые) нарушение(я) перечислены в скобках сразу после каждого определяемого аутоантитела.

[0046] В некоторых вариантах реализации аутоиммунное нарушение представляет собой системное аутоиммунное расстройство, а определяемый аутоантигенный компонент выбран из: АКТГ (дефицит АКТГ), аминоацил-тРНК-гистидилсинтетазы (полимиозит, дерматомиозит), аминоацил-тРНК-синтетазы (полимиозит, дерматомиозит), кардиолипина (СКВ), карбоангидразы П (СКВ, синдром Шегрена, системный склероз), коллагена (ревматоидный артрит (РА), СКВ, прогрессирующий системный склероз), центромер-ассоциированного белка (системный склероз), фибронектина (СКВ, РА, очаговая склеродермия), глюкозо-6-фосфатизомеразы (РА), бета2-гликопротеина I (Бета2-ГПI) (первичный антифосфолипидный синдром), голгина (95, 97, 160 и/или 180) (синдром Шегрена, СКВ, РА), белка теплового шока (различные нарушения иммунной системы), гемидесмосомального белка 180 (пузырчатка, герпес беременных, рубцевой пемфигоид, гистон Н2А-Н2В-ДНК (СКВ), рецептор IgE (хроническая идиопатическая крапивница), кератин (РА), Ку-ДНК-протеинкиназа (СКВ), Ку-нуклеопротеин (синдромы соединительной ткани) La фосфопротеин (La 55-В) (синдром Шегрена), миелопероксидаза (некротизирующий и цесцентический гломерулонефрит (НЦГН), системный васкулит), протеиназы 3 (PR3) (гранулематоз Вегенера, синдром Чёрга-Страусс), РНК-полимеразы I-ПI (РНП) (системный склероз, СКВ), белка распознавания сигналов (SRP54) (полимиозит), топоизомеразы-1 (Scl-70) (склеродермия, синдром Рейно), тубулина (хроническое заболевание печени, висцеральный лейшманиоз) и виментина (системное аутоиммунное заболевание), связанное(ые) аутоиммунное(ые) нарушение(я) перечислены в скобках сразу после каждого аутоантигена.

[0047] В некоторых вариантах реализации изобретения аутоиммунное нарушение представляет собой аутоиммунное расстройство белков плазмы или аутоиммунное расстройство цитокинов, а определяемый аутоантигенный компонент выбран из: ингибитора C1 (аутоиммунный дефицит C1), Clq (СКВ, мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит (МПГН)), цитокина (например, IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-, IL-10, LIF) (РА, системный склероз), фактора II (пролонгированное время коагуляции), фактора V (пролонгированное время коагуляции), фактора VII (пролонгированное время коагуляции), фактора VIII (пролонгированное время коагуляции), фактора IX (пролонгированное время коагуляции), фактора X (пролонгированное время коагуляции), фактора XI (пролонгированное время коагуляции), фактора ХП (пролонгированное время коагуляции), тромбина (пролонгированное время коагуляции), VWF (пролонгированное время коагуляции), гликопротеина IIb/IIIg и Ib/IX (аутоиммунная тромбоцитопения пурпура), IgA (иммунодефицит) и окисленного ЛПНП (ОксЛПНП) (атеросклероз), причем связанное(ые) аутоиммунное(ые) нарушение(я) перечислены в скобках сразу после каждого аутоантигена.

[0048] В некоторых вариантах реализации аутоиммунное расстройство представляет собой рак или паранеопластическое аутоиммунное расстройство, а аутоантигенный определяемый компонент выбран из: амфифизина (нейропатии, мелкоклеточный рак легкого), циклина В 1 (гепатоцеллюлярная карцинома), ДНК топоизомеразы П (рак печени), десмоплакина (псориазиформный акрокератоз), гефирина (паранеопластический синдром мышечной скованности), белка Hu (паранеопластический энцефаломиелит), нейронный никотиновый рецептор ацетилхолина (подострая автономная нейропатия, рак), р53 (рак, СКВ), р62 (белок, связывающийся с мРНК IGF-II), рековерина (связанная с раком ретинопатия), белка R1 (паранеопластическая опсоклонусно-миоклонусная атаксия), бета IV спектрина (синдром альфа мотонейрона спинного мозга), синаптотагмина (миастенический синдром Ламберт-Итона), открываемых потенциалом кальциевых каналов (миастенический синдром Ламберта-Итона) и белка Yo (паранеопластическая мозжечковая дегенерация).

[0049] В некоторых вариантах реализации определяемый антигенный компонент представляет собой эндогенный антиген, который является аберрантно экспрессируемым полипептидом. Примеры таких эндогенных антигенов включают, но не ограничиваясь этим, амилоид бета (А-бета или А.бета.), альфа-синуклеин, цистатин С, тау, ABri, ADan, супероксиддисмутазу (СОД), мутантный Хантингтон, PrP.sup.sc или фрагмент любого из вышеперечисленных.

[0050] В некоторых вариантах реализации изобретения определяемый компонент содержит, по меньшей мере, один эпитоп импланта, который должен быть введен пациенту, продукты метаболизма или разложения материала импланта или вещества, которые специфично связываются с эпитопом материала импланта, такие как антитела к материалу импланта или продукты его разложения. Такие импланты могут включать, например, импланты с электроприводом (например, искусственные кардиостимуляторы), биоимпланты (биоматериал, хирургически имплантированный в организм пациента для замены поврежденной ткани (например, ортопедический реконструктивный протез), сердечные протезы (искусственные клапаны), кожа и роговица), контрацептивные импланты, зубные импланты, ортопедические импланты и устройства для предотвращения адгезии. Примеры материалов имплантов, которые могут содержать эпитопы, включают латекс; силикон; металлы, такие как сплавы на основе кобальта (Со-Cr), титан и титановые сплавы; полимеры, такие как сверхвысокомолекулярный полиэтилен (СВМПЭ) и полиметилметакрилатный цемент (ПММА); и биокерамику, такую как гидроксиапатит и биостекло.

Элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал

[0051] Типичные варианты реализации настоящего изобретения включают в себя различные элементы, не являющиеся антителами, передающие сигнал. Каждый элемент, передающий сигнал, адаптирован для приема, т.е. связывания детекторной молекулы, которая сама по себе адаптирована для приема, т.е. связывания конкретного целевого определяемого компонента. В одном варианте реализации изобретения элемент, передающий сигнал, представляет собой трансмембранный химерный слитый белок, который встроен внутрь и экспрессируется на поверхности биосенсорной клетки, и который адаптирован для активации пути передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к испусканию репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала. В другом варианте реализации изобретения элемент, передающий сигнал, представляет собой растворимый химерный слитый белок, который адаптирован для связывания с элементом, передающим сигнал, на поверхности клетки, таким как нативный рецептор или белок-рецептор, который адаптирован для активации пути передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к испусканию репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала. В еще одном варианте реализации изобретения элемент, передающий сигнал, представляет собой растворимый химерный слитый белок, который встроен внутрь и экспрессируется биосенсорной клеткой. Затем растворимый химерный слитый белок секретируется/выводится во внеклеточное пространство, где он связывается с элементом, передающим сигнал, на поверхности клетки, таким как нативный рецептор или рецепторный белок, который адаптирован для активации пути передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к испусканию репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала.

[0052] Химерные слитые белки по настоящему изобретению могут содержать: (i) компонент белка, который адаптирован для связывания, по меньшей мере, с одним типом детекторной молекулы (например, растворимым антителом); и (ii) компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемого живой генно-модифицированной

биосенсорной клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения компонент белка, который адаптирован для связывания с детекторной молекулой по меньшей мере одного типа, может быть получен из бактериального связывающегося белка (т.е. белка, связывающегося с антителом, который получен из бактерий), такого как, например, домен связывания с антителом IgG белка strep G (в настоящем документе обозначен как IgGbp или Igbp на Фигурах). Тандемные повторы этого домена связывания IgG могут быть включены для увеличения сродства связывающегося белка к растворимому антителу. В альтернативном варианте реализации изобретения компонент химерного слитого белка, который адаптирован для связывания с детекторной молекулой по меньшей мере одного типа, представляет собой домен связывания с антителом, полученный из рецепторного белка, такого как, например, мышиный рецептор Fc гамма RI (FcγRI). В различных типичных вариантах реализации изобретения компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемый живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, представляет собой IgM (для биосенсоров В-клеток); IgGoα/β (для биосенсорных В-клеток); IgE (для биосенсорных тучных клеток); CD19 (для биосенсорных В-клеток), CD3дзета (для биосенсорных Т-клеток) или FcεRI (для биосенсорных тучных клеток).

[0053] Элементы, не являющиеся антителами, передающие сигнал, по настоящему изобретению, могут включать полноразмерные последовательности белка или генно-модифицированные фрагменты белка, такие как выбранные белковые домены, полученные из более крупных молекул белка. Специалисту в данной области техники будет понятно, что фрагменты более крупных молекул могут быть созданы с применением стандартных методов генной инженерии, таких как синтетическая генная технология. Если фрагменты более крупных белков применяются для разработки мотивов связывания антител как аспектов химерных слитых белков, важно сконструировать генно-модифицированные белки для обеспечения надлежащего конформационного свертывания выбранных фрагментов белка. Таким образом, полезно включать (в слитые белки) короткие спейсерные или линкерные элементы, которые с трудом образуют белковые вторичные структуры. Например, короткие комбинации аминокислот, таких как глицин, серии и аланин, могут применяться в указанных спейсерных или линкерных элементах. В типичном варианте реализации изобретения аминокислотная последовательность глицина (G), серии (S), аланин (А), серии (S), глицин (G), серии (S), глицин (G) применяется для отделения домена связывания с антителом от компонента рецепторного комплекса в генно-модифицированной белковой молекуле (см. SEQ ID NO: 19). Что касается пептидного линкера или спейсера, применяемого для соединения детектора с элементом, передающим сигнал, или для соединения разных сегментов элемента, передающего сигнал: линкер обычно соединяет карбоксильный конец одного элемента с аминоконцом другого. Длина пептидных линкеров может варьировать от 0 до 25 аминокислот или любого промежуточного целочисленного значение и обычно, но не всегда, содержат гидрофильные аминокислоты, такие как глицин (G) и серии (S).

[0054] Как указано выше, каждый элемент, передающий сигнал, связывается с детекторной молекулой, которая связывается с конкретным определяемым компонентом, представляющим интерес. Детекторная молекула, связанная с определяемым компонентом, будет (i) связываться с трансмембранным элементом, передающим сигнал,; или (ii) с элементом, передающим сигнал, который сам будет связываться с преобразователем сигнала на поверхности клетки (например, нативным рецептором). В первой ситуации при связывании достаточного количества определяемого компонента с достаточным количеством детекторных молекул, которые сами по себе связаны с трансмембранными элементами, передающими сигнал, не являющимися антителами, на поверхности биосенсорных клеток происходит агрегация элементов, передающих сигнал, активируется путь передачи сигнала, происходит биологический процесс, и репортерный белок испускает обнаруживаемый сигнал. Во втором случае при связывании достаточного количества определяемого компонента с достаточным количеством детекторных молекул и с достаточным количеством элементов, передающих сигнал, которые сами по себе связаны с соответствующим нативным рецептором, происходит агрегация рецепторов на клеточной поверхности, активируется путь передачи сигнала, происходит повышение уровня внутриклеточного кальция, и репортерный белок испускает обнаруживаемый свет.

[0055] Первый элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с константным доменом тяжелой цепи IgM (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 1 приведена последовательность ДНК для элемента IgGbp-IgM, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 2 приведена последовательность белка для элемента IgGbp-IgM, передающего сигнал.

[0056] Второй элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с Igα/β-компонентом рецептора В-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 3 приведена последовательность ДНК для элемента IgGbp-Igα/β, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 4 приведена последовательность белка для элемента IgGbp-Igα/β, передающего сигнал.

[0057] Третий элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с дзета-цепью CD3 рецептора Т-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 5 приведена последовательность ДНК для элемента IgGbp-С3ζ, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 6 приведена последовательность белка для элемента IgGbp-CD3ζ, передающего сигнал.

[0058] Четвертый элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит домен связывания с антителом FcyRI, слитый с константным доменом тяжелой цепи IgM (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 7 приведена последовательность ДНК для элемента FcyRI-IgM, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 8 приведена последовательность белка для элемента FcyRI-IgM, передающего сигнал.

[0059] Пятый элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, содержит домен связывания с антителом FcyRI, слитый с Igα/β-компонентом В-клеточного рецептора с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 9 приведена последовательность ДНК для элемента FcyRI-Igα/β, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 10 приведена последовательность белка для элемента FcyRI-Igα/β, передающего сигнал.

[0060] Шестой элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения, содержит домен связывания с антителом FcyRI, слитый с дзета-цепью CD3 рецептора Т-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 11 приведена последовательность ДНК для элемента FcyRI-CD3ζ, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 12 приведена последовательность белка для элемента FcyRI-CD3ζ, передающего сигнал.

[0061] Седьмой типичный элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с настоящим изобретением содержит бактериальный связывающий белок (IgGbp), слитый с константным доменом IgE (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 13 приведена последовательность ДНК для элемента IgGbp-IgE, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 14 приведена последовательность белка для элемента IgGbp-IgE, передающего сигнал.

[0062] Восьмой типичный элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с настоящим изобретением содержит домен связывания с антителом FcγRI, слитый с константным доменом IgE (В-клетка) с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 15 приведена последовательность ДНК для элемента, передающего сигнал, FcγRI-IgE, а в SEQ ID NO: 16 приведена последовательность белка для элемента, передающего сигнал, FcγRI-IgE.

[0063] Девятый типичный элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, в соответствии с настоящим изобретением содержит мономерный стрептавидин, слитый с дзета-цепью CD3 рецептора Т-клеток с помощью линкера GSASGSG. В SEQ ID NO: 17 приведена последовательность ДНК для элемента mSA-CD3ζ, передающего сигнал, а в SEQ ID NO: 18 приведена последовательность белка для элемента mSA-CD3ζ, передающего сигнал. Мономерный стрептавидин представляет собой рекомбинантную форму стрептавидина, которая содержит мутации для разрушения тетрамера стрептавидина с образованием мономера и повышения растворимости образовавшейся изолированной субъединицы.

Пример биосенсора I

[0064] Как проиллюстрировано на Фиг. 1a-b, первый биосенсор 100 в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит Т-клетки Jurkat 102, которые были модифицированы для выработки экворина 104 и которые были нагружены КТЗ 106 для получения экворина/КТЗ, как описано выше. Данный конкретный биосенсор дополнительно был сконструирован для экспрессии трансмембранного не-антителообразующего элемента 108, передающего сигнал, который представляет собой IgGbp-CD3ζ (SEQ ID NO: 5-6), хотя трансмембранный элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал FcγRI-CD3ζ (SEQ ID NO: 11-12) также можно применять с биосенсором 100. Кроме того, биосенсорная клетка 102 содержит по меньшей мере один путь передачи сигнала 110, активизация которого приводит к повышению внутриклеточного уровня Са2+ 112. Как проиллюстрировано на Фиг. 1b, при связывании достаточного количества детекторных молекул 114 (например, растворимых антител), с которыми связан целевой определяемый компонент 116 (например, Е. coli O157), связывается с трансмембранными элементами 108, не являющимися антителами, передающими сигнал, активируется путь передачи сигнала 110, повышается внутриклеточный уровень Са2 +112, комплекс экворин/КТЗ претерпевает конформационное изменение и испускает сигнал (фотон) света 118, который обнаруживается с помощью фотоумножителя 120, а пик 122 графически отображается на тестовом устройстве (см. описание ниже), указывая на присутствие целевого определяемого компонента 116 в исследуемом образце. В отношении целевого определяемого компонента 116 отображение может быть как качественным, так и количественным.

