Новое антитело, специфичное к CTHRC1, и его применение Российский патент 2024 года по МПК C07K16/18 C12N15/63 A61K39/00 A61P35/00 G01N33/574 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к антителу, которое связывается с CTHRC1, и его применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Противоопухолевые лекарства, которые в настоящее время применяются в клинической практике, можно классифицировать как химиотерапевтические средства и биотерапевтические средства. Химиотерапевтические средства, которые активно разрабатывались в прошлом, представляют собой лекарственные средства, проявляющие токсичность в отношении опухолевых клеток, и недостатком этих лекарств была их токсичность в отношении нормальных клеток наряду с опухолевыми клетками, а также возможное развитие резистентности к ним. Таким образом, существуют ограничения в отношении разработки и применения этих лекарственных средств. В этой связи, в последние годы, в качестве альтернативы началась активная разработка биотерапевтических средств, которые могут восстановить или улучшить иммунную функцию человеческого организма и тем самым ослабить активность опухолевых клеток. Примеры биотерапевтических средств, которые в настоящее время применяются или находятся в разработке, включают цитокины, рекомбинантные антитела (например, моноклональные антитела), терапевтические средства на основе молекул нуклеиновых кислот, ингибиторы ангиогенеза и так далее.

Среди биотерапевтических средств моноклональные терапевтические антитела отличаются тем, что вызывают незначительные побочные эффекты благодаря своей высокой реакционной специфичности в отношении мишеней. Антитела оказывают терапевтическое действие, опосредованное различными механизмами; например, они могут специфически связываться с соответствующими антигенами и подавлять передачу сигнала или индуцировать апоптоз благодаря перекрестному связыванию, и кроме того, могут оказывать терапевтическое действие за счет активации иммунной системы in vivo. Соответственно, моноклональные антитела в качестве противоопухолевых средств могут специфически нацеливаться на опухолевые клетки и подавлять их активность, а также индуцировать иммунные ответы и, таким образом, могут эффективно удалять опухолевые клетки. В результате, терапия с применением моноклональных антител становится основным направлением противоопухолевой терапии. В этой связи, были разработаны такие моноклональные антитела как рамуцирумаб, ритуксимаб, трастузумаб и так далее, которые применялись в лечении рака желудка, рака молочной железы, рака печени и так далее.

При этом белок, содержащий повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1), известен как секретируемый белок, участвующий в сосудистом ремоделировании, формировании костей и морфогенезе в ходе развития.

Согласно недавним исследованиям, сообщалось о повышенной экспрессии CTHRC1 в различных типах злокачественных клеток, таких как клетки злокачественных новообразований поджелудочной железы, яичников, молочной железы, меланомы и так далее, и поэтому CTHRC1 связан с пролиферацией или метастазированием злокачественного новообразования. Следовательно, эти результаты могут означать, что CTHRC1 играет важную роль в агрессивных опухолях. Также известно, что CTHRC1 не только индуцирует пролиферацию и метастазирование опухолевых клеток, но также стимулирует эндотелиальные клетки в опухолевом микроокружении и, таким образом, участвует в ангиогенезе (Park et al., Carcinogenesis (2013) 34: 694, Lee et al, ExpMolMed (2016) 48: e261). В результате анализа кДНК опухоли человека при помощи микрочипов, было обнаружено, что CTHRC1 в основном экспрессируется в солидных опухолях человека, а в результате анализа транскриптома подтвердили, что существуют различия в экспрессии между дольковой карциномой молочной железы и нормальными клетками протоков и долек. Также обнаружили, что CTHRC1 экспрессируется при инвазивных первичных меланомах и метастатических меланомах, но не экспрессируется в доброкачественных невусах или неинвазивных образцах. Кроме того, подавление экспрессии CTHRC1 снижало миграцию клеток линий меланомы in vitro. CTHRC1 был обнаружен при выбухающей дерматофибросаркоме, которая представляет собой местную агрессивную неоплазию, часто метастазирующую, но не при дерматосаркоме или типичной доброкачественной фиброгистиоцитарной опухоли. Кроме того, сообщалось, что экспрессия CTHRC1 существенно выше в опухолевых тканях молочной железы по сравнению с нормальными тканями или предшествующими поражениями, и связана с риском метастазирования в кости. Однако, по-прежнему существует потребность в разработке антител к белку CTHRC1, обладающих улучшенным связыванием и аффинностью, и, в то же время, демонстрирующих превосходные результаты в диагностике и лечении различных типов опухолей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Разработка антител, которые специфически связываются с CTHRC1, постоянно требовалась для лечения различных видов злокачественных новообразований, включая трудно поддающиеся лечению. Соответственно, авторы данного изобретения разработали новое антитело, обладающее высокой аффинностью и специфичностью, и подтвердили, что это антитело обладает противоопухолевым действием при различных видах злокачественных новообразований, тем самым завершив данное изобретение.

Техническое решение

Задачей данного изобретения является предоставление антитела, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1).

Другой задачей данного изобретения является предоставление полинуклеотида, кодирующего антитело, которое специфически связывается с белком CTHRC1; экспрессирующего вектора, включающего полинуклеотид, и клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление композиции и набора для определения антитела, которое специфически связывается с белком CTHRC1.

Следующей задачей данного изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей антитело, для предупреждения или лечения опухолей.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление способа лечения злокачественного заболевания с применением антитела.

Следующей задачей данного изобретения является предоставление композиции, содержащей антитело, для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление способа получения информации для диагностики злокачественного заболевания с применением антитела, включающего: определение белка CTHRC1 в биологическом образце, выделенном у субъекта с подозрением на наличие злокачественного заболевания, посредством реакции антиген-антитело.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление способа получения информации для составления прогноза злокачественного заболевания с применением антитела, включающего: определение белка CTHRC1 в биологическом образце, выделенном у субъекта, страдающего от злокачественного заболевания, посредством реакции антиген-антитело.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление набора для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания, включающего композицию для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление способа определения белка CTHRC1 в образце, включающего определение комплекса антиген CTHRC1 - антитело с применением антитела, которое специфически связывается с белком CTHRC1.

Полезные эффекты

Новое антитело по данному изобретению способно детектировать следовые количества CTHRC1 и также способно детектировать конъюгатные вакцины на основе CTHRC1, и поэтому его можно эффективно применять для количественного определения CTHRC1 и конъюгатных вакцин на основе CTHRC1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 представлены результаты непрямого ИФА с мышиными антителами 4Н5 и 9Е6, обладающими высокой аффинностью связывания с CTHRC1 (чувствительность: 4Н5, 9Е6 >> 1D1 > 6С1).

На Фиг. 2 представлены результаты, подтверждающие, что мышиные антитела 4Н5 и 9Е6 связываются с разными эпитопами, что позволяет предположить, что они могут оказывать противоопухолевое действие, задействуя различные механизмы.

На Фиг. 3 представлены результаты, подтверждающие, что cCMAb45 и cCMAb96 не только имеют высокую аффинность связывания с белком CTHRC1, но и также связываются с ним специфически.

На Фиг. 4 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на миграцию клеток опухоли поджелудочной железы in vitro.

На Фиг. 5 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на миграцию клеток опухоли молочной железы in vitro.

На Фиг. 6 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на миграцию клеток опухоли яичника in vitro.

На Фиг. 7 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на миграцию клеток опухоли мочевого пузыря in vitro.

На Фиг. 8 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на инвазию клеток опухоли поджелудочной железы in vitro.

На Фиг. 9 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на инвазию полученных от пациента клеток опухоли поджелудочной железы in vitro.

На Фиг. 10 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на инвазию клеток опухоли молочной железы in vitro.

На Фиг. 11 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на инвазию клеток опухоли яичника in vitro.

На Фиг. 12 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние cCMAb45 и cCMAb96 на инвазию клеток опухоли мочевого пузыря in vitro.

На Фиг. 13 представлены результаты получения гуманизированных антител-кандидатов 4Н5 и 9Е6.

На Фиг. 14 представлены результаты определения аффинности связывания гуманизированных антител-кандидатов 4Н5 и 9Е6.

На Фиг. 15 представлены результаты проверки эффективности гуманизированных антител-кандидатов 4Н5 и 9Е6 с применением линии клеток опухоли поджелудочной железы Panc-1.

На Фиг. 16 представлены результаты повторного определения аффинности связывания гуманизированных антител-кандидате в 4Н5 и 9Е6 взятых в качестве первичных антител.

