СПОСОБ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА ПОДКОЖНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА U-87, ПЕРЕВИТОГО ИММУНОДЕФИЦИТНЫМ МЫШАМ NU/J Российский патент 2020 года по МПК A61K38/19 A61K39/395 A61K47/26 A61P21/02 A61P37/04 G09B23/28 C12P21/00 

Изобретение относится к медицине, в частности, к онкологии и молекулярной биологии и может быть использовано для торможения роста подкожного трансплантата экспериментальной перевиваемой культуры клеток глиобластомы человека U-87, перевитого (развивающегося в форме злокачественной опухоли) иммунодефицитным атимусным мышам Nu/J (модельным животным, у которых глиобластома U-87 формирует раковую опухоль), в совокупности являющейся общепринятой модельной системой, используемой для определения подходов для лечения клинических глиобластом человека, основанный на инъекциях активирующего макрофаги фактора GcMAF RF^© (Gc protein-derived Macrophage Activating Factor Related Factor).

Известен способ подавления роста раковой опухоли [1], основанный на использовании фотодинамического воздействия и применении в качестве фотосенсибилизатора сульфированного фталоцианина алюминия, при этом у опухоленосителя берут часть асцитной жидкости, подвергают ее фотодинамическому воздействию in vitro, а затем вводят в организм опухоленосителя.

Способ имеет относительно низкую эффективность, поскольку для анализа эффекта торможения бралась мышиная экспериментальная карцинома Эрлиха, причем, в асцитном ее варианте. Кроме того, в предложенном способе подавления роста опухоли Эрлиха в асцитной форме обработка асцита велась вне организма мышей после забора асцитной жидкости, после чего обработанный асцит реинфузируют в организм мыши. Это также снижает эффективность способа.

Известен также способ торможения роста лимфосаркомы Плисса в эксперименте [2], включающий воздействие на опухоль наночастиц железа, при котором с 6-х суток после перевивки лимфосаркомы Плисса крысам-самцам осуществляют восьмикратное внутрибрюшинное или локально в опухоль введение суспензии наночастиц железа на физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл: на 6, 7, 9, 10, 14, 15, 16 и 17 сутки в разовой дозе 1,25 мг/кг массы животного.

Этот способ имеет относительно узкую область применения, поскольку используется для анализа эффекта торможения опухоли, этиологически отличающейся, в частности, от глиобластомы. Кроме того, использование наночастиц несет потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека, поскольку до конца не изучен механизм действия препаратов наночастиц [3].

Кроме того, известен способ подавления роста опухолей [4] путем внутривенного введения наночастиц с последующим облучением опухоли лазерными импульсами с длиной волны в области интенсивного поглощения наночастиц, при этом, для внутривенного введения используют наночастицы фталоцианинов в дозе не ниже 5 мг/кг веса и не выше максимально переносимой дозы при плотности энергии в импульсе не ниже 0,1 Дж/см² и суммарной плотности энергии не ниже 10 Дж/см².

Этот способ также имеет относительно узкую область применения, поскольку для его эффективного применения требуется определенная «прозрачность» ткани, а, в частности, глиобластомы локализуются в недоступной для светового излучения части человеческого тела - в головном мозге.

Помимо указанных выше известен способ создания биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких Льюиса с продолжительной циклофосфаниндуцированной лейкопенией у мышей [5], характеризующийся тем, что циклофосфан вводят внутрибрюшинно в 1/3 минимальной пирогенной дозы - по 83,3 мг/кг 3-кратно на 6, 12, 18 сутки после перевивки.

Способ имеет относительно низкую область применения поскольку моделирует умеренное торможение роста первичного опухолевого узла и метастазов карциномы легких Льюиса с продолжительной лейкопенией у мышей путем внутрибрюшинного введения циклофосфана и является моделью сравнения для доклинических исследований.

Наиболее близким к предложенному является способ торможения роста опухоли у мышей под воздействием бактериального иммуномодулятора поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4, состоящей из антигенов условно-патогенных микроорганизмов [6].

Способ основан на применении свойств ВП-4, которая является активным стимулятором иммунитета и проявляет тормозящее действие на развивающуюся иммуногенную опухоль. Противоопухолевое действие ВП-4 оценивали по торможению роста пигментной метастазирующей иммуногенной опухоли В16 у мышей (по 20 животных в каждой группе), согласно которому опухолевые клетки меланомы В16 имплантировали мышам подкожно в область подмышечной впадины в количестве 5×10⁵ клеток. Вакцину вводили в дозах 200 и 400 мкг внутрибрюшинно и лечение начинали за 7 дней до имплантации опухоли, одновременно с ней и на 2-й день после имплантации. Визуально определяемые опухолевые узлы оценивали на 10, 15, 22-е сутки после инокуляции. Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Объем считали по формуле V=А × (В)². Торможение роста опухоли (%) вычисляли по формуле (Vk - Vo) × 100% / Vk, где Vk - средний объем опухоли в контрольной группе на определенный срок измерения (мм²); Vo - средний объем опухоли в опытной группе на определенный срок измерения (мм²). В качестве положительного эффекта учитывалось торможение роста опухоли более 50%. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, применяя стандартный пакет статистических программ Windows 2000 (StatSoft 6.0), поскольку данный параметрический критерий обнаруживает наиболее выраженные эффекты. Данные представлены как М±m. Различия считались значимыми при р<0,05

Наиболее близкий к предложенному способ также имеет ограниченность применения, поскольку не обеспечивает эффективное торможение развития глиобластомы и заявлено для торможения роста иммуногенной опухоли, исходно чувствительной к клеткам системы врожденного иммунитета. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для торможения развития глиобластомы.

Задача, решаемая в настоящем изобретении, направлена на расширение арсенала технических средств, которые направлены на торможение развития глиобластомы, в частности, на повышение эффективности торможения роста подкожного трансплантата экспериментальной перевиваемой культуры клеток глиобластомы человека U-87, перевитого (развивающегося в форме злокачественной опухоли) иммунодефицитным мышам Nu/J (модельным животным, у которых глиобластома U-87 формирует раковую опухоль), в совокупности являющейся общепринятой модельной системой используемой для определения подходов для лечения клинических глиобластом человека, основанный на инъекциях активирующего макрофаги фактора GcMAF RF^©.