Пример биосенсора II

[0065] Со ссылкой на Фиг. 2а-b, второй биосенсор 200 в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит тучные клетки 202 МС/9 (АТСС® CRL-8306™), которые были модифицированы для выработки экворина 204 и были нагружены КТЗ 206 для получения комплекса экворина/КТЗ, как описано выше. Данный конкретный биосенсор экспрессирует нативный Fc-эпсилон-рецептор (т.е. FcεRI) 207, который связывается с растворимым неантителообразующим элементом 208, передающим сигнал, который представляет собой IgGbp-IgE (SEQ ED NO: 13-14), хотя не-антителообразующий элемент FcγRI-IgE, передающий сигнал (SEQ ID NO: 15-16) также может применяться с биосенсором 200. Как проиллюстрировано на Фиг. 2b, если достаточное количество детекторных молекул 214 (например, растворимых антител), с которыми связан целевой определяемый компонент 216 (например, Е. coli O157), связывается с элементами 208, не являющимися антителами, передающими сигнал, которые ранее были связаны с нативными Fc-эпсилон-рецепторами 207, то активируется путь передачи сигнала 210, повышается внутриклеточный уровень Са2+ 212, комплекс экворин/КТЗ претерпевает конформационное изменение и испускает сигнал (фотон) света 218, который обнаруживается с помощью фотоумножителя 220, а пик 222 графически отображается на тестовом устройстве (см. описание ниже), указывая на присутствие целевого определяемого компонента 216 в исследуемом образце. В отношении целевого определяемого компонента 216 отображение может быть как качественным, так и количественным.

Пример биосенсора III

[0066] Со ссылкой на Фиг. 3а-b, третий биосенсор 300 в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит тучные клетки МС-9 302 (АТСС® CRL-8306™), которые были модифицированы для получения экворина 304 и были нагружены КТЗ 306 с для получения комплекса экворина/КТЗ, как описано выше. Данный конкретный биосенсор экспрессирует нативный Fc-эпсилон-рецептор (т.е. FcεRI) 307, который связывается с элементом 308 трансдукции сигнала, не являющимся антителом, который представляет собой IgGbp-IgE (SEQ ID NO: 13-14), хотя не-антителообразующий элемент FcγRI-IgE, передающий сигнал (SEQ ID NO: 15-16) также можно применять с биосенсором 300. В данном конкретном варианте реализации изобретения биосенсорные клетки 302 были дополнительно модифицированы для экспрессии IgGbp-IgE и выведения этого не-антителообразующего элемента, передающего сигнал, во внеклеточное пространство, где он связывается с нативным FcεRI, экспрессирующимся на поверхности клетки. Как проиллюстрировано на Фиг. 3b, если достаточное количество детекторных молекул 314 (например, растворимых антител), с которыми связан целевой определяемый компонент 316 (например, Е. coli O157), связывается с элементами, передающими сигнал, не являющимися антителами, 308, которые ранее были связаны с нативными Fc-эпсилон-рецепторами 307, то активируется путь передачи сигнала 310, повышается внутриклеточный уровень Са2+312, комплекс экворин/КТЗ претерпевает конформационное изменение и испускает сигнал (фотон) света 318, который обнаруживается с помощью фотоумножителя 320, а пик 322 графически отображается на тестовом устройстве (см. описание ниже), указывая на присутствие целевого определяемого компонента 316 в исследуемом образце. В отношении целевого определяемого компонента 316 отображение может быть как качественным, так и количественным.

Пример биосенсора IV

[0067] Со ссылкой на Фиг. 4, четвертый биосенсор 400 в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит биосенсорные клетки 402, которые были модифицированы для выработки экворина и экспрессируют трансмембранный не-антитело образующий элемент 408, передающий сигнал, который представляет собой mSA-CD3ζ (SEQ ID NO: 17-18). He-антитело образующий элемент mSA-CD3ζ, передающий сигнал (мономер стрептавидина-CD3ζ связывается с биотинилированной детекторной молекулой 414, которая специфично связывается с молекулой-мишенью 416, такой как, например, эпидермальный фактор роста (EGF). Молекулярное антитело 417 против мишени, такое как, например, анти-EGF, создает целевые мультимеры, кластеризующие несколько элементов, передающих сигнал, и индуцирует передачу сигнала, как описано выше. В других вариантах реализации мономерный стрептавидиновый компонент заменен биотинилированным компонентом, и могут применяться альтернативные средства образования связи.

Пример биосенсора V

[0068] Со ссылкой на Фиг. 5, пятый биосенсор 500 в соответствии с типичным вариантом реализации настоящего изобретения содержит биосенсорные клетки 502, которые были модифицированы для выработки экворина и экспрессируют трансмембранный не-антитело образующий элемент 508, передающий сигнал, который представляет собой mSA-CD3ζ (SEQ ED NO: 17-18). Неантител ообразующий элемент mSA-CD3ζ, передающий сигнал (мономерный стрептавидин-CD3ζ) связывается с биотинилированной детекторной молекулой 514, которая в некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой молекулу аутоантигена. Биотинилированная детекторная молекула 514 специфично связывается с молекулой-мишенью 516, которая в некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой молекулу против аутоантигена. Аутоантитела в образце сыворотки создают целевые мультимеры, которые объединяют несколько элементом, передающих сигнал, и индуцируют передачу сигнала, как описано ранее. В других вариантах реализации изобретения мономерный стрептавидиновый компонент заменен биотинилированным компонентом, и могут применяться альтернативные средства образования связи.

[0069] Аминокислотные последовательности передающего сигнал полипептида, применяемые для получения химерных белков по изобретению, могут обладать по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95% 97,5%, 98%, 99% идентичностью или сходством последовательности с белками или доменами, идентифицированными следующими регистрационными номерами или в них: тяжелая цепь IgM (GenBank: САС20458.1), Ig-альфа (P11912.2, GI:547896), Ig-бета (P40259.1 GI.728994), CD19 (AAA69966.1 GI:901823), CD3zeta (P20963.2, GI: 23830999), IgE альфа (1F2Q_A, GI:9257150) и Fc-эпсилонR1 субъединица альфа (P12319.1, GI: 119865).

[0070] Белок A Staphylococcus aureus (Р02976.3, GI: 110283003) кодируется геном spa Staphylococcus aureus, и его структура, включая его сегменты связывания с Ig, а также иммуноглобулинсвязывающие свойства хорошо известны и включены посредством ссылки на Graille, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 May 9; 97(10): 5399.404; и Roben, et al. J Immunol. 1995 Jun 15; 154(12): 6437-45. Варианты Белка A или его иммуноглобулинсвязывающих сегментов, обладающие по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% идентичностью последовательности или сходством с известными аминокислотными последовательностями Белка А, а также способностью связываться с иммуноглобулином или другим определяемым компонентом, таким как описаны Graille, et al. и Roben, et al., могут быть получены с помощью методов молекулярной биологии, хорошо известных в данной области техники, включая прямой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулинсвязывающую аминокислотную последовательность.

[0071] Другие иммуноглобулинсвязывающие белки, такие как Белок G Streptococcus и модифицированные варианты таких белков, известны и включены посредством ссылки на Bailey, et al., J Immunol Methods. 2014 Dec 15; 415: 24-30 (doi: 10.1016/j.jim.2014.10.003) (Epub 2014 Oct 22); и на Watanabe, et al., J Biol Chem. 2009 May 1; 284(18):12373-8 (doi: 10.1074/jbc.M809236200)(Epub 2009 Mar 6). Варианты Белка G или его иммуноглобулинсвязывающих сегментов, обладающих по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% идентичностью или сходством последовательности с известными аминокислотными последовательностями Белка G и способность связываться с иммуноглобулином или другим определяемым компонентом, таким как описан Bailey, et al. and Watanabe, et al., могут быть получены с помощью методов молекулярной биологии, хорошо известных в данной области техники, включая прямой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулинсвязывающую аминокислотную последовательность.

[0072] Fc-рецепторы (FcR) связываются с Fc-частью иммуноглобулина, и многие типы таких Fc-рецепторов известны, включая FcγRI и FcεRI. Структурные и функциональные характеристики связывания этих FcR включены посредством ссылки на Fridman, FASEB J. 1991 Sep; 5(12): 2684-90. Варианты FcR или их иммуноглобулинсвязывающих сегментов, обладающие по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% идентичностью или сходством последовательности с известной аминокислотной последовательностью FcR, такой как последовательность, описанная Фридманом, может быть получена с помощью методов молекулярной биологии, хорошо известных в данной области техники, включая прямой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулинсвязывающую аминокислотную последовательность.

[0073] Белок, передающий сигнал, в соответствии с изобретением, может обладать по меньшей мере 70% 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% идентичностью или сходством последовательности с раскрытыми белками, передающими химерный сигнал, описанными в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18, а также обладает способностью связываться с определяемым компонентом, таким как иммуноглобулин, и затем передавать сигнал в генно-модифицированную биосенсорную клетку. Такие варианты реализации изобретения могут быть сконструированы методами, хорошо известными из уровня техники в обрасти молекулярной биологии или химическим синтезом полинуклеотидов, кодирующих варианты химерных репортерных белков, введением кодирующих последовательностей в вектор и трансформацией или трансфекцией вектором компетентной клетки.

Сортировка и клонирование клеток

[0074] Дизайн и конструирование биосенсоров по настоящему изобретению давали смешанную популяцию биосенсорных клеток при культивировании. Некоторые клетки не экспрессировали модифицированные факторы, а другие экспрессировали факторы с разными уровнями. После успешной электропорации и введения генов биосенсорные клетки культивировали и тестировали на предмет биологического ответа (сигнал вспышки) в виде смешанных популяций. Сортировку отдельных клеток проводили с применением проточного цитометра. Клетки выделяли и затем размножали для анализа, с целью отбора экспрессирующих высокие уровни желаемых белков. Для этого процесса применяли флуоресцентно меченые антитела для нацеливания на различные рецепторы на биосенсорных клетках, тем самым обеспечивая процесс сортировки. Был проведен скрининг отдельных клонов на предмет проведения сигнала, и были выбраны лучшие клоны. В результате этого процесса были идентифицированы и выделены наиболее подходящие клоны. Сортировку клеток с активированной флуоресценцией (СКАФ) и окрашивание живых клеток на предмет внеклеточного белка проводили, как описано ниже.

[0075] Генно-модифицированные биосенсорные клетки подсчитывали, осторожно центрифугировали и повторно суспендировали в промывочном буфере (ССРХ + 2% БСА) до конечной концентрации 1×10⁷-1×10⁸ клеток/мл. В каждом эксперименте использовали полноразмерное антитело с Fc-областью или F(ab)₂. При использовании полноразмерного антитела в каждую пустую пробирку 12×15 мм, которая должна была принимать клетки, помещали 1-0,5 мкг антитела, блокирующего Fc-рецептор. В каждую из этих пробирок добавляли 100 мкг клеток (1×10⁶-1×10⁷ клеток) поверх Fc-блокирующего антитела. Клетки осторожно перемешивали и инкубировали в течение 15 минут при 4°C или комнатной температуре. При использовании F(ab)₂ предыдущую стадию блокировки Fc опускали. Добавляли в общей сложности 1 мкг первичного антитела (против рецептора выбора), и клетки затем осторожно перемешивали перед инкубацией в течение 20-40 минут на льду (или при 4°C). Эта температура препятствовала интернализации рецептора. Клетки осторожно перемешивали (вихревым перемешиванием) с перерывами, чтобы способствовать прикреплению метки. К клеткам добавляли 2 мл холодного промывочного буфера, затем клетки центрифугировали при 4°C, и супернатант отбрасывали. Стадию промывания повторяли перед повторным суспендированием клеток в 100 мкл буфера для промывания/сортировки. Вторичное ФИТЦ-меченое антитело добавляли (0,5-1 мкг) к клеткам и перемешивали перед инкубацией на льду (или при 4°C) в течение 20-40 минут. Клетки были защищены от действия света в течение всего процесса. Добавляли 2 мл холодного промывочного буфера, затем центрифугировали, и супернатант отбрасывали. Стадию промывания повторяли, и клетки повторно суспендировали в 0,5-1 мл промывочного буфера. Клетки инкубировали на льду до сортировки. Сортировку проводили как можно скорее (по крайней мере, в тот же день). Клонирование и культивирование клеток после однократной сортировки клеток проводили, как описано ниже.

[0076] Биосенсорные клетки сортировали на 96-луночных планшетах, каждая лунка которых содержала одну клетку и 100-200 мкл питательной среды для клеток. Планшеты сканировали/контролировали в течение следующих 10-14 дней, чтобы определить скорость роста и момент переноса на 24-луночный планшет. Во время сканирования использовали разную маркировку для разных условий. Некоторые лунки маркировали, если они содержали живые клетки, но не были готовы к переноса, а также маркировали загрязненные лунки. Клетки переносили на 24-луночный планшет, содержащий 1,0 мл соответствующих сред в каждой лунке. В случае загрязненных клеток промывание проводили путем переноса всей суспензии клеток из лунки в 5 мл стерильного в конической пробирке 15 мл. Далее клетки центрифугировали с фактором разделения 170 в течение 10 минут, и супернатант отбрасывали. Осадок повторно суспендировали в 1,0 мл свежей среды на 24-луночном планшете для культивирования. После возобновления роста клетки переносили на 12-луночный планшет, содержащий 1,5 мл свежей среды на лунку.

[0077] Для скрининга клона после роста на 12-луночном планшете подсчитывали клетки, чтобы определить, готовы ли они к нагрузке и тестированию вспышки. Во время тестирования вспышки в одной итерации участвовало 25000 клеток. Для тестирования выращивали достаточное количество клеток, а также оставляли некоторые для продолжения роста. Эта стадия отмечала первый раунд скрининга клонов. Выбранные клоны выращивали дополнительно и подвергали последующим испытаниям в зависимости от желаемых свойств. Например, для биологического ответа проводили скрининг клонов Jurkat-FcγRI-CD3ζ с помощью анти-CD3ε антител (положительный контроль) и моноклональных антител против бактерий с соответствующими бактериями, в то время как дигитонин применяли для теста на химический ответ. Скрининг клонов МС/9-Aeq проводили с применением антител против FcεRI (биологический ответ) и дигитонина (химический ответ).

[0078] Таким образом, сортировку клеток с активированной флуоресценцией (СКАФ) проводили с применением меток флуоресцентных антител для отбора и выделения клеток, которые экспрессировали высокие уровни желаемых белков, которые в этом случае были генно-модифицированными рецепторами. В результате этого процесса получали популяцию биосенсорных клеток с высокими уровнями экспрессии, что было дополнительно подтверждено тестированием вспышки с применением ФУ в тестовом устройстве. В течение всего процесса клетки подсчитывали с применением автоматического счетчика клеток, чтобы устранить ошибку, вызванную человеческим фактором, и повысить систематичность и эффективность. Различные клоны Jurkat-FcγRI-CD3ζ давали разные уровни биологического ответа при тестировании с помощью mAb против Е. coli O111 и бактерий Е. coli O111. Многие клоны были протестированы в одинаковых условиях, и дающие самый высокий ответ были сохранены в банке клонов. Аналогичным образом, результаты химического ответа, полученные при тестировании различных клонов МС/9-Aeq с применением химического вещества дигитонина, показали, что разные клоны дают разные уровни химического ответа, в зависимости от уровня экспрессии экворина. Клоны с самым высоким сигналом были сохранены в банке клонов.

