Антитела, нацеливающиеся на C5aR Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61P35/00 A61P37/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам, которые взаимодействуют с C5aR, в частности с C5aR человека. Настоящее изобретение также относится к композициям на основе нуклеиновой кислоты, композиции на основе вектора и клеткам-хозяевам, способным экспрессировать указанные антитела, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и путям применения указанных антител для лечения определенных заболеваний и/или для диагностических целей.

Предпосылки изобретения

Хемотаксический рецептор 1 анафилатоксина С5а (C5aR) (также известный как CD88) представляет собой рецептор, сопряженный с G-белком (GPCR), принадлежащий к семейству родопсинов, и является одним из двух рецепторов с высокой аффинностью в отношении лиганда С5а, который продуцируется в сыворотке крови как один из основных эффекторных компонентов ответа с участием системы комплемента. В физиологических условиях С5а действует как хемотаксическое средство для воспалительных клеток, стимулирует их респираторный взрыв, а также высвобождение цитокинов и хемокинов, и функционирует для повышения проницаемости сосудов.

C5aR, по-видимому, широко экспрессируется различными типами клеток. Наиболее высокие уровни экспрессии C5aR описаны для нейтрофилов. Уровни экспрессии от низкого до среднего были показаны для макрофагов/моноцитов, дендритных клеток, тучных клеток, эозинофилов, гладкомышечных клеток сосудов легких, астроцитов, микроглии, остеобластов, остеокластов, эпителиальных и эндотелиальных клеток (Monk PN et al., Br J Pharmacol. 2007, 152: 429-448; Wetsel RA, Immunol Lett. 1995, 44: 183-187). В T-клетках человека были выявлены низкие уровни экспрессии (Nataf S, J Immunol. 1999, 162: 4018-4023).

Клеточные ответы на С5а строго контролируются индуцируемой лигандом интернализацией рецептора. Описано, что C5aR быстро и зависимым от дозы образом интернализуется при обработке с помощью С5а, и до 90% рецепторов возвращаются обратно на поверхность клетки. Таким образом, высокие уровни экспрессии C5aR в сочетании с его высокой скоростью переключения могут быть ограничивающими с точки зрения эффективности по причине эффектов опосредованного мишенью распределения лекарственного средства (TMDD).

Взаимодействие C5aR с С5а было описано при многих различных заболеваниях; большинство из них вовлечены в воспалительные и аутоиммунные заболевания (Morgan BP et al., Nat Rev Drag Discov. 2015, 14: 857-877; Hawksworth OA et al., Mol Immunol. 2017, 89: 36-43). Некоторые первоначальные исследования были выполнены для идентификации основных механизмов, посредством которых С5а стимулирует рост опухоли (Markiewski MM et al., Nat Immunol. 2008, 9: 1225-1235; Corrales L. et al, J Immunol. 2012, 189: 4674-4683; Cho MS et al., Cell Rep.2014, 6: 1085-1095). Большинство данных указывает на то, что С5а усиливает пролиферацию раковых клеток, внутриопухолевый ангиогенез и повышает инвазивность опухоли и метастазирование. Более свежие данные также указывают на роль C5a/C5aR в создании иммуносупрессивных сред в контексте солидных опухолей (Sayegh ET et al., Cancer Med. 2014, 3: 747-758; Darling VR et al., Expert Rev Clin Immunol. 2015, 11: 255-263; Markiewski MM et al., Cancer Res. 2009, 69: 6367-6370), что приводит к усилению роста первичной опухоли за счет подавления противоопухолевых ответов (например усиленного рекрутирования миелоидных клеток, экспрессирующих C5aR, таких как супрессорная клетка миелоидного происхождения (MDSC) или макрофаги М2). Исходя из этих данных можно заключить, что стратегии комбинирования с уже известными противоопухолевыми средствами, такими как ингибиторы белков контрольных точек иммунного ответа, для усиления иммунного ответа субъекта за счет уменьшения иммуносупрессивного микроокружения находятся в центре внимания исследования и клинических разработок (Wang Y, et al: Cancer Discov. 2016, 6: 1022-1035).

На сегодняшний день одобрено только одно специфическое терапевтическое средство на основе комплемента, которое нацеливается на вышележащую молекулу С5а, а именно С5. Гуманизированное mAb к С5 экулизумаб способно связывать С5, предотвращая его расщепление и образование белков С5а и C5b, а также последующее образование MAC. Различные другие терапевтические моноклональные антитела, специфические в отношении С5, такие как ALXN1210 или LFG316, проходят клиническую оценку (Hawksworth OA et al., Mol Immunol. 2017, 89: 36-43). Однако, поскольку повышенный риск инфицирования является серьезной проблемой при лечении хронической индукции С5, специфическое нацеливание на нижележащие молекулы при предотвращении биологических активностей других компонентов комплемента является явным преимуществом. Соответственно, ряд антагонистических специфических в отношении С5а моноклональных антител находится в разработке.

Непосредственное нацеливание на C5aR имеет ряд преимуществ перед нацеливанием на С5 или С5а соответственно. Во-первых, ингибирование только рецептора сохранит активность MAC со снижением таким образом потенциального риска инфекций. Во-вторых, блокада C5aR позволяет продолжать взаимодействие С5а с его вторым рецептором C5L2. Поскольку сообщалось, что C5L2 обладает противовоспалительными эффектами, поддержание эффективного сигнального пути C5L2 может привести к повышению эффективности или снижению требований дозировки. В-третьих, непосредственное нацеливание на C5aR может обеспечить фармакодинамические преимущества по сравнению с подавлением растворимого С5а по причине его небольшой молекулярной массы и высокой скорости переключения. В целом, существует большой интерес к разработке ингибиторов C5aR, таких как аптамеры, пептиды и непептидные малые молекулы, которые проходят доклинические и клинические испытания.

В уровне техники была описана нейтрализация поликлональной антисыворотки или моноклональных антител, направленных против N-концевой внеклеточной области C5aR человека и способных препятствовать взаимодействию C5aR-C5a (см., например, Morgan et al., The Journal of Immunology, Vol 151, 377-388. No. 1, July 1, 1993; Oppermann et al., The Journal of Immunology, Vol 151, 3785-3794, No. 7, October 1, 1993),

Однако эти специфические в отношении C5aR антитела не подходят для клинической разработки и терапевтического применения у человека, особенно по причине их животного происхождения (что делает их иммуногенными для пациентов-людей), клональности и/или отсутствия перекрестной реактивности в отношении соответствующих видов животных.

Рассматривались возможности клинической разработки терапевтических антител, нацеливающихся на C5aR. Однако клиническая разработка антагонистического антитела нейтразумаб, специфического в отношении C5aR, гуманизированного mAb IgG4, была остановленав фазе II клинических испытаний из-за проблем с истощением клеток иммунной системы и иммуногенностью (Daniluk S et al., Annals of the Rheumatic Diseases. 2014, 73: 684-685). Поскольку C5aR, по-видимому, конститутивно экспрессируется в различных типах клеток, важно, чтобы антагонистическое антитело не вызывало какого-либо истощения целевых клеток.

Чтобы преодолеть ограничения нейтразумаба было создано второе поколение антител, специфических в отношении C5aR, а именно NNC0215-0384 (US 2013/0295116 (NOVO NORDISK); клон 32F3A6GL). Это антитело представляет собой человеческое антитело IgG1, полученное от трансгенных мышей, и в настоящее время оно проходит клиническую разработку как IPH5401 в области онкологии (Olivier Demaria et al., Innate Pharma 2017. Poster №B184. CRI-CIMT-EATI-AACR Mainz). IPH5401 несет подвергнутую сайленсингу Fc-область человеческого IgG1 для устранения способности антитела индуцировать эффекторную функцию. Это антитело называется в данном документе RefMAB №1.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает новые антитела и фрагменты антител.

Антитела и фрагменты антител, раскрытые в данном документе, могут специфически связываться C5aR человека и предпочтительно перекрестно реагировать с C5aR от макака-крабоеда. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела являются специфическими в отношении C5aR человека и C5aR макака-крабоеда. В некоторых других вариантах осуществления раскрытые антитела или фрагменты антител связываются с N-концевой внеклеточной областью C5aR человека и макака-крабоеда.

Это контрастирует с упомянутым выше антителом IPH5401 из предшествующего уровня техники, которое связывается со второй внеклеточной петлей C5aR человека, что приводит к отсутствию связывания с C5aR макака-крабоеда, широко используемого в токсикологических исследованиях релевантного вида.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что заявленные в данном документе антитела, специфические в отношении C5aR, не только значительно более эффективны в нейтрализации патофизиологических концентраций С5а по сравнению с IPH5401, но также демонстрировали повышенную эффективность с течением времени в подавлении С5-опосредованной активации нейтрофилов in vitro.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела способны эффективно подавлять индуцированную С5а активность C5aR in vitro, особенно при патофизиологической концентрации С5а. Раскрытые антитела или фрагменты антител способны также подавлять индуцированную С5а активацию лейкоцитов in vitro, что определяется их способностью подавлять индуцированную С5а положительную регуляцию CD11b в гранулоцитах и/или моноцитах. В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела или фрагменты антител подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека при концентрации IC₅₀, составляющей 42 нМ, в присутствии 150 нМ С5а человека in vitro. В некоторых других вариантах осуществления раскрытые антитела способны проявлять повышенную эффективность подавления индуцированной С5а положительной регуляции CD11b в гранулоцитах и/или моноцитах после продолжительного периода инкубации. Раскрытые антитела также могут быть эффективными в подавлении индуцированной С5а миграции нейтрофилов.

В целом, настоящее изобретение относится к новым антителам, которые превосходят антитела, специфические в отношении C5aR, известные из уровня техники. В частности, антитела по настоящему изобретению представляют собой человеческие антитела с высокой аффинностью связывания с C5aR человека, которые предпочтительно перекрестно реагируют с C5aR макака-крабоеда и обладают благоприятными функциональными свойствами и свойствами безопасности, которые ранее никогда не наблюдались. Эти свойства делают антитела по настоящему изобретению весьма желательными для терапевтического применения, такого как предупреждение и/или лечение воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также рака.

Настоящее изобретение предусматривает выделенные антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с C5aR человека, содержащие области CDR согласно таблице 1 или таблице 2 настоящего описания. Настоящее изобретение также предусматривает выделенные антитела или фрагменты антител, специфические в отношении C5aR человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащие аминокислотные последовательности согласно таблице 1 или таблице 2 настоящего описания. Настоящее изобретение также предусматривает выделенные антитела или фрагменты антител, специфические в отношении C5aR, содержащие тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC), содержащие аминокислотные последовательности согласно таблице 1 или таблице 2 настоящего описания.

Выделенные антитела по настоящему изобретению практически не индуцируют эффекторную функцию in vitro. Такая эффекторная функция может включать ADCP, ADCC или CDC. Кроме того, выделенные антитело или фрагменты антител по настоящему изобретению содержат одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU. В частности, выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению содержат вариант Fc-области человеческого IgG1, который содержит следующие аминокислотные замены: L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU.

Настоящее изобретение также предусматривает выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению для применения в медицине.

Настоящее изобретение также предусматривает способы лечения субъекта, страдающего заболеванием, таким как воспалительное или аутоиммунное заболевание или рак, посредством введения указанному субъекту эффективного количества антител или фрагментов антител по настоящему изобретению. Предпочтительно указанный субъект является человеком.

Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции, содержащие выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также предусматривает композиции на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также предусматривает композиции на основе вектора, включающие композиции на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также предусматривает клетки-хозяева, содержащие композиции на основе вектора или композиции на основе нуклеиновых кислот, кодирующих выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также предусматривает способы лечения субъекта, страдающего заболеванием, таким как воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание или рак, посредством введения указанному субъекту эффективного количества выделенных антител или фрагментов антител по настоящему изобретению. Предпочтительно указанный субъект является человеком.

Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции, содержащие выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Заявленные антитела или фрагменты антител являются применимыми. Более того, заявленный способ является применимым для идентификации таких антител или фрагментов антител.

Заявленные антитела или фрагменты антител применимы для изменения биологической активности C5aR человека. В частности, заявленные антитела или фрагменты антител предназначены для терапевтического применения, такого как лечение воспалительного или аутоиммунного заболевания или рака.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1. Клеточное связывание МАВ №1, МАВ №2, RefMAB №1 и отрицательного изотипического контроля MOR03207 с C5aR человека и макака-крабоеда, определенное посредством FACS. А. Зависимое от дозы связывание с C5aR человека, сверхэкспрессируемым на клетках СНО Flp-In. В. Зависимое от дозы связывание с C5aR макака-крабоеда, сверхэкспрессируемым на клетках СНО Flp-In. С.Среднее зависимое от дозы связывание с очищенными нейтрофилами человека, полученными из цельной крови трех разных доноров. D. Среднее зависимое от дозы связывание с очищенными нейтрофилами макака-крабоеда, полученными из цельной крови трех разных обезьян.

Фигура 2. Клеточное связывание МАВ №1, МАВ №2, RefMAB №1 и отрицательного изотипического контроля MOR03207 с C5aR человека, макака-крабоеда и грызуна, а также с C5aR, родственным GPCR, C5L2 человека, C3aR человека, FPR1 человека и ChemR23 человека, определенное посредством FACS, при концентрации IgG, составляющей 600 нМ.

Фигура 3. ELISA связывания МАВ №1 с двумя природными вариантами C5aR человека, а также с C5aR мыши, экспрессируемым на вирусоподобных частицах (VLP).

Фигура 4. PathHunter(- анализ β-аррестина от DiscoveRx. Нейтрализация рекрутирования β-аррестина, индуцированного с помощью С5а человека. А. Логарифмические кривые зависимости ответа от дозы для повышающихся концентраций рекомбинантного человеческого С5а при отсутствии или наличии МАВ №1 (50 нМ), МАВ №2 (50 нМ) и RefMAB №1 (50 нМ). В. Процент подавления вычисляли для трех повышающихся концентраций С5а человека (1,2 нМ, 11 нМ и 100 нМ соответственно) при конечной концентрации IgG, составляющей 50 нМ.

Фигура 5. Подавление индуцированной С5а человека положительной регуляции CD11b в гранулоцитах человека при обычных и патофизиологических концентрациях С5а. А+В. Сравнение МАВ №1, МАВ №2 и RefMAB №1 в анализе CD11b в цельной крови. Показаны логарифмические кривые зависимости подавления от дозы. Гранулоциты человека гейтировали как целевые клетки. В качестве количественно определяемых считываемых показателей вычисляли концентрацию IgG, необходимую для достижения 50% подавления положительной регуляции CD11b (концентрацию IC₅₀). Концентрации IC₅₀ для каждого IgG показаны ниже на оси х. А. Логарифмические кривые зависимости ответа от дозы для повышающихся концентраций IgG и 15 нМ С5а человека. В. Логарифмические кривые зависимости ответа от дозы для повышающихся концентраций IgG и 150 нМ С5а человека.

Фигура 6. Подавление индуцированной С5а человека положительной регуляции CD11b в гранулоцитах и моноцитах человека, определенное на протяжении пролонгированного периода времени инкубации. Сравнение МАВ №1 и RefMAB №1 в анализе CD11b в цельной крови после инкубации IgG с целевыми клетками в течение либо 20 минут, либо 300 минут.IgG добавляли в серийных разбавлениях и инкубировали в течение либо 20 минут, либо 300 минут с последующей стимуляцией с помощью 15 нМ С5а человека. Либо гранулоциты (фигуры 6А и В), либо моноциты (фигуры 6С и D) гейтировали в качестве целевых клеток. Определяли уровни CD11b. Показаны логарифмические кривые зависимости подавления от дозы. Данные выражены как% подавления положительной регуляции CD11b при 15 нМ С5а человека. Результаты для МАВ №1 показаны на фигурах 6А и С, и результаты для RefMAB №1 представлены на фигурах 6В и D.