Требуемый результат, заключается в расширении арсенала технических средств, которые направлены на торможение развития глиобластомы, и, в частности, на повышение эффективности торможения роста подкожного трансплантата экспериментальной перевиваемой культуры клеток глиобластомы человека U-87, перевитого (развивающегося в форме злокачественной опухоли) иммунодефицитным мышам Nu/J (модельным животным, у которых глиобластома U-87 формирует раковую опухоль), в совокупности являющейся общепринятой модельной системой, используемой для определения подходов для лечения клинических глиобластом человека, основанный на инъекциях активирующего макрофаги фактора GcMAF RF^©.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе, основанном на введении мышам препарата, согласно изобретению, мышам с подкожно перевитым графтом U-87 вводят протестированный на первом этапе препарат GcMAF RF^© в дозе 1-2 мкг/мышь ежедневно, чередуя интраперитонеальные и интратуморальные инъекции, в течение 22 дней, при этом предшественник GcMAF молекулы витамин Д₃ связывающий белок (DBP) выделяют из белка плазмы крови человека и конвертируют в GcMAF дегликозилированием с использованием двух ферментов гликозилаз - сиалидазы и β-галактозидазы, и проводят на первом этапе оценку способности GcMAF RF^© активировать адаптивное звено противоракового иммунного ответа, на втором этапе оценивают специфическую противораковую активность обработанных GcMAF RF^© макрофагов, а затем проводят биологический тест на способность тормозить рост экспериментальной глиобластомы человека.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что для оценки активации адаптивного звена противоракового иммунитета оценивается фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мыши с использованием в качестве фагоцитируемой субстанции стандартизованных для определения фагоцитарной активности иммунных клеток круглых металлических частиц (бус) с диаметром 1 мкм.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что дополнительно для оценки активации адаптивного звена противоракового иммунитета оценивается эффективность индукции поляризации человеческих макрофагов в M1 фенотип, состоящей в том, что в культуральную среду для активации и индукции смены поляризации макрофагов добавляют GcMAF RF^© в дозах 50-250 нг/мл.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что дополнительно для оценки активации адаптивного звена противоракового иммунитета оценивается аллостимуляторная активность дендритных клеток человека, состоящая в том, что в культуральную среду для активации аллостимуляторной активности дендритных клеток добавляют GcMAF RF^© в дозах 50-250 нг/мл.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что для оценки специфической, направленной против клеток глиобластомы человека U-87, противораковой активности макрофагов, обработанных протестированным на первом этапе препаратом GcMAF RF^©, проводят МТТ тест на жизнеспособность раковых клеток глиобластомы человека U-87 после 24 часовой инкубации с активированными макрофагами;

В целом, повышение эффективности лечения экспериментальной глиобластомы человека, достигается в изобретении, основанном на использовании активирующего макрофаги фактора GcMAF RF^©, получаемого конвертацией его предшественника витамин Д₃ связывающего белка в фактор MAF специфическим дегликозилированием и проведением на первом этапе оценки способности GcMAF RF^© активировать адаптивное звено противоракового иммунного ответа, и на втором этапе оценки специфической противораковой активности обработанных GcMAF RF^© макрофагов в МТТ тесте и проведения биологического теста на способность выделенного GcMAF RF^© тормозить рост экспериментальной глиобластомы человека.

Ниже приводятся теоретические и экспериментальные данные, подтверждающие, что изобретение отвечает критерию практической (промышленной) применимости.

Изобретение иллюстрируется чертежами.

На фиг. 1а - оценка фагоцитирующей активности перитонеальных макрофагов мыши после индукции GcMAF RF^©. Приведен график, отображающий значения IBN. Приведено среднее значение ± SEM (n=4). Достоверность отличий оценена при помощи критерия Манна-Уитни, *р<0,05.

На фиг. 1б - фотографии перитонеальных макрофагов после активации различными агентами с интернализованными магнитными частицами. 1 - контроль (макрофаги без активации), 2 - активация DBP, 3,4 - активация GcMAF RF^©, видно активное поглощение битцев макрофагами.

На фиг. 2а - оценка прямой цитотоксичности GcMAF RF^© на раковые клетки U87 и MCF-7. На графике представлены средние значения ± SD (n=3). Достоверность относительно контроля оценена при помощи критерия Манна-Уитни, *р<0,05.

На фиг. 2б - оценка опосредованной через перитонеальные макрофаги цитотоксичности GcMAF RF^© на раковые клетки U87 и MCF-7. На графике представлены средние значения ± SD (n=3). Достоверность относительно контроля оценена при помощи критерия Манна-Уитни, *р<0,05.

На фиг. 3 - оценка аллостимуляторной активности дендритных клеток человека после индукции GcMAF RF^© и стандартным активатором ЛПС. Данные представлены в виде ИВ - индекса влияния, отношения стимулированных дендритных клеток к интактным дендритным клеткам. Показатель ИВ выше 1 (черная линия) означает активацию дендритных клеток. Достоверность отличия экспериментальных групп от контроля (аллостимуляторной активности не активированных дендритных клеток) оценена при помощи критерия Манна-Уитни, *р<0,05.

На фиг. 4 - оценка M1 поляризации макрофагов человека под воздействием препарата GcMAF RF^©. Поляризация макрофагов оценена, используя способность к аллостимуляторной активности макрофагов после их поляризации в M1 фенотип. В качестве индукторов созревания использовали ЛПС (стандартный активатор) и GcMAF RF^© (50 и 250 нг/мл). Данные представлены в виде ИВ - индекса влияния, отношения стимулированных макрофагов к интактным. Показатель ИВ выше 1 (черная линия) означает активацию макрофагов. Достоверность результатов оценивали при помощи парного теста Уилкоксона, *р<0,05; **р<0,01.