Культивирование биосенсорных клеток

[0079] Различные рецептуры питательной среды применяли для различных клеточных линий с целью обеспечения оптимальных условий роста. Тучные клетки МС/9 культивировали в полной среде для тучных клеток (МДСИ - Sigma, кат. № D5796, , 10% ФТС, 10% добавки T-Stim, 50 мкМ β-меркаптоэтанола). Т-клетки Jurkat культивировали в полных средах RPMI (RPMI-ThermoFisher, 10% ФТС, ). В .зависимости от характеристик электропорированных конструкций для селекции в клеточной культуре применяли разные антибиотики. Соответствующие антибиотики добавляли в питательную среду через 2-3 дня после электропорации для отбора клеток, которые успешно интегрировали линеаризованные конструкции ДНК. Концентрацию клеток поддерживали в диапазоне от 4,0×10⁵ до 1,0×10⁶ клеток/мл для оптимального роста клеток. Различные клеточные линии и клоны обрабатывали для длительного хранения, а запасы замораживали в жидком азоте следующим образом: (i) клетки центрифугировали при 150°C в течение 10 минут, и супернатант отбрасывали; (ii) осадок клеток повторно суспендировали в среде для замораживания (RPMI, 50% ФТС, 10% ДМСО) в концентрации 5,0×10⁵ клеток/мл; и (iii) аликвоты по 1 мл помещали в криофлаконы Nunc емкостью 2 мл и замораживали при -80°C в течение 24 часов перед переносом в жидкий азот для длительного хранения.

Нагрузка биосенсорных клеток

[0080] Биосенсорные клетки по настоящему изобретению центрифугировали в конических пробирках емкостью 50 мл с фактором разделения 150 в течение 10 минут.Супернатант отбрасывали, и осадок повторно суспендировали в нагрузочной среде (RPMI, 10% обедненного антителами ФТС, , 0,1% Pluronic F68 и 1,5 мМ коэлентеразина) при концентрации 25000 клеток / 180 мкл. Кроме того, клетки нагружали в различных концентрациях, таких как, например, 100000 клеток / 180 мкл и 400000 клеток / 180 мкл. Клетки нагружали при комнатной температуре с осторожным встряхиванием / покачиванием в течение 24-26 часов. Перед применением коммерчески доступная ФТС, обедненная антителами, может быть дополнительно очищена с применением других систем истощения антител.

Повышение концентрации клеток

[0081] Было продемонстрировано, что биосенсорные клетки по настоящему изобретению более эффективно нагружаются при более низких концентрациях, а не при более высоких концентрациях. Например, было показано, что нагружающие клетки с плотностью 25000 клеток / 180 мкл против 400000 клеток / 180 мкл дают двукратное усиление обнаруживаемого сигнала. Клетки Jurkat-FcγRI-CD3ζ клона P5G7 нагружали как при концентрации 400000 клеток / 180 мкл, так и 25000 клеток / 180 мкл, и затем тестировали при концентрации 400000 клеток / 180 мкл в каждой реакции. Применяли ночную культуру бактерий Е. coli O111 с 23 нМ mAb против Е. coli O111. Биосенсорные клетки, нагруженные при более низкой концентрации, давали более высокий сигнал при том же количестве тестируемых бактериальных клеток. Плотность биосенсорных клеток в основном изменяется путем повышения концентрации клеток после нагрузки, чтобы обеспечить оптимальное обнаружение патогенов. Различные концентрации применялись для обнаружения патогенов в зависимости от целевого патогена и качества антитела, если детекторная молекула является растворимым антителом. Биосенсорные клетки концентрируют центрифугированием при 150°C в течение 10 минут, и осадок клеток повторно суспендируют в желаемом объеме тестируемой среды. Среда нагрузки дополнительно может служить тестовой средой. В некоторых случаях добавление нормальной ФТС к среде вызывало биологический ответ, приводящий к сигналу биосенсора (вспышка) из-за высокой концентрации антител в нормальной ФТС. Поэтому в процессе нагрузки использовали коммерчески доступной ФТС, обедненной антителами, который уменьшал сигнал, инициированный антителом, не устраняя его полностью. Дополнительные способы применялись для дальнейшего истощения следовых количеств антител в коммерчески доступной ФТС, обедненной антителами.

Биоанализ

[0082] В иллюстративных вариантах реализации настоящего изобретения формат биоанализа определяемого компонента устанавливается с помощью биосенсорной клетки и растворимого моноклонального антитела (mAb), которое является специфичным для этого определяемого компонента (например, патогена). В этих вариантах реализации изобретения специфичность биоанализа непосредственно связана с селективным связыванием растворимого антитела с анализируемой мишенью, а специфичность и чувствительность биосенсора определяются путем обнаружения и измерения биолюминесценции. В этом процессе биосенсорные клетки первоначально нагружают с применением светоизлучающей молекулы, коэлентеразина (КТЗ). Затем добавляют растворимое антитело по выбору и анализируемый образец. Если в образце присутствует целевой патоген, он взаимодействует с растворимым антителом, которое связывается со слитым белком, экспрессируемым биосенсорной клеткой, в конечном счете вызывая каскад сигнала, который приводит к световому испусканию из биосенсорной клетки. Испускаемый свет обнаруживается с помощью фотоумножителя (ФУ) в тестовом устройстве, а сигнал, испускаемый клеткой биосенсора, отображается как количество фотонов в секунду. Как описано ниже, были разработаны различные методы для обнаружения патогенов на основе растворимого антитела и целевого патогена. Три таких метода, подробно описанные ниже, включают: (i) мгновенное добавление детекторных молекул (например, антител); (ii) покрытие биосенсорных клеток с помощью детекторных молекул (например, антител); и (iii) покрытие определяемых компонентов (например, бактерий) антителами.

Тестовая установка

[0083] Аспект биоанализа согласно настоящему изобретению может быть выполнен в тестовом блоке или тестовом картридже, предназначенном для применения с настольной или переносной системой тестирования и устройством, описанным в заявке на выдачу патента США №13/711296 (патент США №9023640), которая включена в настоящее описание посредством качестве ссылки в полном объеме. Тестовый картридж, который может быть одноразовым изделием, принимает как образец, так и биосенсор и вводит биосенсор в тестовый картридж, смешивая образец и биосенсор предсказуемым и контролируемым образом. Тестовый картридж дополнительно содержит реакционную камеру для приема испытуемого образца и биосенсора, причем реакционная камера имеет заданную внутреннюю геометрию и дополнительно адаптирована для минимизации или устранения фоновых шумов с целью улучшения общего соотношения сигнал/шум. По меньшей мере один стабилизатор может быть расположен в реакционной камере для минимизации повреждения испытуемому образца и биосенсора силой сдвига во время процесса смешивания.

[0084] В иллюстративном варианте реализации изобретения реакционная камера и каналы для жидкости, которые ведут к реакционной камере внутри тестового картриджа, предназначены для достижения нескольких целей. Входной канал для жидкости, поступающий в реакционную камеру, включает трубчатую форму, причем диаметр трубки относительно небольшой и сужается, чтобы стать еще меньше на входе в реакционную камеру. Это увеличивает скорость поступления жидкости в реакционную камеру и способствует более интенсивному и гомогенному перемешиванию в результате объемного движения реагентов внутри реакционной камеры. Желательно смешивать реагенты и образец таким образом, чтобы способствовать смешению за пределами молекулярной диффузии и свести к минимуму продолжительность теста, при этом гарантируя, что любой инфекционный агент, присутствующий в образце, быстро встречается с биосенсором. Входной канал может быть смещен от центральной оси реакционной камеры, чтобы способствовать вращению реагентов по часовой стрелке или против часовой стрелки вокруг центральной оси тестовой камеры, поскольку текучие среды смешивают, чтобы повысить однородность смеси. Кроме того, входной канал расположен приблизительно по касательной к внутренней поверхности реакционной камеры, чтобы позволить входящей жидкости проходить от входного канала к реакционной камере, оставаясь при этом в контакте с боковой поверхностью реакционной камеры, что обеспечивает минимально турбулентный поток и минимальное попадание воздушных пузырьков в смешанные жидкости. Пузырьки нежелательны из-за непредсказуемого преломления света, которое они вызывают, когда свет, испускаемый реагентами, проходит через пузырьки внутри смешанных реагентов или на поверхности смешанных реагентов. Ось входного канала может быть наклонена выше горизонтали (например, около 30 градусов), чтобы обеспечить частично направленное вниз направление потока текучей среды и гарантировать, что реагент смешается с жидкостью, находящейся на дне реакционной камеры. Альтернативно, реагенты могут быть введены в тестовую камеру с использованием альтернативных средств доставки жидкости, таких как вертикальный канал для доставки реагентов на дно реакционной камеры или подача жидкости непосредственно на центральную ось тестовой камеры с целью создания столбика реагента, протекающего в тестовую камеру и тем самым содействия перемешиванию путем захвата.

[0085] Форма (т.е., заданная геометрия) реакционной камеры может представлять собой вращающуюся секцию, облегчающую движение смешивающихся жидкостей по часовой стрелке или против часовой стрелки вокруг центральной оси реакционной камеры. Альтернативно, при желании, может быть применена форма реакционной камеры, отличная от вращающейся секции, такая как прямоугольная или неправильная форма. В одном варианте реализации изобретения вращающаяся секция, применяемая для образования реакционной камеры, представляет собой часть эллипса для облегчения сбора рассеянного света, испускаемого реагентами и отражающего этот свет в направлении поверхности детектора, который может представлять собой фотоумножитель (ФУ) (Hamamatsu). Поверхность реакционной камеры может быть отражающей, чтобы улучшить способность эллиптической формы собирать свет. В некоторых вариантах реализации изобретения максимальный диаметр поверхности ФУ ограничен для достижения максимального соотношения сигнал/шум на выходе системы. Диаметр реакционной камеры может быть спроектирован таким образом, чтобы приблизительно соответствовать диаметру ФУ, что влияет на эллиптическую форму, которая может быть достигнута в реакционной камере, предназначенной для удерживания определенного объема текучих сред. Из-за ограниченной эллиптической формы цвет поверхности реакционной камеры может быть частично рассеивающим белым в целях дополнительного сбора света, который возникает, когда свет, который иначе не отражался бы непосредственно на поверхности ФУ, частично рассеивается белой поверхностью, и часть его направляется к поверхности ФУ. В качестве альтернативы можно использовать другие поверхности и материалы, такие как зеркальный полированный алюминий или прозрачный материал. Кроме того, желательно, чтобы материал реакционной камеры был минимально фосфоресцирующим, чтобы предотвратить испускание света из самой реакционной камеры, затмевающего испускаемый реагентами свет и препятствующее обнаружению. Было выявлено, что белые полимерные материалы, такие как акрилонитрилбутадиенстирол или другие подобные полимерные материалы, обладают низким уровнем фосфоресценции, было обнаружено, поэтому дополнительный сбор света, обеспечиваемый комбинацией отражения и диффузии света, является преимуществом с точки зрения соотношения сигнала к шуму на выходе светочувствительного контура.

[0086] В типичном варианте реализации изобретения тестовый блок представляет собой систему для применения в анализе образца. Система содержит биосенсорный реагент, причем биосенсорный реагент содержит живые биологические клетки; карту резервуара с длинной петлевой частью и короткой петлей, в которой карта резервуара хранит биосенсорный реагент; и основание тестового картриджа, и при этом основание тестового картриджа сконфигурировано для приема карты резервуара. Основание тестового картриджа дополнительно содержит: (i) реакционную камеру, имеющую центральную ось, причем реакционная камера имеет форму вращающегося полуэллипса; и (ii) входной канал, соединенный с реакционной камерой, причем входной канал расположен над реакционной камерой под углом 15-60 градусов выше горизонтали, и, при этом, входной канал смещен от центральной оси реакционной камеры, причем после введения образца, подлежащего анализу, в основание тестового картриджа через входной канал образец гомогенно смешивается с биосенсорный реагентом, сводя к минимуму повреждение живых биологических клеток.

[0087] В другом типичном варианте реализации изобретения тестовый блок обеспечивает систему для быстрого обнаружения присутствия определяемого компонента в биологическом образце. Эта система содержит биосенсорный реагент, содержащий по меньшей мере одно антитело, специфичное в отношении заданного определяемого компонента и биолюминесцентного агента, причем по меньшей мере одно антитело экспрессируется на поверхности живых генно-модифицированных лимфоцитов, и при этом биолюминесцентный агент экспрессируется живыми генно-модифицированными лимфоцитами, и, при этом биосенсорный реагент осуществляет: (i) обнаружение присутствия конкретного определяемого компонента в тестируемом образце и (ii) испускание обнаруживаемого светового сигнала, когда биосенсорный реагент реагирует с образцом и обнаруживает присутствие конкретного определяемого компонента в образце. Дополнительно включен тестовый картридж. Тестовый картридж дополнительно содержит: (i) карту резервуара, причем карта резервуара дополнительно содержит биосенсорный реагент; и (ii) основание тестового картриджа, и при этом основание тестового картриджа сконфигурировано для приема карты резервуара. Основание тестового картриджа дополнительно содержит: а) реакционную камеру, имеющую центральную ось, причем реакционная камера имеет форму вращающегося полуэллипса; b) входной канал, соединенный с реакционной камерой, причем входной канал расположен над реакционной камерой под углом 15-60 градусов выше горизонтали, и при этом входной канал смещен от центральной оси реакционной камеры; и с) при введении образца в основание тестового картриджа через входной канал образец гомогенно смешивается с биосенсорным реагентом, одновременно минимизируя повреждение живых, генно-модифицированных лимфоцитов и минимизируя любое барботирование смешанного биосенсорного реагента и образца в реакционной камере. Дополнительно включен тестовый блок, предназначенный для приема тестового картриджа. Тестовый блок содержит датчик для обнаружения обнаруживаемого светового сигнала, испускаемого биосенсорным реагентом при взаимодействии с образцом, причем обнаружение испускаемого обнаруживаемого светового сигнала указывает на присутствие определяемого компонента в образце, причем обнаружение конкретного определяемого компонента в образце происходит в реальном времени.

Пример биоанализа 1; мгновенное добавление антител

[0088] В иллюстративном варианте реализации биоанализа по настоящему изобретению, в котором детекторная молекула представляет собой растворимое антитело, растворимое антитело и исследуемый образец смешивают вместе непосредственно перед введением биосенсорных клеток в исследуемый образец. В этом варианте реализации изобретения нагруженные биосенсорные клетки центрифугируют и концентрируют, обычно до 400000 клеток / 180 мкл (подходит для однократной реакции) в нагружающей среде. Затем аликвоту нагруженных биосенсорных клеток 180 мкл (около 400000 клеток) загружают в длинную петлю карты резервуара. Для положительного контроля 30 мкл анти-CD3ε-антитела в средах RPMI загружают в короткую петлевую часть карты резервуара. Затем карту резервуар фиксируют в основании тестового картриджа. Аликвоту 2 мкл антитела (0,5 мг/мл) против целевого патогена, например, против Е. coli O111 (если целевым патогеном является Е. coli O111), смешивают с 28 мкл образца, подлежащего анализу, в смесительной камере для картриджа. Основание тестового картриджа вставляют в тестовое устройство, а нагруженные биосенсорные клетки вводят в реакционную камеру, чтобы инициировать реакцию. Результирующий сигнал регистрируют в течение 4-8 минут, и в конце периода анализа 30 мкл анти-CD3ε-антитела вводят из короткой петли резервуара в реакционную камеру в качестве положительного контроля реакции, которая регистрируется в течение 2 минут. В качестве альтернативного положительного контроля можно применять 30 мкл 0,61 мМ дигитонина, а не анти-CD3ε-антитело. Отрицательный контрольный опыт может быть выполнен с применением предварительно определенного патогена, который не является специфичным для применяемого антитела.