Фигура 7. Подавление индуцированной С5а человека миграции нейтрофилов человека. МАВ №1 и отрицательный контроль MOR03207 тестировали при двух концентрациях IgG (100 нМ и 600 нМ соответственно) в присутствии 10 нМ С5а человека. Показаны средние значения из трех независимых анализов, выполненных в 3 разных моментах времени (15 мин, 25 мин, 35 мин). Нейтрофилы получали от 3 разных доноров-людей. Процент подавления вычисляли на основании миграции нейтрофилов в отсутствие антитела.

Фигура 8. Репортерный биоанализ ADCC и ADCP с применением Promega. Сравнение МАВ №1 и моноклонального контрольного IgG к C5aR, несущего либо Fc-область человеческого IgG1 дикого типа (не подвергнутую сайленсингу), либо вариант (подвергнутый сайленсингу) Fc-области, идентичный Fc-области МАВ №1. Кроме того, антитело MOR03207 изотипического контроля включали либо с вариантом, либо с Fc-областью человеческого IgG1 дикого типа. Анализы выполняли согласно инструкциям поставщика с применением либо сконструированных клеток Jurkat, экспрессирующих FcγRIIa_Н, для имитации пути ADCP, либо клеток Jurkat, экспрессирующих FcγRIIIa, вариант V158 с высокой аффинностью, для имитации пути ADCC, и клеток СНО, экспрессирующих C5aR. А. Результаты репортерного биоанализа ADCP при концентрации IgG, составляющей 10 мкг/мл. В. Результаты репортерного биоанализа ADCC при концентрации IgG, составляющей 10 мкг/мл. Данные представлены как средний сигнал флуоресценции, превышающий фон.

Фигура 9. Средний фармакокинетический профиль группы для МАВ №1 у крыс Han Wistar после однократного внутривенного введения 10 мг/кг IgG. Данные представлены как средние значения (концентрация IgG с течением времени) (стандартное отклонение (S) (N=3).

Фигура 10. Результаты профилирования панели белков (3Р) для МАВ №1 и МАВ №2. Числа для каждого антитела представляют собой полученный сигнал связывания каждого антитела и тестируемого белка по сравнению со связыванием антитела MOR03207 отрицательного изотипического контроля. Антитела тестировали при концентрации 10 нМ и 100 нМ соответственно.

Фигура 11. Высвобождение цитокинов созревшими in vitro макрофагами M1 и М2, полученными из моноцитов. Определяли уровни IL-10 и IL-12 посредством ELISA после обработки с помощью МАВ №1 и инкубации с С5а в течение ночи.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к ряду человеческих антител, которые распознают C5aR человека.

Определения

Термин "C5aR" относится к белку, известному как хемотаксический рецептор 1 анафилатоксина С5а или CD88.

C5aR человека (Uniprot: Р21730⏐1-350) (в данном документе называется "вариант D/K") характеризуется аминокислотной последовательностью

Описаны две природные миссенс-мутации C5aR человека ((http://www.uniprot.org/uniprot/P21730): Reference SNP (refSNP) Cluster Report: rs4467185 (MAF: 0.03) и Cluster Report: rs11880097 (MAF: 0.03). Одна мутация находится в пределах N-концевой внеклеточной области C5aR человека (положение 2 в SEQ ID NO: 1), приводя к замене D на N.

Белок C5aR человека, который содержит обе природные миссенс-мутации в своей последовательности (также в данном документе называемый "вариант N/N"), характеризуется аминокислотной последовательностью

C5aR макака-крабоеда (Macaca fascicularis) характеризуется аминокислотной последовательностью

C5aR мыши (Mus musculus) характеризуется аминокислотной последовательностью

C5aR крысы (Rattus norvegicus) характеризуется аминокислотной последовательностью

Термин "C5a" относится к белку, известному как компонент С5а комплемента человека.

С5а человека (Uniprot: Р01031⏐678-751) характеризуется аминокислотной последовательностью

Термин "C5L2" относится к белку, известному как хемотаксический рецептор 2 анафилатоксина С5а.

C5L2 человека характеризуется аминокислотной последовательностью

Термин "C3aR" относится к белку, известному как хемотаксический рецептор анафилатоксина С3а.

C3aR человека характеризуется аминокислотной последовательностью

Термин "FPR1" относится к белку, известному как рецептор fMet-Leu-Phe.

FPR1 человека характеризуется аминокислотной последовательностью

Термин "ChemR23" относится к белку, известному как хемокин-подобный рецептор 1.

ChemR23 человека характеризуется аминокислотной последовательностью

Используемый в данном документе термин "антитело" относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, который взаимодействует с антигеном. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в сокращенном виде в данном документе обозначена как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CHI, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в сокращенном виде в данном документе обозначена как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Термин "антитело" включает, например, моноклональные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, верблюжьи антитела и химерные антитела. Антитела могут относиться к любому изотипу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу. Как легкая, так и тяжелая цепи подразделяются на области структурной и функциональной гомологии.

Используемая в данном документе фраза "фрагмент антитела" относится к одной или нескольким частям антитела, которые сохраняют способность специфически взаимодействовать с (например, посредством связывания, стерического несоответствия, стабилизирующего пространственного распределения) антигеном. Примеры связывающих фрагментов включают без ограничения Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; F(ab)2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирном участке; Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1; Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из домена VH; и выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Более того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который позволяет им образовывать единую белковую цепь, в которой области VL и VH соединяются попарно с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "фрагмент антитела". Эти фрагменты антител получают с применением общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергаются скринингу в отношении применимости таким же образом, как и интактные антитела. Фрагменты антител также могут быть включены в однодоменные антитела, макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23: 1126-1136). Фрагменты антител можно прививать к остовам на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США №6703199, в котором описаны монотела на основе полипептида, представляющего собой фибронектин). Фрагменты антител могут быть включены в одноцепочечные молекулы, содержащие пару тандемных Fv-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих сайтов (Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8: 1057-1062; и патент США №5641870).

Используемые в данном документе термины "человеческое антитело" или "фрагмент человеческого антитела" представляют собой антитело или фрагмент антитела, содержащие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей человеческого происхождения. Человеческие антитела также можно выделять из синтетических библиотек или из организма трансгенных мышей (например XenoMouse) при условии, что соответствующая система обеспечивает получение антител, содержащих вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей человеческого происхождения. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также получена из таких последовательностей. Источники человеческого происхождения включают, например, человеческие последовательности зародышевой линии или мутантные версии человеческих последовательностей зародышевой линии или антитела, содержащего консенсусные каркасные последовательности, полученные в результате анализа человеческих каркасных последовательностей, например, как описано в Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296: 57-86).

Структуры и местоположения вариабельных доменов иммуноглобулинов, например CDR, можно определять с применением широко известных схем нумерации, например, схемы нумерации по Kabat, схемы нумерации по Chothia или комбинации схем по Kabat и Chothia (см., например, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273: 927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit, NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883; и Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948.

В данном документе термины "гуманизированное антитело" или "фрагмент гуманизированного антитела" определены как молекула антитела, которая содержит константные области антитела, полученные из последовательностей человеческого происхождения, и при этом вариабельные области антитела и их части или только CDR получены от другого вида. Например, гуманизированное антитело может содержать привитые CDR, где CDR вариабельного домена характеризуются происхождением, отличным от человеческого, тогда как один или несколько каркасов вариабельного домена характеризуются человеческим происхождением, и константный домен (если таковой имеется) характеризуется человеческим происхождением.

Термины "химерное антитело" или "фрагмент химерного антитела" определены в данном документе как молекула антитела, которая содержит константные области антитела, полученные из последовательностей, встречающихся у одного вида, или соответствующие им, и вариабельные области антитела, полученные от другого вида. Предпочтительно константные области антитела получены из последовательностей, встречающихся у человека, или соответствуют им, а вариабельные области антитела (например, VH-, VL-, CDR- или FR-области) получены из последовательностей, встречающихся у животного, отличного от человека, например, мыши, крысы, кролика или хомяка.

Термин "выделенное антитело" относится к антителу или фрагменту антитела, которые практически не содержат других антител или фрагментов антител, характеризующихся другой антигенной специфичностью. Более того, выделенные антитело или фрагмент антитела могут практически не содержать другой клеточный материал и/или химические вещества. Таким образом, в некоторых аспектах предусмотренные антитела представляют собой выделенные антитела, которые были отделены от антител с другой специфичностью. Выделенное антитело может представлять собой моноклональное антитело. Выделенное антитело может представлять собой рекомбинантное моноклональное антитело. Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом мишени, может, однако, характеризоваться перекрестной реактивностью с другими родственными антигенами, например из других видов (например видов-гомологов).

Используемый в данном документе термин "рекомбинантное антитело" включает все антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью средств, не существующих в природе. Например, антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, антитела, выбранные и выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг всего или части человеческого гена иммуноглобулина, последовательностей с другими последовательностями ДНК или антител, выделенных от животного (например мыши), которые являются трансгенными или трансхромосомными по отношению к человеческим генам иммуноглобулинов или полученной из них гибридомы. Предпочтительно такие рекомбинантные антитела содержат вариабельные области, в которых каркасные и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать мутагенезу in vitro (или, если используется животное, трансгенное по последовательностям человеческих Ig, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, поскольку получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственны им, в естественных условиях могут не встречаться в пределах репертуара антител зародышевой линии человека in vivo. Рекомбинантное антитело может представлять собой моноклональное антитело. В одном варианте осуществления антитела и фрагмент антитела, раскрытые в данном документе, выделены из библиотеки HuCAL (Rothe et al, J. Mol. Biol. (2008) 376, 1182-1200).

Как используется в данном документе, антитело "связывается специфически с", "специфически связывается с", является "специфическим в отношении" или "специфически распознает" антиген, такой как C5aR человека, если такое антитело способно различать такой антиген и один или несколько эталонных антигенов, поскольку специфичность связывания является не абсолютным, а относительным свойством. Например, можно осуществлять стандартный анализ ELISA. Оценку в баллах можно проводить посредством стандартного проявления окрашивания (например, с применением вторичного антитела с пероксидазой хрена и тетраметилбензидина с перекисью водорода). Реакция в определенных лунках оценивается по оптической плотности, например при 450 нм. Типичный фон (=отрицательная реакция) может соответствовать 0,1 OD; типичная положительная реакция может соответствовать 1 OD. Это означает, что разница между положительной и отрицательной реакциями может быть более чем 10-кратной. Как правило, определение специфичности связывания осуществляется с применением не одного эталонного антигена, а набора из приблизительно трех-пяти неродственных антигенов, таких как белки сухого молока, BSA, трансферрин и т.п.

Используемый в данном документе термин "аффинность" относится к силе взаимодействия между полипептидом и его мишенью в одном сайте. В пределах каждого сайта связывающая область полипептида взаимодействует со своей мишенью во многих сайтах посредством слабых нековалентных сил; чем больше взаимодействий, тем выше аффинность.

Используемый в данном документе термин "K_D" относится к константе диссоциации, которая получена из соотношения k_off и K_on (т.е. k_off/k_on) и выражается в виде молярной концентрации (М). Значения K_D для антигенсвязывающих фрагментов, таких как, например, моноклональные антитела, можно определить с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Способами определения K_D антигенсвязывающего фрагмента, такого как, например, моноклональное антитело, являются SET (титрование при равновесии в растворе) или поверхностный плазмонный резонанс с применением биосенсорной системы, такой как система Biacore®. В настоящем изобретении антитело, специфическое в отношении C5aR, как правило, характеризуется константой скорости диссоциации (K_D) (k_off/k_on), составляющей менее чем 5×10^-2 М, менее чем 10^-2 М, менее чем 5×10^-3 М, менее чем 10^-3 М, менее чем 5×10^-4 М, менее чем 10^-4 М, менее чем 5×10^-5 М, менее чем 10^-5 М, менее чем 5×10^-6 М, менее чем 10^-6 М, менее чем 5×10^-7 М, менее чем 10^-7 М, менее чем 5×10^-8 М, менее чем 10^-8 М, менее чем 5×10^-9 М, менее чем 10^-9 М, менее чем 5×10^-10 М, менее чем 10^-10 М, менее чем 5×10^-11 М, менее чем 10^-11 М, менее чем 5×10^-12 М, менее чем 10^-12 М, менее чем 5×10^-13 М, менее чем 10^-13 М, менее чем 5×10^-14 М, менее чем 10^-14 М, менее чем 5×10^-15 М или менее чем 10^-15 М или меньше.

Термин "эпитоп" включает любую белковую область, которая специфически распознается антителом или фрагментом антитела или иным образом взаимодействует с молекулой. Обычно эпитопы представляют собой химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов или Сахаров, и обычно могут обладать специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Как будет понятно специалисту в данной области техники, практически все, с чем антитело способно специфически связываться, может представлять собой эпитоп.

"Композиции" по настоящему изобретению можно использовать для терапевтических или профилактических применений. Настоящее изобретение, таким образом, относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела, раскрытые в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество для них. В связанном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения рака. Такой способ предусматривает стадии введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит антитело или фрагмент антитела, описанные в данном документе.

Настоящее изобретение относится к терапевтическим способам, включающим введение терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела, раскрытых в данном документе, субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Используемые в данном документе выражения "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" относятся к количеству антитела к C5aR, необходимому для индукции требуемого биологического ответа. В соответствии с настоящим изобретением терапевтически эффективное количество представляет собой количество антитела к C5aR, необходимое для лечения и/или предупреждения заболевания.

"Вводимый" или "введение" включают без ограничения доставку лекарственного средства с помощью инъекционной формы, такой как, например, для внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного пути или чресслизистого пути, например, в виде назального спрея или аэрозоля для ингаляции или в виде принимаемых внутрь раствора, капсулы или таблетки. Предпочтительным является введение с помощью инъекционной формы.

Используемые в данном документе термины "лечение", "лечить" или "обеспечение лечения" и подобные относятся к клиническому вмешательству в попытке изменить природный ход заболевания у субъекта, подлежащего лечению, которое может быть выполнено либо для профилактики, либо в ходе клинической патологии. Желаемые эффекты лечения включают без ограничения предупреждение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, снижение любых непосредственных или опосредованных патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или смягчение болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением используются для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин "эффекторная функция" относится к таким биологическим активностям, присущим Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Неограничивающие примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора и антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP); отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.

"Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой антитела, связывающиеся с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, NK-клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяют этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген целевой клеткой, а затем цитотоксические клетки уничтожают целевую клетку цитотоксинами. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII.

"Комплементзависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису целевой клетки в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется посредством связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса) по настоящему изобретению, которые связываются со своим когнатным антигеном.

"Антителозависимый клеточный фагоцитоз" или "ADCP" относится к механизму устранения покрытых антителами целевых клеток посредством интернализации фагоцитирующими клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки.

"Предупреждать" или "предупреждение" относятся к снижению риска приобретения или развития заболевания (т.е. предупреждение развития хотя бы одного из клинических симптомов заболевания у субъекта, который может подвергаться воздействию фактора, вызывающего заболевание, или характеризуется предрасположенностью к заболеванию до начала заболевания). "Предупреждение" также относится к способам, которые направлены на предупреждение начала проявления заболевания или его симптомов или которые обеспечивают задержку начала проявления заболевания или его симптомов.

Используемые в контексте данного документа термины "субъект" или "вид" относятся к любому млекопитающему, включая грызунов, таких как мышь или крыса, и приматов, таких как макак-крабоед (Масаса fascicularis), макак-резус (Масаса mulatto) или люди (Homo sapiens). Предпочтительно субъектом является примат, наиболее предпочтительно человек.