На Фиг. 17 представлены результаты повторной проверки эффективности первоначально отобранных гуманизированных антител-кандидатов 4Н5 и 9Е6.

На Фиг. 18 представлены результаты, подтверждающие, что hCMAb45 и hCMAb96 специфически связываются с белком CTHRC1.

На Фиг. 19 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на миграцию клеток опухоли поджелудочной железы in vitro.

На Фиг. 20 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на миграцию клеток опухоли яичника in vitro.

На Фиг. 21 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на миграцию клеток опухоли молочной железы in vitro.

На Фиг. 22 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на миграцию клеток опухоли мочевого пузыря, опухоли легкого и меланомы in vitro.

На Фиг. 23 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на инвазию клеток опухоли поджелудочной железы in vitro.

На Фиг. 24 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на инвазию клеток опухоли яичника in vitro.

На Фиг. 25 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на инвазию клеток опухоли молочной железы in vitro.

На Фиг. 26 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное влияние hCMAb45 и hCMAb96 на инвазию клеток опухоли мочевого пузыря, опухоли легкого и меланомы in vitro.

На Фиг. 27 представлены результаты, подтверждающие противоопухолевое действие hCMAb45 и hCMAb96 in vivo. Модель с применением линии клеток опухоли поджелудочной железы ВхРС-3 демонстрирует уменьшение объема опухоли по сравнению с контрольной группой.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее данное изобретение будет описано более подробно. При этом, каждое описание и воплощение, раскрытое в данной заявке, также может быть применено к другим описаниям и воплощениям, соответственно. Таким образом, все комбинации различных элементов, описанных в данной заявке, входят в объем данного изобретения. Более того, объем данного изобретения не ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже.

В описании изобретения использованы стандартные 1-буквенные и 3-буквенные обозначения аминокислот естественного происхождения. Кроме того, аминокислоты, упомянутые в данном документе, обозначаются следующими аббревиатурами согласно правилам номенклатуры IUPAC-IUB.

В одном аспекте данного изобретения предложено антитело, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1).

В данном описании термин «CTHRC1 (белок, содержащий повторы тройной спирали коллагена-1») представляет собой водорастворимый белок, который задействован в сосудистом ремоделировании, формировании костей и морфогенезе, и известно, что белок экспрессируется в поврежденных артериях и поэтому способствует миграции клеток и опосредует ремоделирование поврежденной аорты путем ингибирования синтеза коллагена в фибробластах и гладкомышечных клетках. Также известно, что экспрессия CTHRC1 в эндотелиальных клетках регулирует трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и поэтому подавляет экспрессию генов-мишеней TGF-β, включая коллаген. Кроме того, у трансгенных по CTHRC1 мышей повышено количество остеобластов, формирование кости остеобластами и дифференцировка и минерализация прогениторных остеогенных клеток, а также взаимодействие с Wnt5a для активации пути плоскостной клеточной полярности. На этом основании можно подтвердить роль CTHRC1 в регуляции морфогенеза в ходе развития.

Белок CTHRC1 по данному изобретению может быть получен путем рекомбинации стандартным способом или может быть приобретен на рынке. CTHRC1 по данному изобретению может находиться в форме отдельного белка или в форме, связанной с другими белками или полисахаридами, и в частности, он может быть в форме, связанной с бактериальными экзотоксинами, однако его формы не исчерпываются перечисленными.

Антитела, специфически распознающие белок CTHRC1, можно применять в диагностике, предупреждении и лечении таких заболеваний, как злокачественные заболевания, при которых повышена экспрессия CTHRC1. В этой связи авторы данного изобретения разработали антитело, которое связывается с человеческим и мышиным белком CTHRC1 с высокой аффинностью. Антитело по данному изобретению связывается со всеми человеческими белками CTHRC1 с высокой аффинностью и поэтому его можно эффективно применять в области диагностики заболеваний, при которых повышена экспрессия белка CTHRC1, а также в области предупреждения или лечения злокачественных заболеваний.

В данном описании термин «антитело» относится к молекуле белка, который функционирует как рецептор, способный специфически распознавать антигены, в том числе к молекуле иммуноглобулина, обладающей иммунологической реактивностью в отношении конкретного антигена. Он может включать поликлональные антитела, моноклональные антитела, целые антитела и фрагменты антител. Для задач данного изобретения антитело может представлять собой антитело, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1). Кроме того, термин включает химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела и бивалентные или биспецифические молекулы (например, биспецифические антитела), диатела, триатела и тетратела. Кроме того, термин дополнительно включает одноцепочечное антитело, обладающее функцией связывания с неонатальными Fc рецепторами (FcRn), одноцепочечные антитела (scabs), производные константной области антитела и искусственные антитела на основе белкового остова. Целое антитело имеет структуру с двумя полноразмерными легкими цепями и двумя полноразмерными тяжелыми цепями, при этом каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидной связью. Целое антитело включает IgA, IgD, IgE, IgM и IgG, при этом IgG включает подтипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Фрагмент антитела относится к фрагменту, обладающему антигенсвязывающей функцией, и включает Fd, Fab, Fab', F(ab')2, Fv и так далее. Fd относится к части тяжелой цепи, входящей в состав Fab фрагмента. Fab имеет структуру, состоящую из вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, константной области легкой цепи и первой константной области тяжелой цепи (домена СН1), и имеет один антигенсвязывающий сайт. Fab' отличается от Fab тем, что он имеет шарнирный участок, включающий по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена СН1 тяжелой цепи. Антитело F(ab')2 получают, если остаток цистеина в шарнирном участке Fab' образует дисульфидную связь. Вариабельный фрагмент (Fv) относится к минимальному фрагменту, имеющему только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Стабилизированный дисульфидной связью фрагмент антитела Fv (dsFv) характеризуется тем, что вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны дисульфидной связью, тогда как одноцепочечный Fv (scFv) обычно характеризуется тем, что вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны ковалентной связью через пептидный линкер. Эти фрагменты антител можно получить с применением протеазы (например, Fab может быть получен путем рестриктазного расщепления целых антител папаином, а фрагмент F(ab')2 может быть получен путем расщепления целых антител пепсином). Предпочтительно, фрагменты антител могут быть сконструированы при помощи технологии генной рекомбинации.

В данном описании термин «моноклональное антитело» относится к молекулам антител, имеющим единый молекулярный состав, полученным из популяции по существу идентичных антител. Такие моноклональные антитела демонстрируют специфичность связывания и аффинность к одному определенному эпитопу.

В целом, иммуноглобулин имеет тяжелую цепь и легкую цепь, и каждая из тяжелой цепи и легкой цепи включает константную область и вариабельную область (эти области также известны как «домены»). Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи включают три гипервариабельных участка, обозначаемые участками, определяющими комплементарность (далее обозначаются «CDR»), и четыре каркасных области. CDR преимущественно отвечают за связывание с эпитопом антигена. CDR каждой цепи обычно обозначают CDR1, CDR2 и CDR3, нумеруя их последовательно, начиная от N-конца, и также указывают цепь, в которой располагается конкретная область CDR.

В данном описании термин «человеческое антитело» относится к молекуле, происходящей из человеческого иммуноглобулина, в которой полноразмерная аминокислотная последовательность антитела, включая области, определяющие комплементарность, и каркасные области, состоит из аминокислотной последовательности человеческого иммуноглобулина. Человеческие антитела обычно применяют для лечения заболеваний человека, и они могут иметь три или более важных преимуществ. Во-первых, человеческое антитело может легче взаимодействовать с человеческой иммунной системой, так что клетки-мишени могут лизироваться более эффективно, например, благодаря комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Во-вторых, преимуществом является то, что человеческая иммунная система не распознает антитело как чужеродное антитело. В-третьих, преимуществом является то, что даже при введении лекарства в меньшем количестве и с меньшей частотой, время его полужизни в кровеносной системе человека такое же как у антитела естественного происхождения.

Кроме того, когда антитело по данному изобретению включает константную область, оно может включать константную область, происходящую из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или их комбинации или гибриды.

Используемый в данном описании термин «комбинация» означает, что полипептиды, кодирующие константные области одноцепочечных иммуноглобулинов одного происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. Например, димер или мультимер могут быть образованы из двух или более константных областей, выбранных из группы, состоящей из константных областей IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

В данном описании термин «гибрид» означает, что последовательности, соответствующие двум или более константным областям иммуноглобулинов различного происхождения, присутствуют в одноцепочечной константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Например, возможные гибридные домены могут состоять из 1-4 доменов, выбранных из группы, состоящей из CH1, СН2, СН3 и СН4 IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

В данном описании термин «антитело, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1)» относится к антителу, способному подавлять активность белка CTHRC1 за счет связывания с белком CTHRC1.