Пример биоанализа 2; Покрытие биосенсорных клеток антителами

[0089] В другом типичном варианте реализации биоанализа по настоящему изобретению, в котором детекторная молекула является растворимым антителом, биосенсорные клетки покрывают растворимым антителом в течение определенного периода времени перед смешиванием с образцом, который подлежит анализу с применением биосенсорных клеток. В этом варианте реализации нагруженные биосенсорные клетки центрифугируют и концентрируют, обычно до 400000 клеток / 180 мкл (подходит для однократной реакции) в нагружающей среде. Далее аликвоту 180 мкл биосенсорных клеток (около 400000 клеток) смешивают с 2 мкл антитела (0,5 мг/мл) против целевого патогена, такого как против Е. coli O111 (если целевым патогеном является Е. coli O111) в пробирке Эппендорфа. Биосенсорные клетки, смешанные с антителом, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем загружают в длинную петлю карты резервуара. Для положительного контроля 30 мкл анти-CD3ε-антитела в среде RPMI загружают в часть короткой петли карты резервуара. Затем карту резервуар фиксируют в основании тестового картриджа. В реакционную камеру добавляют 30 мкл объема исследуемого образца. Основание тестового картриджа вставляют в тестовое устройство, а биосенсорные клетки инжектируют в тестовое устройство, чтобы инициировать реакцию. Результирующий сигнал регистрируют в течение 4-8 минут, и в конце тестового периода 30 мкл анти-CD3ε-антитела вводят из короткой петли резервуара в реакционную камеру в качестве положительного контроля реакции, которая регистрируется в течение 2 минут. В качестве альтернативного положительного контроля можно применять 30 мкл 0,61 мМ дигитонина, а не анти-CD3ε-антитело. Отрицательный контрольный опыт может быть выполнен с применением заранее определенного патогена, который не является специфичным для применяемого антитела.

Пример биоанализа 3; Покрытие определяемого компонента антителами

[0090] В другом типичном варианте реализации биоанализа по настоящему изобретению, в котором детекторная молекула представляет собой растворимое антитело, определяемый компонент (например, патогенные бактерии) в течение определенного периода времени покрывают растворимым антителом до смешивания с образцом, подлежащим анализу с помощью биосенсора. В этом варианте реализации изобретения нагруженные биосенсорные клетки центрифугируют и концентрируют, обычно до 400000 клеток /180 мкл (подходит для одной реакции) в нагружающей среде. Аликвоты биосенсорных клеток по 180 мкл (около 400000 клеток) загружают в длинную петлю карты резервуара. Для положительного контроля 30 мкл анти-CD3ε-антитела в среде RPMI загружают в часть короткой петли карты резервуара. Затем карту резервуара резервуара фиксируют в основании картриджа. Аликвоту 2 мкл антитела (0,5 мг/мл) против целевого патогена, такого как против Е. coli O111 (если целевым патогеном является Е. coli O111), смешивают с 28 мкл образца, подлежащего анализу, в пробирке Эппендорфа. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, затем помещают в камеру для смешивания картриджа. Картридж вставляются в ФУ, и биосенсорные клетки вводят в смесительную камеру, чтобы инициировать реакцию. Результирующий сигнал регистрируют в течение 4-8 минут, и в конце тестового периода 30 мкл анти-CD3ε-антитела вводят из короткой петли резервуара в реакционную камеру в качестве реакции положительного контроля, которую регистрируются в течение 2 минут. В качестве альтернативного положительного контроля можно использовать 30 мкл 0,61 мМ дигитонина, а не анти-CD3ε-антитело. Отрицательный контрольный тест может быть выполнен с применением предварительно определенного патогена, который не является специфичным для применяемого антитела.

[0091] Иллюстративные биоанализы, описанные в настоящем документе, могут включать в себя другие добавки, которые уменьшают фоновый шум и усиливают сигнал. Было показано, что применение анти-CD3ε-антитела в качестве положительного контроля позволяет обнаружить менее 10 нагруженных биосенсорных клеток в смеси из 50000 ненагруженных биосенсорных клеток. Было продемонстрировано, что биосенсор сам по себе обнаруживает 230 КОЕ бактерий в образце 30 мкл. В описанных выше биоанализах патентованное моноклональное антитело (1F11) против бактерий Е. coli O111 применялось для обнаружения бактерий Е. coli O111, причем E.coli O157 использовали в качестве отрицательного контроля. Показано, что Е. coli O157 дают отрицательные результаты, тем самым доказывая специфичность системы. Дополнительно, многочисленные коммерчески доступные антитела могут применяться в описанном биоанализе. Что касается патентованного моноклонального антитела (1F11), то анализ антител и выбор моноклонального антитела осуществляли, как описано ниже.

[0092] Выработку антител определяли с помощью ТИФА, проводимого на 96-луночных планшетах. Каждую лунку покрывали различными ЛС (Е. coli O157, Е. coli O127, Е. coli O111, Е. coli O26, Klebsiella pnuemoniae, Salmonella enterioa и наивные сыворотки) или бактериальными клетками (Е. coli O157, Е. coli O111, Е. coli 26 и Е. coli DH5α). В лунки добавляли супернатант гибридомы от разных клонов mAb O157 или mAb O111. Для обнаружения применяли конъюгированный с пероксидазой хрена (ПХ) козий анти-мышиный IgG (Приложение ПI.A.3). Два клона гибридомы (1В10 и 6G1) Е. coli O157 распознают исключительно ЛПС Е. coli O157 и Е. coli O157. Девять гибридомных клонов Е. coli O111 специфично распознают ЛПС Е. coli O111 и Е. coli O111. Клоны с показателями максимальной оптической плотности (OD) были выбраны для валидации, которую выполняли, как описано ниже.

[0093] Гранулы клеток гибридомы собирали и хранили при -80°С перед экстракцией РНК. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции кДНК с последующей вложенной ПЦР-амплификацией. Все положительные продукты ПЦР были клонированы в векторы клонирования ТА и отправлены на секвенирование. После анализа последовательностей определяли вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи. Четыре одноцепочечных антитела (scFv) О157 (1В10) (индивидуальный mAb, продуцируемый ПСР) и АТСС НВ 10452, а также два одноцепочечных антитела 0111, продуцируемых ПСП (1F11 и 1F2), рекомбинантно экспрессировали и очищали аффинной хроматографией с иммобилизированными ионами металлов (АХИМ). Последовательность scFv была построена следующим образом: сигнал секреции pel В + аминокислота Аланин + Гистидиновая метка + аминокислоты Глицин-Серин-Серин-Глицин + сайт расщепления ВГТ + аминокислоты Глицин-Серин-Серин-Глицин + вариабельный участок тяжелой цепи + линкерный участок Серин-Аланин-Аспарагиновая кислота-Аспарагиновая кислота-Аланин-Лизин-Лизин-Аспарагиновая кислота-Аланин-Аланин-Лизин-Лизин-Аспарагиновая кислота-Аспарагиновая кислота-Аланин-Лизин-Лизин-Аспарагиновая кислота-Аспарагиновая кислота + вариабельный участок легкой цепи. Очищенные scFv анализировали с применением многослойных планшетов, покрытых ЛПС O157 или O111.

[0094] Целью настоящего исследования было изучить взаимодействие моноклинального антитела (mAb) с цельными бактериальными клетками (Е. coli O157 или Е. coli O111) и оценить кинетическую константу (KD) взаимодействия антитело-бактерия. В этих анализах применяли козье поликлональное антитело против Е. coli O157, козье поликлональное антитело против Е. coli O111, три моноклональных антитела (1022, 1024 и 1061) против Е. coli O157 и одно моноклональное антитело против Е. coli O111. Кроме того, применяли сенсорный чип СМ5 и набор для аминного сочетания. Все анализы проводили на приборе Biacore X100. В протоколе одно поликлональное антитело (против выбранных бактерий) было иммобилизировано на сенсорном чипе СМ5. Затем осуществляли связывание с выбранными бактериями, с последующей инъекцией моноклонального антитела против тех же бактерий в непрерывном потоке буферного раствора. Мониторинг взаимодействия осуществляли в режиме реального времени. Относительное связывание антитела с каждой бактерией регистрировали в резонансных единицах (РЕ). Результаты анализа методом BIAcore связывания специфичного антитела против Е. coli O157 (mAb FF754) с Е. coli O157 и Е. coli O111 продемонстрировали, что mAb O157 специфично в отношении своего целевого антигена.

[0095] Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано путем описания типичных вариантов его реализации, и хотя варианты реализации изобретения были описаны с определенной степенью детальности, они не предназначены для ограничения каким-либо образом объема прилагаемой формулы изобретения указанными деталями. Специалистам в данной области техники будут доступны дополнительные преимущества и модификации. Следовательно, изобретение в его более широких аспектах не ограничивается какими-либо конкретными деталями, типичными устройствами и способами и/или иллюстративными примерами, показанными и описанными. Соответственно, отклонения от таких деталей могут быть сделаны без выхода за пределы общей концепции изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Fundamental Solutions Corporation

Zupancic, Thomas J.

Zeng, Lingchun

Vedamoorthy, Srikanth

Lwande, Joel S.

Joseph, Kittle D.

<120> Биосенсорная система для быстрого обнаружения определяемых компонентов

<130> 35044-0006

<160> 19

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 1929

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: BBP-IgM

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(1929)

<400> 1

atg gtg ctg cag acg caa gtg ttt atc tcc ctg ctg ctc tgg atc agc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

gga gcg tac ggc act tac aag ctg gtg atc aac ggt aaa acc ttg aag 96

Gly Ala Tyr Gly Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys

20 25 30

ggt gag acc acc act gag gca gtc gac gcc gcc act gcc gag aag gtc 144

Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val

35 40 45

ttt aaa cag tat gcc aat gat aac ggc gtg gac ggc gag tgg acc tac 192

Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr

50 55 60

gat gac gcc act aag aca ttc act gtg act gaa aag ccc gag gtg att 240

Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile

65 70 75 80

gac gcg tcc gaa ttg aca cct gcg gtg acc acc tac aaa ctg gtt atc 288

Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile

85 90 95

aac ggc aag act ctg aag ggc gag acc acc aca gag gca gtc gat gcc 336

Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala

100 105 110

gcc acc gcc gag aag gtc ttc aag caa tat gcc aac gac aac ggg gtg 384

Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val

115 120 125

gac ggg gag tgg acc tac gat gat gcc acc aag acc ttc acc gtg acc 432

Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr

130 135 140

gag aag ccc gaa gtg atc gat gcg agt gaa ctg act ccc gcc gtg aca 480

Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr

145 150 155 160

ggt tct gct tct ggt tct ggt ggt tca gca tca gca cca act ttg ttt 528

Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe

165 170 175

cca ctt gtc tca tgt gag aac tcg cca tcg gat acc tcg agc gta gcg 576

Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala

180 185 190

gtc gga tgt ctc gct caa gac ttt ctt ccg gac agc atc acg ttt tca 624

Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser

195 200 205

tgg aag tat aag aac aat tcg gat att tcg agc acg cga gga ttt ccc 672

Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro

210 215 220

agc gta ttg aga ggg gga aag tac gcg gca aca agc cag gtg ctg ctc 720

Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu

225 230 235 240

cca agc aag gat gtg atg cag ggc act gac gag cat gta gta tgc aag 768

Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys

245 250 255

gta cag cac ccc aat gga aac aag gaa aag aat gtc cct ctg cct gta 816

Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val

260 265 270

att gcc gag ctc cct cct aaa gtg tca gtg ttc gtg ccg ccc aga gat 864

Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp

275 280 285

ggg ttc ttt gga aac ccg cga tcg aag tcg aaa ctg atc tgc cag gcc 912

Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala

290 295 300

acg gga ttc agc cct cgg cag att caa gtg tcg tgg ttg cgg gag gga 960

Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly

305 310 315 320

aaa cag gtg gga tcg ggg gtg acc aca gac cag gtg cag gcg gag gct 1008

Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala

325 330 335

aaa gaa agc ggt ccc acc aca tat aag gtc act tcc acc ctt act att 1056

Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile

340 345 350

aag gaa tcg gat tgg ttg tca cag tcg atg ttc aca tgt aga gtc gat 1104

Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp

355 360 365

cat cgc gga ctc acg ttt caa cag aac gcg tca tca atg tgt gta ccc 1152

His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro

370 375 380

gat caa gat acg gcg atc aga gta ttc gcc att ccg cct agc ttc gca 1200

Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala

385 390 395 400

tcc att ttt ctc acc aaa agc aca aag ctg aca tgt ctt gtg aca gac 1248

Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp

405 410 415

ctc aca acg tac gat tca gtc aca att tca tgg acc agg cag aat ggg 1296

Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly

420 425 430

gag gcg gta aag acg cac acc aac att tcg gaa agc cat ccc aac gcc 1344

Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala

435 440 445

acg ttt tcg gcg gtc ggg gag gca tcg att tgt gag gac gat tgg aat 1392

Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn

450 455 460

tca ggg gag cgc ttc aca tgc acg gtc act cac acg gat ctc cca tcc 1440

Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser

465 470 475 480

ccg ttg aag cag aca atc tcg cga ccc aaa ggt gtc gca ctg cac agg 1488

Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg

485 490 495

ccc gac gtc tac ctc ctg cct cct gcc agg gaa cag ctc aac ctc cgg 1536

Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg

500 505 510

gaa tca gca acg atc acg tgt ctt gta acc ggg ttt tca ccg gct gac 1584

Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp

515 520 525

gtc ttt gtc caa tgg atg cag cgg gga caa ccc ttg tca cca gag aag 1632

Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys

530 535 540

tat gtg aca tca gcg ccc atg ccc gag cca cag gct ccg ggt agg tat 1680

Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr

545 550 555 560

ttt gcc cat tcc atc ctc act gtg tcc gag gaa gag tgg aac acc ggc 1728

Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly

565 570 575

gaa acg tac acg tgc gtc gta gca cac gaa gcg ttg ccc aat aga gtg 1776

Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val

580 585 590

act gag aga act gta gat aag tcc act gag ggc gaa gta agc gcg gat 1824

Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Asp

595 600 605

gaa gaa ggt ttc gaa aac ttg tgg gct aca gcg agc acg ttt atc gtg 1872

Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu Trp Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ile Val

610 615 620

ttg ttc ttg ctt tca ctc ttc tac tcc aca act gta acc ctg ttc aag 1920

Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys

625 630 635 640

gtc aag tag 1929

Val Lys

<210> 2

<211> 642

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys

20 25 30

Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr

50 55 60

Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile

65 70 75 80

Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile

85 90 95

Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala

100 105 110

Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val

115 120 125

Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr

130 135 140

Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr

145 150 155 160

Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe

165 170 175

Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala

180 185 190

Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser

195 200 205

Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro

210 215 220

Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu

225 230 235 240

Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys

245 250 255

Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val

260 265 270

Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp

275 280 285

Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala

290 295 300

Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly

305 310 315 320

Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala

325 330 335

Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile

340 345 350

Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp

355 360 365

His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro

370 375 380

Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala

385 390 395 400

Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp

405 410 415

Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly

420 425 430

Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala

435 440 445

Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn

450 455 460

Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser

465 470 475 480

Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg

485 490 495

Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg

500 505 510

Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp

515 520 525

Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys

530 535 540

Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr

545 550 555 560

Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly

565 570 575

Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val

580 585 590

Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Asp

595 600 605

Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu Trp Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ile Val