В данном описании, если контекст не требует иного, слова "содержать", "иметь" и "включать" и их соответствующие вариации, такие как "содержит", "содержащий", "имеет", "имеющий", "включает" и "включающий" следует понимать как подразумевающие включение указанного элемента, или целого числа, или группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента, или целого числа, или группы элементов или целых чисел.

Используемые в данном документе термины "сконструированный" или "модифицированный" включают манипуляцию с нуклеиновыми кислотами или полипептидами посредством способов синтеза (например, посредством рекомбинантных методик, синтеза пептидов in vitro, посредством ферментативного или химического объединения пептидов или некоторой комбинации этих методик). Предпочтительно антитела или фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением сконструированы или модифицированы с улучшением одного или нескольких свойств, таких как связывание антигена, стабильность, период полужизни, эффекторная функция, иммуногенность, безопасность и т.п.

Используемый в данном документе термин "вариант" относится к полипептиду, который отличается от эталонного полипептида одной или несколькими модификациями, например, аминокислотными заменами, вставками или делециями.

Используемый в данном документе термин "аминокислотная мутация" охватывает аминокислотные замены, делеции, вставки и модификации. Любая комбинация замены, делеции, вставки и модификации может быть осуществлена при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например пониженным связыванием с Fc-рецептором. Делеции и вставки аминокислотной последовательности включают N- и/или С-концевые делеции и вставки аминокислотных остатков. Конкретные аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены. Аминокислотные замены включают замену двадцати стандартных аминокислот не встречающимися в природе аминокислотами или производными встречающихся в природе аминокислот.Аминокислотные мутации могут быть получены с применением генетических или химических способов, хорошо известных из уровня техники. Генетические способы могут включать сайт-направленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и т.п. Предполагается, что также могут быть применимы способы изменения группы боковой цепи аминокислотного остатка посредством способов, отличных от генной инженерии, таких как химическая модификация. В данном документе могут быть использованы различные обозначения для обозначения одной и той же аминокислотной мутации. Например, замена глицина в положении 327 Fc-области на аланин может быть обозначена как 237А, G337, G337A или Gly329Ala.

Используемый в данном документе термин "ЕС₅₀" относится к концентрации антитела, или фрагмента антитела, или лиганда, которая индуцирует ответ в анализе, составляющий среднее между исходным и максимальным. Следовательно, она представляет собой концентрацию антитела или лиганда, при которой наблюдается эффект, составляющий 50% от максимального.

Используемый в данном документе термин "IC₅₀" относится к концентрации антитела или фрагмента антитела, которая подавляет ответ в анализе, составляющий среднее между максимальным ответом и исходным. Она представляет собой концентрацию антитела, которая снижает данный ответ на 50%.

Термины "подавление", или "подавлять", или "снижение", или "снижать", или "нейтрализация", или "нейтрализовать" относятся к снижению или прекращению любой фенотипической характеристики (такой как связывание, или биологическая активность, или функция) или к снижению или прекращению встречаемости, степени или вероятности этой характеристики. "Подавление", "снижение" или "нейтрализация" не обязательно должны быть полными, важно, чтобы их можно было выявить с применением подходящего анализа. В некоторых вариантах осуществления термины "снижать", или "подавлять", или "нейтрализовать" означают способность вызывать снижение на 20% или больше. В другом варианте осуществления термины "снижать", или "подавлять", или "нейтрализовать" означают способность вызывать снижение на 50% или больше. В еще одном варианте осуществления термины "снижать", или "подавлять", или "нейтрализовать" означают способность вызывать общее снижение на 75%, 85%, 90%, 95% или больше.

Используемый в данном документе термин "антагонистическое" антитело относится к антителу или фрагменту антитела, которые взаимодействуют с антигеном и частично или полностью подавляют или нейтрализуют биологическую активность, или функцию, или любую другую фенотипическую характеристику целевого антигена. Белок "дикого типа" представляет собой версию или вариант белка, встречающегося в природе. Аминокислотная последовательность белка дикого типа, например Fc-области человеческого антитела IgG1, представляет собой аминокислотную последовательность белка, встречающегося в природе. По причине аллотипических различий у белка дикого типа может быть более одной аминокислотной последовательности. Например, существует несколько аллотипов встречающихся в природе константных областей тяжелой цепи человеческого IGg1 (см., например, Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1).

Термин "Fc-область" используется для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc-область иммуноглобулина обычно содержит два константных домена, СН2-домен и СН3-домен. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи IgG могут незначительно варьироваться, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяется как простирающаяся от Cys226 или от Pro230 до С-конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Варианты осуществления

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

а) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41, область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

а) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, содержащим 6 CDR, определенных по Kabat, любого из антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, содержащим 6 CDR, определенных по Chothia, любого из антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой моноклональное антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела относятся к изотипу IgG. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела относятся к классу IgG1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела практически не индуцируют эффекторную функцию in vitro.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 35, или VL под SEQ ID NO: 36, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 35, или VL под SEQ ID NO: 36, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 42, или VL под SEQ ID NO: 43, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 42, или VL под SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36 или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, содержащим вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL) любого из антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, содержащим тяжелую цепь (VH) и легкую цепь (LC) любого из антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 35, или VL под SEQ ID NO: 36

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 42, или VL под SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 35, или VL под SEQ ID NO: 36.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, и дополнительно содержат VH под SEQ ID NO: 42, или VL под SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой моноклональное антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 и с VL под SEQ ID NO: 36.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 42 и с VL под SEQ ID NO: 43.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 44 и с LC под SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO: 45.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 и с LC под SEQ ID NO: 38.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 44 и с LC под SEQ ID NO: 45.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой моноклональное антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие или гуманизированные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие антитело или фрагмент антитела.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека по настоящему изобретению, представляют собой рекомбинантные или синтетические антитело или фрагмент антитела. В дополнительном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой выделенные рекомбинантные моноклональные антитело или фрагмент антитела. В дополнительном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой выделенные рекомбинантные моноклональные человеческие антитело или фрагмент антитела.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR в соответствии с настоящим изобретением, относятся к изотипу IgG. В другом варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела относятся к классу IgG1. В другом варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела относятся к классу IgG1 человека.

Нуклеиновые кислоты

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные выделенные указанные антитело или фрагмент антитела содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека, где последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 46, область HCDR2 под SEQ ID NO: 47, область HCDR3 под SEQ ID NO: 48, область LCDR1 под SEQ ID NO: 51, область LCDR2 под SEQ ID NO: 52 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 53, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 49, область HCDR2 под SEQ ID NO: 50, область HCDR3 под SEQ ID NO: 48, область LCDR1 под SEQ ID NO: 51, область LCDR2 под SEQ ID NO: 52 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 53, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 58, область HCDR2 под SEQ ID NO: 59, область HCDR3 под SEQ ID NO: 60, область LCDR1 под SEQ ID NO: 63, область LCDR2 под SEQ ID NO: 64 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 65, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 61, область HCDR2 под SEQ ID NO: 62, область HCDR3 под SEQ ID NO: 60, область LCDR1 под SEQ ID NO: 63, область LCDR2 под SEQ ID NO: 64 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 65.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека, где последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 70, область HCDR2 под SEQ ID NO: 71, область HCDR3 под SEQ ID NO: 72, область LCDR1 под SEQ ID NO: 75, область LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 77, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 73, область HCDR2 под SEQ ID NO: 74, область HCDR3 под SEQ ID NO: 72, область LCDR1 под SEQ ID NO: 75, область LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 77, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 82, область HCDR2 под SEQ ID NO: 83, область HCDR3 под SEQ ID NO: 84, область LCDR1 под SEQ ID NO: 87, область LCDR2 под SEQ ID NO: 88 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 89, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 85, область HCDR2 под SEQ ID NO: 86, область HCDR3 под SEQ ID NO: 84, область LCDR1 под SEQ ID NO: 87, область LCDR2 под SEQ ID NO: 88 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 89.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат VH под SEQ ID NO: 54 и VL под SEQ ID NO: 55 или VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 54 и/или VL под SEQ ID NO: 55.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат VH под SEQ ID NO: 66 и VL под SEQ ID NO: 67 или VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 66 и/или VL под SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат VH под SEQ ID NO: 78 и VL под SEQ ID NO: 79 или VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 78 и/или VL под SEQ ID NO: 79.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат VH под SEQ ID NO: 90 и VL под SEQ ID NO: 91 или VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 90 и/или VL под SEQ ID NO: 91.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 56 и LC под SEQ ID NO: 57 или НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 56 и/или LC под SEQ ID NO: 57.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 68 и LC под SEQ ID NO: 69 или НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 68 и/или LC под SEQ ID NO: 69.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 80 и LC под SEQ ID NO: 81 или НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 80 и/или LC под SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 92 и LC под SEQ ID NO: 93 или НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 92 и/или LC под SEQ ID NO: 93.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 56 и LC под SEQ ID NO: 57.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 68 и LC под SEQ ID NO: 69.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 80 и LC под SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, раскрытого в данном документе, где указанные последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС под SEQ ID NO: 92 и LC под SEQ ID NO: 93.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент, специфические в отношении C5aR человека, где последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат VH и VL любого из антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, кодируемые любой из последовательностей нуклеиновой кислоты или множества последовательностей нуклеиновой кислоты, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих любые из выделенных антител или фрагментов антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих любые из выделенных антител или фрагментов антител, специфических в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты содержат НС и LC любого из антител или фрагментов антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления указанная композиция на основе нуклеиновой кислоты, и/или указанная_последовательность нуклеиновой кислоты, и/или множество последовательностей нуклеиновой кислоты являются выделенными.

Векторы

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию на основе вектора, содержащую вектор или множество векторов, содержащих композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию на основе вектора, содержащую вектор или множество векторов, содержащих композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих любые из выделенных антител или фрагментов антител, специфических в отношении C5aR человека, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию на основе вектора, содержащую вектор или множество векторов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, раскрытых в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления указанные композиция на основе вектора, и/или вектор, и/или множество векторов являются выделенными.

Клетки-хозяева

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает клетку-хозяина, содержащую композицию на основе вектора, содержащую вектор или множество векторов, содержащих композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей композицию на основе вектора, содержащую вектор или множество векторов, содержащих композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR, раскрытые в таблице 1 или таблице 2.

В одном варианте осуществления клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением способна экспрессировать выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, кодируемые композицией на основе вектора или композицией на основе нуклеиновой кислоты.

В дополнительном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой выделенную клетку-хозяина. В дополнительном варианте осуществления указанная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В одном варианте осуществления указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека. В другом варианте осуществления указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО. В одном варианте осуществления указанная клетка представляет собой клетку НЕК. В другом варианте осуществления указанная клетка представляет собой клетку PERC.6. В одном варианте осуществления указанная клетка представляет собой клетку НКВ11.

Специалисту будет понятно, что последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и/или легкую цепь антитела или фрагмента антитела по настоящему изобретению, могут быть клонированы в разные векторы или в один и тот же вектор.

Векторы могут быть введены в соответствующие клетки-хозяева, такие как прокариотические (например бактериальные) или эукариотические (например дрожжей или млекопитающих) клетки, посредством способов, известных из уровня техники (см., например, "Current Protocol in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds.), Greene Publishing Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989 and 1992). Многочисленные клонирующие векторы известны специалистам в данной области техники, и отбор подходящего клонирующего вектора является предметом выбора. Ген может находиться под контролем промотора, сайта связывания рибосом (для бактериальной экспрессии) и необязательно оператора (совместно в данном документе называются "контрольными" элементами) таким образом, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая требуемый белок, транскрибируется в РНК в клетке-хозяине, трансформированной вектором, содержащим эту конструкцию экспрессии. Кодирующая последовательность может содержать или может не содержать сигнальный пептид или лидерную последовательность. При экспрессии в клетках-хозяевах получают антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению. Эти стадии могут быть выполнены разными способами, известными специалисту в данной области техники. Как правило, такие стадии обычно включают трансформацию или трансфекцию подходящей клетки-хозяина композицией на основе нуклеиновой кислоты, или композицией на основе вектора, или инфекционной частицей, которая кодирует антитело или фрагменты антител. Кроме того, такие стадии обычно включают культивирование указанных клеток-хозяев в условиях, подходящих для пролиферации (размножения, роста) указанных клеток-хозяев, и стадию культивирования в условиях, подходящих для продуцирования (экспрессии, синтеза) кодируемых антитела или фрагмента антитела. Культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для пролиферации или экспрессии, обычно осуществляется в присутствии среды, содержащей компоненты, подходящие для роста клеток или индукции экспрессии. В конкретных вариантах осуществления способы получения антител или фрагментов антител по настоящему изобретению дополнительно включают стадию выделения и очистки полученных антитела или фрагмента антитела из клеток-хозяев или среды. Если система экспрессии секретирует белок в ростовую среду, то белок можно очистить непосредственно из среды. Если белок не секретируется, его выделяют из клеточных лизатов или извлекают из фракции клеточных мембран. Выбор подходящих условий роста и способов извлечения находится в компетенции специалистов в данной области техники. Затем антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению можно очистить посредством ряда методик, известных специалисту в данной области техники.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека, любого из антител, раскрытых в таблице 1 или таблице 2. В одном варианте осуществления предусмотрен способ получения выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей композицию на основе вектора, содержащую вектор или множество векторов, содержащих композицию на основе нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты или множество последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, в условиях, подходящих для экспрессии антитела или фрагмента антитела, и выделение антитела или фрагмента антитела из клетки-хозяина или культуральной среды клетки-хозяина. Антитело или фрагмент антитела, выделенные как описано в данном документе, могут быть очищены посредством методик, известных из уровня техники, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография и т.п.Условия, используемые для очистки конкретных антитела или фрагмента антитела, будут частично зависеть от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и будут очевидны для специалистов в данной области техники. Для очистки посредством аффинной хроматографии можно использовать антитело, лиганд, рецептор или антиген, с которыми связываются антитело или фрагмент антитела. Например, для очистки антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением посредством аффинной хроматографии можно использовать матрицу с белком А или белком G. Чистота антитела или фрагмента антитела может быть определена посредством любого из множества хорошо известных аналитических способов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п.

Специфичность

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, раскрытым в таблице 1 или таблице 2. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением являются специфическими в отношении C5aR человека.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением являются специфическими в отношении C5aR человека, кодируемого аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением являются специфическими в отношении полипептида,_содержащего_аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением являются специфическими в отношении полипептида, состоящего из_аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с внеклеточной областью C5aR человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с N-концевой внеклеточной областью C5aR человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с N-концевой внеклеточной областью C5aR человека, где N-концевая внеклеточная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с N-концом C5aR человека, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 13.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой выделенные рекомбинантные человеческие моноклональные антитело или фрагмент антитела.