На фиг. 5а - терапия подкожно перевитого графта человеческой глиобластомы U87 иммуннодефицитным мышам. Приведен график роста U87 графта глиобластомы человека. Стрелками обозначена схема терапии препаратом GcMAF RF^©. На графике отображены значения Median ± SEM (n=4).

На фиг. 5б - график распределения объемов графтов человеческой глиобластомы U87 у иммуннодефицитных мышей в последней точке (39 день с момента начала терапии). Достоверность различий оценена при помощи критерия Манна-Уитни, *р<0,05; **р<0,01.

На фиг. 5в - фотографии мышей из групп контроля и GcMAF RF^© на 39 день с момента начала терапии.

Актуальность данного изобретения подтверждается описанными в современной научной литературе противораковыми свойствами препарата GcMAF.

Ниже приводятся экспериментальные доказательства активации выделенным GcMAF RF^© популяций клеток адаптивного звена противоракового иммунитета и его противораковой активности в системе ех vivo и в биологическом тесте с перевитым графтом глиобластомы человека U-87.

Используемые методики.

Лабораторные животные. Мы использовали 2-3-месячных мышей линий CBA/Lac и Nu/J (самки, 20-25 г), выращенные в SPF виварии Института цитологии и генетики СО РАН (RFMEFI61914X0005 и FMEFI62114X0010). Животных содержали в группах по 5-10 мышей на клетку в стандартных лабораторных условиях (22-26°С, цикл свет/темнота 14/10 ч) со свободным доступом к пище (Ssniff, Германия) и воде. Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Института цитологии и генетики СО РАН.

Опухолевые модели. Клеточная линия глиобластомы человека (U87) была получена из коллекции клеток Института цитологии и генетики СО РАН. Клетки аденокарциномы молочной железы человека (MCF-7) были получены из Института клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово, Новосибирская область, Россия). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 40 мкг/мл сульфата гентамицина при 37°С в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone) в атмосфере 5% CO2 при влажности 70-80%.

Препарат GcMAF RF^© получали из плазмы человеческой крови, полученной от здоровых доноров. Препарат является собственностью компании ООО «MAF-RF». Концентрации белка определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Стоковая концентрация GcMAF RF^© составляла 25 мкг/мл.

Выделение и культивирование перитонеальных макрофагов мыши. Перитонеальные макрофаги собирали из брюшинной полости мышей линии СВА. Макрофаги культивировали в 12-луночных планшетах с плотностью 5×10⁵ клеток/лунка в среде RPMI-1640 (Биолот), содержащей 10% FBS (HyClone) и 40 мкг/мл гентамицина в течение 12 часов. Затем культивируемые клетки трижды промывали PBS для отмывки неадгезивных клеток. Культивируемые макрофаги обрабатывали различными активаторами в течение 3 часов и использовали для анализа на фагоцитоз, как описано ниже.

Анализ фагоцитоза. Анализ на фагоцитоз проводили по протоколу, описанному в работе [7], со следующими изменениями. Перитонеальные макрофаги мыши предварительно обрабатывали бессывороточной средой RPMI-1640 в течение 120 минут перед обработкой активаторами. Затем среду заменяли на нормальную среду RPMI-1640, содержащую 25 мкг/мл GcMAF RF^©, 25 мкг/мл DBP или 10 мкг/мл ЛПС (E. coli 0114:В4, Sigma-Aldrich) или на среду RPMI-1640, содержащую 5% FBS без активатора (контроль). 60 мкг магнитных битцев (Dynabeads М-280, Invitrogen) добавляли в каждую лунку. Неинтернализованные битцы промывали 3 раза 1 мл раствора PBS через 60 минут после добавления активаторов. Макрофаги фотографировали в проходящем свете с использованием инвертированного микроскопа AxioObserver Z1 (Zeiss) и программного обеспечения ZEN и подсчитывали количество интернализованных битцев. Фагоцитарную активность макрофагов оценивали с помощью индекса «количество интернализованных битцев» (IBN). Этот показатель рассчитывали по следующей формуле: IBN = количество интернализованных битцев в лунке/количество макрофагов в лунке.

МТТ-тест. В исследовании in vitro цитотоксичности применяемого препарата GcMAF RF^© перитонеальные мышиные макрофаги высевали в 96-луночный планшет (5×10⁴ клеток/лунку), активировали, как описано выше, и добавляли раковые клетки U87 или MCF-7 человека в соотношении 1:1. Клетки инкубировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, гентамицина 40 мкг/мл и выдерживали при 37°С в течение 18 часов в атмосфере 5% СО₂. После инкубации добавляли МТТ (Sigma) до конечной концентрации 0,5 мг/мл и клетки культивировали в течение дополнительных 3 часов. Клетки центрифугировали (5810R, Eppendorf) при 4000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость убирали, а выпавшие в осадок синие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО. Оптическую плотность определяли на приборе Multiscan RC при 570 нм, вычитая фон при 620 нм. Измерения проводили в трех повторностях для каждого образца. Стандартная формула применялась для расчета процента живых клеток:

[(D_exp - D_background) / (D_control - D_background)] × 100%, ГДе D_exp - значение оптической плотности в лунках с активированными перитонеальными макрофагами с раковыми клетками; D_control - значение оптической плотности в лунках с неактивированными перитонеальными макрофагами с раковыми клетками; D_background - оптическая плотность фона.

Прямую цитотоксичность препаратов оценивали аналогичным методом, при этом активаторы добавляли непосредственно к раковым клеткам.

Выделение дендритных клеток и оценка их аллостимуляторной активности. Дендритные клетки генерировали из прилипающей фракции мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии ГМ-КСФ и ИФН-γ в течение 4 суток при 37° в СО₂ инкубаторе при 5% СО₂. На последующие 24 ч в качестве дозревающего стимула вносился липополисахарид (E. coli 0114:В4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл) либо GcMAF RF© в концентрации 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл и 500 нг/мл. Для оценки аллостимуляторной активности дендритные клетки культивировали с аллогенными мононуклеарными клетками в соотношении 1:10. Пролиферативный ответ оценивался на 5-е сутки радиометрически по включению ³Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.