610 615 620

Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys

625 630 635 640

Val Lys

<210> 3

<211> 1884

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: BBP-IgAB

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(1884)

<400> 3

atg ccg ggt gga ccc gga gtg ctc cag gca ttg cct gca acc atc ttc 48

Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe

1 5 10 15

ctg ctg ttc ttg ttg tcc gcc gtc tac ctt gga cct ggt tgc cag gca 96

Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala

20 25 30

act tac aag ctg gtg atc aac ggt aaa acc ttg aag ggt gag acc acc 144

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr

35 40 45

act gag gca gtc gac gcc gcc act gcc gag aag gtc ttt aaa cag tat 192

Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr

50 55 60

gcc aat gat aac ggc gtg gac ggc gag tgg acc tac gat gac gcc act 240

Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr

65 70 75 80

aag aca ttc act gtg act gaa aag ccc gag gtg att gac gcg tcc gaa 288

Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu

85 90 95

ttg aca cct gcg gtg acc acc tac aaa ctg gtt atc aac ggc aag act 336

Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

100 105 110

ctg aag ggc gag acc acc aca gag gca gtc gat gcc gcc acc gcc gag 384

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu

115 120 125

aag gtc ttc aag caa tat gcc aac gac aac ggg gtg gac ggg gag tgg 432

Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp

130 135 140

acc tac gat gat gcc acc aag acc ttc acc gtg acc gag aag ccc gaa 480

Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu

145 150 155 160

gtg atc gat gcg agt gaa ctg act ccc gcc gtg aca ggt tct gct tcg 528

Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Gly Ser Ala Ser

165 170 175

ggc tca gga ctg tgg atg cat aag gtg cct gca tcg ctc atg gtg agc 576

Gly Ser Gly Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser

180 185 190

ctg ggc gaa gat gca cat ttt cag tgt ccc cat aac agc tcc aac aac 624

Leu Gly Glu Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn

195 200 205

gcg aac gtg acc tgg tgg cgg gtg ctc cat ggc aat tac acc tgg ccg 672

Ala Asn Val Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro

210 215 220

cct gaa ttt ctc gga ccg gga gag gac ccg aat ggg acc ctt atc atc 720

Pro Glu Phe Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile

225 230 235 240

cag aac gtg aat aag tcc cac gga gga atc tac gtc tgc cgc gtg caa 768

Gln Asn Val Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln

245 250 255

gag gga aat gag agc tac caa cag tca tgc gga acg tac ctc cgc gtc 816

Glu Gly Asn Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val

260 265 270

cgg cag cca cca ccg agg ccg ttc ctc gat atg gga gag gga act aag 864

Arg Gln Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys

275 280 285

aac cgg atc att acc gcc gaa ggc atc atc ctc ctc ttc tgc gcc gtc 912

Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val

290 295 300

gtg ccg ggg act ctg ctt ctg ttc cgg aaa agg tgg caa aac gaa aag 960

Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys

305 310 315 320

ctg ggt ctg gac gct ggg gac gaa tac gag gat gaa aac ttg tac gag 1008

Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu

325 330 335

ggc ctg aat ctg gac gat tgc tcg atg tat gag gac att agc aga gga 1056

Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly

340 345 350

ctg cag ggt acc tac caa gac gtg gga agc ctg aac atc ggg gat gtg 1104

Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val

355 360 365

cag ctc gag aaa cca agg aaa aga aga gct agc gaa gga cgc gga tca 1152

Gln Leu Glu Lys Pro Arg Lys Arg Arg Ala Ser Glu Gly Arg Gly Ser

370 375 380

ctg ctt act tgc ggc gat gtc gaa gaa aat ccc gga cca atg gcc aga 1200

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg

385 390 395 400

ttg gcg ctg tcg ccg gtc cct tcg cac tgg atg gtg gcc ctg ctg ctc 1248

Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala Leu Leu Leu

405 410 415

ttg ctt tcg gcg gct gag ccg gtg cca gcg gct aga tcg gag gac cgc 1296

Leu Leu Ser Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu Asp Arg

420 425 430

tac aga aat ccg aag ggt tcc gct tgc tca cgc atc tgg caa tca cca 1344

Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln Ser Pro

435 440 445

cgc ttc atc gcg cgc aaa cgc ggc ttc act gtc aag atg cac tgc tat 1392

Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His Cys Tyr

450 455 460

atg aac tcg gcc agc ggg aat gtg tcg tgg ctg tgg aag cag gaa atg 1440

Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln Glu Met

465 470 475 480

gac gag aat ccg cag caa ctg aaa ctg gag aag ggc cgg atg gaa gaa 1488

Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu

485 490 495

tcc cag aat gag tcg ctg gcc acc ctt act atc caa ggt atc cgg ttt 1536

Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile Arg Phe

500 505 510

gaa gat aac ggg atc tac ttc tgt caa cag aag tgt aac aac act tca 1584

Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn Thr Ser

515 520 525

gag gtg tac cag gga tgc ggc acc gaa ctc cgc gtc atg gga ttc tcc 1632

Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser

530 535 540

acc ctc gcc caa ctg aag cag cgc aac acg ctg aag gac ggc atc att 1680

Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile Ile

545 550 555 560

atg atc cag acc ctg ctg atc atc ctg ttc atc att gtg ccg atc ttt 1728

Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile Phe

565 570 575

ctg ctc ttg gat aag gac gac tcg aaa gcc gga atg gaa gag gac cac 1776

Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His

580 585 590

acg tac gaa ggt ctg gac atc gac caa act gcg act tac gag gac att 1824

Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile

595 600 605

gtg acc ctc cgg act ggc gaa gtc aag tgg tcc gtg ggt gaa cac cct 1872

Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro

610 615 620

gga cag gaa tag 1884

Gly Gln Glu

625

<210> 4

<211> 627

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe

1 5 10 15

Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala

20 25 30

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr

35 40 45

Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr

50 55 60

Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr

65 70 75 80

Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu

85 90 95

Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

100 105 110

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu

115 120 125

Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp

130 135 140

Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu

145 150 155 160

Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Gly Ser Ala Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser

180 185 190

Leu Gly Glu Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn

195 200 205

Ala Asn Val Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile

225 230 235 240

Gln Asn Val Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln

245 250 255

Glu Gly Asn Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val

260 265 270

Arg Gln Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys

275 280 285

Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val

290 295 300

Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys

305 310 315 320

Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu

325 330 335

Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly

340 345 350

Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val

355 360 365

Gln Leu Glu Lys Pro Arg Lys Arg Arg Ala Ser Glu Gly Arg Gly Ser

370 375 380

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg

385 390 395 400

Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala Leu Leu Leu

405 410 415

Leu Leu Ser Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu Asp Arg

420 425 430

Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln Ser Pro

435 440 445

Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His Cys Tyr

450 455 460

Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln Glu Met

465 470 475 480

Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu

485 490 495

Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile Arg Phe

500 505 510

Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn Thr Ser

515 520 525

Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser

530 535 540

Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile Ile

545 550 555 560

Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile Phe

565 570 575

Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His

580 585 590

Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile

595 600 605

Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro

610 615 620

Gly Gln Glu

625

<210> 5

<211> 936

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: BBP-CD3Z

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(936)

<400> 5

atg aag tgg aag gcg ctt ttc acc gcg gcc atc ctg cag gca cag ttg 48

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

ccg att aca gag gca act tac aag ctg gtg atc aac ggt aaa acc ttg 96

Pro Ile Thr Glu Ala Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu

20 25 30

aag ggt gag acc acc act gag gca gtc gac gcc gcc act gcc gag aag 144

Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys

35 40 45

gtc ttt aaa cag tat gcc aat gat aac ggc gtg gac ggc gag tgg acc 192

Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr

50 55 60

tac gat gac gcc act aag aca ttc act gtg act gaa aag ccc gag gtg 240

Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val

65 70 75 80

att gac gcg tcc gaa ttg aca cct gcg gtg acc acc tac aaa ctg gtt 288

Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val

85 90 95

atc aac ggc aag act ctg aag ggc gag acc acc aca gag gca gtc gat 336

Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp

100 105 110

gcc gcc acc gcc gag aag gtc ttc aag caa tat gcc aac gac aac ggg 384

Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly

115 120 125

gtg gac ggg gag tgg acc tac gat gat gcc acc aag acc ttc acc gtg 432

Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val

130 135 140

acc gag aag ccc gaa gtg atc gat gcg agt gaa ctg act ccc gcc gtg 480

Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val

145 150 155 160

aca ggt tct gct tct ggt tct ggt cag agc ttt ggc ctg ctg gat ccc 528

Thr Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro

165 170 175

aaa ctc tgc tac ctg ctg gat gga atc ctc ttc atc tat ggt gtc att 576

Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile

180 185 190

ctc act gcc ttg ttc ctg aga gtg aag ttc agc agg agc gca gac gcc 624

Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

195 200 205

ccc gcg tac cag cag ggc cag aac cag ctc tat aac gag ctc aat cta 672

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

210 215 220

gga cga aga gag gag tac gat gtt ttg gac aag aga cgt ggc cgg gac 720

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

225 230 235 240

cct gag atg ggg gga aag ccg cag aga agg aag aac cct cag gaa ggc 768

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

245 250 255

ctg tac aat gaa ctg cag aaa gat aag atg gcg gag gcc tac agt gag 816

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

260 265 270

att ggg atg aaa ggc gag cgc cgg agg ggc aag ggg cac gat ggc ctt 864

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

275 280 285

tac cag ggt ctc agt aca gcc acc aag gac acc tac gac gcc ctt cac 912

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

290 295 300

atg cag gcc ctg ccc cct cgc taa 936

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

305 310

<210> 6

<211> 311

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu

20 25 30

Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys

35 40 45

Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr

50 55 60

Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val

65 70 75 80

Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val

85 90 95

Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly

115 120 125

Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val

130 135 140

Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro

165 170 175

Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile

180 185 190

Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

195 200 205

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

210 215 220

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

225 230 235 240

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

245 250 255

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

260 265 270

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

275 280 285

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

290 295 300

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

305 310

<210> 7

<211> 2340

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: FcгаммаR1-IgM

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(2340)

<400> 7

atg att ctt acc agc ttt gga gat gac atg tgg ctt cta aca act ctg 48

Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

cta ctt tgg gtt cca gtc ggt ggg gaa gtg gtt aat gcc acc aag gct 96

Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala

20 25 30

gtg atc acc ttg cag cct cca tgg gtc agt att ttc cag aag gaa aat 144

Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn

35 40 45

gtc act tta tgg tgt gag ggg cct cac ctg cct gga gac agt tcc aca 192

Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr

50 55 60

caa tgg ttt atc aac gga aca gcc gtt cag atc tcc acg cct agt tat 240

Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr

65 70 75 80

agc atc cca gag gcc agt ttt cag gac agt ggc gaa tac agg tgt cag 288

Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln

85 90 95

ata ggt tcc tca atg cca agt gac cct gtg cag ttg caa atc cac aat 336

Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn

100 105 110

gat tgg ctg cta ctc cag gcc tcc cgc aga gtc ctc aca gaa gga gaa 384

Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu

115 120 125

ccc ctg gcc ttg agg tgt cac gga tgg aag aat aaa ctg gtg tac aat 432

Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn

130 135 140

gtg gtt ttc tat aga aat gga aaa tcc ttt cag ttt tct tca gat tcg 480

Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser

145 150 155 160

gag gtc gcc att ctg aaa acc aac ctg agt cac agc ggc atc tac cac 528

Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His

165 170 175

tgc tca ggc acg gga aga cac cgc tac aca tct gca gga gtg tcc atc 576

Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile

180 185 190

acg gtg aaa gag ctg ttt acc acg cca gtg ctg aga gca tcc gtg tca 624

Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser

195 200 205

tct ccc ttc ccg gag ggg agt ctg gtc acc ctg aac tgt gag acg aat 672

Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn

210 215 220

ttg ctc ctg cag aga ccc ggc tta cag ctt cac ttc tcc ttc tac gtg 720

Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val

225 230 235 240

ggc agc aag atc ctg gag tac agg aac aca tcc tca gag tac cat ata 768

Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile

245 250 255

gca agg gcg gaa aga gaa gat gct gga ttc tac tgg tgt gag gta gcc 816

Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala

260 265 270

acg gag gac agc agt gtc ctt aag cgc agc cct gag ttg gag ctc caa 864

Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln

275 280 285

gtg ctt ggt ccc cag tca tca gct cct ggt tct gct tct ggt tct ggt 912

Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

290 295 300

ggt tca gca tca gca cca act ttg ttt cca ctt gtc tca tgt gag aac 960

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

305 310 315 320

tcg cca tcg gat acc tcg agc gta gcg gtc gga tgt ctc gct caa gac 1008

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

325 330 335

ttt ctt ccg gac agc atc acg ttt tca tgg aag tat aag aac aat tcg 1056

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

340 345 350

gat att tcg agc acg cga gga ttt ccc agc gta ttg aga ggg gga aag 1104

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

355 360 365

tac gcg gca aca agc cag gtg ctg ctc cca agc aag gat gtg atg cag 1152

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

370 375 380

ggc act gac gag cat gta gta tgc aag gta cag cac ccc aat gga aac 1200

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

385 390 395 400

aag gaa aag aat gtc cct ctg cct gta att gcc gag ctc cct cct aaa 1248

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

405 410 415

gtg tca gtg ttc gtg ccg ccc aga gat ggg ttc ttt gga aac ccg cga 1296

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

420 425 430

tcg aag tcg aaa ctg atc tgc cag gcc acg gga ttc agc cct cgg cag 1344

Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln

435 440 445

att caa gtg tcg tgg ttg cgg gag gga aaa cag gtg gga tcg ggg gtg 1392

Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val

450 455 460

acc aca gac cag gtg cag gcg gag gct aaa gaa agc ggt ccc acc aca 1440

Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr

465 470 475 480

tat aag gtc act tcc acc ctt act att aag gaa tcg gat tgg ttg tca 1488

Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser

485 490 495

cag tcg atg ttc aca tgt aga gtc gat cat cgc gga ctc acg ttt caa 1536

Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln

500 505 510

cag aac gcg tca tca atg tgt gta ccc gat caa gat acg gcg atc aga 1584

Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg

515 520 525

gta ttc gcc att ccg cct agc ttc gca tcc att ttt ctc acc aaa agc 1632

Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser

530 535 540

aca aag ctg aca tgt ctt gtg aca gac ctc aca acg tac gat tca gtc 1680

Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val

545 550 555 560

aca att tca tgg acc agg cag aat ggg gag gcg gta aag acg cac acc 1728

Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr

565 570 575

aac att tcg gaa agc cat ccc aac gcc acg ttt tcg gcg gtc ggg gag 1776

Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu

580 585 590

gca tcg att tgt gag gac gat tgg aat tca ggg gag cgc ttc aca tgc 1824

Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys

595 600 605

acg gtc act cac acg gat ctc cca tcc ccg ttg aag cag aca atc tcg 1872

Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser

610 615 620

cga ccc aaa ggt gtc gca ctg cac agg ccc gac gtc tac ctc ctg cct 1920

Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro

625 630 635 640

cct gcc agg gaa cag ctc aac ctc cgg gaa tca gca acg atc acg tgt 1968

Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys

645 650 655

ctt gta acc ggg ttt tca ccg gct gac gtc ttt gtc caa tgg atg cag 2016

Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln

660 665 670

cgg gga caa ccc ttg tca cca gag aag tat gtg aca tca gcg ccc atg 2064

Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met

675 680 685

ccc gag cca cag gct ccg ggt agg tat ttt gcc cat tcc atc ctc act 2112

Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr

690 695 700

gtg tcc gag gaa gag tgg aac acc ggc gaa acg tac acg tgc gtc gta 2160

Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val

705 710 715 720

gca cac gaa gcg ttg ccc aat aga gtg act gag aga act gta gat aag 2208

Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys

725 730 735

tcc act gag ggc gaa gta agc gcg gat gaa gaa ggt ttc gaa aac ttg 2256

Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu

740 745 750

tgg gct aca gcg agc acg ttt atc gtg ttg ttc ttg ctt tca ctc ttc 2304

Trp Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe

755 760 765

tac tcc aca act gta acc ctg ttc aag gtc aag tag 2340

Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

770 775

<210> 8

<211> 779

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala

20 25 30

Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn

35 40 45

Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr

50 55 60

Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr

65 70 75 80

Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln

85 90 95

Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn

100 105 110

Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu

115 120 125

Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn

130 135 140

Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser

145 150 155 160

Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His

165 170 175

Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile

180 185 190

Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser

195 200 205

Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn

210 215 220

Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val

225 230 235 240

Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile

245 250 255

Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala

260 265 270

Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln

275 280 285

Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

305 310 315 320

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

325 330 335

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

340 345 350

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

355 360 365

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

370 375 380

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

385 390 395 400

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

405 410 415

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

420 425 430

Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln

435 440 445

Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val

450 455 460

Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr

465 470 475 480

Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser

485 490 495

Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln

500 505 510

Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg

515 520 525

Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser

530 535 540

Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val

545 550 555 560

Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr

565 570 575

Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu

580 585 590

Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys

595 600 605

Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser

610 615 620

Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro

625 630 635 640

Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys

645 650 655

Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln

660 665 670

Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met

675 680 685

Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr

690 695 700

Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val

705 710 715 720

Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys

725 730 735

Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu

740 745 750

Trp Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe

755 760 765

Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

770 775

<210> 9

<211> 2259

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: FcгаммаR1-IgAB

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(2259)