Видовая перекрестная реактивность

В дополнительных вариантах осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением перекрестно реагируют с C5aR макака-крабоеда (яванского макака). В другом варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением являются специфическими в отношении C5aR человека и C5aR макака-крабоеда.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела связываются посредством перекрестной реактивности с C5aR макака-крабоеда. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением специфически связываются с внеклеточной областью C5aR человека и C5aR макака-крабоеда. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с N-концевой внеклеточной областью C5aR человека и C5aR макака-крабоеда. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с N-концевой внеклеточной областью C5aR человека и C5aR макака-крабоеда, где N-концевая внеклеточная область C5aR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

В еще одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением не связываются с C5aR грызуна, таким как C5aR мыши или крысы.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 и/или SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 13 и/или SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека и C5aR макака-крабоеда, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%

идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Моновалентная аффинность в отношении пептидов C5aR

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела характеризуются моновалентной аффинностью в отношении пептида C5aR человека, содержащего SEQ ID NO: 13, с K_D, составляющей 100 нМ или меньше, например, 90 нМ или меньше, 80 нМ или меньше, 70 нМ или меньше, 60 нМ или меньше, 50 нМ или меньше, 40 нМ или меньше, 30 нМ или меньше, 20 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или 1 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления указанная моновалентная аффинность определяется в формате IgG. В определенных вариантах осуществления указанная моновалентная аффинность определяется посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в данном документе в примере 4.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела. Кажущаяся аффинность (бивалентная) в отношении пептидов C5aR

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся аффинностью в отношении пептида C5aR человека, содержащего SEQ ID NO: 13, с K_D, составляющей 1 нМ или меньше, например, 0,5 нМ или меньше, 0,4 нМ или меньше, 0,3 нМ или меньше, 0,2 нМ или меньше, 0,1 нМ или меньше, 90 пМ или меньше, 80 пМ или меньше, 70 пМ или меньше, 60 пМ или меньше, 50 пМ или меньше, 40 пМ или меньше, 30 пМ или меньше, 20 пМ или меньше, 10 пМ или меньше, 5 пМ или меньше, или 1 пМ или меньше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся аффинностью в отношении пептида C5aR макака-крабоеда, содержащего SEQ ID NO: 14, с K_D, составляющей 300 нМ или меньше, например, 250 нМ или меньше, 200 нМ или меньше, 150 нМ или меньше, 100 нМ или меньше, 90 нМ или меньше, 80 нМ или меньше, 70 нМ или меньше, 60 нМ или меньше, 50 нМ или меньше, 40 нМ или меньше, 30 нМ или меньше, 20 нМ или меньше, 10 нМ или 1 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся аффинностью в отношении пептида C5aR человека, содержащего SEQ ID NO: 13, с K_D, составляющей 0,3 нМ или меньше, и в отношении пептида C5aR макака-крабоеда, содержащего SEQ ID NO: 14, с K_D, составляющей 150 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся_аффинностью в отношении пептида C5aR человека, содержащего SEQ ID NO: 13, с K_D, составляющей 0,05 нМ или меньше, и в отношении пептида C5aR макака-крабоеда, содержащего SEQ ID NO: 14, с K_D, составляющей 80 нМ или меньше.

В определенных вариантах осуществления указанная кажущаяся аффинность определяется в формате IgG. В одном варианте осуществления указанная кажущаяся аффинность определяется посредством биослойной интерферометрии (BLI), как описано в данном документе в примере 5.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Кажущаяся аффинность (бивалентная) в отношении полноразмерного C5aR

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся аффинностью в отношении C5aR человека с K_D, составляющей 10 нМ или меньше, например, 5 нМ или меньше, 4 нМ или меньше, 3 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше, 0,5 нМ или меньше, 0,4 нМ или меньше, 0,3 нМ или меньше, 0,2 нМ или меньше, или 0,1 нМ или меньше.

В вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся_аффинностью в отношении C5aR макака-крабоеда с K_D, составляющей 10 нМ или меньше, например, 9 нМ или меньше, 8 нМ или меньше, 7 нМ или меньше, 6 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 4 нМ или меньше, 3 нМ или меньше, или 1 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело характеризуется кажущейся аффинностью в отношении C5aR человека с K_D, составляющей 0,5 нМ или меньше, и в отношении C5aR макака-крабоеда с K_D, составляющей 5 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления указанный C5aR человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления указанный C5aR человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления указанный C5aR макака-крабоеда содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3.

В определенных вариантах осуществления указанная кажущаяся аффинность определяется в формате IgG. В вариантах осуществления указанные C5aR человека или C5aR макака-крабоеда экспрессируются на клетках. В вариантах осуществления указанные C5aR человека или C5aR макака-крабоеда экспрессируются на сконструированных клетках СНО, экспрессирующих полноразмерный человека. В вариантах осуществления указанные клетки СНО представляют собой клетки СНО Flp-In.

В определенных вариантах осуществления указанная кажущаяся аффинность определяется, как описано в данном документе в примере 6.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28,

область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32,

область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31,

область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32,

область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39,

область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32,

область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41,

область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32,

область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Кажущаяся ЕС₅₀ в отношении полноразмерного C5aR

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело связывается с C5aR человека с концентрацией ЕС50, составляющей 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 4 нМ или меньше, 3 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше, 0,5 нМ или меньше, 0,4 нМ или меньше, 0,3 нМ или меньше, 0,2 нМ или меньше, или 0,1 нМ или меньше.

В вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело связывается с C5aR макака-крабоеда с концентрацией ЕС50, составляющей 20 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 9 нМ или меньше, 8 нМ или меньше, 7 нМ или меньше, 6 нМ или меньше, 5 нМ или меньше, 4 нМ или меньше, 3 нМ или меньше, или 1 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанное выделенное антитело связывается с C5aR человека и C5aR макака-крабоеда с концентрацией ЕС₅₀ K_D, составляющей 10 нМ или меньше.

В одном варианте осуществления указанный C5aR человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления указанный C5aR человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления указанный C5aR макака-крабоеда содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3.

В определенных вариантах осуществления указанная концентрация ЕС₅₀ определяется в формате IgG. В вариантах осуществления указанные C5aR человека или C5aR макака-крабоеда экспрессируются на клетках. В вариантах осуществления указанные C5aR человека или C5aR макака-крабоеда экспрессируются на сконструированных клетках СНО, экспрессирующих полноразмерный человека. В вариантах осуществления указанные клетки СНО представляют собой клетки СНО Flp-In. В определенных вариантах осуществления указанные C5aR человека или C5aR макака-крабоеда экспрессируются на нейтрофилах. В вариантах осуществления указанный C5aR человека экспрессируется на нейтрофилах человека. В вариантах осуществления указанный C5aR макака-крабоеда экспрессируется на нейтрофилах макака-крабоеда. В определенных вариантах осуществления указанные нейтрофилы получают из цельной крови. В определенных вариантах осуществления указанная концентрация ЕС50 определяется, как описано в данном документе в примере 7.

В дополнительных вариантах осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, практически не связываются с родственным C5aR антигеном, выбранным из группы, состоящей из C5L2 человека, ChemR23 человека, FPR1 и C3aR человека. В определенных вариантах осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, практически не связываются с родственным C5aR антигеном, выбранным из группы, состоящей из C5L2 человека, ChemR23 человека, FPR1 и C3aR человека, при концентрации IgG, составляющей 300 нМ. В одном варианте осуществления указанное связывание определяется, как описано в примере 7.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 37 или 44 и с VL под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные антитело или фрагмент антитела связываются с C5aR человека, содержащим SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2, с концентрацией ЕС50, составляющей 5 нМ или меньше, например, 4 нМ или меньше, 3 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1 нМ или меньше, или 0,5 нМ или меньше.

В определенных вариантах осуществления указанный C5aR человека представлен на вирусоподобных частицах. В определенных вариантах осуществления указанный C5aR человека экспрессируется как слитый белок. В определенных вариантах осуществления указанный C5aR человека слит с белком GAG. В вариантах осуществления указанный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, раскрытую в таблице 8. В определенных вариантах осуществления указанное связывание определяется посредством ELISA, как описано в примере 8.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ Ш NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ Ш NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ Ш NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Функциональность - С5А-индуцируемая активация C5aR

В целом, выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для предотвращения или подавления взаимодействия между C5aR человека и С5а человека, таким образом предотвращая, подавляя, нейтрализуя или снижая сигнальные пути, которые опосредованы C5aR, и/или модулируя биологические пути и механизмы, в которых участвует C5aR.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным антителу или фрагменту антитела, специфическим в отношении C5aR человека, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела специфически нарушают C5aR-опосредованную трансдукцию сигнала.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, специфически нарушают взаимодействие С5а с C5aR, экспрессируемым на клетках. В еще одном дополнительном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела способны специфически нарушать С5а-индуцированную трансдукцию сигнала, опосредованную C5aR.

В способах анализа функциональной активности антитела, специфического в отношении C5aR, можно использовать анализы связывания, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) и другие способы, которые известны из уровня техники (см. Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) и Maddox, D.E. et al. (1983; J. Exp.Med. 158:1211-1216)). В качестве альтернативы, в анализах можно тестировать способность выделенных антитела или фрагмента антитела по настоящему изобретению вызывать биологический ответ в результате связывания с C5aR либо in vivo, либо in vitro. Такие анализы описаны в примерах, раскрытых в данном документе. Другие подходящие анализы будут известны специалистам в данной области техники.

В определенных вариантах осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению антагонизируют активность C5aR человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела нейтрализуют активность C5aR человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению подавляют активность C5aR человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению подавляют передачу сигнала C5aR человека. В одном варианте осуществления указанные активность C5aR человека или передача сигнала C5aR человека индуцируются посредством С5а. В одном варианте осуществления указанные активность C5aR человека или передача сигнала C5aR человека индуцируются посредством взаимодействия С5а человека с C5aR человека. В одном варианте осуществления указанные активность C5aR или передача сигнала C5aR индуцируются посредством связывания С5а человека с C5aR человека. В одном варианте осуществления указанный C5aR экспрессируется на клетках. В одном варианте осуществления указанные активность C5aR человека или передача сигнала C5aR человека подавляются in vitro, и/или ex vivo, и/или in vivo.

С5А-индуцированное рекрутирование β-аррестина

Способность выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавлять индуцированную С5а активацию C5aR тестировали в анализе рекрутирования β-аррестина, как описано в примере 14, и выявили, что оба антитела являются еще более эффективными антагонистами активности C5aR по сравнению с известным из уровня техники антителом RefMAB №1, особенно при высоких патофизиологических концентрациях С5а.

Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, подавляют способность С5а индуцировать активность C5aR. В одном варианте осуществления указанная индуцированная С5а активность C5aR определяется в анализе рекрутирования β-аррестина, как описано в примере 14. В одном варианте осуществления указанная индуцированная С5а активность C5aR определяется in vitro.

В одном таком варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела подавляют способность С5а человека индуцировать опосредованное C5aR человека рекрутирование β-аррестина. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела подавляют индуцированное С5а человека рекрутирование β аррестина. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела подавляют опосредованное C5aR человека рекрутирование β-аррестина.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, подавляют индуцированное С5а человека взаимодействие C5aR человека с β-аррестином. В одном таком варианте осуществления указанное индуцированное С5а человека взаимодействие C5aR человека с β-аррестином и/или такое индуцированное С5а человека рекрутирование бета-аррестина измеряются с применением комплементации фрагментов фермента бета-галактоз ид азы. В одном варианте осуществления указанное индуцированное С5а человека взаимодействие C5aR человека с β-аррестином и/или такое индуцированное С5а человека рекрутирование β-аррестина определяются, как описано в примере 14. В одном таком варианте осуществления указанное индуцированное С5а человека взаимодействие C5aR человека с β-аррестином и/или такое индуцированное С5а человека рекрутирование β-аррестина тестируется при концентрации IgG, составляющей 50 нМ.

Способность выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением подавлять индуцированную С5а человека активность C5aR человека, например подавлять индуцированное С5а человека взаимодействие C5aR с β-аррестином и/или индуцированное С5а человека опосредованное C5aR человека β-рекрутирование, может быть определена посредством построения кривых зависимости ответа от дозы для повышающихся концентраций С5а человека и фиксированной концентрации IgG и посредством вычисления соответствующих концентраций ЕС50.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела повышают концентрацию ЕС₅₀, определяемую для С5а человека в анализе рекрутирования β-аррестина, в по меньшей мере 5 раз или больше, например, в по меньшей мере 6 раз, в по меньшей мере 7 раз, в по меньшей мере 8 раз, в по меньшей мере 9 раз, в по меньшей мере 10 раз, в по меньшей мере 11 раз, в по меньшей мере 12 раз или в по меньшей мере 13 раз, при концентрации IgG, составляющей 50 нМ, по сравнению с концентрацией ЕС50, определяемой в отсутствие указанных выделенных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела повышают концентрацию ЕС₅₀, определяемую для С5а человека в анализе рекрутирования β-аррестина, при концентрации IgG, составляющей 50 нМ, в приблизительно 5 раз, приблизительно 6 раз, приблизительно 7 раз, приблизительно 8 раз, приблизительно 9 раз, приблизительно 10 раз, приблизительно 11 раз, приблизительно 12 раз или приблизительно 13 раз по сравнению с концентрацией ЕС₅₀, определяемой в отсутствие указанных выделенных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, где указанный С5а человека должен присутствовать в концентрации, которая выше в по меньшей мере 5 раз или больше, например, по меньшей мере 6 раз или больше, по меньшей мере 7 раз или больше, по меньшей мере 8 раз или больше, по меньшей мере 9 раз или больше, по меньшей мере 10 раз или больше, по меньшей мере 11 раз или больше, по меньшей мере 12 раз или больше или по меньшей мере 13 раз или больше, для индукции такой же активности C5aR человека в анализе рекрутирования β-аррестина при концентрации IgG, составляющей 50 нМ, по сравнению с концентрацией С5а человека в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления указанный анализ рекрутирования β-аррестина выполняется, как описано в примере 14. В одном варианте осуществления указанный анализ рекрутирования β-аррестина выполняется in vitro.

В качестве альтернативы, способность выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR в соответствии с настоящим изобретением, подавлять индуцированное С5а опосредованное C5aR рекрутирование β-аррестина может быть определена посредством вычисления % подавления для различных концентраций С5а человека.

В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированное С5а человека опосредованное C5aR человека рекрутирование β-аррестина на по меньшей мере 50%, на по меньшей мере 55%, на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 80% или на по меньшей мере 90% при концентрации IgG, составляющей 50 нМ, и в присутствии 1,2 нМ или 11 нМ С5а человека по сравнению с уровнем индуцированного С5а человека опосредованного C5aR человека рекрутирования β-аррестина в присутствии 1,2 нМ или 11 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагменты антитела, специфические в отношении C5aR в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированное С5а человека опосредованное C5aR человека рекрутирование бета-аррестина на по меньшей мере 25%, например, на по меньшей мере 30%, на по меньшей мере 35%, на по меньшей мере 40%, на по меньшей мере 45% или на по меньшей мере 50% при концентрации IgG, составляющей 50 нМ, и в присутствии 1,2 нМ или 11 нМ С5а человека по сравнению с уровнем индуцированного С5а человека опосредованного C5aR человека рекрутирования β-аррестина в присутствии 100 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления указанный анализ рекрутирования β-аррестина выполняется, как описано в примере 14. В одном варианте осуществления указанный анализ рекрутирования β-аррестина выполняется in vitro.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33, и область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

С5А-индуцированная положительная регуляция экспрессии CD11b

С5а, как эффективный активатор нейтрофилов и моноцитов человека, индуцирует положительную регуляцию антигена CD11b клеточной поверхности в таких клетках. Таким образом, способность выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавлять индуцированную С5а активацию гранулоцитов и/или моноцитов может быть оценена посредством определения уровней экспрессии CD11b в таких клетках.

Способность выделенных антитела или фрагментов антител в соответствии с настоящим изобретением подавлять экспрессию CD11b в гранулоцитах и/или моноцитах может быть определена посредством построения кривых зависимости ответа от дозы для повышающихся концентраций IgG и фиксированной концентрации С5а человека и вычисления соответствующих концентраций IC50. В качестве альтернативы, способность выделенных антитела или фрагментов антител в соответствии с настоящим изобретением подавлять экспрессию CD11b в гранулоцитах и/или моноцитах С5а может быть определена посредством вычисления % подавления экспрессии CD11b для различных концентраций IgG.

В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека с концентрацией IC₅₀, составляющей 30 нМ или меньше, 25 нМ или меньше, 20 нМ или меньше, 15 нМ или меньше, 10 нМ или меньше или 5 нМ или меньше, в присутствии 15 нМ С5а человека.