Антитело, которое специфически связывается с белком CTHRC1, характеризуется тем, что оно связывается с человеческим белком CTHRC1 с высокой аффинностью.

Антитело может включать (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1 или 11, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 или 12, и CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 3 или 13; и (б) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 или 14, CDR2 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 5 или 15, и CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 6 или 16.

Дополнительно, антитело по данному изобретению может включать, без ограничения, вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, 17, 21 или 25, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной с последовательностью SEQ ID NO: 9, 19, 23 или 27.

В одном примере данного изобретения антитело по данному изобретению с улучшенной аффинностью и специфичностью к белку CTHRC1 может, в частности, включать вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 и CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи с последовательностью с SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 5 и CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 6; или вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 12 и CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 13; и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи с последовательностью с SEQ ID NO: 14, CDR2 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 15 и CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 16, без ограничения.

В одном воплощении данного изобретения антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, обозначили «4Н5», или «cCMAb45», а антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, обозначили «9Е6», или «cCMAb96».

Кроме того, антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, обозначили «4Н5», или «hCMAb45», а антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, обозначили «9Е6», или «hCMAb96».

В одном воплощении данного изобретения четыре новых антитела 4Н5, 9Е6, 6С1 и 1D1 с наиболее высокой аффинностью к антигену были отобраны путем скрининга В лимфоцитов, связывающихся с белком CTHRC1, и в результате анализа эпитопов 4Н5 и 9Е6 среди четырех антител, подтвердили, что 4Н5 и 9Е6 специфически связываются с белком CTHRC1 с высокой аффинностью, таким образом получив два вышеупомянутых новых антитела.

Эти результаты позволяют предположить, что антитело по данному изобретению, связывающееся с белком CTHRC1, можно эффективно применять в области, где необходимо распознавание белка CTHRC1, например, в диагностике или лечении заболеваний, при которых повышена экспрессия белка CTHRC1.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ получения антитела.

Антитело по данному изобретению можно легко получить при помощи стандартной технологии получения антител. Например, способ получения моноклональных антител может быть реализован путем получения гибридомы с применением В лимфоцитов, полученных у иммунизированных животных (Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256: 495) или может быть реализован с применением технологии фагового дисплея, не ограничиваясь перечисленным. Способ получения поликлональных антител можно легко осуществлять, используя стандартную технологию получения антител.

Библиотека антител с применением технологии фагового дисплея является способом экспрессии антитела на поверхности фага с генами антитела, непосредственно полученного из В лимфоцитов без получения гибридомы. Технология фагового дисплея позволяет преодолеть множество трудностей, связанных с получением моноклональных антител путем иммортализации В-клеток. Стандартный фаговый дисплей включает следующие стадии: 1) встраивание олигонуклеотида, имеющего случайную последовательность, в область, соответствующую N-концу белка pIII (или pIV) оболочки фага; 2) экспрессию слитого белка, состоящего из части естественного белка оболочки и полипептида, кодируемого вышеупомянутым олигонуклеотидом, имеющим случайную последовательность; 3) обработку материала, который может связываться с полипептидом, кодируемым олигонуклеотидом; 4) элюирование частиц пептид-фаг, связанных с вышеупомянутым материалом при низких рН или с применением молекулы, способной конкурировать за связывание; 5) амплификацию элюированного фага в клетке-хозяине при помощи пэннинга; 6) повтор вышеуказанных стадий для получения желаемого количества фага; и 7) определение последовательности активного антитела по последовательностям ДНК клонов фага, отобранных при помощи пэннинга.

Способ получения моноклонального антитела по данному изобретению можно осуществлять с применением технологии фагового дисплея. Специалист в области техники, к которой относится данное изобретение, может легко осуществить вышеуказанные стадии, опираясь на хорошо известные методики фагового дисплея, изложенные, например, Barbas et al. (METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119, 1991 J. Virol. 2001 July; 75 (14): 6692-9) и Winter et al. (Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994). Примеры фагов, которые можно применять для конструирования библиотеки антител, включают, без ограничения, нитчатые фаги, такие как fd, М13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 и Pf3. Также, примеры векторов, которые можно использовать для экспрессии гетерогенного гена на поверхности нитчатого фага, включают фаговые векторы, такие как fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 или fdtetDOG, или фагмидные векторы, такие как pHEN1, pComb3, pComb8 или pSEX, без ограничения. Другие примеры хелперных фагов, которые можно применять для получения естественного белка оболочки, необходимого для успешной ре-инфекции рекомбинантного фага, включают M13K07 или VSCM13, без ограничения.

Полинуклеотид, кодирующий клон моноклонального антитела по данному изобретению, можно легко выделить и секвенировать с применением стандартных методов, например, с применением олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для специфической амплификации представляющих интерес областей тяжелой цепи и легкой цепи с матрицы ДНК фага. После выделения полинуклеотид а его можно поместить в экспрессирующий вектор, который затем вводят в подходящие клетки-хозяева, и из трансформированных клеток-хозяев (т.е. трансформантов) можно получить желаемое моноклональное антитело. Таким образом, способ получения человеческого моноклонального антитела может включать стадию амплификации полинуклеотида, кодирующего человеческое моноклональное антитело, в экспрессирующем векторе, включающем полинуклеотид, кодирующий человеческое моноклональное антитело, но не ограничивается указанным.

В еще одном аспекте данного изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий антитело, экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, и клетка-хозяин, в которую внедрен экспрессирующий вектор.

Антитело является таким, как описано выше.

Экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий антитело по данному изобретению, не ограничивается каким-либо конкретным, но может представлять собой вектор, способный реплицировать и/или экспрессировать полинуклеотид в эукариотических или прокариотических клетках, включая клетки млекопитающих (например, клетки человека, обезьяны, кролика, крысы, хомяка или мыши), клетки растений, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки бактерий (например, Е. coli). Предпочтительно, это может быть вектор, включающий по меньшей мере один маркер селекции и функционально связанный с подходящим промотором, так что нуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине. Например, вектор может быть в форме, в которой полинуклеотид внедряют в фаг, плазмиду, космиду, мини-хромосому, вектор на основе вируса или ретровируса и так далее.

Экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий антитело, может представлять собой экспрессирующий вектор, включающий каждый из полинуклеотидов, кодирующих тяжелую цепь или легкую цепь антитела, или экспрессирующий вектор, включающий все полинуклеотиды, кодирующие тяжелую цепь или легкую цепь антитела.

Клетка-хозяин, в которую внедряют экспрессирующий вектор, может быть трансформантами с внедренным экспрессирующим вектором, например, бактериальными клетками, такими как Е. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium и так далее; клетками дрожжей; клетками грибов, такими как Pichia pastoris и так далее; клетками насекомых, такими как клетки Drosophila, клетки Sf9 Spodoptera и так далее; клетками животных, такими как клетки яичника китайского хомячка (СНО), SP2/0 (миеломы мыши), лимфобластоидными клетками человека, клетками COS (фибробластами почки мартышки), клетками NSO (миеломы мыши), клетками 293Т, клетками меланомы Боуэса, клетками НТ-1080, клетками BHK (почки новорожденного хомяка), клетками HEK (почки эмбриона человека), клетками PERC.6 (ретины человека) и так далее; и клетками растений.

В данном описании термин «внедрение» относится к доставке вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий антитело, в клетку-хозяина. Такое внедрение можно осуществлять различными способами, известными в области техники, такими как ко-преципитация ДНК с фосфатом кальция, опосредованная ДЭАЭ-декстраном трансфекция, опосредованная полибреном трансфекция, электропорация, микроинъекция, опосредованная липосомами трансфекция, слияние липосом, липофекция и слияние протопластов. Также, трансфекция означает доставку желаемого материала в клетку путем инфицирования с помощью вирусных частиц. Кроме того, вектор можно внедрять в клетку-хозяина с применением генной пушки и так далее. В данном изобретении «внедрение» может использоваться взаимозаменяемо с «трансфекцией».

В еще одном аспекте данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело, для предупреждения или лечения злокачественного заболевания.