<400> 9

atg att ctt acc agc ttt gga gat gac atg tgg ctt cta aca act ctg 48

Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

cta ctt tgg gtt cca gtc ggt ggg gaa gtg gtt aat gcc acc aag gct 96

Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala

20 25 30

gtg atc acc ttg cag cct cca tgg gtc agt att ttc cag aag gaa aat 144

Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn

35 40 45

gtc act tta tgg tgt gag ggg cct cac ctg cct gga gac agt tcc aca 192

Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr

50 55 60

caa tgg ttt atc aac gga aca gcc gtt cag atc tcc acg cct agt tat 240

Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr

65 70 75 80

agc atc cca gag gcc agt ttt cag gac agt ggc gaa tac agg tgt cag 288

Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln

85 90 95

ata ggt tcc tca atg cca agt gac cct gtg cag ttg caa atc cac aat 336

Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn

100 105 110

gat tgg ctg cta ctc cag gcc tcc cgc aga gtc ctc aca gaa gga gaa 384

Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu

115 120 125

ccc ctg gcc ttg agg tgt cac gga tgg aag aat aaa ctg gtg tac aat 432

Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn

130 135 140

gtg gtt ttc tat aga aat gga aaa tcc ttt cag ttt tct tca gat tcg 480

Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser

145 150 155 160

gag gtc gcc att ctg aaa acc aac ctg agt cac agc ggc atc tac cac 528

Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His

165 170 175

tgc tca ggc acg gga aga cac cgc tac aca tct gca gga gtg tcc atc 576

Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile

180 185 190

acg gtg aaa gag ctg ttt acc acg cca gtg ctg aga gca tcc gtg tca 624

Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser

195 200 205

tct ccc ttc ccg gag ggg agt ctg gtc acc ctg aac tgt gag acg aat 672

Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn

210 215 220

ttg ctc ctg cag aga ccc ggc tta cag ctt cac ttc tcc ttc tac gtg 720

Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val

225 230 235 240

ggc agc aag atc ctg gag tac agg aac aca tcc tca gag tac cat ata 768

Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile

245 250 255

gca agg gcg gaa aga gaa gat gct gga ttc tac tgg tgt gag gta gcc 816

Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala

260 265 270

acg gag gac agc agt gtc ctt aag cgc agc cct gag ttg gag ctc caa 864

Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln

275 280 285

gtg ctt ggt ccc cag tca tca gct cct ggt tct gct tcg ggc tca gga 912

Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

290 295 300

ctg tgg atg cat aag gtg cct gca tcg ctc atg gtg agc ctg ggc gaa 960

Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu

305 310 315 320

gat gca cat ttt cag tgt ccc cat aac agc tcc aac aac gcg aac gtg 1008

Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val

325 330 335

acc tgg tgg cgg gtg ctc cat ggc aat tac acc tgg ccg cct gaa ttt 1056

Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe

340 345 350

ctc gga ccg gga gag gac ccg aat ggg acc ctt atc atc cag aac gtg 1104

Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val

355 360 365

aat aag tcc cac gga gga atc tac gtc tgc cgc gtg caa gag gga aat 1152

Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn

370 375 380

gag agc tac caa cag tca tgc gga acg tac ctc cgc gtc cgg cag cca 1200

Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro

385 390 395 400

cca ccg agg ccg ttc ctc gat atg gga gag gga act aag aac cgg atc 1248

Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile

405 410 415

att acc gcc gaa ggc atc atc ctc ctc ttc tgc gcc gtc gtg ccg ggg 1296

Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly

420 425 430

act ctg ctt ctg ttc cgg aaa agg tgg caa aac gaa aag ctg ggt ctg 1344

Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu

435 440 445

gac gct ggg gac gaa tac gag gat gaa aac ttg tac gag ggc ctg aat 1392

Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn

450 455 460

ctg gac gat tgc tcg atg tat gag gac att agc aga gga ctg cag ggt 1440

Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly

465 470 475 480

acc tac caa gac gtg gga agc ctg aac atc ggg gat gtg cag ctc gag 1488

Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu

485 490 495

aaa cca agg aaa aga aga gct agc gaa gga cgc gga tca ctg ctt act 1536

Lys Pro Arg Lys Arg Arg Ala Ser Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

500 505 510

tgc ggc gat gtc gaa gaa aat ccc gga cca atg gcc aga ttg gcg ctg 1584

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Leu Ala Leu

515 520 525

tcg ccg gtc cct tcg cac tgg atg gtg gcc ctg ctg ctc ttg ctt tcg 1632

Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser

530 535 540

gcg gct gag ccg gtg cca gcg gct aga tcg gag gac cgc tac aga aat 1680

Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn

545 550 555 560

ccg aag ggt tcc gct tgc tca cgc atc tgg caa tca cca cgc ttc atc 1728

Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile

565 570 575

gcg cgc aaa cgc ggc ttc act gtc aag atg cac tgc tat atg aac tcg 1776

Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser

580 585 590

gcc agc ggg aat gtg tcg tgg ctg tgg aag cag gaa atg gac gag aat 1824

Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn

595 600 605

ccg cag caa ctg aaa ctg gag aag ggc cgg atg gaa gaa tcc cag aat 1872

Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn

610 615 620

gag tcg ctg gcc acc ctt act atc caa ggt atc cgg ttt gaa gat aac 1920

Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn

625 630 635 640

ggg atc tac ttc tgt caa cag aag tgt aac aac act tca gag gtg tac 1968

Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr

645 650 655

cag gga tgc ggc acc gaa ctc cgc gtc atg gga ttc tcc acc ctc gcc 2016

Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala

660 665 670

caa ctg aag cag cgc aac acg ctg aag gac ggc atc att atg atc cag 2064

Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile Ile Met Ile Gln

675 680 685

acc ctg ctg atc atc ctg ttc atc att gtg ccg atc ttt ctg ctc ttg 2112

Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu

690 695 700

gat aag gac gac tcg aaa gcc gga atg gaa gag gac cac acg tac gaa 2160

Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr Glu

705 710 715 720

ggt ctg gac atc gac caa act gcg act tac gag gac att gtg acc ctc 2208

Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr Leu

725 730 735

cgg act ggc gaa gtc aag tgg tcc gtg ggt gaa cac cct gga cag gaa 2256

Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln Glu

740 745 750

tag 2259

<210> 10

<211> 752

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala

20 25 30

Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn

35 40 45

Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr

50 55 60

Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr

65 70 75 80

Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln

85 90 95

Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn

100 105 110

Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu

115 120 125

Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn

130 135 140

Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser

145 150 155 160

Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His

165 170 175

Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile

180 185 190

Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser

195 200 205

Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn

210 215 220

Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val

225 230 235 240

Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile

245 250 255

Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala

260 265 270

Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln

275 280 285

Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

290 295 300

Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu

305 310 315 320

Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val

325 330 335

Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe

340 345 350

Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val

355 360 365

Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn

370 375 380

Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro

385 390 395 400

Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile

405 410 415

Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly

420 425 430

Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu

435 440 445

Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn

450 455 460

Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly

465 470 475 480

Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu

485 490 495

Lys Pro Arg Lys Arg Arg Ala Ser Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

500 505 510

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Leu Ala Leu

515 520 525

Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser

530 535 540

Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn

545 550 555 560

Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile

565 570 575

Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser

580 585 590

Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn

595 600 605

Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn

610 615 620

Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn

625 630 635 640

Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr

645 650 655

Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala

660 665 670

Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile Ile Met Ile Gln

675 680 685

Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu

690 695 700

Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr Glu

705 710 715 720

Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr Leu

725 730 735

Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln Glu

740 745 750

<210> 11

<211> 1335

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: FcгаммаR1-CD3Z

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(1335)

<400> 11

atg aag tgg aag gcg ctt ttc acc gcg gcc atc ctg cag gca cag ttg 48

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

ccg att aca gag gca gaa gtg gtt aat gcc acc aag gct gtg atc acc 96

Pro Ile Thr Glu Ala Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala Val Ile Thr

20 25 30

ttg cag cct cca tgg gtc agt att ttc cag aag gaa aat gtc act tta 144

Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn Val Thr Leu

35 40 45

tgg tgt gag ggg cct cac ctg cct gga gac agt tcc aca caa tgg ttt 192

Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr Gln Trp Phe

50 55 60

atc aac gga aca gcc gtt cag atc tcc acg cct agt tat agc atc cca 240

Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr Ser Ile Pro

65 70 75 80

gag gcc agt ttt cag gac agt ggc gaa tac agg tgt cag ata ggt tcc 288

Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ile Gly Ser

85 90 95

tca atg cca agt gac cct gtg cag ttg caa atc cac aat gat tgg ctg 336

Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn Asp Trp Leu

100 105 110

cta ctc cag gcc tcc cgc aga gtc ctc aca gaa gga gaa ccc ctg gcc 384

Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala

115 120 125

ttg agg tgt cac gga tgg aag aat aaa ctg gtg tac aat gtg gtt ttc 432

Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn Val Val Phe

130 135 140

tat aga aat gga aaa tcc ttt cag ttt tct tca gat tcg gag gtc gcc 480

Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser Glu Val Ala

145 150 155 160

att ctg aaa acc aac ctg agt cac agc ggc atc tac cac tgc tca ggc 528

Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His Cys Ser Gly

165 170 175

acg gga aga cac cgc tac aca tct gca gga gtg tcc atc acg gtg aaa 576

Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile Thr Val Lys

180 185 190

gag ctg ttt acc acg cca gtg ctg aga gca tcc gtg tca tct ccc ttc 624

Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser Ser Pro Phe

195 200 205

ccg gag ggg agt ctg gtc acc ctg aac tgt gag acg aat ttg ctc ctg 672

Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn Leu Leu Leu

210 215 220

cag aga ccc ggc tta cag ctt cac ttc tcc ttc tac gtg ggc agc aag 720

Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val Gly Ser Lys

225 230 235 240

atc ctg gag tac agg aac aca tcc tca gag tac cat ata gca agg gcg 768

Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile Ala Arg Ala

245 250 255

gaa aga gaa gat gct gga ttc tac tgg tgt gag gta gcc acg gag gac 816

Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala Thr Glu Asp

260 265 270

agc agt gtc ctt aag cgc agc cct gag ttg gag ctc caa gtg ctt ggt 864

Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly

275 280 285

ccc cag tca tca gct cct ggt tct gct tct ggt tct ggt cag agc ttt 912

Pro Gln Ser Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Phe

290 295 300

ggc ctg ctg gat ccc aaa ctc tgc tac ctg ctg gat gga atc ctc ttc 960

Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe

305 310 315 320

atc tat ggt gtc att ctc act gcc ttg ttc ctg aga gtg aag ttc agc 1008

Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser

325 330 335

agg agc gca gac gcc ccc gcg tac cag cag ggc cag aac cag ctc tat 1056

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

340 345 350

aac gag ctc aat cta gga cga aga gag gag tac gat gtt ttg gac aag 1104

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

355 360 365

aga cgt ggc cgg gac cct gag atg ggg gga aag ccg cag aga agg aag 1152

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys

370 375 380

aac cct cag gaa ggc ctg tac aat gaa ctg cag aaa gat aag atg gcg 1200

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

385 390 395 400

gag gcc tac agt gag att ggg atg aaa ggc gag cgc cgg agg ggc aag 1248

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

405 410 415

ggg cac gat ggc ctt tac cag ggt ctc agt aca gcc acc aag gac acc 1296

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

420 425 430

tac gac gcc ctt cac atg cag gcc ctg ccc cct cgc taa 1335

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435 440

<210> 12

<211> 444

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala Val Ile Thr

20 25 30

Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn Val Thr Leu

35 40 45

Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr Gln Trp Phe

50 55 60

Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr Ser Ile Pro

65 70 75 80

Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ile Gly Ser

85 90 95

Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn Asp Trp Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala

115 120 125

Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn Val Val Phe

130 135 140

Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser Glu Val Ala

145 150 155 160

Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His Cys Ser Gly

165 170 175

Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile Thr Val Lys

180 185 190

Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser Ser Pro Phe

195 200 205

Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn Leu Leu Leu

210 215 220

Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val Gly Ser Lys

225 230 235 240

Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile Ala Arg Ala

245 250 255

Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala Thr Glu Asp

260 265 270

Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly

275 280 285

Pro Gln Ser Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Phe

290 295 300

Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe

305 310 315 320

Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser

325 330 335

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

340 345 350

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

355 360 365

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys

370 375 380

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

385 390 395 400

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

405 410 415

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

420 425 430

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435 440

<210> 13

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: FcгаммаR1-IgE

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(1848)

<400> 13

cat atg gaa gtg gtt aat gcc acc aag gct gtg atc acc ttg cag cct 48

His Met Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro

1 5 10 15

cca tgg gtc agt att ttc cag aag gaa aat gtc act tta tgg tgt gag 96

Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn Val Thr Leu Trp Cys Glu

20 25 30

ggg cct cac ctg cct gga gac agt tcc aca caa tgg ttt atc aac gga 144

Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr Gln Trp Phe Ile Asn Gly

35 40 45

aca gcc gtt cag atc tcc acg cct agt tat agc atc cca gag gcc agt 192

Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr Ser Ile Pro Glu Ala Ser

50 55 60

ttt cag gac agt ggc gaa tac agg tgt cag ata ggt tcc tca atg cca 240

Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ile Gly Ser Ser Met Pro

65 70 75 80

agt gac cct gtg cag ttg caa atc cac aat gat tgg ctg cta ctc cag 288

Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn Asp Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

gcc tcc cgc aga gtc ctc aca gaa gga gaa ccc ctg gcc ttg agg tgt 336

Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys

100 105 110

cac gga tgg aag aat aaa ctg gtg tac aat gtg gtt ttc tat aga aat 384

His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn Val Val Phe Tyr Arg Asn