В другом варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85% или на по меньшей мере 90% в присутствии 15 нМ С5а человека и при концентрации IgG, составляющей 600 нМ, по сравнению с уровнем экспрессии CD11b в присутствии 15 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В дополнительном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека с концентрацией IC50, составляющей 150 нМ или меньше, 125 нМ или меньше, 100 нМ или меньше, 90 нМ или меньше, 80 нМ или меньше, 70 нМ или меньше, 60 нМ или меньше, 50 нМ или меньше или 40 нМ или меньше в присутствии 150 нМ С5а человека.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека с концентрацией IC₅₀, составляющей 42 нМ, в присутствии 150 нМ С5а человека.

В дополнительном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека на по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% в присутствии 150 нМ С5а человека и при концентрации IgG, составляющей 600 нМ, по сравнению с уровнем экспрессии CD11b в присутствии 150 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагменты антител, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавляют индуцированную С5а экспрессию CD11b в гранулоцитах человека на по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 65% в присутствии 150 нМ С5а человека и при концентрации IgG, составляющей 100 нМ, по сравнению с уровнем экспрессии CD11b в присутствии 150 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления указанное определение экспрессии CD11b выполняется, как описано в примере 15. В одном варианте осуществления указанное определение экспрессии CD11b выполняется in vitro и/или ex vivo.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Кроме того, ингибиторную активность выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением в отношении индуцированной С5а человека экспрессии CD11b далее анализировали на протяжении длительного периода времени, что означает, что антитела предварительно инкубировали с гранулоцитами и/или моноцитами, присутствующими в цельной крови, на протяжении варьирующихся промежутков времени (например 300 минут против 20 минут) перед добавлением С5а человека. Эксперимент продемонстрировал, что выделенные антитела в соответствии с настоящим изобретением являются еще более эффективными антагонистами активности C5aR на протяжении более длительного периода времени, например более длительного периода времени инкубации, в частности, по сравнению с антителом RefMAB№l из предшествующего уровня техники.

Соответственно, способность выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением подавлять индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах и/или моноцитах на протяжении длительного периода времени может быть определена посредством построения кривых зависимости ответа от дозы для повышающихся концентраций IgG и фиксированной концентрации С5а человека и посредством вычисления соответствующих значений ЕС50 после инкубации указанных выделенных антител с указанными гранулоцитами и/или моноцитами в течение различных периодов времени инкубации.

Как показано на фигурах 6А и С, выделенные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению демонстрировали четкий сдвиг определенной кривой зависимости ответа от дозы в сторону более низких значений концентрации IgG, определенных через 300 минут инкубации, по сравнению с кривой зависимости ответа от дозы, определенной через 20 минут инкубации. RefMAB№l не демонстрировало повышения эффективности с течением времени (см. фигуры 6В и D).

Таким образом, в одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением являются более эффективными в подавлении индуцированной С5а экспрессии CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека после продолжительного периода времени инкубации с указанными клетками.

В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека при в по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 раз или по меньшей мере 6 раз более низкой концентрации IC₅₀, определяемой после продолжительного периода времени инкубации, составляющего 50 минут, 100 минут, 150 минут, 200 минут, 250 минут или 300 минут по сравнению с концентрацией IC₅₀, определяемой после периода времени инкубации, составляющего 20 минут.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека при в приблизительно 5 раз более низкой концентрации IC₅₀, определяемой после продолжительного периода времени инкубации, составляющего 300 минут, по сравнению с концентрацией IC₅₀, определяемой после периода времени инкубации, составляющего 20 минут.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека при в по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 15 раз или по меньшей мере 19 раз более низкой концентрации IC₅₀, определяемой после продолжительного периода времени инкубации, составляющего 300 минут, по сравнению с соответствующей концентрацией IC₅₀ RefMAB№l.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением подавляют индуцированную С5а человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека и/или моноцитах человека с концентрацией IC₅₀, составляющей 3 нМ или меньше, 2,5 нМ или меньше, 2 нМ или меньше, 1,5 нМ или меньше или 1 нМ или меньше, после продолжительного периода времени инкубации с указанными клетками, составляющего 300 минут.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

С5А-индуцированная миграция нейтрофилов

В следующих анализах оценивали способность выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, подавлять индуцированную С5а человека миграцию нейтрофилов человека и выявили, что МАВ№1 эффективно подавляло индуцированную С5 миграцию нейтрофилов in vitro.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека по настоящему изобретению, подавляют индуцированную С5а человека миграцию нейтрофилов человека in vitro.

В дополнительном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела подавляют индуцированную С5а человека миграцию нейтрофилов человека на по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80% по сравнению с уровнем миграции в присутствии 10 нМ С5а человека и в отсутствие указанных выделенных антитела или фрагмента антитела in vitro.

В одном варианте осуществления указанная миграция нейтрофилов человека определяется через 15 минут, через 25 минут и/или через 35 минут. В определенных вариантах осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением тестируются при концентрации IgG, составляющей 100 нМ и/или 600 нМ.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению подавляют индуцированную С5а человека миграцию нейтрофилов человека на по меньшей мере 25% через 35 минут и при концентрации IgG, составляющей 100 нМ, по сравнению с уровнем миграции через 35 минут в присутствии 10 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению подавляют индуцированную С5а человека миграцию нейтрофилов человека на по меньшей мере 60% через 25 минут и при концентрации IgG, составляющей 100 нМ и/или 600 нМ, по сравнению с уровнем миграции через 25 минут в присутствии 10 нМ С5а человека и в отсутствие указанных антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению подавляют индуцированную С5а человека миграцию нейтрофилов человека на по меньшей мере 40% через 35 минут при концентрации IgG, составляющей 600 нМ, по сравнению с уровнем миграции через 35 минут в присутствии 10 нМ С5а человека и в отсутствие указанного антитела.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Эффекторная функция

Fc-область иммуноглобулина обычно обеспечивает благоприятные фармакокинетические свойства антител, такие как пролонгированный период полужизни в сыворотке крови и способность индуцировать эффекторную функцию посредством связывания с Fc-рецепторами, экспрессируемыми на клетках. С другой стороны, связывание с Fc-рецепторами также может приводить к нежелательной активации определенных рецепторов клеточной поверхности, что приводит к нежелательному высвобождению цитокинов и серьезным побочным эффектам при системном введении.

Соответственно, для определенных терапевтических ситуаций желательно снизить или устранить нормальное связывание Fc-области дикого типа антитела, такой как Fc-область IgG дикого типа, с одним, или несколькими, или всеми Fc рецепторами и/или связывание с компонентом комплемента, таким как Clq, чтобы снизить или устранить способность антитела индуцировать эффекторную функцию. Например, могут быть желательными снижение или устранение связывания Fc-области антитела с одним, или несколькими, или всеми Fcγ-рецепторами, такими как FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa.

Эффекторная функция может включать без ограничения одно или несколько из следующего: комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпредставляющими клетками, связывание с NK-клетками, связывание с макрофагами, связывание с моноцитами, связывание с полиморфоядерными клетками, прямая передача сигнала, индуцирующая апоптоз, перекрестное связывание антител, связанных с мишенью, созревание дендритных клеток или примирование Т-клеток.

Сниженное или устраненное связывание Fc-области с Fc-рецептором и/или с Clq обычно достигается посредством мутации Fc-области дикого типа, такой как Fc-область IgG1, более конкретно Fc-область человеческого IgG1, что приводит к получению варианта Fc-области или сконструированной Fc-области указанной Fc-области дикого типа, например варианта Fc-области человеческого IgG1. Могут быть полезны замены, которые приводят к снижению связывания. Для снижения или устранения свойств связывания Fc-области с Fc-рецептором предпочтительны неконсервативные аминокислотные замены, т.е. замена одной аминокислоты другой аминокислотой, характеризующейся другими структурными и/или химическими свойствами.

Соответственно, в одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, содержат вариант Fc-области, характеризующийся сниженным или устраненным связыванием с Fc-рецептором и/или с Clq по сравнению с Fc-областью дикого типа. В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат вариант Fc-области, который снижает или устраняет способность антитела индуцировать эффекторную функцию. В дополнительном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением практически не индуцируют эффекторную функцию.

В определенных вариантах осуществления эффекторная функция представляет собой одну или несколько выбранных из группы, состоящей из CDC, ADCC и ADCP. В одном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой ADCC. В одном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой CDC. В одном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой ADCP. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением практически не индуцируют ADCC, и/или CDC, и/или ADCP. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением не индуцируют ADCC или ADCP in vitro.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые снижают или устраняют связывание варианта Fc-области с одним или несколькими Fc-рецепторами и/или с C1q по сравнению с Fc-областью дикого типа. В одном варианте осуществления вариант Fc-области выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые снижают или устраняют способность антитела индуцировать эффекторную функцию по сравнению с Fc-областью дикого типа.

В конкретном варианте осуществления одна или несколько аминокислотных замен могут снижать аффинность связывания варианта Fc-области в отношении одного или нескольких Fc-рецепторов и/или C1q в по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 5 раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 20 раз или даже по меньшей мере 50 раз по сравнению с Fc-областью дикого типа. В альтернативных вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен могут снижать способность выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением индуцировать эффекторную функцию в по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 5 раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 20 раз или даже по меньшей мере 50 раз по сравнению с Fc-областью дикого типа.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением практически не связывается с одним или несколькими Fc-рецепторами и/или C1q. В одном варианте осуществления вариант Fc-области антитела в соответствии с настоящим изобретением практически устраняет способность указанного антитела индуцировать эффекторную функцию. В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением практически не индуцируют эффекторную функцию. В одном варианте осуществления указанная эффекторная функция представляет собой ADCC, и/или ADCP, и/или CDC. В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением практически не индуцируют эффекторную функцию, что означает, что уровень индуцированной эффекторной функции незначительно превышает фон, измеренный в отсутствие указанного антитела.

В одном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой Fc-рецептор человека. В одном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой Рсурецептор. В одном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой FcγRIIIa, FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIIb человека.

В одном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой одну или несколько выбранных из группы, состоящей из CDC, ADCC и ADCP. В конкретном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой ADCC, CDC и ADCP. В более конкретном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой ADCC и ADCP.

В одном варианте осуществления Fc-область дикого типа представляет собой Fc-область IgG1. В одном варианте осуществления Fc-область дикого типа представляет собой Fc-область человеческого IgG1. В одном варианте осуществления Fc-область дикого типа представляет собой Fc-область человеческого IgG1. В одном варианте осуществления Fc-область дикого типа представляет собой Fc-область человеческого IgG1, содержащую аминокислотную последовательность

PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат вариант Fc-области человеческого IgG1, который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с Fc-областью человеческого IgG1 дикого типа. В одном варианте осуществления одна или несколько аминокислотных замен снижают или устраняют связывание варианта Fc-области с Fc-рецептором и/или с C1q, и/или снижают способность указанного антитела индуцировать эффекторную функцию по сравнению с Fc-областью дикого типа.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотную замену в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из 234, 235, 237, 330 и 331, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQIDNO: 11.

В одном варианте осуществления указанный вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотную замену в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из L234, L235 и G237, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотные замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из L234A, L235E, G237A, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQIDNO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотные замены L234A и L235E, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотные замены L234A, L235E и G237A, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотную замену в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из АЗЗО и Р331, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотные замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотные замены A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 содержит аминокислотные замены L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат вариант Fc-области человеческого IgG1, который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с Fc-областью человеческого IgG1 дикого типа, содержащей последовательность под SEQ ID NO: 11, которые снижают или устраняют аффинность связывания варианта Fc-области с одним или несколькими Fc-рецепторами и/или с C1q, и/или снижают способность указанного антитела индуцировать эффекторную функцию, где одна или несколько аминокислотных замен представляют собой L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением относятся к классу IgG1 человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением относятся к варианту класса IgG1 человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением практически не индуцируют эффекторную функцию in vitro. В одном варианте осуществления вариант Fc-области человеческого IgG1 практически не связывается с одним или несколькими Fc-рецепторами и/или C1q. В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQIDNO: 11.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением относятся к классу IgG1 человека, содержащего аминокислотную замену L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат аминокислотную замену L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат аминокислотную замену L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат аминокислотную замену L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, и практически не индуцируют эффекторную функцию in vitro. В одном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой одну или несколько выбранных из группы, состоящей из CDC, ADCC и ADCP.

В одном таком варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат аминокислотную замену L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU, по сравнению с Fc-областью человеческого IgG1 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и практически не связываются с одним или несколькими Fc-рецепторами и/или C1q in vitro.

В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением относятся к классу IgG1 человека. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению практически не индуцируют эффекторную функцию in vitro. В одном варианте осуществления выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Связывание антитела с Fc-рецепторами с помощью своей Fc-области можно легко определить, например посредством ELISA или посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением стандартного измерительного оборудования, такого как устройство Biacore® (GE Healthcare), а Fc-рецепторы могут быть получены посредством рекомбинантной экспрессии. В качестве альтернативы, аффинность связывания Fc-областей может быть оценена с применением линий клеток, которые, как известно, экспрессируют конкретные Fc-рецепторы, таких как NK-клетки, экспрессирующие рецептор FcγIIIa. Эффекторная функция антитела может быть измерена посредством способов, известных из уровня техники. Подходящие in vitro анализы для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы описаны, например, в WO2012130831. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например на животной модели, такой как раскрытая в Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998). Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); и Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)). Анализы связывания C1q (такие как ELISA) могут быть проведены для определения того, способно ли антитело связывать C1q и, следовательно, характеризоваться активностью CDC (см., например, WO 2006/029879). In vitro способы для оценки связывания с Fc-рецепторами или для оценки иммунной эффекторной функции описаны в данном документе в примерах 10-13.

Слитые белки

Выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть слиты или не слиты с одним или несколькими другими аминокислотными остатками, полипептидами или фрагментами. Такой слитый белок может быть получен любым подходящим путем, в том числе посредством генетических или химических подходов. Указанные связанные фрагменты могут содержать секреторные или лидерные последовательности, последовательности, которые способствуют выявлению, экспрессии, разделению или очистке, или последовательности, которые придают белку повышенную стабильность, например в ходе рекомбинантного продуцирования. Неограничивающие примеры потенциальных фрагментов включают бета-галактозидазу, глутатион-S-трансферазу, люциферазу, фрагмент полимеразы Т7, сигнальный пептид секреции, антитело или фрагмент антитела, токсин, репортерный фермент, фрагмент, способный связывать ион металла, такой как полигистидиновая метка, метку, подходящую для выявления и/или очистки, домен гомо- или гетероассоциации, фрагмент, который повышает растворимость белка, или фрагмент, который содержит сайт ферментативного расщепления.

Соответственно, выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут необязательно содержать один или несколько фрагментов для связывания с другими мишенями или целевыми белками, представляющими интерес.Следует учитывать, что такие дополнительные фрагменты могут обеспечивать или не обеспечивать дополнительную функциональность антителу и могут модифицировать или не модифицировать свойства выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением. Диагностическое применение

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение выделенных антитела или фрагмента антитела, специфических в отношении C5aR человека в соответствии с настоящим изобретением, для диагностики заболевания. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением для выявления C5aR, в частности C5aR человека и/или C5aR макака-крабоеда. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ выявления C5aR у субъекта или в образце, включающий стадию приведения указанного субъекта или образца в контакт с выделенными антителом или фрагментом антитела, специфическими в отношении C5aR человека по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ диагностики заболевания у субъекта, включающий стадию приведения указанного субъекта или образца в контакт с выделенными антителом или фрагментом антитела в соответствии с настоящим изобретением.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Терапевтические способы

Выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять в терапевтических способах. Антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять для лечения заболевания, такого как рак, аутоиммунное заболевание или воспалительное заболевание.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения заболевания.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением для лечения заболевания. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении заболевания. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении заболевания у субъекта, нуждающегося в этом.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение выделенных антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве лекарственного препарата. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в медицине. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве лекарственного препарата для лечения субъекта, нуждающегося в этом.