Антитело связывается с высокой аффинностью с белком CTHRC1, экспрессия которого повышена при злокачественном заболевании и, как известно, играет важную роль в росте и метастазировании раковых клеток, приводя к подавлению, нейтрализации и/или цитотоксической реакции белка CTHRC1, результатом чего является предупреждение или лечение заболевания, при котором повышена экспрессия белка CTHRC1. Антитело является таким, как описано выше.

В данном описании термин «злокачественное заболевание» относится к любому типу злокачественного заболевания, без ограничения, предупреждение или лечение которого можно осуществлять с помощью антитела по данному изобретению. Его примеры могут включать рак поджелудочной железы, рак яичника, рак молочной железы, меланому, рак печени, рак шейки матки, рак желудка, рак легкого, колоректальный рак, рак полости рта и рак мочевого пузыря. В данном описании термин «предупреждение» относится ко всем действиям, которые подавляют или замедляют развитие злокачественного заболевания благодаря введению композиции, а термин «лечение» относится ко всем действиям, которые приводят к восстановлению или благоприятным образом изменяют симптомы злокачественного заболевания благодаря введению композиции.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемый носитель.

В данном описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю или разбавителю, который не вызывает раздражения в организме и не нарушает биологическую активность и свойства вводимого соединения. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, которые можно применять для составления композиции в форме жидких растворов, включают физиологический раствор, стерильную воду, раствор Рингера, забуференный физиологический раствор, раствор альбумина для инъекций, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и смесь одного или более из перечисленного. При необходимости композиция может также содержать другие стандартные добавки такие как антиокислители, буферы, бактериостатические вещества и так далее. Кроме того, композиция может дополнительно содержать разбавители, диспергирующие вещества, поверхностно-активные вещества, связывающие вещества и смазывающие вещества для составления композиции в виде инъекционных составов, таких как водные растворы, суспензии, эмульсии и так далее, пилюль, капсул, гранул или таблеток.

Фармацевтическая композиция может быть в форме различных составов для перорального или парентерального введения. Фармацевтическую композицию изготавливают, используя стандартные разбавители или эксципиенты, включая наполнители, увеличивающие объем вещества, связующие вещества, смачивающие вещества, дезинтегрирующие вещества, поверхностно-активные вещества и так далее. Твердые составы для перорального применения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и так далее. Указанные твердые составы могут быть получены путем смешивания по меньшей мере одного соединения с одним или более чем одним эксципиентом, например, крахмалом, карбонатом кальция, сахарозой, лактозой, желатином и так далее. В дополнение к простым эксципиентам также можно применять смазывающие вещества, такие как стеарат магния, тальк и так далее. Кроме того, жидкие составы для перорального применения включают суспензии, растворы для введения внутрь, эмульсии и сиропы и так далее. В дополнение к воде, часто используемой в качестве простого разбавителя, и жидкого парафина, можно включать различные эксципиенты, например, смачивающие агенты, подсластители, корригенты, консерванты и так далее. Композиции для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворы, суспендирующие вещества, эмульсии, лиофилизированные вещества, суппозитории и так далее. В качестве неводных растворителей и суспендирующих веществ можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и эфиры для инъекций, такие как этилолеат и так далее. Основы для суппозиториев могут включать витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицериножелатин и так далее.

Фармацевтическая композиция может быть в любой форме, выбранной из группы, состоящей из таблетки, пилюли, порошка, гранулы, капсулы, суспензии, раствора для приема внутрь, эмульсии, сиропа, стерильного водного раствора, неводного раствора, лиофилизированного вещества и суппозитория.

Композицию по данному изобретению можно вводить в эффективном количестве.

В данном описании термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для лечения заболеваний, при разумном соотношении пользы и риска, предусмотренном для любого медицинского воздействия. Уровень эффективной дозировки композиции может определяться в зависимости от вида субъекта, тяжести заболевания, возраста и пола субъекта, типа злокачественного заболевания, активности лекарственного средства, чувствительности к лекарственному средству, времени введения, пути введения, скорости выведения, продолжительности лечения, факторов, включающих лекарства, используемых в комбинации с композицией, и других факторов, известных в области медицины. Композицию по данному изобретению можно вводить в отдельности или в комбинации с другими терапевтическими агентами, и можно вводить последовательно или одновременно со стандартными терапевтическими агентами. Кроме того, композицию можно вводить в форме для однократного или многократного введения. Важно вводить композицию в минимальном количестве, которое может демонстрировать максимальный эффект, не вызывая побочных эффектов, с учетом всех факторов, описанных выше, и минимальное количество может быть легко установлено специалистами в области техники.

В следующем аспекте данного изобретения предложен способ лечения злокачественного заболевания с применением антитела.

Антитело и злокачественное заболевание являются такими, как описано выше.

Способ лечения злокачественного заболевания может представлять собой способ лечения злокачественного заболевания, включающий стадию введения фармацевтической композиции, включающей антитело вместе с фармацевтически приемлемым носителем, субъекту, у которого имеется злокачественное заболевание или у которого подозревают наличие злокачественного заболевания. При этом, фармацевтически приемлемый носитель является таким, как описано выше. Способ лечения злокачественного заболевания может, в частности, представлять собой способ лечения злокачественного заболевания, включающий стадию введения композиции, включающей антитело, субъекту, у которого существует злокачественное заболевание.

Примеры субъектов включают млекопитающих, включая крупный рогатый скот, свиней, овец, цыплят, собак, людей и так далее, а также птиц. Субъектом может быть любой субъект, у которого злокачественное заболевание лечат введением композиции по данному изобретению.

В частности, композицию можно вводить в фармацевтически эффективном количестве в форме для однократного или многократного введения. При этом, композицию можно вводить в форме жидкости, порошка, аэрозоля, капсулы, таблетки или капсулы с кишечнорастворимой оболочкой или суппозитория. Кроме того, композицию можно вводить внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, перорально, местно, интраназально, внутрилегочно или ректально, без ограничения. Однако когда композицию вводят перорально, пептид подвергается расщеплению в желудке, и по этой причине пероральная композиция должна быть составлена таким образом, чтобы действующее вещество было покрыто или защищено от распада в желудке. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить при помощи любых устройств, способных доставлять действующее вещество в клетку-мишень.

В следующем аспекте данного изобретения предложен способ получения информации для диагностики злокачественного заболевания, включающий: определение белка CTHRC1 в биологическом образце, выделенном у субъекта с подозрением на наличие злокачественного заболевания, по реакции антиген-антитело с применением антитела. Кроме того, способ может представлять собой способ диагностики злокачественного заболевания.

В еще одном аспекте данного изобретения предложен способ получения информации для составления прогноза злокачественного заболевания, включающий: определение белка CTHRC1 в биологическом образце, выделенном у субъекта, страдающего от злокачественного заболевания, по реакции антиген-антитело с применением антитела. Кроме того, способ может представлять собой способ составления прогноза злокачественного заболевания. Антитело, злокачественное заболевание, субъект и белок CTHRC1 являются такими, как описано выше. Поскольку известно, что экспрессия белка CTHRC1 повышается при различных видах злокачественных заболеваний, антитело по данному изобретению можно эффективно применять в диагностике злокачественных заболеваний, при которых известна повышенная экспрессия белка CTHRC1. Кроме того, также сообщалось, что повышенная экспрессия белка CTHRC1 индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ), связанный с метастазированием, и поэтому сопряжена с неблагоприятным прогнозом злокачественного заболевания. Следовательно, антитело по данному изобретению можно эффективно применять для составления прогноза злокачественного заболевания.

Способ получения информации для диагностики злокачественного заболевания или составления прогноза злокачественного заболевания позволяет определять белок CTHRC1 путем реакции человеческого моноклонального антитела по данному изобретению, специфического в отношении CTHRC1, с биологическим образцом, выделенным у субъекта с подозрением на злокачественное заболевание или страдающего злокачественным заболеванием, и обнаружение образования комплекса антиген-антитело, с получением информации для диагностики злокачественного заболевания или составления прогноза злокачественного заболевания.

В частности, способ может представлять собой способ получения информации для диагностики злокачественного заболевания или способ диагностики злокачественного заболевания, включающий стадии: (а) обработки антителом биологического образца, выделенного у субъекта, у которого подозревают злокачественное заболевание, для детекции белка CTHRC1 посредством реакции антиген-антитело; и (б) сравнение уровня белка CTHRC1, детектированного на стадии

(а) с таковым в контрольной группе, и отнесение субъекта к пациентам со злокачественным заболеванием, если уровень белка CTHRC1 в биологическом образце выше, чем в контрольной группе.