Оценка популяции макрофагов M1. Моноциты периферической крови культивировали с ГМ-КСФ (для получения неполяризованных макрофагов) и далее культивировали в течение 48 часов в отсутствие стимулов, либо добавляли ЛПС (Sigma-Aldrich) или GcMAF RF^© (50 и 250 нг/мл). Для оценки аллостимуляторной активности макрофаги культивировали с аллогенными мононуклеарными клетками в соотношении 1:10. Пролиферативный ответ оценивался на 5-е сутки радиометрически по включению ³Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.

Анализ противораковой активности in vivo. Клетки глиобластомы U87 открепляли от пластика с использованием раствора трипсина-ЭДТА (Sigma-Aldrich). Клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 минут. Клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM. Для получения солидных опухолей U87 1-2 млн клеток в 100 мкл среды DMEM инъецировали подкожно мышам Nu/J в межлопаточную область. Рост опухоли измеряли с помощью штангенциркуля каждые 3-4 дня. Объем опухоли (V) рассчитывали по формуле: где W - ширина опухоли, мм; L - длина опухоли, мм.

После того, как графты опухоли достигали 15-20 мм³, начинали инъекции GcMAF RF^©, циклофосфана, циклофосфана совместно с препаратом экзогенной ДНК или физ. раствора (контроль). GcMAF RF^© вводили каждый день в количестве 1-2 мкг/инъекцию в течение 22 дней, чередуя внутриопухолевые и внутрибрюшинные инъекции. Циклофосфан вводили внутрибрюшинно в количестве 280 мг/кг. Терапия препаратами циклофосфана и экзогенной ДНК была осуществлена по технологии «Каранахан» или «3+1», описанной в работе [8] и использована в качестве положительного контроля для сравнения биологического действия препарата GcMAF RF^©. При этом циклофосфан вводили метрономно 4 раза (в 0, 35, 70 часов и на 7 сутки с момента начала терапии) в количестве 70 мг/кг, через 18 часов после каждой инъекции цитостатика вводили препарат ДНК (состав препарата ДНК описан в работе [9]) внутрь опухоли в количестве 0,5 мг/инъекцию. Измерение объемов опухолей проводили каждые 3-4 дня. Эксперимент был повторен несколько раз. На графике представлены медианы ± SEM (n=4).

Статистика. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Statistica 10. Минимум четыре повторения были выполнены в каждом эксперименте. На рисунках столбцы показывают SEM или SD. Уровень достоверности оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни или парного критерия Уилкоксона.

Рассмотрим теоретические и экспериментальные предпосылки настоящего изобретения.

Витамин Д₃ связывающий белок плазмы крови (DBP), основная функция которого - связывание и транспортировка витамина Д₃, обладает еще одной важнейшей функцией. В результате сайт специфического дегликозилирования он приобретает способность активировать макрофаги [10, 11]. Гликозилированный Gc полипептид (DBP) содержит один трисахарид в позиции 420 остатка треонина, состоящий из N-ацетилгалактозамина с двумя разветвленными остатками Сахаров галактозы и сиаловой кислоты. DBP конвертируется в GcMAF несколькими последовательными модификациями. Олигосахарид гидролизуется мембран связанными β-галактозидазой и сиалидазой активированных воспалительным процессом В и Т лимфоцитов. β-ралактозидаза находится на цитоплазматической мембране В лимфоцитов, сиалидаза на мембране Т лимфоцитов, которые через специфические рецепторы связываются с DBP. В результате модификаций образуется активный белок (GcMAF), содержащий остаточный сахар N-ацетилгалактозамин (GalNAc) [11-13].

Известно, что опухоль продуцирует большое количество разнообразных молекул, разрушающих возможность организма элиминировать неопластический очаг [14]. Способность опухоли изменять свойства макрофагов, превращая их в фенотип М2, является важнейшей характеристикой гуморального воздействия неопластической ткани на иммунную систему. Одним из факторов изменения статуса макрофагов является секреция опухолевыми клетками фермента нагалазы [13, 15]. В норме нагалаза присутствует в лизосомах нормальных гепатоцитов и является экзодегликозилазой. Фермент может в незначительном количестве секретироваться в перицитоплазматическое пространство, где участвует в процессах поддержания функциональной активности внеклеточного матрикса. В результате такой секреции лизосомальная нагалаза обнаруживается в плазме крови с физиологической активностью 0.23 нмоль/мг/мин [16, 17].

Известно, при заболевании раком количество сывороточной нагалазы значительно возрастает. Сывороточная нагалаза больных раком проявляет как эндоэнзиматические, так и экзоэнзиматические характеристики и способна дегликозилировать и трисахарид предшественника MAF и GcMAF, несущий терминальный GalNAc остаток. Активность сывороточной нагалазы у больных онкозаболеваниями составляет от минимальной 0.63 до максимальной 5.21 нмоль/мг/мин [18-21]. В результате дегликозилирования витамин Д₃ полипептид теряет способность активировать инфильтрующие опухоль макрофаги, что в клинических наблюдениях характеризуется как иммуносупресессия, связанная с потерей макрофагами специфических активностей [18].

В работах [10, 18, 22], было сделано предположение, что инъекции очищенного экзогенного GcMAF могут компенсировать дефектный фактор и активировать систему макрофагов. И что такая иммунотерапия будет обладать противораковым действием. Проведенные клинические исследования свидетельствовали об эффективном воздействии GcMAF на опухоль, приводящим к значительной редукции опухолевого очага или полному уходу опухоли с продолжительным (несколько лет) безрецидивным периодом. Лечение пациентов с различными прогрессирующими раками инъекциями GcMAF, как предполагается, связано как с активацией инфильтрующих опухоль макрофагов, так и с блокированием активности сывороточной нагалазы [11, 21, 23-25]. Основная концепция терапевтического противоракового эффекта GcMAF состоит в активации макрофагов, редукции опухоли до полной ее эрадикации, сопровождающейся снижением количества сывороточной нагалазы, как диагностического маркера эрадикации опухоли.