В одном варианте осуществления заболевание ассоциировано с нежелательным присутствием C5aR, в частности C5aR человека. В одном варианте осуществления заболевание ассоциировано с нежелательным присутствием С5а, в частности С5а человека.

В одном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное заболевание. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет собой рак. Неограничивающие примеры видов рака включают рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, саркому, рак кожи, плоскоклеточную карциному, рак костей, меланому, почечно-клеточную карциному и рак почки.

В одном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой аутоиммунное или воспалительное заболевание. Неограничивающие примеры аутоиммунного или воспалительного заболевания включают ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатический артрит, системную красную волчанку (SLE), волчаночный нефрит, диабет типа I, болезнь Грейвса, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), синдром раздраженного кишечника, рассеянный склероз (MS), аутоиммунный миокардит, болезнь Кавасаки, ишемическую болезнь сердца, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), интерстициальное заболевание легких, аутоиммунный тиреоидит, склеродермию, системный склероз, остеоартрит, атопический дерматит, витилиго, болезнь "трансплантат против хозяина", синдром Шегрена, аутоиммунный нефрит, синдром Гудпасчера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, ANCA-ассоциированный васкулит, увеит, склеродермию, буллезный пемфигоид, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, хорею Хантингтона, кистозный фиброз, подагру, возрастную дегенерацию желтого пятна, аллергию, астму, антифосфолипидный синдром (APS), атеросклероз, С3-гломерулопатию и IgA-нефропатию, ишемическое/реперфузионное повреждение, перитонит, сепсис и другие аутоиммунные заболевания, которые являются результатом острого или хронического воспаления.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, в соответствии с настоящим изобретением для применения в способе лечения субъекта, имеющего заболевание, включающем введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. Субъект, нуждающийся в лечении, как правило, представляет собой млекопитающее, более конкретно человека. Для применения в терапевтических способах выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены, дозированы и введены в соответствии с надлежащей медицинской практикой.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с НС под SEQ ID NO: 37 или 44 и с LC под SEQ ID NO: 38 или 45.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Фармацевтические композиции

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую выделенные антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемые носитель или вспомогательное вещество.

Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере одно другое фармацевтически активное соединение. Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно применять в диагностике, предупреждении и/или лечении заболеваний, ассоциированных с нежелательным присутствием C5aR, в частности C5aR человека. В частности, настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые подходят для профилактического, терапевтического и/или диагностического применения у млекопитающего, более конкретно у человека.

В целом, антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены в виде фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно(один) антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением и по меньшей мере один(одно) фармацевтически приемлемый(приемлемое) носитель или вспомогательное вещество и необязательно одно или несколько дополнительных фармацевтически активных соединений. Такой состав может быть подходящим для перорального, парентерального, местного введения или для введения ингаляцией. Соответственно, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно(один) антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, может быть введена парентерально, например внутривенно, или внутримышечно, или подкожно. В качестве альтернативы, антитело по настоящему изобретению может быть введено путем, отличным от парентерального, например перорально или местно. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию, содержащую антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, вводят внутривенно или подкожно.

В частности, антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять в комбинации с одним или несколькими фармацевтически активными соединениями, которые применяют или которые можно применять для предупреждения и/или лечения заболеваний, в развитие которых вовлечен целевой антиген, представляющий интерес, в результате чего может быть получен или не получен синергический эффект. Примеры таких соединений, а также пути, способы и фармацевтические составы или композиции для их введения будут очевидны для клинициста.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, для применения в предупреждении и/или лечении заболевания, ассоциированного с нежелательным присутствием C5aR. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, для применения в качестве лекарственного препарата. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, для применения в предупреждении и/или лечении аутоиммунного заболевания, и/или воспалительного заболевания, и/или рака.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения аутоиммунного заболевания, и/или воспалительного заболевания, и/или рака у субъекта, нуждающегося в этом, с применением фармацевтической композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением.

Дополнительно предусмотрен способ получения антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением в форме, подходящей для введения in vivo, при этом способ включает (а) получение антитела или фрагмента антитела способом в соответствии с настоящим изобретением и (b) составление указанного антитела или фрагмента антитела с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом, при этом препарат антитела или фрагмента антитела составляют для введения in vivo. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат терапевтически эффективное количество одного или нескольких антител или фрагментов антител в соответствии с настоящим изобретением, растворенных в фармацевтически приемлемом носителе или вспомогательном веществе.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, в соответствии с настоящим изобретением содержат

a) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 28, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 31, область HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

c) область HCDR1 под SEQ ID NO: 27, область HCDR2 под SEQ ID NO: 39, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

d) область HCDR1 под SEQ ID NO: 30, область HCDR2 под SEQ ID NO: 41, область HCDR3 под SEQ ID NO: 40, область LCDR1 под SEQ ID NO: 32, область LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и область LCDR3 под SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) VH под SEQ ID NO: 35 и VL под SEQ ID NO: 36, или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO: 43, или

VH и VL, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 35 или 42 и с VL под SEQ ID NO: 36 или 43.

В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека для, содержат

a) НС под SEQ ID NO: 37 и LC под SEQ ID NO: 38, или

b) НС под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO: 45, или

НС и LC, которые характеризуются по меньшей мере по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с VH под SEQ ID NO: 37 или 44 и с VL под SEQ ID NO: 38 или 45. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела, специфические в отношении C5aR человека, представляют собой моноклональные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантные антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческие, гуманизированные или химерные антитело или фрагмент антитела.

Последовательности антител

Демонстрационные примеры

Пример 1. Создание антигена и контроль качества

Аминокислотные последовательности C5aR и GPCR, родственных C5aR, от различных видов брали из общедоступных источников (например, Uniprot), проверяли и получали на месте или приобретали у сторонних поставщиков.

Синтетические пептиды

В качестве антигенов для начального пэннинга и скрининга применяли линейные пептиды, покрывающие N-концевую внеклеточную область C5aR человека. Пептиды химически синтезировали с биотиновой меткой (JPT), очищали с помощью RP-HPLC и доставляли в виде лиофилизированного материала. Лиофилизированные пептиды хранили при -80°С. В качестве альтернативы, пептиды конъюгировали с трансферрином или бычьим сывороточным альбумином (BSA).

В качестве антигенов для последующих исследований связывания применяли линейные пептиды, содержащие N-концевую область C5aR человека и макака-крабоеда. Пептиды химически синтезировали с биотиновой меткой (Genscript), очищали с помощью RP-HPLC и доставляли в виде лиофилизированного материала. Лиофилизированные пептиды хранили при -80°С. Для восстановления пептиды растворяли в необходимом объеме PBS и хранили при -80°С.

Рекомбинантные белки

Белок C1q

Белок C1q, очищенный от объединенной нормальной плазмы крови человека, приобретали у компании Complement Technology, Inc. (№ по каталогу А099).

Белок С5а человека

Рекомбинантный С5а человека либо приобретали у компании R&D Systems (№ по каталогу 2037-С5), либо получали на месте.

Для получения на месте ДНК, кодирующую аминокислоты С5а человека (Uniprot: Р01031| Lys679 - Arg751), клонировали в вектор экспрессии рЕТ21а (Novagen) в рамке с N-концевой сигнальной последовательностью ompA, за которой следовала последовательность, кодирующая связывающий мальтозу белок (МВР), сайт расщепления FXa и линкер GS.

С5а человека (hC5a) экспрессировался в клетках Е. coli BL21 (DE3) (Novagen) в виде слитого белка на основе связывающего мальтозу белка (МВР) с N-концевой меткой. Экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG и культуры дополнительно культивировали в течение 20-23 ч. Клетки собирали центрифугированием и осадок ресуспендировали в буфере для лизиса (буфер PBS плюс 2 мМ MgCl₂, 20 ед./мл бензоназы (Roche) и 1 таблетка/50 мл cOmplete, таблетки коктейля с ингибитором протеазы без EDTA (Roche)). Клетки разрушали либо путем химического лизиса, либо путем гомогенизации под высоким давлением. Полученную суспензию центрифугировали и супернатант подвергали стерилизующей фильтрации для дальнейших стадий очистки.

Очищали слитый белок hC5a-MBP с помощью аффинной хроматографии на декстрин-сефарозе с применением колонки MBP-Trap (GE-Healthcare) и необязательно подвергали тонкой очистке с помощью катионообменной хроматографии с применением колонки Hi-Trap SP FF (GE LifeSciences). В очищенных продуктах слияния на основе МВР заменяли буфер с помощью колонок PD10 (GE Healthcare) на буфер для расщепления FXa (20 мМ Tris/HCl, рН 8,0; 100 мМ NaCl; 2 мМ CaCl₂). Белок hC5a высвобождали от связывающего мальтозу белка путем добавления фактора Ха (1:100 (вес/вес)) и инкубации в течение ночи в роторном шейкере при комнатной температуре. Высвобожденный hC5a очищали с помощью катионообменной хроматографии с применением колонки Hi-Trap SP FF (GE LifeSciences). Все стадии аффинной хроматографии выполняли с применением системы препаративной хроматографии Avant 25.

Замену буфера на PBS выполняли с применением колонок PD 10 (GE Healthcare). Образцы подвергали стерилизующей фильтрации и определяли концентрации hC5a с помощью УФ-спектрофотометрии. Чистоту и целостность образцов анализировали с помощью SDS-PAGE в денатурирующих, восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, SEC-HPLC и масс-спектрометрии.

Fc гамма-рецепторы (FcγR) и FcRn-рецепторы

ДНК, кодирующую внеклеточную область FcγRI человека, FcγRIIa человека (131H), FcγRIIa человека (131R), FcγRIIb человека, FcγRIIIa человека (158F) и FcγRIIIa человека (158V), клонировали в рамке с N-концевой лидерной последовательностью Vκ и С-концевой 6х His-меткой в вектор экспрессии рМАХ, который представляет собой модифицированный вектор экспрессии на основе pcDNA3.1 (Thermo Fisher).

ДНК, кодирующую внеклеточную область большой субъединицы р51 FcRn человека, макака-крабоеда, мыши или крысы, клонировали в рамке с N-концевой лидерной последовательностью Vκ и С-концевой AVI-6xHis-меткой в вектор экспрессии рМАХ, который представляет собой модифицированный вектор экспрессии на основе pcDNA3.1 (Thermo Fisher). Кроме того, ДНК, кодирующую белок малой субъединицы p14 FcRn человека, макака-крабоеда, мыши или крысы (= идентичный бета-2 микроглобулину), клонировали во вторую открытую рамку считывания в рамке с N-концевой лидерной последовательностью Vκ. Аминокислотные последовательности полученных рецепторов кратко описаны в таблицах 6 и 7.

Линия клеток HEK293-6Е была разработана Национальным советом по научным исследованиям Канады (NRC). Клетки поддерживали в среде Freestyle F17 (Thermo Scientific) в увлажненном инкубаторе с CO2 при 37°С и 6% СО₂. HKB11 (исходный клон: патент США №6136599, J. Biomed. Sci. 2002; 9:631-638) представляет собой линию гибридных клеток человека, полученную в результате слияния клеток почки эмбриона человека HEK293 и клеток лимфомы Беркитта 2В8. Клетки HKB11 №52 поддерживали в среде МАС1.0, содержащей 1% FCS, в увлажненном инкубаторе с СО₂ при 37°С и 6% CO₂.

Клетки HKB11 №52 или HEK293-6Е транзиентно трансфицировали через один день после посева с помощью коммерчески доступного реагента для трансфекции согласно инструкциям изготовителя. Клетки культивировали в течение 3 дней и собирали надосадочную жидкость кондиционированной культуры клеток путем центрифугирования с последующей стерилизующей фильтрацией (0,22 мкм). Создавали стабильно трансфицированные пулы HKB11 №52 путем трансфекции клеток с последующим отбором с помощью 800 мкг/мл G418 (Thermo Scientific). Экспрессию антигенов в стабильных пулах осуществляли в течение 4 дней после посева. Собирали надосадочные жидкости кондиционированной культуры клеток путем центрифугирования с последующей стерилизующей фильтрацией (0,22 мкм).

Соответствующие белки очищали с помощью IMAC с применением колонок Protino Ni-NTA (Macherey-Nagel). Все стадии хроматографии выполняли с применением систем хроматографии (GE Healthcare). В образцах буфер заменяли на D-PBS с применением колонок PD10 (GE Healthcare). В некоторых случаях стадию тонкой очистки с помощью препаративной SEC выполняли в D-PBS с применением колонки Superdex 200 (GE Healthcare).

Биотинилирование гетеродимеров FcRn выполняли путем in vitro биотинилирования с применением набора BirA (Avidity) с последующей препаративной SEC с применением колонки Superdex 200 (GE Healthcare).

Качество образцов анализировали с помощью SDS-PAGE в денатурирующих, восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, анализа сдвига показателей стрептавидина, HP-SEC и DLS.

Вирусоподобные частицы (VLP)

VLP, стабильно экспрессирующие один из двух природных вариантов C5aR человека (вариант D/K или вариант N/N), а также C5aR мыши, создавали на месте, как описано в WO 2015/193143. Все эксперименты по клонированию выполняли с применением стандартных технологий. Антигены, представляющие интерес, клонировали в соответствующую двухвекторную систему для экспрессии в клетках млекопитающего. В этой системе один вектор экспрессирует GAG, а другой вектор экспрессирует слитый белок GPCR-GAG. Экспрессия этих векторов находится под контролем промотора CMV. Затем клетки-хозяева трансфицировали двумя векторами. Созданные конструкции получали в виде слитых белков, в которых антиген, представляющий интерес, сливают на N-конце с GAG-белком (HV1B1 (ID Uni-Prot: Р03347)). Экспрессию белков и получение VLP осуществляли при стандартных условиях в суспензионных культурах. Клетками-хозяевами, применяемыми в данных экспериментах, были клетки HKB11 (АТСС; CRL-12568) и клетки HEK (Life Technologies). Через три дня после трансфекции надосадочные жидкости, содержащие VLP, собирали и очищали с применением стандартных процедур (в том числе осаждения и ионообменной хроматографии). Выделенные белки подвергали SDS-PAGE хроматографии. Надосадочные жидкости анализировали с помощью коммерческого антитела к GAG или коммерческого антитела к C5aR и выяснили, что совместная экспрессия GAG и слитого белка GPCR-GAG приводила к высокому уровню экспрессии GAG и GPCR-GAG в VLP. Это подтвердило, что антигены C5aR эффективно встраивались в VLP, и что антигены C5aR являлись выявляемыми с помощью антител. Аминокислотные последовательности полученных слитых белков кратко описаны в таблице 8.

Линии клеток

Создавали клетки СНО Flp-In, стабильно экспрессирующие полноразмерный C5aR человека, C5aR макака-крабоеда, C5aR мыши, C5aR крысы и GPCR, родственные C5aR, C5L2 человека, C3aR человека, FPR1 человека и ChemR23 человека. Для создания клеток СНО Flp-In различные векторные конструкции синтезировали методами генной инженерии на месте и выполняли трансфекцию клеток согласно методическим разработкам (Thermofischer/Invitrogen). Все конструкции содержали N-концевую V5/His-метку. Применяли коммерчески доступные вторичные антитела - к His (например, Dianova, № по каталогу DIA-910) или к V5 (например, AbD Serotec, № по каталогу MCA2285GA) для подтверждения экспрессии соответствующего GPCR на поверхности клеток линии, даже в отсутствие коммерчески доступного специфического рабочего антитела к GPCR.