В частности, способ может представлять собой получения информации для составления прогноза злокачественного заболевания или способ составления прогноза злокачественного заболевания, включающий стадии: (а) обработки антителом биологического образца, выделенного у субъекта, страдающего злокачественным заболеванием, для детекции белка CTHRC1 посредством реакции антиген-антитело; и (б) сравнение уровня белка CTHRC1, детектированного на стадии (а) с таковым в контрольной группе.

В данном описании термин «биологический образец» охватывает ткани, клетки, цельную кровь, сыворотку, плазму, образцы ткани, полученные при аутопсии (мозга, кожи, лимфатических узлов, спинного мозга и так далее), культуральную надосадочную жидкость, разрушенные эукариотические клетки и бактериальные экспрессирующие системы и так далее, без ограничения. Можно проводить реакцию указанных биологических образцов с антителом управляемым или неуправляемым образом для определения наличия белка CTHRC1 или наличия или отсутствия злокачественного заболевания.

В данном описании термин «комплекс антиген-антитело» относится к конъюгату между антигеном белком CTHRC1 в образце и моноклональным антителом по данному изобретению, распознающим антиген белок CTHRC1. Образование такого комплекса антиген-антитело можно детектировать любым способом, выбранным из группы, состоящей из колориметрического способа, электрохимического способа, флуориметрического способа, люминометрии, способа подсчета частиц, визуальной оценки и сцинтилляционного способа, но способы не ограничиваются перечисленными, и можно использовать различные способы.

В данном изобретении для детектирования комплекса антиген-антитело можно применять различные метки. Частные примеры меток включают ферменты, флуоресцентные вещества, лиганды, люминесцентные вещества, микрочастицы и радиоактивные изотопы, но не ограничиваются ими.

Примеры фермента, используемого в качестве детектируемой метки, включают ацетилхолинэстеразу, щелочную фосфатазу, βD-галактозидазу, пероксидазу хрена, β-лактамазу и так далее. Примеры флуоресцентных веществ включают флуоресцеин, хелаты Eu³⁺, Eu³⁺, криптат и так далее. Примеры лигандов включают производные биотина и так далее, а примеры люминесцентных веществ включают сложный эфир акридиния, производные изолюминола и так далее. Кроме того, примеры микрочастиц включают коллоидное золото, окрашенный латекс и так далее, а примеры радиоактивных изотопов включают ⁵⁷Со, ³Н, ¹²⁵I и меченый ¹²⁵I реактив Болтона - Хантера и так далее.

Предпочтительно, комплекс антиген-антитело можно детектировать при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). Примеры ИФА включают различные ИФА, такие как прямой ИФА с применением меченого антитела, распознающего антиген, присоединенный к твердой подложке, непрямой ИФА с применением меченого вторичного антитела, распознающего захватывающее антитело в комплексе с антигеном, распознающее антиген, присоединенный к твердой подложке, прямой сэндвич-ИФА с применением другого меченого антитела, распознающего антиген в комплексе антиген-антитело, присоединенном к твердой подложке, непрямой сэндвич-ИФА, в котором происходит реакция между антигеном в комплексе антиген-антитело, присоединенном к твердой подложке, и другим антителом, и применяется меченое вторичное антитело, распознающее другое антитело, и конкурентный ИФА, в котором происходит конкуренция между различными антигенами за один сайт связывания антитела, и так далее.

Моноклональное антитело может иметь детектируемую метку. Если моноклональное антитело не имеет детектируемой метки, можно осуществлять его захват и детекцию другим антителом, имеющим детектируемую метку.

В следующем аспекте данного изобретения предложена композиция для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания.

Антитело и злокачественное заболевание являются такими, как описано выше. С применением композиции для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания, включающей антитело по данному изобретению, специфическое к белку CTHRC1, возможно диагностировать заболевания, связанные с экспрессией или уровнем экспрессии белка CTHRC1, такие как злокачественные заболевания или составлять прогноз злокачественного заболевания.

В еще одном аспекте данного изобретения предложен набор для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания, включающий композицию для диагностики злокачественного заболевания или для составления прогноза злокачественного заболевания.

Композиция и злокачественное заболевание являются такими, как описано выше. Кроме того, набор для диагностики злокачественного заболевания может дополнительно включать композицию, раствор или устройство, имеющее один или более других компонентов, подходящих для способов определения.

В еще одном аспекте данного изобретения предложены композиция и набор для определения белка CTHRC1, включающие антитело, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1).

В еще одном аспекте задачей данного изобретения предложен способ определения белка CTHRC1 в образце, включающий определение комплекса антиген CTHRC1 - антитело с применением антитела, которое специфически связывается с белком CTHRC1. Способ определения можно применять для количественного анализа конъюгатных вакцин.

В данном описании термин «комплекс антиген-антитело» относится к конъюгату между соответствующим антигеном в образце и антителом, распознающим антиген. Определение комплекса антиген-антитело можно осуществлять любыми известными в области техники способами, например, спектроскопическим, фотохимическим, биохимическим, иммунохимическим, электрическим, абсорбционно-спектрометрическим, химическим и другими способами. В частности, его можно определять любыми способами, выбранными из группы, состоящей из колориметрического способа, электрохимического способа, флуориметрического способа, люминометрии, способа подсчета частиц, визуальной оценки и сцинтилляционного способа, а также способов вестерн-блоттинга, ИФА, радиоиммуноанализа, радиоиммунодиффузии, метода диффузии по Оухтерлони, ракетным иммуноэлектрофорезом, иммуноокрашиванием ткани, анализа иммунопреципитации, анализа связывания комплемента, проточной цитометрии ((FACS), белковыми чипами и так далее, но способ не ограничивается перечисленным.

В данном изобретении для детектирования комплекса антиген-антитело можно применять различные метки. Частные примеры меток включают ферменты, флуоресцентные вещества, лиганды, люминесцентные вещества, микрочастицы и радиоактивные изотопы, без ограничения.

Примеры фермента, используемого в качестве детектируемой метки, включают ацетилхолинэстеразу, щелочную фосфатазу, βD-галактозидазу, пероксидазу хрена, β-лактамазу и так далее. Примеры флуоресцентных веществ включают флуоресцеин, хелаты Eu³⁺, Eu³⁺, криптат и так далее. Примеры лигандов включают производные биотина и так далее, а примеры люминесцентных веществ включают сложный эфир акридиния, производные изолюминола и так далее. Кроме того, примеры микрочастиц включают коллоидное золото, окрашенный латекс и так далее, а примеры радиоактивных изотопов включают ⁵⁷Со, ³Н, ¹²⁵I и меченый ¹²⁵I реактив Болтона - Хантера и так далее. Материалы не ограничиваются перечисленными.

Набор по данному изобретению может быть представлен в форме иммуноферментного анализа (ИФА). В частности, набор может включать описанное выше антитело в качестве захватывающего антитела, а ИФА может включать: (1) поликлональное антитело, связывающееся с CTHRC1; (2) захватывающее антитело, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1); и (3) антитело, связывающееся с меченным для детекции IgG Fc, не ограничиваясь перечисленным.

В данном описании термин «иммуно-ферментный анализ (ИФА)» также относится к способу иммуно-ферментного анализа и представляет собой способ количественного анализа связывания фермента с антителом с образованием комплекса антиген-антитело по изменению оптической плотности в результате реакции фермента с субстратом. Примеры ИФА включают различные ИФА, такие как прямой ИФА с применением меченого антитела, распознающего антиген, присоединенный к твердой подложке, непрямой ИФА с применением меченого вторичного антитела, распознающего захватывающее антитело в комплексе с антигеном, распознающее антиген, присоединенный к твердой подложке, прямой сэндвич-ИФА с применением другого меченого антитела, распознающего антиген в комплексе антиген-антитело, присоединенном к твердой подложке, непрямой сэндвич-ИФА, в котором происходит реакция между антигеном в комплексе антиген-антитело, присоединенном к твердой подложке, и другим антителом, и применяется меченое вторичное антитело, распознающее другое антитело, и конкурентный ИФА, в котором происходит конкуренция между различными антигенами за один сайт связывания антитела, и так далее.

При помощи антитела по данному изобретению, которое специфически связывается с белком CTHRC1, включающей его композиции для определения, набора, а также способа определения, в котором их применяют, возможно определять следовые количества белка CTHRC1. Количество детектируемого белка, в частности может быть менее 1 мг, менее 100 мкг и, более конкретно, менее 10 мкг, менее 1 мкг, менее 100 нг, менее 10 нг и менее 1 нг.