Предшественник активатора макрофагов DBP и непосредственно GcMAF получают различными способами. Так факторы могут быть очищены афинной хроматографией на 25-гидроксивитамин D₃-сефарозе [26], или на актин-агарозе за счет своего второго специфического актин связывающего сайта [27]. Известен способ производства промышленного количества GcMAF содержащей композиции, основанного на ферментации исходной субстанции, где в качестве исходного сырья для получения GcMAF используют молозиво и систему ферментации в присутствии витамина Д₃ и олеиновой кислоты [28]. В указанном способе получения GcMAF находится в составе композиции, представляющей собой совокупность множества биологических молекул.

Описывается способ активации предшественника GcMAF обработкой дегликозилазами, кросслинкированными на инертном носителе [29].

GcMAF используется для лечения различных заболеваний. В различных источниках, содержащих экспериментальные данные, показано, что противораковая активность GcMAF главным образом опосредована активацией макрофагов [11, 19, 22, 30, 31]. Введение GcMAF ингибирует рост графта рака поджелудочной железы человека, трансплантированного иммунодефицитным мышам [32]. Инъекции обогащенной GcMAF сыворотки мышам с привитым асцитом Эрлиха увеличивают продолжительность жизни мышей [33]. GcMAF ингибирует пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и стимулируемый клетками ангиогенез. Экспозиция с фактором активации макрофагов значительно редуцирует экспрессию виментина, что означает реверсию эпителиально/ мезенхимальной транзиции, являющейся показателем прогрессии рака молочной железы человека в эпителиальном направлении [25, 34]. Описан эффект ингибирования роста опухоли, индуцированной 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA), воздействием GcMAF у хомяка [35]. Показано позитивное синергичное действие GcMAF в сочетании с фотодинамической терапией при лечении модельной мышиной карциномы SCCVII [36]. Имеются данные, что GcMAF прямым действием ингибирует пролифирацию клеток различных раков [37]. Полученные результаты свидетельствуют, что противораковые свойства GcMAF связаны с различными биологическими свойствами молекулы, которые включают в первую очередь активацию макрофагов, ингибирование тумор-индуцированного ангиогенеза, прямое ингибирование пролиферации раковых клеток, их миграционных свойств и способности к метастазированию. Предполагается, что снижение содержания количества GcMAF в плазме крови является существенным фактором, определяющим многочисленные функциональные нарушения в организме человека, включая развитие злокачественных новообразований [38].

Оценим фагоцитирующую активность перитонеальных макрофагов, индуцированных GcMAF RF^©.

Эксперименты по оценке активации перитонеальных макрофагов мыши GcMAF RF^© как базовый тест на активную субстанцию, проводится для каждого выделения GcMAF RF^© фактора. Фагоцитарная активность макрофагов была оценена с помощью метода интернализации магнитных частиц [7] и оценивалась с помощью индекса IBN, показывающего отношение числа интернализованных битцев к общему числу макрофагов через 3 часа после введения активаторов. В качестве отрицательного контроля были использованы макрофаги без добавления активаторов, в качестве положительного контроля - стандартный активатор ЛПС (10 мкг/мл).

На фигуре 1а приведен график, отображающий специфическую активность препарата, полученного в ходе нескольких выделений (n=4). Препарат GcMAF RF^© активирует фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в 3,7 раз по сравнению с контролем (р<0.05), в то время как ЛПС в 1,6 раз, a DBP - 1,2 раза, что достоверно не отличается от контроля. На фигуре 16 приведен пример, демонстрирующей способность фагоцитировать магнитные частицы активированных GcMAF RF^© перитонеальных макрофагов мыши.

Оценим прямую и опосредованную макрофагами цитотоксичность GcMAF RF^© на раковые клетки MCF-7 и U87.

В экспериментах по определению цитотоксичности использовался препарат GcMAF RF^© в концентрации 25 мкг/мл. Эксперименты проводились параллельно на двух раковых культурах: аденокарцинома молочной железы MCF-7 и глиобластома человека U87. При оценке влияния GcMAF RF^© на цитотоксичность, опосредованную перитонеальными макрофагами, первоначально макрофаги были активированы индукторами в течение 3-х часов. Затем к культуре активированных макрофагов были добавлены раковые клетки и оставлены в СО₂ инкубаторе на 24 часа. При оценке прямой цитотоксичности, GcMAF RF^© в той же концентрации был добавлен непосредственно к раковым клеткам. Цитотоксичность оценивалась при помощи МТТ теста.

Прямое воздействие GcMAF RF^© не выявило эффекта гибели раковых клеток. При использовании индукторов ЛПС и DBP наблюдалась стимуляция деления клеток (р<0,05) (Фиг. 2а). Предварительная обработка перитонеальных макрофагов GcMAF RF^©, при совместном культивировании снижает жизнеспособность раковых клеток, как MCF-7, так и U87 на 25-35% (р<0,05) (Фиг. 2б).

Оценим активацию профессиональных свойств дендритных клеток GcMAF RF^©.

Была проведена оценка стимулирующего действия GcMAF RF^© на созревание и функции дендритных клеток человека в культуре in vitro. Для этого из моноцитов периферической крови генерировали дендритные клетки, культивировали их в течение 24 часов либо в отсутствии каких-либо стимулов (интактные дендритные клетки), либо в присутствии липополисахарида (позитивный контроль, стандартный индуктор созревания дендритных клеток), либо в присутствии GcMAF RF^© в различных дозах (50, 100, 250, 500 нг/мл), и оценивали его влияние в сравнении со стандартным активатором ЛПС на аллостимуляторную активность дендритных клеток (т.е. их способность стимулировать пролиферацию аллогенных Т-лимфоцитов). Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали радиометрически по включению ³Н-тимидина (1 мкКю/лунку) (Таблица 1).