Пример 2. Создание антител, специфических в отношении C5aR человека, из библиотеки HuCAL PLATINUM^®

Для создания антител применяли библиотеку HuCAL Platinum^® для отбора антител со специфичностью в отношении C5aR человека. Библиотека HuCAL PLATINUM^® представляет собой фагмидную библиотеку, основанную на концепции HuCAL (Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86), и в ней применяется технология CysDisplay^® для представления Fab на поверхности фагов (Lohning et al., WO 2001/05950).

Для идентификации антител, специфических в отношении C5aR человека, реализовали стратегии пэннинга с применением антигенного материала C5aR человека и макака-крабоеда для отбора антител, характеризующихся межвидовой перекрестной реактивностью. Каждая проводимая операция пэннинга включала по меньшей мере 3 отдельных цикла отбора по различным антигенам C5aR (в виде либо растворимых рекомбинантных антигенов, либо антигенов, сверхэкспрессируемых на клетках).

Хотя общая гомология между C5aR макака-крабоеда и человека, составляющая 90%, является довольно высокой, внеклеточные домены характеризуются только 75% идентичностью белковых последовательностей. Действительно, идентификация антител, являющихся перекрестно-реактивными в отношении C5aR макака-крабоеда, оказалась сложной задачей, поскольку антитела-предшественники МАВ№1 и МАВ№2 были одними из немногих кандидатов, демонстрирующих специфическое связывание с клетками по C5aR человека, экспрессируемому на клетках, перекрестную реактивность с C5aR макака-крабоеда и отсутствие связывания с другими родственными GPCR.

Поводили операции пэннинга в растворе на основе гранул по пептидам, представляющим N-конец (NT) C5aR человека, что привело к идентификации антител-предшественников МАВ№1 и МАВ№2, обладающих специфичностью в отношении C5aR человека и макака-крабоеда и способных связываться с полноразмерным C5aR человека, экспрессируемым на клетках.

Этот клон подвергали двум последовательно проводимым операциям пэннинга для созревания аффинности с применением клеток СНО Flp-In, сконструированных для обеспечения сверхэкспрессии либо C5aR человека, либо C5aR макака-крабоеда, чтобы дополнительно повысить аффинность и специфичность в отношении C5aR человека и макака-крабоеда. Кроме того, в отношении антител осуществляли конструирование для дополнительного повышения специфичности, удаления потенциальных сайтов посттрансляционной модификации (мотивов РТМ) и для целей приведения антител к зародышевой линии.

На этой последней стадии процесса конструирования МАВ№1 и МАВ№2 были идентифицированы в качестве потенциальных кандидатов средства терапии. Поскольку оба кандидата МАВ№1 и МАВ№2 происходят из одних и тех же предшественников, они обладают подобными аминокислотными последовательностями и характеристиками in vitro.

Эти два антитела дополнительно описаны в приведенных ниже примерах.

Пример 3. Получение антител, специфических в отношении C5aR человека

Как МАВ№1, так и МАВ№2 относятся к изотипу IgG1f человека, но у них в отношении Fc-области осуществлено конструирование для устранения способности антител опосредовать иммунную эффекторную функцию. Fc-область содержит 5 аминокислотных замен по сравнению с Fc-областью IgG1 человека дикого типа, а именно L234A, L235E, G237A, A330S и P331S (h_IgG1f_AEASS), с нумерацией согласно индексу EU.

Антитела состоят из каркаса тяжелой цепи VH3-15 и каркаса легкой цепи лямбда 1 антитела.

Получение антител в транзиентном режиме - HKB11, обеспечивающие улучшенное получение в микромасштабе

Эукариотические клетки HKB11№52 транзиентно трансфицировали векторами экспрессии млекопитающих, кодирующими тяжелую и легкую цепи МАВ№1 или МАВ№2 (IgG1 человека_АЕА88) соответственно. Надосадочные жидкости культур клеток собирали через 7 дней после трансфекции и подвергали аффинной хроматографии с использованием белка A (MabSelect SuRe | GE Healthcare) с применением установки для обработки жидкостей. Образцы оставляли в нейтрализованном буфере для элюирования (NaPS: 137 мМ фосфата натрия, 81 мМ NaCl, рН 7). Образцы подвергали стерилизующей фильтрации (размер пор 0,2 мкм). Концентрации белка определяли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм, а чистоту IgG анализировали в денатурирующих, восстанавливающих условиях с применением CE-SDS (LabChip GXII | Perkin Elmer). UHP-SEC проводили для анализа препаратов IgG в нативном состоянии.

Получение антител в транзиентном режиме - получение в исследовательских масштабах в СНО

Клетки СНО3-Е7 транзиентно трансфицировали вектором экспрессии млекопитающих, кодирующим тяжелую и легкую цепи МАВ№1 или МАВ№2 (IgG1 человека_AEASS) соответственно. Надосадочные жидкости культур клеток собирали через 6 дней после трансфекции и подвергали стандартной аффинной хроматографии с использованием белка A (MabSelect SuRe | GE Healthcare). Если не указано иное, выполняли замену буфера на 1x PBS Дюльбекко (рН 7,2 | Invitrogen) и образцы подвергали стерилизующей фильтрации (размер пор 0,2 мкм). Концентрации белка определяли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм, а чистоту IgG анализировали в денатурирующих, восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с применением CE-SDS (LabChip GXII | Perkin Elmer). UHP-SEC проводили для анализа препаратов IgG в нативном состоянии.

Результаты получения в транзиентном режиме

Данные по качеству продукта (содержание мономеров согласно SEC) и продуктивность в отношении МАВ№1 и МАВ№2 кратко описаны в таблице 9. В целом, были достигнуты приемлемые значения содержания мономеров (>95%) и выхода (>55 мг/л в клетках HKB11). Значения объемного выхода, полученные при получении в транзиентном режиме в СНО3Е-7 в исследовательском масштабе, также находились в ожидаемом диапазоне.

Создание пулов стабильных HKB11

Для создания пулов HKB11№52, стабильно экспрессирующих МАВ№1 или МАВ№2, применяли двухвекторную систему для совместной трансфекции.

Для облегчения отбора пулов эти векторы содержат кассеты устойчивости к зеоцину и неомицину. Два вектора транзиентно совместно трансфицировали в активно делящиеся клетки HKB11№52 в соотношении 1:1. Отбор через день после трансфекции начинали с добавления 160 мкг/мл зеоцина и 800 мкг/мл генетицина к суспензии клеток. Во время отбора количество клеток и их жизнеспособность сначала снижались. Через 20 дней после трансфекции клетки начали восстанавливаться. После достижения жизнеспособности ~ 80% размер стабильных пулов увеличивали до желаемого объема в зависимости от необходимого количества. Надосадочные жидкости культур клеток при получении периодическим способом собирали на 6 день после посева. Крупномасштабная очистка МАВ№1 и МАВ№2

Очистку МАВ№1 и МАВ№2 из надосадочных жидкостей культур клеток стабильных пулов HKB11№52 с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А (MabSelect SURE | GE Healthcare) выполняли с применением 100 мМ цитрата, 150 мМ NaCl, рН 3,5, в качества буфера для элюирования. После инкубации при рН 3,5 в течение 60 минут образцы нейтрализовали. Выполняли замену буфера на 150 мМ гистидина, рН 6,0, и образцы подвергали стерилизующей фильтрации (размер пор 0,2 мкм). Концентрации белка определяли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм, а чистоту IgG анализировали в денатурирующих, восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с применением CE-SDS (LabChip GXII | Perkin Elmer). UHP-SEC проводили для анализа препаратов IgG в нативном состоянии.

Результаты крупномасштабного получения

Как кратко описано в таблице 10, получение МАВ№1 и МАВ№2 обеспечивало благоприятные значения выхода, чистоту и целостность.

Контрольные антитела

Различные контрольные антитела получали и включали в эксперименты с целью сравнения.

RefMAB№1 - эталонное антитело

Нуклеотидные последовательности, кодирующие области VH и VL из антитела "IPH5401", специфического в отношении C5aR человека, были взяты из заявки на патент США US 2013/0295116 (NOVO NORDISK - клон 32F3A6GL). Нуклеотидные последовательности синтезировали методами генной инженерии в виде линейных фрагментов ДНК с соответствующими фланкирующими областями (например, подходящими сайтами узнавания рестрикционных ферментов, линкерными последовательностями) либо на месте, либо на базе внешнего поставщика. Фрагменты ДНК клонировали в подходящие векторы экспрессии IgG млекопитающих, кодирующие тяжелые и легкие цепи IgG1 человека AEASS, как описано выше, с применением стандартных способов молекулярной биологии. RefMAB№1 получали в транзиентном режиме, как описано выше. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей RefMAB№1 представлены в таблице 3.

Дополнительные контрольные антитела

Изготовленное на месте антитело отрицательного изотипического контроля со специфичностью в отношении лизоцима куриного яйца (MOR03207), а также изготовленное на месте антитело положительного контроля (антитело к C5aR) со специфичностью в отношении N-конца C5aR человека получали в транзиентном режиме, как описано выше, в формате либо IgG1 человека, либо IgG1 человека_AEASS.

Определение свойств связывания МАВ№1 и МАВ№2

Пример 4. Определение аффинности моновалентного связывания МАВ№1 и МАВ№2 в отношении N-концевых пептидов C5aR с применением SPR

Способ

Определение K_D с помощью модели захвата IgG выполняли при 25°С на устройстве Biacore Т200 (Biacore, GE Healthcare). Приблизительно 500 относительных единиц IgG, разбавленного с помощью HBS-EP+, рН 7,4, захватывали на чипе СМ5 (Biacore, GE Healthcare), на котором было иммобилизовано антитело к Fc человека (GE Healthcare) с применением стандартной химии сочетания аминов EDC-NHS. Эталонную проточную кювету 1 только активировали и дезактивировали. Измерения кинетических параметров выполняли с применением 6 различных концентраций пептида C5aR человека или макака-крабоеда_NT-bio (SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 соответственно) (2-кратное серийное разбавление, от 2000 до 62,5 нМ) с использованием HBS-EP+(GE Healthcare) в качестве буфера подвижной фазы (время инъекции 300 с; время диссоциации 600 с; скорость потока 30 мкл/мин.). После каждого цикла сенсорный чип регенерировали для удаления связанного комплекса пептид/антитело с помощью 3×20-секундных инъекций 3 мМ MgCl₂. Для двойного сравнения с эталоном применяли холостую инъекцию буфера подвижной фазы. Все сенсограммы аппроксимировали с применением программного обеспечение Biacore Т200 Evaluation 3.1, (Biacore, GE Healthcare) для определения констант скорости k_on и k_off, которые применяли для вычисления K_D. Необработанные данные аппроксимировали с помощью модели связывания 1:1, при этом параметры R_max устанавливали локально, и RI устанавливали на 0.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 11. Оба антитела показывали подобное связывание с пептидом C5aR человека, при этом значения K_D находились в нижней части диапазона двузначных значений с размерностью наномоль и связывание с пептидом C5aR макака-крабоеда являлось более слабым.

Пример 5. Определение кажущейся аффинности (бивалентной) МАВ№1 и МАВ№2 в отношении N-концевых пептидов C5aR с применением Octet

Способ

Определение кажущейся K_D с помощью модели захвата пептида C5aR_NT-bio выполняли при 27°С на устройстве Octet НТХ (, Pall Life Sciences). Приблизительно 0,03 нМ пептида, разбавленного в PBS, рН 7,4, загружали на сенсоры (, Pall Life Sciences) со стрептавидином (SA). Измерения кинетических параметров выполняли с применением 7 разных концентраций IgG (3-кратное серийное разбавление, от 200 до 0,27 нМ для пептида C5aR человека_NT-bio (SEQ ID NO: 13) и от 1000 до 1,4 нМ для пептида C5aR макака-крабоеда_NT-bio (SEQ ID NO: 14) в буфере Octet (PBS, 0,05% (об./об.) Tween-20, 0,1% (вес/об.) BSA) со временем ассоциации 480 с и временем диссоциации 900 с. После каждой стадии диссоциации сенсоры регенерировали для удаления связанного антитела (3×30 с Gly/HCl, рН 1,5). Все сенсограммы подгоняли с использованием программного обеспечения для анализа данных Octet 10.0 () для определения кажущейся константы скорости k_on и аппроксимированной константы скорости k_off, которые использовали для расчета кажущейся K_D (с использованием модели связывания 1:1).

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 12. Оба антитела демонстрировали высокий уровень связывания с пептидом C5aR человека в бивалентном формате со значениями кажущейся K_D в двухзначном-трехзначном пикомолярном диапазоне. Связывание с пептидом C5aR макака-крабоеда было в приблизительно 1000 раз слабее. Наблюдаемое более слабое связывание с пептидом C5aR макака-крабоеда возникло в основном из-за высоких констант скоростей k_off. Что касается кажущихся значений аффинности к C5aR_NT человека, МАВ№2 демонстрировал в приблизительно 10 раз более слабую аффинность связывания по сравнению с МАВ№1 (K_D: 290 пМ по сравнению с 20 пМ).

Пример 6. Определение кажущейся аффинности (бивалентной) МАВ№1 в отношении полноразмерного C5aR, экспрессируемого на клетках, с использованием KinExA

Поскольку C5aR принадлежит семейству GPCR, очень трудно создать материал на основе рекомбинантного полноразмерного антигена, который можно использовать для измерений SPR. Поэтому выполняли измерения с использованием клеток СНО Flp-m, стабильно экспрессирующих C5aR человека или C5aR макака-крабоеда, и KinExA.

Способ

Определение кажущейся K_D на экспрессирующих C5aR клетках выполняли при к.т. с помощью устройства KinExA 3200 (Sapidyne Instruments). PBS (Gibco), дополненный BSA (1 мг/мл) и 0,02% (об./об.) NaN₃, использовали в качестве аналитического буфера. МАВ№1 (концентрация: 2 нМ и 30 пМ) использовали в качестве аналита, а клетки Flip-In СНО hC5aR_V5/His (конечная концентрация: 3 миллиона клеток/мл и 1 миллион клеток/мл, 2-кратное серийное разбавление) или клетки Flip-In СНО cyC5aR_V5/His (конечная концентрация: 25 миллионов клеток/мл и 6 миллионов клеток/мл, 2-кратное серийное разбавление) в качестве титранта и уравновешивали на протяжении ночи при к.т. в шейкере с верхним приводом. После уравновешивания образцы центрифугировали и надосадочные жидкости использовали для анализа. Свободную концентрацию МАВ№1 определяли с использованием гранул из полиметилметакрилата (РММА), покрытых MabSSL (GE Healthcare), и для выявления использовали антитело к Fab2 человека Alexa Fluor 647 (500 нг/мл). Кажущуюся K_D получали с использованием программного обеспечения KinExA и с помощью "анализа с количеством кривых n", который позволяет одновременно подгонять все данные кривые с одним значением K_D.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 13. МАВ№1 демонстрировал высокий уровень связывания с полноразмерным C5aR человека со значением кажущейся K_D 130 пМ. Связывание с полноразмерным C5aR макака-крабоеда оказалось в приблизительно 20 раз слабее со значением кажущейся K_D,составляющим приблизительно 3 нМ. Подобные результаты, касающиеся связывания с C5aR макака-крабоеда, наблюдали ранее при измерениях с помощью Octet и Biacore (см. пример 4 и пример 5).