В одном воплощении данного изобретения подтвердили, что выполняя непрямой ИФА с использованием антител 4Н5 и 9Е6, специфически связывающихся с CTHRC1, в качестве захватывающих антител, можно определять белок CTHRC1 на уровне нескольких нанограммов, и что при помощи ИФА также можно анализировать конъюгатные вакцины.

Как указано выше, при помощи антитела по данному изобретению можно определять гораздо более низкое количество белка CTHRC1 по сравнению со стандартными наборами для определения белка CTHRC1. Следовательно, антитело по данному изобретению можно эффективно применять для количественного определения CTHRC1 и вакцин, в которых оно используется.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее данное изобретение будет описано более подробно на Примерах. Однако, данные Примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕР 1. Мышиные антитела cCMAb45 и cCMAb96

Пример 1-1. Обнаружение 4Н5 и 9Е6

Для разработки антитела, нацеленного на белок CTHRC1, обнаружили мышиное моноклональное антитело, связывающееся с белком CTHRC1. В частности, после продуцирования антитела к CTHRC1 в ответ на введение белка CTHRC1 мыши, из селезенки мыши выделяли В лимфоциты. Выделенные лимфоциты разводили таким образом, чтобы на каждую лунку 96-луночного планшета, покрытого белком CTHRC1 приходился только один В лимфоцит. Затем проводили скрининг В-лимфоцитов, связавшихся с белком CTHRC1, с применением антител к иммуноглобулинам мыши, меченых пероксидазой хрена (HRP).

В результате обнаружили четыре вида мышиных моноклональных антител к CTHRC1 (4Н5, 9Е6, 6С1 и 1D1).

Пример 1-2. Подтверждение аффинности к CTHRC1

Для нахождения антитела с наиболее высокой аффинностью к белку CTHRC1 среди четырех видов мышиных моноклональных антител к CTHRC1, обнаруженных в Примере 1-1, выполняли непрямой ИФА.

Планшет для иммуно анализа, покрытый CTHRC1-Fc и CTHRC1-His, инкубировали с четырьмя видами антител (4Н5, 9Е6, 6С1 и 1D1) в различных концентрациях и проводили реакцию в течение 2 часов, и измеряли значения OD (оптической плотности) с применением меченых HRP антител к иммуноглобулинам мыши в качестве вторичного антитела. В частности, более высокое значение OD указывает, что антитела связываются с CTHRC1 с более высокой аффинностью.

В результате подтвердили, что хотя значения OD у всех четырех антител повышались в зависимости от концентрации белка CTHRC1, два вида антител (4Н5 и 9Е6) связывались с белком CTHRC1 с более высокой аффинностью по сравнению с другими антителами (Фиг. 1).

Пример 1-3. Подтверждение эпитопов

Для подтверждения высокоаффинных эпитопов 4Н5 и 9Е6 среди всех четырех видов мышиных антител к CTHRC1 выполняли конкурентный ИФА. В частности, эпитоп относится к участку антигена, который распознается антителом.

Поверхность планшетов для иммуноанализа покрывали белком CTHRC1 и затем добавляли меченые биотином антитела 4Н5 и 9Е6 и не меченые биотином антитела в соотношении 1:0, 1:3, 1:6, 1:12,5, 1:25, 1:50 и 1:100. Измеряли значения OD для каждого антитела с применением конъюгированного с HRP стрептавидина в качестве вторичного антитела. В частности, если два антитела (4Н5 и 9Е6) имеют одинаковые эпитопы, значения OD понижаются с увеличением концентрации немеченых антител, тогда как в случае, если эпитопы двух антител различаются между собой, значения OD не изменяются даже когда концентрация немеченых антител увеличивается.

В результате подтвердили, что эпитопы 4Н5 и 9Е6 различаются между собой (Фиг. 2).

Пример 1-4. Получение химерных антител cCMAb45 и cCMAb96

Для минимизации иммуногенности мышиных антител 4Н5 и 9Е6, специфичных в отношении CTHRC1 и обладающих высокой аффинностью, получали химерные антитела, в которых сохраняли вариабельную область мышиного антитела и только константную область заменяли белком человеческого происхождения. Полученные антитела обозначали cCMAb45 и cCMAb96.

Пример 1-5. Анализ аффинности (непрямой ИФА)

Подтверждали аффинность cCMAb45 и cCMAb96 к белку CTHRC1, представлявших собой химерные антитела к CTHRC1, полученные в Примере 1-3. Для исследования аффинности антигенов и антител проводили непрямой ИФА.

CTHRC1 в концентрации 5 мкг/мл разливали по 100 мкл в лунки планшета для иммунологического анализа и оставляли при 4°С в течение ночи. На следующий день покрывающий раствор CTHRC1 удаляли и блокировали в течение 2 часов. Затем добавляли антитела cCMAb45 и cCMAb96 в различных концентрациях и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, несвязавшиеся антитела удаляли и затем промывали планшет. Измеряли значения OD с применением конъюгированного с HRP антитела к Fc иммуноглобулина человека, распознающего константные области человеческого происхождения, в качестве вторичного антитела. В частности, более высокое значение OD указывает на более высокую аффинность антитела к CTHRC1.

В результате у cCMAb45 наблюдалось значение K_D 5,2×10^-10 М, а у cCMAb96 наблюдалось значение K_D 4,3×10^-10 М. Подтвердили, что оба антитела демонстрируют очень высокую аффинность к белку CTHRC1 (Фиг. 3).

Пример 1-6. Анализ специфичности (непрямой ИФА)

Для подтверждения специфичности связывания cCMAb45 и cCMAb96 с CTHRC1 выполняли непрямой ИФА. Как и при анализе аффинности, поверхность планшета для иммуноанализа покрывали белком CTHRC1, а также рядом белков, не являющихся специфическими антигенами. На следующий день раствор иммобилизуемого белка удаляли и выполняли блокирование, добавляли cCMAb45 и cCMAb96 в концентрациях 0 мкг/мл, 1 мкг/мл и 5 мкг/мл и инкубировали в течение 2 часов. Затем раствор, содержащий антитела, удаляли и промывали для удаления несвязавшихся антител. Для измерения значений OD использовали антитело к легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека, конъюгированное с HRP, в качестве вторичного антитела.

В результате подтвердили, что cCMAb45 и cCMAb96 демонстрировали высокую специфичность к CTHRC1 (Фиг. 3).

Пример 1-7. Подтверждение ингибирующего влияния на миграцию опухолевых клеток

Для проверки терапевтической эффективности cCMAb45 и cCMAb96 подтверждали ингибиторное влияние на миграцию клеток линий опухоли поджелудочной железы, опухоли молочной железы, опухоли яичника и опухоли мочевого пузыря.

В частности, готовили cCMAb45 и cCMAb96 в концентрациях 1 мкг/мл и 5 мкг/мл или 1 мкг/мл и 10 мкг/мл, разводили в бессывороточной среде вместе с клетками линий и помещали в верхнюю камеру планшетов Transwell. Среду, содержащую сыворотку, помещали в нижнюю камеру для создания окружения, в которое клетки могут мигрировать. Количество мигрировавших клеток определяли путем культивирования каждой клеточной линии с антителами в течение соответствующего времени.

В результате подтвердили, что степень миграции опухолевых клеток существенно снижалась под воздействием cCMAb45 и cCMAb96 по сравнению с IgG, служившим контролем (Фиг. 4-7).

Пример 1-8. Подтверждение ингибирующего влияния на инвазию опухолевых клеток

Таким же образом, как и в Примерах 1-7, для проверки эффективности cCMAb45 и cCMAb96 подтверждали ингибиторное влияние на инвазию опухолевых клеток. В эксперименте использовали клетки опухоли поджелудочной железы, линию клеток опухоли поджелудочной железы, полученную от пациента, клетки опухоли молочной железы, опухоли яичника и опухоли мочевого пузыря.

Верхнюю камеру планшетов Transwell покрывали реагентом Matrigel, который является искусственным миметиком внеклеточного матрикса, и изучали способность опухолевых клеток к инвазии. Готовили cCMAb45 и cCMAb96 в концентрациях 1 мкг/мл и 5 мкг/мл или 1 мкг/мл и 10 мкг/мл, разводили в бессывороточной среде вместе с клетками линий и помещали в верхнюю камеру планшетов Transwell. Среду, содержащую сыворотку, помещали в нижнюю камеру. После культивирования с антителами в течение определенного периода времени измеряли количество мигрировавших клеток, проникших в Matrigel.