Эксперимент был выполнен на 4 донорах, результаты по каждому донору представлены индивидуально, аллостимуляторная активность приведена в виде значения индекса влияния - отношение стимулированных дендритных клеток к интактным (Фиг. 3). Таким образом, значения ИВ выше 1 говорит о повышении аллостимуляторной активности по отношению к контролю (не активированным дендритным клеткам).

В данной серии экспериментов было показано, что добавление GcMAF RF^© в культуру дендритных клеток на этапе созревания приводило к усилению аллостимуляторной активности дендритных клеток, сопоставимой со стандартным индуктором созревания дендритных клеток - ЛПС (р<0,05). Максимальный эффект GcMAF RF^© отмечался при использовании дозы 250 нг/мл (ИВ от 1,2 до 2,9 расч. ед., р<0,05). Схожий с ЛПС эффект достигался при использовании концентрации GcMAF RF^© 100 нг/мл.

Таким образом, на четырех независимых донорах показано, что GcMAF RF^© в концентрации 100 и 250 нг/мл обладает способностью активировать дендритные клетки к созреванию.

Оценим M1 поляризацию макрофагов GcMAF RF^©.

Была проведена оценка стимулирующего действия GcMAF RF^© на M1 поляризацию ГМ-КСФ дифференцированных макрофагов в культуре in vitro.

Известно, что классическим стимулом поляризации макрофагов в Ml клетки, которые играют важную роль в защите от опухолевого роста, является ЛПС [39]. При этом одним из функциональных критериев M1 клеток является их высокая аллостимуляторная активность (способность стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток). В настоящем исследовании была проведена сравнительная оценка влияния ЛПС и GcMAF RF^© на аллостимуляторную активность ГМ-КСФ дифференцированных (неполяризованных) макрофагов.

Моноциты периферической крови культивировали с ГМ-КСФ и далее культивировали в течение 48 часов в отсутствии стимулов (0), либо добавляли ЛПС или GcMAF RF^© (50 и 250 нг/мл). Для оценки аллостимуляторной активности макрофаги культивировали с аллогенными мононуклеарными клетками, пролиферативный ответ оценивался на 5 сутки радиометрически по включению ³Н-тимидина (1 мкКю/лунку) (Таблица 2).

В эксперименте использовали макрофаги, выделенные из 3-х различных доноров, к полученным макрофагам в свою очередь добавляли мононуклеары 3-х различных доноров. Таким образом, всего получилось 9 независимых вариаций. Результаты по каждой вариации представлены индивидуально, аллостимуляторная активность приведена в виде значения индекса влияния - отношение стимулированных макрофагов к интактным (Фиг. 4).

Как видно из полученных данных, добавление M1-поляризующего стимула ЛПС (позитивный контроль) к неполяризованным макрофагам усиливало их аллостимуляторную активность (р<0,01). GcMAF RF^© обладал схожим эффектом, причем в дозе 50 нг/мл проявлял более выраженную М1-поляризующую активность (р<0,01), чем в дозе 250 нг/мл (р<0,05).

Таким образом, GcMAF RF^© усиливает аллостимуляторную активность макрофагов аналогично эффекту ЛПС, что свидетельствует о его способности индуцировать поляризацию в сторону Ml макрофагов.

Оценим противораковую активность GcMAF RF^© в отношении экспериментальной глиобластомы человека U-87.

Противораковая активность препарата GcMAF RF^© была оценена на модели подкожного графта человеческой глиобластомы U87 иммуннодефицитным мышам. Инъекции препаратов были начаты после достижения размеров графта 15-20 мм³. В процессе и по окончании терапии мышам измеряли объем графта каждые 3-4 дня. В качестве сравнительной терапии был использован стандартный цитостатик циклофосфан в количестве 280 мг/кг, что составляет максимально допустимую дозировку цитостатика для мышей. А также метрономная терапия циклофосфаном и препаратом ДНК «3+1». Указанная терапия успешно использовалась при лечении как солидной, так и асцитной форм мышиной опухоли Кребс-2 [8], а также в многочисленных экспериментах подтвердила свою эффективность при использовании на модели первичных линий глиомы человека in vitro [40] и иммортализованной клеточной линии U87 как in vitro, так и in vivo (данные не приведены). Таким образом, в качестве положительного контроля (наличие циторедуцирующего действия) были использованы группы циклофосфан и циклофосфан + препарат ДНК. В качестве отрицательного контроля (отсутствие циторедуцирующей терапии) использовалась контрольная группа, получающая инъекции физ. раствора.

Терапия препаратом GcMAF RF^© была проведена в течение 22 дней. Препарат кололи мышам каждый день в количестве 1-2 мкг/мышь, при этом чередовали внутрибрюшинные и внутриопухолевые инъекции. Оказалось, что препарат GcMAF RF^© наравне с терапией циклофосфаном и препаратом ДНК обладает выраженным противоопухолевым действием (р<0,05 и р<0,01 соответственно) (Фиг. 5а, 5б).

На 39 день эксперимент был прекращен по этическим соображениям ввиду большого объема графтов у мышей в контрольной группе (Фиг. 5а, 5б). На фигуре 5в приведены фотографии трансплантатов у мыши из контрольной группы и группы GcMAF RF^© на 39 день с момента начала терапии.

Список использованных источников

1. RU 2159644, С2, A61N 5/067, 27.11. 2000

2. RU 2561294, C1, G09B 23/28, В82В 1/00, 27.08.2015

3. Колесниченко А.В., Тимофеев М.А., Протопопова М.В. Токсичность наноматериалов - 15 лет исследований. Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №3-4. С. 54-61

4. RU 2339414, C1, A61N 5/067, 27.11.2008

5. RU 2488173, C1, A61N 31/675, 20.07.2013

6. Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Ахматов А.Т., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Киселевский М.В. Усиление цитотоксической активности мононуклеаров периферической крови человека и торможение роста опухоли у мышей под воздействием бактериального иммуномодулятора. Сибирский онкологический журнал. 2007. N3 (23). С. 52-57.

7. Ishikawa М, Inoue Т, Inui Т, Kuchiike D, Kubo K, Uto Y, Nishikata Т. Anovel assay system for macrophage-activating factor activity using a human U937 cell line. Anticancer Res. 2014; 34: 4577-4582.