115 120 125

gga aaa tcc ttt cag ttt tct tca gat tcg gag gtc gcc att ctg aaa 432

Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser Glu Val Ala Ile Leu Lys

130 135 140

acc aac ctg agt cac agc ggc atc tac cac tgc tca ggc acg gga aga 480

Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His Cys Ser Gly Thr Gly Arg

145 150 155 160

cac cgc tac aca tct gca gga gtg tcc atc acg gtg aaa gag ctg ttt 528

His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile Thr Val Lys Glu Leu Phe

165 170 175

acc acg cca gtg ctg aga gca tcc gtg tca tct ccc ttc ccg gag ggg 576

Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser Ser Pro Phe Pro Glu Gly

180 185 190

agt ctg gtc acc ctg aac tgt gag acg aat ttg ctc ctg cag aga ccc 624

Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn Leu Leu Leu Gln Arg Pro

195 200 205

ggc tta cag ctt cac ttc tcc ttc tac gtg ggc agc aag atc ctg gag 672

Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val Gly Ser Lys Ile Leu Glu

210 215 220

tac agg aac aca tcc tca gag tac cat ata gca agg gcg gaa aga gaa 720

Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile Ala Arg Ala Glu Arg Glu

225 230 235 240

gat gct gga ttc tac tgg tgt gag gta gcc acg gag gac agc agt gtc 768

Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala Thr Glu Asp Ser Ser Val

245 250 255

ctt aag cgc agc cct gag ttg gag ctc caa gtg ctt ggt ccc cag tca 816

Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Pro Gln Ser

260 265 270

tca gct cct ggt tct gct tct ggt tct ggt gtt cga cca gtt aac atc 864

Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Pro Val Asn Ile

275 280 285

acc gag ccc aca ctg gaa ctg ctg cac agc agc tgc gac ccc aac gcc 912

Thr Glu Pro Thr Leu Glu Leu Leu His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala

290 295 300

ttc cac agc acc atc cag ctg tat tgc ttc atc tac ggc cac atc ctg 960

Phe His Ser Thr Ile Gln Leu Tyr Cys Phe Ile Tyr Gly His Ile Leu

305 310 315 320

aac gac gtg tcc gtg tcc tgg ctg atg gac gac aga gag atc acc gac 1008

Asn Asp Val Ser Val Ser Trp Leu Met Asp Asp Arg Glu Ile Thr Asp

325 330 335

acc ctg gcc cag acc gtg ctg atc aaa gag gaa ggc aag ctg gcc tct 1056

Thr Leu Ala Gln Thr Val Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser

340 345 350

acc tgc agc aag ctg aat atc aca gag cag cag tgg atg agc gag agc 1104

Thr Cys Ser Lys Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser

355 360 365

acc ttc acc tgt aaa gtg acc tcc cag ggc gtg gac tac ctg gcc cac 1152

Thr Phe Thr Cys Lys Val Thr Ser Gln Gly Val Asp Tyr Leu Ala His

370 375 380

acc aga aga tgc ccc gac cac gaa ccc aga ggc gtg atc acc tac ctg 1200

Thr Arg Arg Cys Pro Asp His Glu Pro Arg Gly Val Ile Thr Tyr Leu

385 390 395 400

atc ccc cct agc ccc ctg gac ctg tac cag aac ggc gct cct aag ctg 1248

Ile Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Pro Lys Leu

405 410 415

acc tgc ctg gtg gtg gac ctg gaa agc gag aag aac gtg aac gtg aca 1296

Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Glu Ser Glu Lys Asn Val Asn Val Thr

420 425 430

tgg aac cag gaa aag aaa acc agc gtg tcc gcc agc cag tgg tac acc 1344

Trp Asn Gln Glu Lys Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser Gln Trp Tyr Thr

435 440 445

aag cac cac aac aac gcc acc acc tcc atc acc agc atc ctg ccc gtg 1392

Lys His His Asn Asn Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile Leu Pro Val

450 455 460

gtg gcc aag gac tgg atc gag ggc tac ggc tac cag tgc atc gtg gac 1440

Val Ala Lys Asp Trp Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Gln Cys Ile Val Asp

465 470 475 480

cac ccc gac ttc cct aag ccc atc gtg cgg agc atc acc aag acc cct 1488

His Pro Asp Phe Pro Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Thr Pro

485 490 495

ggc cag aga tct gcc ccc gag gtg tac gtg ttc ccc cca cct gag gaa 1536

Gly Gln Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr Val Phe Pro Pro Pro Glu Glu

500 505 510

gag tcc gag gac aag aga acc ctg acc tgt ctg atc cag aac ttc ttc 1584

Glu Ser Glu Asp Lys Arg Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe

515 520 525

cca gag gac atc agc gtg cag tgg ctg ggc gac ggc aag ctg atc tcc 1632

Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu Ile Ser

530 535 540

aac agc cag cac agc aca acc acc cct ctg aag tcc aac ggc agc aac 1680

Asn Ser Gln His Ser Thr Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn Gly Ser Asn

545 550 555 560

cag ggc ttc ttc atc ttc agc aga ctg gaa gtg gcc aag acc ctg tgg 1728

Gln Gly Phe Phe Ile Phe Ser Arg Leu Glu Val Ala Lys Thr Leu Trp

565 570 575

acc cag aga aag cag ttt aca tgc caa gtg atc cat gag gcc ctg cag 1776

Thr Gln Arg Lys Gln Phe Thr Cys Gln Val Ile His Glu Ala Leu Gln

580 585 590

aag ccc aga aag ctg gaa aag acc atc agc acc agc ctg ggc aac acc 1824

Lys Pro Arg Lys Leu Glu Lys Thr Ile Ser Thr Ser Leu Gly Asn Thr

595 600 605

tcc ctg cgc cct agt tag ctc gag 1848

Ser Leu Arg Pro Ser Leu Glu

610 615

<210> 14

<211> 613

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

His Met Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro

1 5 10 15

Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn Val Thr Leu Trp Cys Glu

20 25 30

Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr Gln Trp Phe Ile Asn Gly

35 40 45

Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr Ser Ile Pro Glu Ala Ser

50 55 60

Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ile Gly Ser Ser Met Pro

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn Asp Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys

100 105 110

His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn Val Val Phe Tyr Arg Asn

115 120 125

Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser Glu Val Ala Ile Leu Lys

130 135 140

Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His Cys Ser Gly Thr Gly Arg

145 150 155 160

His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile Thr Val Lys Glu Leu Phe

165 170 175

Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser Ser Pro Phe Pro Glu Gly

180 185 190

Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn Leu Leu Leu Gln Arg Pro

195 200 205

Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val Gly Ser Lys Ile Leu Glu

210 215 220

Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile Ala Arg Ala Glu Arg Glu

225 230 235 240

Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala Thr Glu Asp Ser Ser Val

245 250 255

Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Pro Gln Ser

260 265 270

Ser Ala Pro Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Pro Val Asn Ile

275 280 285

Thr Glu Pro Thr Leu Glu Leu Leu His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala

290 295 300

Phe His Ser Thr Ile Gln Leu Tyr Cys Phe Ile Tyr Gly His Ile Leu

305 310 315 320

Asn Asp Val Ser Val Ser Trp Leu Met Asp Asp Arg Glu Ile Thr Asp

325 330 335

Thr Leu Ala Gln Thr Val Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser

340 345 350

Thr Cys Ser Lys Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser

355 360 365

Thr Phe Thr Cys Lys Val Thr Ser Gln Gly Val Asp Tyr Leu Ala His

370 375 380

Thr Arg Arg Cys Pro Asp His Glu Pro Arg Gly Val Ile Thr Tyr Leu

385 390 395 400

Ile Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Pro Lys Leu

405 410 415

Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Glu Ser Glu Lys Asn Val Asn Val Thr

420 425 430

Trp Asn Gln Glu Lys Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser Gln Trp Tyr Thr

435 440 445

Lys His His Asn Asn Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile Leu Pro Val

450 455 460

Val Ala Lys Asp Trp Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Gln Cys Ile Val Asp

465 470 475 480

His Pro Asp Phe Pro Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Thr Pro

485 490 495

Gly Gln Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr Val Phe Pro Pro Pro Glu Glu

500 505 510

Glu Ser Glu Asp Lys Arg Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe

515 520 525

Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu Ile Ser

530 535 540

Asn Ser Gln His Ser Thr Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn Gly Ser Asn

545 550 555 560

Gln Gly Phe Phe Ile Phe Ser Arg Leu Glu Val Ala Lys Thr Leu Trp

565 570 575

Thr Gln Arg Lys Gln Phe Thr Cys Gln Val Ile His Glu Ala Leu Gln

580 585 590

Lys Pro Arg Lys Leu Glu Lys Thr Ile Ser Thr Ser Leu Gly Asn Thr

595 600 605

Ser Leu Arg Pro Ser

610

<210> 15

<211> 1449

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: BBP-IgE

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(1449)

<400> 15

cat atg act tac aag ctg gtg atc aac ggt aaa acc ttg aag ggt gag 48

His Met Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu

1 5 10 15

acc acc act gag gca gtc gac gcc gcc act gcc gag aag gtc ttt aaa 96

Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys

20 25 30

cag tat gcc aat gat aac ggc gtg gac ggc gag tgg acc tac gat gac 144

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp

35 40 45

gcc act aag aca ttc act gtg act gaa aag ccc gag gtg att gac gcg 192

Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala

50 55 60

tcc gaa ttg aca cct gcg gtg acc acc tac aaa ctg gtt atc aac ggc 240

Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly

65 70 75 80

aag act ctg aag ggc gag acc acc aca gag gca gtc gat gcc gcc acc 288

Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr

85 90 95

gcc gag aag gtc ttc aag caa tat gcc aac gac aac ggg gtg gac ggg 336

Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

100 105 110

gag tgg acc tac gat gat gcc acc aag acc ttc acc gtg acc gag aag 384

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys

115 120 125

ccc gaa gtg atc gat gcg agt gaa ctg act ccc gcc gtg aca ggt tct 432

Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Gly Ser

130 135 140

gct tct ggt tct ggt gtt cga cca gtt aac atc acc gag ccc aca ctg 480

Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Pro Val Asn Ile Thr Glu Pro Thr Leu

145 150 155 160

gaa ctg ctg cac agc agc tgc gac ccc aac gcc ttc cac agc acc atc 528

Glu Leu Leu His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala Phe His Ser Thr Ile

165 170 175

cag ctg tat tgc ttc atc tac ggc cac atc ctg aac gac gtg tcc gtg 576

Gln Leu Tyr Cys Phe Ile Tyr Gly His Ile Leu Asn Asp Val Ser Val

180 185 190

tcc tgg ctg atg gac gac aga gag atc acc gac acc ctg gcc cag acc 624

Ser Trp Leu Met Asp Asp Arg Glu Ile Thr Asp Thr Leu Ala Gln Thr

195 200 205

gtg ctg atc aaa gag gaa ggc aag ctg gcc tct acc tgc agc aag ctg 672

Val Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser Thr Cys Ser Lys Leu

210 215 220

aat atc aca gag cag cag tgg atg agc gag agc acc ttc acc tgt aaa 720

Asn Ile Thr Glu Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser Thr Phe Thr Cys Lys

225 230 235 240

gtg acc tcc cag ggc gtg gac tac ctg gcc cac acc aga aga tgc ccc 768

Val Thr Ser Gln Gly Val Asp Tyr Leu Ala His Thr Arg Arg Cys Pro

245 250 255

gac cac gaa ccc aga ggc gtg atc acc tac ctg atc ccc cct agc ccc 816

Asp His Glu Pro Arg Gly Val Ile Thr Tyr Leu Ile Pro Pro Ser Pro

260 265 270

ctg gac ctg tac cag aac ggc gct cct aag ctg acc tgc ctg gtg gtg 864

Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Pro Lys Leu Thr Cys Leu Val Val

275 280 285

gac ctg gaa agc gag aag aac gtg aac gtg aca tgg aac cag gaa aag 912

Asp Leu Glu Ser Glu Lys Asn Val Asn Val Thr Trp Asn Gln Glu Lys

290 295 300

aaa acc agc gtg tcc gcc agc cag tgg tac acc aag cac cac aac aac 960

Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser Gln Trp Tyr Thr Lys His His Asn Asn

305 310 315 320

gcc acc acc tcc atc acc agc atc ctg ccc gtg gtg gcc aag gac tgg 1008

Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile Leu Pro Val Val Ala Lys Asp Trp

325 330 335

atc gag ggc tac ggc tac cag tgc atc gtg gac cac ccc gac ttc cct 1056

Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Gln Cys Ile Val Asp His Pro Asp Phe Pro

340 345 350

aag ccc atc gtg cgg agc atc acc aag acc cct ggc cag aga tct gcc 1104

Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Thr Pro Gly Gln Arg Ser Ala

355 360 365

ccc gag gtg tac gtg ttc ccc cca cct gag gaa gag tcc gag gac aag 1152

Pro Glu Val Tyr Val Phe Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser Glu Asp Lys

370 375 380

aga acc ctg acc tgt ctg atc cag aac ttc ttc cca gag gac atc agc 1200

Arg Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser

385 390 395 400

gtg cag tgg ctg ggc gac ggc aag ctg atc tcc aac agc cag cac agc 1248

Val Gln Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu Ile Ser Asn Ser Gln His Ser

405 410 415

aca acc acc cct ctg aag tcc aac ggc agc aac cag ggc ttc ttc atc 1296

Thr Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn Gly Ser Asn Gln Gly Phe Phe Ile

420 425 430

ttc agc aga ctg gaa gtg gcc aag acc ctg tgg acc cag aga aag cag 1344

Phe Ser Arg Leu Glu Val Ala Lys Thr Leu Trp Thr Gln Arg Lys Gln

435 440 445

ttt aca tgc caa gtg atc cat gag gcc ctg cag aag ccc aga aag ctg 1392

Phe Thr Cys Gln Val Ile His Glu Ala Leu Gln Lys Pro Arg Lys Leu

450 455 460

gaa aag acc atc agc acc agc ctg ggc aac acc tcc ctg cgc cct agt 1440

Glu Lys Thr Ile Ser Thr Ser Leu Gly Asn Thr Ser Leu Arg Pro Ser

465 470 475 480

tag ctc gag 1449

Leu Glu

<210> 16

<211> 480

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

His Met Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu

1 5 10 15

Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys

20 25 30

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp

35 40 45

Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala

50 55 60

Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly

65 70 75 80

Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr

85 90 95

Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

100 105 110

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys

115 120 125

Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Gly Ser

130 135 140

Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Pro Val Asn Ile Thr Glu Pro Thr Leu

145 150 155 160

Glu Leu Leu His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala Phe His Ser Thr Ile

165 170 175

Gln Leu Tyr Cys Phe Ile Tyr Gly His Ile Leu Asn Asp Val Ser Val

180 185 190

Ser Trp Leu Met Asp Asp Arg Glu Ile Thr Asp Thr Leu Ala Gln Thr

195 200 205

Val Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser Thr Cys Ser Lys Leu

210 215 220

Asn Ile Thr Glu Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser Thr Phe Thr Cys Lys

225 230 235 240

Val Thr Ser Gln Gly Val Asp Tyr Leu Ala His Thr Arg Arg Cys Pro

245 250 255

Asp His Glu Pro Arg Gly Val Ile Thr Tyr Leu Ile Pro Pro Ser Pro

260 265 270

Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Pro Lys Leu Thr Cys Leu Val Val

275 280 285

Asp Leu Glu Ser Glu Lys Asn Val Asn Val Thr Trp Asn Gln Glu Lys

290 295 300

Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser Gln Trp Tyr Thr Lys His His Asn Asn

305 310 315 320

Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile Leu Pro Val Val Ala Lys Asp Trp