В результате подтвердили, что способность опухолевых клеток к инвазии снижалась под воздействием cCMAb45 и cCMAb96 по сравнению с IgG, служившим контролем (Фиг. 8-12).

ПРИМЕР 2. Гуманизированные антитела hCMAb45 и hCMAb96

Пример 2-1. Конструирование библиотеки гуманизированных антител

Для уменьшения иммуногенности cCMAb45 и cCMAb96, представляющих собой химерные антитела к CTHRC1, получали гуманизированные антитела, в которых каркасную область (далее обозначается «FR»), содержащую CDR область, заменили каркасной областью человеческого происхождения, за исключением CDR области, которая является наиболее важной для связывания антигена.

Библиотеку гуманизированных антител, имеющих различные области FR, включающие CDR области cCMAb45 и cCMAb96, сконструировали при помощи технологии пересадки CDR.

Пример 2-2. Отбор гуманизированных антител и преобразование в IgG

Из библиотеки гуманизированных антител, сконструированной, как описано выше, отбирали клоны, специфичные в отношении CTHRC1 и обладающие высокой аффинностью. Транзиторную экспрессию IgG осуществляли в клетках HEK293F для очистки каждого из восьми антител 4Н5 и 9Е6, и подтверждали чистоту посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).

В результате продуктивность гуманизированного антитела 4Н5 составила от 15 мг/л до 67,3 мг/л, а продуктивность гуманизированного антитела 9Е6 составила от 3,1 мг/л до 33,3 мг/л (Фиг. 13).

Пример 2-3. Анализ аффинности гуманизированных антител

Для анализа аффинности выполняли непрямой ИФА с восемью клонами-кандидатами 4Н5, полученными в Примере 2-2. Поверхность планшета для иммуноанализа покрывали CTHRC1-His, и на следующий день готовили серию разведений восьми гуманизированных антител-кандидатов и cCMAb45 с последовательным уменьшением концентрации 1/3, начиная от максимальной концентрации 500 нг/мл, и добавляли в планшет. Измеряли значения OD с применением конъюгированного с HRP антитела к Fc иммуноглобулина человека в качестве вторичного антитела. Аффинность выражали в виде значений K_D. Низкие значения K_D указывают на высокую аффинность.

В результате измеренные значения K_D гуманизированного антитела оказались такими же или более низкими, чем у cCMAb45.

В результате аналогичного анализа восьми клонов-кандидатов гуманизированного антитела 9Е6 измеренные значения Kd гуманизированного антитела 9Е6 оказались такими же или чуть более высокими, чем у cCMAb96.

В частности, подтвердили, что аффинность гуманизированного антитела 4Н5 составила от 0,82×10^-10 М до 2,5×10^-10 М, а аффинность гуманизированного антитела 9Е6 составила от 1,61×10^-10 М до 4,8×10^-10 М (Фиг. 14).

Пример 2-4. Исследование эффективности гуманизированных антител

Для исследования эффективности клонов-кандидатов гуманизированных антител 4Н5 и 9Е6 проводили исследование миграции с применением линии клеток опухоли поджелудочной железы Panc-1. Разводили 5 мкг/мл каждого антитела и 5×10⁴ клеток в бессывороточной среде и помещали в верхнюю камеру планшета Transwell. Затем среду, содержащую сыворотку, помещали в нижнюю камеру для создания окружения, в которое клетки могут мигрировать. Количество мигрировавших клеток определяли путем культивирования с антителами в течение 24 часов и оценивали эффективность антител-кандидатов.

В результате подтвердили, что степень миграции опухолевых клеток существенно снижалась под воздействием cCMAb45 и cCMAb96 по сравнению с IgG, служившим контролем (Фиг. 4-7).

В результате клоны-кандидаты гуманизированного антитела 4Н5 снижали способность клеток к миграции на 30%-50% по сравнению с контрольным IgG, а клоны-кандидаты гуманизированного антитела 9Е6 снижали способность клеток к миграции на 30%-40%. В заключение, подтвердили, что все гуманизированные антитела-кандидаты 4Н5 и 9Е6 обладали эффективностью, сопоставимой или более высокой, чем cCMAb45 и cCMAb96 (Фиг. 15).

Пример 2-5. Отбор гуманизированных антител и повторная оценка аффинности и эффективности

Антитела отбирали, оценивая клоны-кандидаты гуманизированных антител 4Н5 и 9Е6 на основании трех критериев: аффинность, эффективность и выход. Для гуманизированного антитела 4Н5 отбирали SA2759, SA2761, SA2762 и SA2765, а для гуманизированного антитела 9Е6 отбирали SA2768, SA2769 и SA2770.

Для повторной оценки аффинности и эффективности антител, отобранных на основании указанных выше критериев, проводили непрямой ИФА для оценки аффинности и исследование миграции для оценки эффективности. Эксперимент проводили таким же способом, как описано в Примерах 2-3 и 2-4.

В результате, что касается аффинности, подтвердили, что, как и в первом определении, измеренные значения K_D оказались сопоставимы или ниже, чем у cCMAb45 и cCMAb96, а способность клеток к миграции также снижалась на 30%-50%. В частности, подтвердили, что отобранное гуманизированное антитело 4Н5 обладало аффинностью порядка нескольких пМ и снижало способность клеток к миграции на 40%, а гуманизированное антитело 9Е6 обладало аффинностью порядка нескольких десятков пМ и снижало способность клеток к миграции на 50% (Фиг. 16 и 17).

Наконец, SA2765 обозначили hCMAb45, a SA2770 обозначили hCMAb96.

Пример 2-6. Анализ специфичности hCMAb45 и hCMAb96

Для определения специфичности связывания hCMAb45 и hCMAb96 с CTHRC1 выполняли непрямой ИФА. Поверхность планшета для иммуноанализа покрывали белком CTHRC1-His и рядом неспецифических антигенов. На следующий день проводили реакцию hCMAb45 и hCMAb96 с антигенами в концентрациях 0 мкг/мл, 1 мкг/мл и 5 мкг/мл и затем измеряли значения OD с применением антитела к легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека, конъюгированного с HRP, в качестве вторичного антитела.

В результате подтвердили, что hCMAb45 и hCMAb96 специфично связываются с CTHRC1 (Фиг. 18).

Пример 2-7. Подтверждение ингибирующего влияния на миграцию опухолевых клеток

Для проверки терапевтической эффективности hCMAb45 и hCMAb96 подтверждали ингибирующее влияние на миграцию опухолевых клеток. Использовали опухоли поджелудочной железы, молочной железы, яичника, мочевого пузыря, легкого и злокачественной меланомы, а эксперимент проводили таким же способом, как описано в Примере 1-7.

В результате подтвердили, что способность опухолевых клеток к миграции существенно снижалась под воздействием hCMAb45 и hCMAb96 по сравнению с IgG, служившим контролем (Фиг. 19-22).

Пример 2-8. Подтверждение ингибирующего влияния на инвазию опухолевых клеток

Ингибирующее влияние hCMAb45 и hCMAb96 на инвазию опухолевых клеток подтверждали таким же образом, как и в эксперименте, описанном в Примере 1-8.

В результате способность опухолевых клеток к инвазии существенно снижалась под воздействием hCMAb45 и hCMAb96 по сравнению с IgG, служившим контролем (Фиг. 23-26).

Пример 2-9. Подтверждение противоопухолевого действия in vivo на модели опухоли поджелудочной железы у животных

Способность гуманизированных антител hCMAb45 и hCMAb96, специфически связывающихся с белком CTHRC1, ингибировать миграцию и инвазию опухолевых клеток подтверждали in vitro в Примерах 2-7 и 2-8. Соответственно, подтверждали, что аналогичное противоопухолевое действие наблюдалось in vivo. В частности, создавали модель на мышах с использованием подкожных ксенографтов клеток линии опухоли поджелудочной железы ВхРС-3, с повышенной экспрессией CTHRC1. 1×10⁶ клеток трансплантировали мышам подкожно в правую заднюю лапу и через 6 дней отбирали мышей, у которых развивались опухоли размером от 73 мм³ до 77 мм³ и разделяли на группы. Лекарство вводили в хвостовую вену, служившая контролем группа получала IgG, а экспериментальные группы получали hCMAb45 и hCMAb96 в дозе 10 мг/кг дважды в неделю на протяжении 4 недель, размер опухоли измеряли дважды в неделю при помощи штангенциркуля. После лечения антителами эксперимент заканчивали на 28 день (8 введение) и размер опухоли сравнивали с размером опухоли в контрольной группе, получавшей IgG.