8. Potter EA, Dolgova E V., Proskurina AS, Minkevich AM, Efremov YR, Taranov OS, Omigov V V., Nikolin VP, Popova NA, Bayborodin SI, Ostanin AA, Chernykh ER, Kolchanov NA, Shurdov MA, Bogachev SS. A strategy to eradicate well-developed Krebs-2 ascites in mice. Oncotarget. 2016; 7: 11580-11594.

9. Alyamkina EA, Nikolin VP, Popova NA, Minkevich AM, Kozel A V, Dolgova E V, Efremov YR, Bayborodin SI, Andrushkevich OM, Taranov OS, Omigov V V, Rogachev VA, Proskurina AS, Vereschagin EI, Kiseleva E V, Zhukova M V, Ostanin AA, Chernykh ER, Bogachev SS, Shurdov MA. Combination of cyclophosphamide and double-stranded DNA demonstrates synergistic toxicity against established xenografts. Cancer Cell Int. 2015; 15:32.

10. Yamamoto N, Kumashiro R. Conversion of vitamin D3 binding protein (group-specific component) to a macrophage activating factor by the stepwise action of beta-galactosidase of В cells and sialidase of T cells. J Immunol. 1993; 151:2794-2802.

11. Yamamoto N, Suyama H, Yamamoto N. Immunotherapy for Prostate Cancer with Gc Protein-Derived Macrophage-Activating Factor, GcMAF. Transl Oncol. 2008; 1:65-72.

12. Naraparaju VR, Yamamoto N. Roles of β-galactosidase of В lymphocytes and sialidase of T lymphocytes in inflammation-primed activation of macrophages. Immunol Lett. 1994. 43: 143-148.

13.Saburi E, Saburi A, Ghanei M. Promising role for Gc-MAF in cancer immunotherapy: From bench to bedside. Casp J Intern Med. 2017; 8: 228-238.

14. Rabinovich G, Gabrilovich D, Sotomayor E. Immunosuppressive Strategies That Are Mediated By Tumor Cells. Annu Rev Immunol. 2007; 25: 267-296.

15. Korbelik M, Naraparaju VR, Yamamoto N. The value of serum alpha-N-acetylgalactosaminidase measurement for the assessment of tumour response to radio- and photodynamic therapy. Br J Cancer. 1998; 77: 1009-1014.

16. Ioannou YA, Bishop DF, Desnick RJ. Overexpression of human α-galactosidase A results in its intracellular aggregation, crystallization in lysosomes, and selective secretion. J Cell Biol. 1992; 119: 1137-1150.

17. Nagasawa H, Uto Y, Sasaki H, Okamura N, Murakami A, Kubo S, Kirk KL, Hori H. Gc protein (vitamin D-binding protein): Gc genotyping and GcMAF precursor activity. Anticancer Res. 2005; 25: 3689-3695.

18. Yamamoto N, Naraparaju VR, Asbell SO. Deglycosylation of serum vitamin D3-binding protein leads to immunosuppression in cancer patients. Cancer Res. 1996; 56:2827-2831.

19. Mohamad SB, Nagasawa H, Uto Y, Hori H. Tumor cell alpha-N-acetylgalactosaminidase activity and its involvement in GcMAF-related macrophage activation. Comp Biochem Physiol - AMol Integr Physiol. 2002; 132: 1-8.

20. Matsuura T, Uematsu T, Yamaoka M, Furusawa K. Effect of salivary gland adenocarcinoma cell-derived alpha- N-acetylgalactosaminidase on the bioactivity of macrophage activating PubMed Commons. Int J Oncol. 2004; 24: 521-528.

21. Thyer L, Ward E, Smith R, Branca J TV, Morucci G, Gulisano M, Noakes D, Eslinger R, Pacini S. GC protein-derived macrophage-activating factor decreases α-N-acetylgalactosaminidase levels in advanced cancer patients. Oncoimmunology. 2013; 2: 1-7.

22. Yamamoto N, Homma S. Vitamin D3 binding protein (group-specific component) is a precursor for the macrophage-activating signal factor from lysophosphatidylcholine-treated lymphocytes. Proc Natl Acad Sci. 1991; 88: 8539-8543.

23. Inui T, Kuchiike D, Kubo K, Mette M, Uto Y, Hori H, Sakamoto N. Clinical experience of integrative cancer immunotherapy with GcMAF. Anticancer Res. 2013; 33:2917-2920.

24. Rehder DS, Nelson RW, Borges CR. Glycosylation status of vitamin D binding protein in cancer patients. Protein Sci. 2009; 18: 2036-2042.

25. Thyer L, Ward E, Smith R, Fiore M, Magherini S, Branca J, Morucci G, Gulisano M, Ruggiero M, Pacini S. A Novel Role for a Major Component of the Vitamin D Axis: Vitamin D Binding Protein-Derived Macrophage Activating Factor Induces Human Breast Cancer Cell Apoptosis through Stimulation of Macrophages. Nutrients. 2013; 5: 2577-2589.

26. Link RP, Perlman KL, Pierce EA, Schnoes HK, DeLuca HF. Purification of human serum vitamin D-binding protein by 25-hydroxyvitamin D3-Sepharose chromatography. Anal Biochem. 1986; 157(2): 262-269.

27. Haddad JG, Kowalski MA, Sanger JW. Actin affinity chromatography in the purification of human, avian and other mammalian plasma proteins binding vitamin D and its metabolites (Gc globulins). Biochem J. 1984; 218(3): 805-810.

28. WO 2017076396 A1

29. US 20110123591 A1

30. https://boletnebudu.ru/category/gcmaf-terapija/

31.Homma S, Yamamoto M, Yamamoto N. Vitamin D-binding protein (group-specific component) is the sole serum protein required for macrophage activation after treatment of peritoneal cells with lysophosphatidylcholine. Immunol Cell Biol. 1993; 71: 249-257.