325 330 335

Ile Glu Gly Tyr Gly Tyr Gln Cys Ile Val Asp His Pro Asp Phe Pro

340 345 350

Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Thr Pro Gly Gln Arg Ser Ala

355 360 365

Pro Glu Val Tyr Val Phe Pro Pro Pro Glu Glu Glu Ser Glu Asp Lys

370 375 380

Arg Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser

385 390 395 400

Val Gln Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu Ile Ser Asn Ser Gln His Ser

405 410 415

Thr Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn Gly Ser Asn Gln Gly Phe Phe Ile

420 425 430

Phe Ser Arg Leu Glu Val Ala Lys Thr Leu Trp Thr Gln Arg Lys Gln

435 440 445

Phe Thr Cys Gln Val Ile His Glu Ala Leu Gln Lys Pro Arg Lys Leu

450 455 460

Glu Lys Thr Ile Ser Thr Ser Leu Gly Asn Thr Ser Leu Arg Pro Ser

465 470 475 480

<210> 17

<211> 864

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный белок: mSa-CD3Z

<220>

<221> КДП

<222> (1)..(864)

<400> 17

atg aag tgg aaa gcc ctt ttt acc gcc gcc att ctg caa gcg caa ttg 48

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

ccg atc act gaa gcc gca tcg gcc gag gcc ggt atc act gga acc tgg 96

Pro Ile Thr Glu Ala Ala Ser Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp

20 25 30

tac aac cag cac gga tcc aca ttc acc gtg acc gcc ggt gct gac gga 144

Tyr Asn Gln His Gly Ser Thr Phe Thr Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly

35 40 45

aat ctg acc gga cag tac gag aat cgg gct cag ggc acc ggt tgt cag 192

Asn Leu Thr Gly Gln Tyr Glu Asn Arg Ala Gln Gly Thr Gly Cys Gln

50 55 60

aac tcc cct tac acc ctc act ggg aga tac aac ggc acc aag ctg gaa 240

Asn Ser Pro Tyr Thr Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Thr Lys Leu Glu

65 70 75 80

tgg agg gtg gaa tgg aac aac tcc acc gaa aac tgc cat tcc cgc act 288

Trp Arg Val Glu Trp Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys His Ser Arg Thr

85 90 95

gag tgg cgc gga cag tat cag ggg gga gcc gaa gcg cgg atc aac acc 336

Glu Trp Arg Gly Gln Tyr Gln Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr

100 105 110

caa tgg aac ctg acc tac gag ggc ggg agc gga ccc gcg act gag cag 384

Gln Trp Asn Leu Thr Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro Ala Thr Glu Gln

115 120 125

ggc cag gat acg ttc act aag gtc aag ggc agc gca tca ggc tcg gga 432

Gly Gln Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

130 135 140

cag agc ttt ggc ctg ctg gat ccc aaa ctc tgc tac ctg ctg gat gga 480

Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly

145 150 155 160

atc ctc ttc atc tat ggt gtc att ctc act gcc ttg ttc ctg aga gtg 528

Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val

165 170 175

aag ttc agc agg agc gca gac gcc ccc gcg tac cag cag ggc cag aac 576

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

180 185 190

cag ctc tat aac gag ctc aat cta gga cga aga gag gag tac gat gtt 624

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

195 200 205

ttg gac aag aga cgt ggc cgg gac cct gag atg ggg gga aag ccg cag 672

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln

210 215 220

aga agg aag aac cct cag gaa ggc ctg tac aat gaa ctg cag aaa gat 720

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

225 230 235 240

aag atg gcg gag gcc tac agt gag att ggg atg aaa ggc gag cgc cgg 768

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

245 250 255

agg ggc aag ggg cac gat ggc ctt tac cag ggt ctc agt aca gcc acc 816

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

260 265 270

aag gac acc tac gac gcc ctt cac atg cag gcc ctg ccc cct cgc taa 864

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

275 280 285

<210> 18

<211> 287

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Ala Ser Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp

20 25 30

Tyr Asn Gln His Gly Ser Thr Phe Thr Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly

35 40 45

Asn Leu Thr Gly Gln Tyr Glu Asn Arg Ala Gln Gly Thr Gly Cys Gln

50 55 60

Asn Ser Pro Tyr Thr Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Thr Lys Leu Glu

65 70 75 80

Trp Arg Val Glu Trp Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys His Ser Arg Thr

85 90 95

Glu Trp Arg Gly Gln Tyr Gln Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr

100 105 110

Gln Trp Asn Leu Thr Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro Ala Thr Glu Gln

115 120 125

Gly Gln Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

130 135 140

Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly

145 150 155 160

Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val

165 170 175

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

180 185 190

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

195 200 205

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln

210 215 220

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

225 230 235 240

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

245 250 255

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

260 265 270

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

275 280 285

<210> 19

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 19

Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly

1 5

<---

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен биосенсор и система для быстрого обнаружения определяемых компонентов, а также способ получения указанной системы и способ обнаружения определяемого компонента. Биосенсор и система содержат полученную из клеточного компонента иммунной системы млекопитающих живую генно-модифицированную биосенсорную клетку, встроенный внутрь и экспрессируемый указанной клеткой репортерный белок, путь передачи сигнала и множество не являющихся антителами и передающих сигнал элементов. Система дополнительно включает по меньшей мере один тип детекторной молекулы, по меньшей мере один определяемый компонент. Способ получения указанной системы включает трансфекцию или трансформацию иммуноцита одним или несколькими кодирующими репортерный белок, путь передачи сигнала и множество трансмембранных элементов полинуклеотидами вышеуказанной системы. Способ обнаружения определяемого компонента включает приведение содержащего определяемый компонент образца в контакт с вышеуказанной системой и обнаружение определяемого компонента при испускании сигнала репортерным белком. Изобретения обеспечивают обнаружение и идентификацию инфекционных агентов, патогенных микроорганизмов, токсинов и других загрязняющих веществ в реальном времени. 4 н. и 36 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Система быстрого обнаружения определяемых компонентов, содержащая:

(a) живую генно-модифицированную биосенсорную клетку, причем живая генно-модифицированная биосенсорная клетка получена из клеточного компонента иммунной системы млекопитающих;

(b) репортерный белок, причем репортерный белок встроен внутрь и экспрессируется живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой и при этом репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные, заранее заданные цитозольные изменения в живой генно-модифицированной биосенсорной клетке;

(c) путь передачи сигнала, встроенный или естественным образом присутствующий в живой генно-модифицированной биосенсорной клетке, причем путь передачи сигнала контролирует биологический процесс внутри цитозоля живой генно-модифицированной биосенсорной клетки и при этом биологический процесс, когда он происходит, вызывает испускание репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала;

(d) по меньшей мере один тип детекторной молекулы, причем каждая детекторная молекула адаптирована для связывания с конкретным определяемым компонентом;

(e) по меньшей мере один определяемый компонент, причем этот по меньшей мере один определяемый компонент связывается с детекторной молекулой, которая является специфичной в отношении этого определяемого компонента;

(f) множество трансмембранных элементов, передающих сигнал, не являющихся антителами, экспрессируемых живой генно-модифицированной биосенсорной клеткой, причем каждый элемент, передающий сигнал, адаптирован для восприятия детекторной молекулы; и

(g) при этом при связывании достаточного количества определяемых компонентов с достаточным количеством детекторных молекул, которые сами по себе связаны с трансмембранными элементами, передающими сигнал, не являющимися антителами, на поверхности биосенсорной клетки происходит агрегация элементов, передающих сигнал, путь передачи сигнала активируется, происходит биологический процесс и репортерный белок испускает обнаруживаемый сигнал.

2. Система по п. 1, отличающаяся тем, что живая генно-модифицированная клетка получена из В-клетки или Т-клетки, репортерный белок является экворином, путь передачи сигнала включает повышение уровня внутриклеточного кальция, детекторная молекула представляет собой антитело, которое связывается с пищевым патогеном, определяемый компонент является пищевым патогеном, а множество элементов, передающих сигнал, адаптировано для восприятия антитела посредством связывания с участком бактериального белка, связывающегося с IgG.

3. Система по п. 1, отличающаяся тем, что биосенсорная клетка получена из В-клетки или Т-клетки.

4. Система по п. 1, отличающаяся тем, что репортерный белок является экворином, а поддающийся обнаружению сигнал представляет собой вспышку синего света.

5. Система по п. 1, отличающаяся тем, что биологический процесс, контролируемый путем передачи сигнала, дополнительно включает повышение уровня внутриклеточного кальция.

6. Система по п. 1, отличающаяся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, является химерным слитым белком, экспрессируемым биосенсорной клеткой, причем этот химерный белок дополнительно содержит:

(а) по меньшей мере один компонент белка, который адаптирован для связывания с по меньшей мере одним типом детекторной молекулы; а также

(b) по меньшей мере один компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемого на поверхности того типа иммуноцитов, из которого была получена биосенсорная клетка.

7. Система по п. 6, отличающаяся тем, что по меньшей мере один компонент белка, который адаптирован для связывания с по меньшей мере одним типом детекторной молекулы, получен из бактериального белка, связывающегося с антителом.

8. Система по п. 6, отличающаяся тем, что по меньшей мере один компонент белка, который адаптирован для связывания с детекторной молекулой по меньшей мере одного типа, представляет собой домен связывания с антителом, полученный из рецепторного белка FcR или другого рецепторного белка.

9. Система по п. 6, отличающаяся тем, что по меньшей мере один компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемый на поверхности иммуноцита, представляет собой IgM; Igα/β; IgE; CD19; CD3ζ или их комбинации.

10. Система по п. 1, отличающаяся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, кодируется последовательностью ДНК, обладающей по меньшей мере 95 % идентичностью с последовательностью ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 17.

11. Система по п. 1, отличающаяся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, является химерным слитым белком, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 18.

12. Система по п. 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна детекторная молекула представляет собой растворимое антитело.

13. Система по п. 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна детекторная молекула представляет собой растворимый IgG.

14. Система по п. 1, отличающаяся тем, что определяемый компонент является пищевым инфекционным агентом.

15. Система по п. 1, отличающаяся тем, что определяемый компонент представляет собой бактерию или вирус.

16. Система по п. 15, отличающаяся тем, что биосенсорная клетка получена из тучной клетки.

17. Способ обнаружения определяемого компонента, включающий приведение образца, содержащего определяемый компонент, в контакт с системой по п. 1 и обнаружение определяемого компонента при испускании сигнала репортерным белком.

18. Способ получения системы по п. 1, включающий трансфекцию или трансформацию иммуноцита одним или несколькими полинуклеотидами, кодирующими элементы (b), (с) и (f) системы.

19. Биосенсор для быстрого обнаружения определяемых компонентов, содержащий:

(а) живую генно-модифицированную клетку, причем живая генно-модифицированная клетка получена из иммуноцита;

(b) репортерный белок, причем репортерный белок встроен внутрь и экспрессируется иммуноцитом и при этом репортерный белок испускает поддающийся обнаружению сигнал в ответ на определенные, заранее заданные цитозольные изменения в иммуноците;

(c) путь передачи сигнала, встроенный или естественным образом присутствующий внутри иммуноцита, причем путь передачи сигнала контролирует биологический процесс в цитозоле иммуноцита, и при этом биологический процесс, когда он происходит, вызывает испускание репортерным белком поддающегося обнаружению сигнала; а также

(d) множество элементов, не являющихся антителами, передающих сигнал, которые непосредственно связываются с определяемым компонентом в анализируемом образце или которые опосредованно связываются с определяемым компонентом в анализируемом образце через комплекс определяемого компонента и по меньшей мере одного антитела или другой детекторной молекулы, причем связанные элементы, не являющиеся антителами, передающие сигналы, в дальнейшем взаимодействуют с биосенсорной клеткой, чтобы прямо или косвенно активировать путь передачи сигнала.

20. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что дополнительно содержит множество рецепторных молекул по меньшей мере одного определенного типа, экспрессируемых на поверхности генно-модифицированной клетки, причем по меньшей мере один заранее определенный тип рецепторной молекулы взаимодействует с путем передачи сигнала и при этом по меньшей мере один заранее определенный тип рецепторной молекулы связывается с элементами, не являющимися антителами, передающими сигнал.

21. Биосенсор по п. 20, отличающийся тем, что по меньшей мере один заранее определенный тип рецепторных молекул, экспрессируемый на поверхности генно-модифицированной клетки, представляет собой FcεRI.

22. Биосенсор по п. 19, дополнительно содержащий по меньшей мере одно экзогенное антитело или другую детекторную молекулу, адаптированную для взаимодействия с элементами, передающими сигнал, не являющимися антителами, причем по меньшей мере одно экзогенное антитело или другая детекторная молекула также адаптированы для связывания с конкретным определяемым компонентом.

23. Биосенсор по п. 22, отличающийся тем, что по меньшей мере одно экзогенное антитело является растворимым IgG.

24. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что иммуноцит является В-клеткой, Т-клеткой или тучной клеткой.

25. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элементы, не являющиеся антителами, передающие сигнал, экспрессируются генно-модифицированной клеткой в виде трансмембранных химерных слитых белков.

26. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элементы, не являющиеся антителами, передающие сигнал, вырабатываются генно-модифицированной клеткой, а затем выводятся из генно-модифицированной клетки в виде растворимых слитых белков.

27. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что репортерный белок является экворином, а поддающийся обнаружению сигнал представляет собой вспышку синего света.

28. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что биологический процесс, контролируемый путем передачи сигнала, дополнительно включает повышение уровня внутриклеточного кальция.

29. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, представляет собой химерный слитый белок, который содержит:

(а) по меньшей мере один белковый компонент, который адаптирован для связывания с по меньшей мере одним типом детекторной молекулы; и

(b) по меньшей мере один компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемого на поверхности того типа иммуноцитов, из которого получена живая генно-модифицированная клетка.

30. Биосенсор по п. 29, отличающийся тем, что по меньшей мере один белковый компонент, который адаптирован для связывания с детекторной молекулой по меньшей мере одного типа, получен из бактериального белка, связывающегося с антителом.

31. Биосенсор по п. 29, отличающийся тем, что по меньшей мере один компонент белка, который адаптирован для связывания с детекторной молекулой по меньшей мере одного типа, представляет собой домен связывания с антителом, полученный из рецепторного белка FcR или другого рецепторного белка.

32. Биосенсор по п. 29, отличающийся тем, что по меньшей мере один компонент рецепторного комплекса, обычно экспрессируемый на поверхности живой генно-модифицированной клетки, представляет собой IgM; Igα/β; IgE; CD19; CD3ζ или их комбинации.

33. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, кодируется последовательностью ДНК, обладающей по меньшей мере 95 % идентичностью последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 17.

34. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, является химерным слитым белком, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 18.

35. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что каждый элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, представляет собой растворимый химерный слитый белок, который содержит бактериальный домен связывания с IgG, слитый с константным доменом IgE с помощью линкера GSASGSG (SEQ ID NO: 19).

36. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что каждый элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, представляет собой растворимый химерный слитый белок, который содержит домен связывания с антителом FcγRI, слитый с константным доменом IgE с помощью линкера GSASGSG (SEQ ID NO: 19).

37. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, кодируется последовательностью ДНК, обладающей по меньшей мере 95 % идентичностью последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13 и 15.

38. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что элемент, не являющийся антителом, передающий сигнал, является химерным слитым белком, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14 и 16.

39. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что определяемый компонент является пищевым инфекционным агентом.

40. Биосенсор по п. 19, отличающийся тем, что определяемый компонент представляет собой бактерию или вирус.