В результате подтвердили, что размер опухоли в группах, получавших hCMAb45 и hCMAb96, был меньше по сравнению с контрольной группой, получавшей IgG (Фиг. 27). В частности, подтвердили, что в группе, получавшей hCMAb96, противоопухолевое действие было более выраженным, чем в группе, получавшей hCMAb45.

В приведенных выше Примерах подтвердили противоопухолевое действие связывающихся с CTHRC1 гуманизированных антител hCMAb45 и hCMAb96 in vivo, и засвидетельствовали их потенциал в качестве веществ, сдерживающих или подавляющих опухолевый рост.

На основании вышеизложенного материала специалисты в области техники поймут, что возможны и другие воплощения данного изобретения, без изменения технической концепции или существенных признаков данного изобретения. В этой связи приведенные в качестве примеров воплощения служат исключительно для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Таким образом, объем данного изобретения определяется приведенной ниже формулой изобретения, а не описанием, приведенным выше. Все изменения, охватываемые значениями и диапазоном эквивалентности формулы изобретения, следует считать входящими в объем данного изобретения.

--->

Перечень последовательностей

<110> Prestige BioPharma Pte. Ltd.

<120> Новое антитело, специфичное к CTHRC1, и его применение

<130> OPA20050

<150> KR 10-2019-0070048

<151> 2019-06-13

<160> 28

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4H5-VH-CDR1

<400> 1

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4H5-VH-CDR2

<400> 2

Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4H5-VH-CDR3

<400> 3

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4H5-VL-CDR1

<400> 4

Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4H5-VL-CDR2

<400> 5

Leu Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4H5-VL-CDR3

<400> 6

Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb45-тяжелая цепь

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb45-тяжелая цепь

<400> 8

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tgctctgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attaatcctt actatggtag tactagctac 180

aatctgaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240

atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatcgggc 300

tatggttacg acgagagtgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb45-легкая цепь

<400> 9

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb45-легкая цепь

<400> 10

gatgttttga tgacccaaac tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60

atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180

tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcct 300

ctcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9E6-VH-CDR1

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9E6-VH-CDR2

<400> 12

Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9E6-VH-CDR3

<400> 13

Thr Thr Glu Ser Tyr

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9E6-VL-CDR1

<400> 14

Gln Asn Ile Asn Val Trp

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9E6-VL-CDR2

<400> 15

Lys Ala Ser

1

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9E6-VL-CDR3

<400> 16

Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb96-тяжелая цепь

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Glu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 18

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb96-тяжелая цепь

<400> 18

caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatccta gtagtggtac tactaactac 180

gatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca catcctccac cacagcctac 240

atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aacagagtct 300

tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb96-легкая цепь

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cCMAb96-легкая цепь

<400> 20

gacattgtga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120

ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 21

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb45-тяжелая цепь

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Val Tyr Gly Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Gly Ser Met Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb45-тяжелая цепь

<400> 22

caggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tattatgggt gcggcaggcg 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagca attaatcctt actatggtag tactgtgtac 180

gggcagaagt tccagggcag actcaccatt accgcggacg ggtctatgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagatcgggc 300

tatggttacg acgagagtgc tatggactac tggggtcaag gaaccctagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb45-легкая цепь

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 24

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb45-легкая цепь

<400> 24

gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctct 60

atctcttgcc ggtctagtaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180

tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcct 300

ctcacgttcg gccaggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 25

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb96-тяжелая цепь

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Pro Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Glu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 26

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb96-тяжелая цепь

<400> 26

caggtccaac tggtacagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtc 60

tcctgtaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt ccgtcaagct 120

ccgggacaag ggctggagtg gattggatat atttatccta gtagtggtac tactaactac 180

aaccaaaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gccccctgag atctgaggac acagcggtct attactgtac aacagagtct 300

tactggggcc agggaaccac tgtcaccgtc tcctca 336

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb96-легкая цепь

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hCMAb96-легкая цепь

<400> 28

gacattcaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacagtgg cgtcccatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, специфически связывающемуся с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 CTHRC1. Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанное антитело; экспрессирующий вектор, содержащий указанный вектор; клетка-хозяин, содержащая указанный вектор; композиция или набор, содержащие указанное антитело. Раскрыты способ предоставления информации для диагностики или прогноза злокачественного заболевания; способ определения белка CTHRC1 в образце. Изобретение обладает способностью эффективно лечить злокачественное заболевание с повышенной экспрессией CTHRC1. 11 н. и 4 з.п. ф-лы, 22 ил., 2 пр.

1. Антитело, специфически связывающееся с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1), содержащее: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 12, и CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 13; и

(б) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 14, CDR2 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 15, и CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 16.

2. Антитело по п. 1, в котором вариабельная область тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 или 25, и вариабельная область легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 или 27.

3. Полинуклеотид, кодирующий антитело по п. 1 или 2.

4. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по п. 3.

5. Клетка-хозяин для получения антитела, которое специфически связывается с белком, содержащим повторы тройной спирали коллагена-1 (CTHRC1), содержащая экспрессирующий вектор по п. 4.

6. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения злокачественного заболевания с повышенной экспрессией CTHRC1, содержащая антитело по п. 1 или 2 в эффективном количестве,

где злокачественное заболевание выбрано из злокачественного заболевания поджелудочной железы, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, меланомы, злокачественного заболевания легкого и злокачественного заболевания мочевого пузыря.

7. Способ предоставления информации для диагностики злокачественного заболевания, включающий

(а) обработку антителом биологического образца, выделенного у субъекта, у которого подозревают злокачественное заболевание, для детекции белка CTHRC1 посредством реакции антиген-антитело с применением антитела по п. 1 или 2; и

(б) сравнение уровня белка CTHRC1, детектированного на стадии (а), с таковым в контрольной группе, и отнесение субъекта к пациентам со злокачественным заболеванием, если уровень белка CTHRC1 в биологическом образце выше, чем в контрольной группе;

где злокачественное заболевание выбрано из злокачественного заболевания поджелудочной железы, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, меланомы, злокачественного заболевания легкого и злокачественного заболевания мочевого пузыря.

8. Способ предоставления информации для составления прогноза злокачественного заболевания, включающий

(а) обработку антителом биологического образца, выделенного у субъекта, страдающего злокачественным заболеванием, для детекции белка CTHRC1 посредством реакции антиген-антитело с применением антитела по п. 1 или 2; и

(б) сравнение уровня белка CTHRC1, детектированного на стадии (а), с таковым в контрольной группе;

где злокачественное заболевание выбрано из злокачественного заболевания поджелудочной железы, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, меланомы, злокачественного заболевания легкого и злокачественного заболевания мочевого пузыря.

9. Композиция для диагностики злокачественного заболевания с повышенной экспрессией CTHRC1 или составления прогноза злокачественного заболевания с повышенной экспрессией CTHRC1, содержащая антитело по п. 1 или 2 в эффективном количестве,

где злокачественное заболевание выбрано из злокачественного заболевания поджелудочной железы, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, меланомы, злокачественного заболевания легкого и злокачественного заболевания мочевого пузыря.

10. Набор для диагностики злокачественного заболевания с повышенной экспрессией CTHRC1 или составления прогноза злокачественного заболевания с повышенной экспрессией CTHRC1, содержащий композицию по п. 9 и композицию, имеющую один или более типов других компонентов, раствор или устройство, подходящие для способа анализа,

где злокачественное заболевание выбрано из злокачественного заболевания поджелудочной железы, злокачественного заболевания яичника, злокачественного заболевания молочной железы, меланомы, злокачественного заболевания легкого и злокачественного заболевания мочевого пузыря.

11. Набор для определения белка CTHRC1, содержащий антитело по п. 1 или 2 и композицию, имеющую один или более типов других компонентов, раствор или устройство, подходящие для способа анализа.

12. Набор по п. 11, представленный в форме ИФА (иммуноферментный анализ).

13. Набор по п. 12, в котором антитело представляет собой захватывающее антитело.

14. Набор по п. 12, где ИФА представляет собой непрямой ИФА, включающий:

(1) поликлональное антитело, связывающееся с CTHRC1;

(2) захватывающее антитело в форме антитела по п. 1 или 2; и

(3) антитело, связывающееся с меченным для детекции IgG Fc.

15. Способ определения белка CTHRC1 в образце, включающий определение образования комплекса антиген CTHRC1 - антитело с применением антитела по п. 1 или 2.