32. Kisker O, Onizuka S, Becker CM, Fannon M, Flynn E, D' Amato R, Zetter B, Folkman J, Ray R, Swamy N, Pirie-Shepherd S. Vitamin D Binding Protein-Macrophage Activating Factor (DBP-maf) Inhibits Angiogenesis and Tumor Growth in Mice. Neoplasia. 2003; 5: 32-40.

33. Kuchiike D, Uto Y, Mukai H, Ishiyama N, Abe C, Tanaka D, Kawai T, Kubo K, Mette M, Inui T, Endo Y, Hori H. Degalactosylated/Desialylated human serum containing GcMAF induces macrophage phagocytic activity and in vivo antitumor activity. Anticancer Res. 2013; 33: 2881-2886.

34. Pacini S, Punzi T, Morucci G, Gulisano M, Ruggiero M. Effects of vitamin D-binding protein-derived macrophage-activating factor on human breast cancer cells. Anticancer Res. 2012; 32: 45-52.

35. Toyohara Y, Hashitani S, Kishimoto H, Noguchi K, Yamamoto N, Urade M. Inhibitory effect of vitamin D-binding protein-derived macrophage activating factor on DMBA-induced hamster cheek pouch carcinogenesis and its derived carcinoma cell line. Oncol Lett. 2011; 2: 685-691.

36. Korbelik M, Naraparaju VR, Yamamoto N. Macrophage-directed immunotherapy as adjuvant to photodynamic therapy of cancer. Br J Cancer. 1997; 75: 202-207.

37. Gregory KJ, Zhao B, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, Huang B, Pirie-Shepherd S, Fannon M. Vitamin D binding protein-macrophage activating factor directly inhibits proliferation, migration, and uPAR expression of prostate cancer cells. PLoS One. 2010; 5(10): e13428.

38. Malik S, Fu L, Juras DJ, Karmali M, Wong BYL, Gozdzik A, Cole DEC. Common variants of the vitamin D binding protein gene and adverse health outcomes. Crit Rev Clin Lab Sci. 2013; 50: 1-22.

39. Martinez FO, Sica A, Mantovani A, Locati M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008; 13: 453-461.

40. Долгова E.B., Проскурина A.C., Поттер E.A., Тыринова Т.В., Таранов О.С., Ефремов Я.Р., Орищенко К.Е., Мишинов С.В., Ступак В.В., Останин А.А., Черных E.Р., Богачев С.С. Оценка эффективности эрадикации стволовых инициирующих раковых клеток на примере первичных культур глиобластомы человека. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2018; 22(7): 825-836.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для торможения роста подкожного трансплантата экспериментальной глиобластомы человека U-87, перевитого иммунодефицитным мышам Nu/J. Мышам с подкожно перевитым графтом U-87 вводят протестированный на первом этапе препарат GcMAF RF^© в дозе 1-2 мкг/мышь ежедневно, чередуя интраперитонеальные и интратуморальные инъекции, в течение 22 дней. Предшественник GcMAF RF^© молекулы, витамин Д₃ связывающий белок – DBP, выделяют из белка плазмы крови человека и конвертируют в GcMAF RF^© дегликозилированием с использованием двух ферментов гликозилаз - сиалидазы и β-галактозидазы. На первом этапе проводят оценку способности GcMAF RF^© активировать адаптивное звено противоракового иммунного ответа. На втором этапе оценивают специфическую противораковую активность обработанных GcMAF RF^© макрофагов. Затем проводят биологический тест на способность тормозить рост экспериментальной глиобластомы человека. Способ обеспечивает расширение арсенала технических средств, которые направлены на торможение развития глиобластомы, и, в частности, на повышение эффективности торможения роста подкожного трансплантата экспериментальной перевиваемой культуры клеток глиобластомы человека U-87, перевитого (развивающегося в форме злокачественной опухоли) иммунодефицитным мышам Nu/J (модельным животным, у которых глиобластома U-87 формирует раковую опухоль), за счет инъекций активирующего макрофаги фактора GcMAF RF^©. 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

1. Способ торможения роста подкожного трансплантата экспериментальной глиобластомы человека U-87, перевитого иммунодефицитным мышам Nu/J, основанный на том, что мышам с подкожно перевитым графтом U-87 вводят протестированный на первом этапе препарат GcMAF RF^© в дозе 1-2 мкг/мышь ежедневно, чередуя интраперитонеальные и интратуморальные инъекции, в течение 22 дней, при этом предшественник GcMAF RF^© молекулы, витамин Д₃ связывающий белок – DBP, выделяют из белка плазмы крови человека и конвертируют в GcMAF RF^© дегликозилированием с использованием двух ферментов гликозилаз - сиалидазы и β-галактозидазы, и проводят на первом этапе оценку способности GcMAF RF^© активировать адаптивное звено противоракового иммунного ответа, на втором этапе оценивают специфическую противораковую активность обработанных GcMAF RF^© макрофагов, а затем проводят биологический тест на способность тормозить рост экспериментальной глиобластомы человека.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки активации адаптивного звена противоракового иммунитета оценивается фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мыши с использованием в качестве фагоцитируемой субстанции стандартизованных для определения фагоцитарной активности иммунных клеток круглых металлических частиц - бус с диаметром 1 мкм.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно для оценки активации адаптивного звена противоракового иммунитета оценивается эффективность индукции поляризации человеческих макрофагов в M1 фенотип, состоящей в том, что в культуральную среду для активации и индукции смены поляризации макрофагов добавляют GcMAF RF^© в дозах 50-250 нг/мл.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно для оценки активации адаптивного звена противоракового иммунитета оценивается аллостимуляторная активность дендритных клеток человека, состоящая в том, что в культуральную среду для активации аллостимуляторной активности дендритных клеток добавляют GcMAF RF^© в дозах 50-250 нг/мл.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки специфической, направленной против клеток глиобластомы человека U-87, противораковой активности макрофагов, обработанных протестированным на первом этапе препаратом GcMAF RF^©, проводят МТТ тест на жизнеспособность раковых клеток глиобластомы человека U-87 после 24 часовой инкубации с активированными макрофагами.