Пример 7. Связывание МАВ№1 и МАВ№2 с полноразмерным C5aR, экспрессируемым на клетках СНО Flp-In и полученных из цельной крови нейтрофилах (анализ FACS)

Клеточное связывание с линиями клеток СНО Flp-In, стабильно экспрессирующими различные полноразмерные антигены C5aR и родственные GPCR, а также связывание с очищенными нейтрофилами человека или макака-крабоеда, эндогенно экспрессирующими C5aR человека или макака-крабоеда, исследовали с помощью FACS. Нейтрофилы макака-крабоеда получали из цельной крови макака-крабоеда от трех разных животных (LPT Hamburg).

Способы

Линии клеток C5aR-CHO Flp-In блокировали и добавляли IgG либо в серийных разбавлениях, либо при одной (высокой) концентрации 300 нМ. Для выявление связывания IgG добавляли конъюгированное с R-фикоэритрином (R-PE) антитело к (специфическому Fc-гамма-фрагменту)2 IgG человека и измеряли уровень флуоресценции с использованием матричного устройства для FACS или устройства Novocyte.

Нейтрофилы очищали из образцов цельной крови с EDTA с использованием смеси для выделения нейтрофилов MACSexpress от Miltenyi Biotec. Вкратце, с использованием этого набора клетки выделяли с помощью магнитного мечения и отрицательного магнитного разделения. После удаления эритроцитов клетки окрашивали путем добавления IgG в серийном разбавлении с последующим добавлением конъюгированных с Alexa Fluor 647 антител выявления, специфических в отношении Р(ab)2-фрагмента человека. Измерения выполняли на матричном устройстве для FACS. Данные FACS оценивали с использованием FlowJo, вводили в GraphPad Prism (v4.0) и подгоняли к сигмоидальной кривой зависимости ответа от дозы с использованием нелинейной регрессии для расчета ЕС50.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 14 и на фигурах 1 и 2. На фигуре 1А и С изображено связывание МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l с C5aR человека и макака-крабоеда, присутствующими на сконструированных клетках СНО, экспрессирующих соответствующий полноразмерный рецептор. В целом, в высокой степени сопоставимые кривые связывания C5aR человека с почти идентичными концентрациями ЕС₅₀ определяли для МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l. Аналогичные результаты получали с C5aR макака-крабоеда для МАВ№1 и МАВ№2. Как и ожидалось, RefMAB№l не демонстрировало связывания с C5aR макака-крабо еда, экспрессируемым на клетках СНО.

Связывание с C5aR макака-крабоеда и человека также подтверждали с использованием очищенных нейтрофилов, полученных из цельной крови человека или макака-крабоеда (фигура 1В и D). Опять же, в высокой степени сопоставимые кривые связывания с почти идентичными значениями ЕС₅₀ на нейтрофилах человека и макака-крабоеда наблюдали для МАВ№1. Интересно, что МАВ№2 демонстрировал общий более низкий сигнал по сравнению с фоновыми уровнями на нейтрофилах макака-крабоеда по сравнению с МАВ№1. Этот результат не наблюдали при анализе связывания с C5aR макака-крабоеда, экспрессированным на клетках СНО. Отсутствие связывания с нейтрофилами макака-крабоеда подтверждали для RefMAB№l

Для C5aR грызунов не ожидалось перекрестной реактивности с C5aR крысы и мыши из-за низкой гомологии последовательностей (итоговая идентичность 66%). Действительно, ни МАВ№1, ни МАВ№2 не показывали какого-либо значительного связывания с C5aR крысы или мыши, экспрессируемым на клетках CHO-Flp, при тестировании при концентрации IgG 300 нМ (фигура 2). Чтобы исключить перекрестную реактивность с любым другим представителем подсемейства C5aR, связывание с полноразмерными человеческими C5L2, ChemR23, FPR1 и C3aR, экспрессируемыми на клетках СНО Flp-In, также определяли с помощью FACS (по сравнению с нетрансфицированными исходными клетками СНО Flp-In). Как показано на фигуре 2, даже при концентрации IgG 300 нМ не выявляли значительного уровня клеточного связывания МАВ№1 и МАВ№2 с любым из родственных C5aR GPCR или с исходными клетками СНО.

Совместно и МАВ№1, и МАВ№2 демонстрировали специфическое связывание с C5aR человека и макака-крабоеда.

Пример 8. Связывание МАВ№1 и МАВ№2 с полноразмерным C5aR человека, представленным на вирусоподобных частицах (VLP) - связьшание с природными вариантами C5aR человека

Сообщается о двух природных вариантах C5aR человека (SEQ ID NO: 1; вариант D/K и SEQ ID NO: 2; вариант N/N).

Для сравнения связывания МАВ№1 и Mab№2 с двумя природными вариантами создавали VLP, экспрессирующие один из двух вариантов C5aR, как описано в примере 1. В качестве отрицательного контроля включали VLP, экспрессирующие C5aR мыши, поскольку МАВ№1 и Mab№2 перекрестно не реагируют с C5aR мыши.

Способ

Для оценивания связывания полученные VLP покрывали на протяжении ночи и после стадии блокирования на следующий день добавляли титры IgG. Связывание IgG с нанесенным в виде покрытия антигеном выявляли с использованием конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела к IgG2 человека и AttoPhos в качестве субстрата.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 15 и показаны на фигуре 3. И МАВ№1, и МАВ№2 демонстрировали сопоставимые кривые титрования в отношении обоих природных вариантов C5aR человека с равными концентрациями ЕС₅₀. Как и ожидалось, не выявляли связывания с C5aR мыши. На основании этих данных можно было ожидать высокий уровень аффинности связывания МАВ№1 и МАВ№2 с C5aR человека in vivo, независимо от природного варианта, присутствующего на соответствующих целевых клетках.

Пример 9. Профилирование панели белков (ЗР)

Потенциальное неспецифическое нецелевое связывание для МАВ№1 определяли в общем анализе ЗР.

Способ

Профилирование панели белков в основном выполняли, как описано у Frese et al. (mAbs 5:2, 279-287; March/April 2013). 32 разными белками и контролями покрывали два 384-луночных стандартных планшета MSD при концентрации 1,0 мкг/мл при 4°С на протяжении ночи. Раствор покрытия сливали и планшеты блокировали с помощью 50 мкл 3% (вес/об.) BSA в PBS в течение одного часа при к.т. на шейкере для микротитровальных планшетов (-500 об./мин.) с последующими тремя стадиями промывки с помощью 50 мкл буфера для промывки (PBS с 0,05% (об./об.) Tween 20). Образцы IgG разбавляли до 100 нМ и 10 нМ аналитическим буфером (PBS с 0,5% (вес/об.) BSA, 0,05% (об./об.) Tween 20). В качестве контролей использовали антитело MOR03207 (IgG1f_AEASS) изотипического контроля и аналитический буфер. Образцы и контроли добавляли при 30 мкл/лунка и инкубировали в течение трех часов при к.т. на шейкере для микротитровальных планшетов. Планшеты промывали три раза и добавляли 30 мкл антитела выявления (ECL-меченного антитела к Fab человека) на лунку и инкубировали в течение одного часа на шейкере для микротитровальных планшетов (~500 об./мин.). После промывания планшета MSD и добавления 35 мкл/лунка буфера считывания MSD Т с поверхностно-активным веществом выявляли электро-хемилюминесцентный сигнал с использованием устройства SECTOR Imager S600 (Meso Scale Diagnostics).

Для оценивания сигналы связывания образца антитела с определенным белком делили на соответствующие сигналы связывания эталонного антитела MOR03207 с получением коэффициента связывания (BR). Затем рассчитывали совокупный коэффициент связывания (CBR) всех белков кроме контролей (всего 25): CBR до 150 указывает на IgG без выявляемого неспецифического связывания. Значения выше 150 указывают на IgG с повышенным уровнем неспецифического связывания по сравнению с эталонным антителом MOR03207.

Результаты

Результаты для МАВ№1 и МАВ№2 показаны на фигуре 10. В целом, не выявляли критического неспецифического связывания ни с одним из тестируемых белков. Наблюдали очень низкий (МАВ№2) и низкий (МАВ№1) уровень связывания с бычьим трансферрином. Связывание с бычьим трансферрином подтверждали в анализе связывания на основе Octet, но связывания с трансферрином крысы и макака-крабоеда не выявляли (данные не показаны). Таким образом, наблюдаемое связывание с бычьим трансферрином расценивали как некритическое.

Финальный формат антитела и безопасность

C5aR экспрессируется на различных иммунных клетках, таких как лейкоциты, нейтрофилы и лимфоциты, и необходимо предотвратить опосредованное Fc IgG1 человека истощение таких клеток, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов. Соответственно, окончательный формат IgG антитела к C5aR должен быть подвергнут сайленсингу в отношении способности индуцировать любую эффекторную функцию во время терапевтического вмешательства.

И МАВ№1, и МАВ№2 содержат пять аминокислотных замен в Fc-области IgG1f человека, а именно L234A, L235E, G237A, A330S и P331S (hlgG1f_AEASS, нумерация согласно индексу ЕС) для устранения эффекторной функции, индуцированной антителом. Клиническая безопасность данного формата в контексте терапии на основе антитела к C5aR была описана в уровне техники (Wagner F et al. Annals of the Rheumatic Diseases. 2014; 73: 499. doi: 10.1136/annrheumdis-2014-eular.2156.)

Отсутствие способности МАВ№1 и МАВ№2 индуцировать эффекторную функцию подтверждали в разных анализах, таких как исследования связывания с Fcγ-рецепторами или C1q, а также in vitro анализы ADCC и ADCP, раскрываемые ниже.

Пример 10. Связывание МАВ№1 и МАВ№2 с FcRn-рецептором с использованием Octet

Способ

Определение кажущейся K_D для иммобилизованного неонатального Fc-рецептора (FcRn) от разных видов выполняли при рН 6,0 и 7,2 при 27°С с использованием устройства Octet НТХ (, Pall Life Sciences). Захватывали 0,5 нМ биотинилированного FcRn человека, макака-крабоеда, мыши и крысы на покрытых стрептавидином (SA) сенсорах (, Pall Life Sciences). Измерения кинетических параметров выполняли с использованием 8 разных концентраций IgG (3-кратное серийное разбавление, 1000-0,46 нМ) в буфере Octet (PBS, 0,05% (об./об.), Tween-20, 0,1% (вес/об.) BSA) с временем ассоциации 240 с и временем диссоциации 180 с. После каждого цикла сенсор регенерировали для удаления связанного комплекса пептид/антитело (2×30 с в HBS-EP+, рН 8,0). Все сенсограммы подгоняли с использованием программного обеспечения для анализа данных 10.0 (, Pall Life Sciences) для определения кажущейся аффинности и данные подгоняли к модели устойчивого состояния.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 16. МАВ№1 и МАВ№2 демонстрировали значения кажущейся аффинности связывания с FcRn разных видов в ожидаемом диапазоне значений аффинности (сопоставимо с антителом изотипического контроля MOR03207 IgG1f), и поведение физиологического связывания для связывания с FcRn человека может быть подтверждено для обеих молекул IgG, т.е. связывание при нейтральном рН (7,2) не выявляли. Следовательно, 5 мутаций, введенные в Fc-область антител, не оказали отрицательного влияния на связывание FcRn человека.

Пример 11. Связывание МАВ№1 и МАВ№2 с Fcy-рецепторами человека с использованием Octet

Способ

Определение K_D с помощью модели захвата IgG выполняли при 27°С с использованием Octet (, Pall Life Sciences). Захватывали 2,0 нМ IgG, разбавленных аналитическим буфером Octet (PBS, 0,05% (об./об.) Tween-20, 0,1% (вес/об.) BSA) на покрытых белком А сенсорах (, Pall Life Sciences). Измерения кинетических параметров выполняли с использованием 7 концентраций Fc-гамма-рецепторов (2-кратное серийное разбавление) в аналитическом буфере. После каждого цикла сенсоры регенерировали для удаления связанного комплекса пептид/антитело (2×30 с в 10 мМ Gly/HCl, рН 1,5). Все сенсограммы подгоняли с использованием программного обеспечения для анализа данных 10.0 (, Pall Life Sciences) для определения констант скорости k_on и k_off, которые использовали для расчета K_D. Необработанные данные подгоняли с помощью модели связывания 1:1 с параметром R_max, установленным локально.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 17. Отсутствие или очень слабое связывание МАВ№1 и МАВ№2 с любым из тестируемых Fcγ-рецепторов могло быть выявлено и было подтверждено, что введенные мутации в Fc-область IgG1 человека эффективны в устранении связывания Fcγ рецептора.

Пример 12. Связывание МАВ№1 и МАВ№2 с C1q с использованием Octet

Способ

Определение кажущейся (бивалентной) K_D с помощью модели захвата IgG выполняли при 27°С с использованием Octet ( Pall Life Sciences). Захватывали 2,0 нМ IgG, разбавленных буфером Octet, с помощью антитела к Fab CHI каппа/лямбда человека (ВАС), иммобилизованным на покрытых стрептавидином (SA) сенсорах (, Pall Life Sciences). Измерения кинетических параметров выполняли с использованием 8 разных концентраций C1q (3-кратное серийное разбавление, 500-0,69 нМ) в аналитическом буфере Octet (см. выше) с временем ассоциации 240 с и временем диссоциации 240 с. После каждого цикла сенсоры регенерировали для удаления связанного комплекса пептид/антитело (2×50 мМ NaOH, 1×10 мМ Gly/HCl, рН 1,5, по 30 с каждый). Все сенсограммы подгоняли с использованием программного обеспечения для анализа данных 9 (, Pall Life Sciences) для определения кажущейся аффинности. Данные подгоняли к модели устойчивого состояния.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 18. Как и ожидалось, связывание МАВ№1 и МАВ№2 с C1q (выделенным из объединенной плазмы крови человека) не наблюдали и было подтверждено, что введенные мутации в Fc-область IgG1 человека эффективны для устранения связывания C1q.

Пример 13. Активность ADCC и ADCP in vitro MAB№1

Способы

Активность ADCC и ADCP для МАВ№1 тестировали с использованием репортерных биоанализов ADCC и ADCP с применением Promega согласно инструкциям изготовителя (№по каталогу G7017 и №по каталогу G988A соответственно). В наборах используются сконструированные клетки Jurkat в качестве эффекторных клеток. Клетки либо стабильно экспрессируют FcyRIIIa-рецептор, вариант V158 (высокая аффинность) для ADCC и рецепторы FcγRIIa_Н для ADCP, и элемент ответа NFAT, управляющий экспрессией люциферазы светлячка. В качестве целевых клеток использовали клетки СНО Flp-In, экспрессирующие C5aR человека. Связывание эффекторных клеток с мишенью через мостик антитела (например, через МАВ№1 или МАВ№2) запускает каскад событий в пути NFAT, что приводит к экспрессии белка люциферазы светлячка. Ферментативная реакция обуславливает люминесценцию, уровень которой пропорционален концентрации люциферазы, что напрямую коррелирует с активностью ADCC или ADCP. Активность ADCC или ADCP анализировали для МАВ№1 путем построения графика среднего сигнала для фоновых значений.

Поскольку для МАВ№1 версия IgG1f человека дикого типа не была доступна, IgG1f дикого типа, а также версия IgG1f_AEASS человека с подвергнутой сайленсингу Fc, полученного на месте контрольного антитела человека к C5aR, были включены в качестве положительного контроля. Кроме того, в качестве отрицательного контроля была включена версия с подвергнутой сайленсингу Fc (hIgG1_AEASS) и версия дикого типа (hIgG1f) антитела изотопического контроля MOR03207.

Результаты

Результаты кратко описаны в таблице 19 и показаны на фигуре 8А (ADCP) и В (ADCC) для концентрации IgG 10 мкг/мл. МАВ№1 не индуцировало активацию FcγRIIIa или FcγRIIa_H пути NFAT в сконструированных эффекторных клетках в присутствии сверхэкспрессирующих C5aR клеток СНО, подобную версии с подвергнутой сайленсингу Fc контрольного антитела к C5aR и версии с подвергнутой сайленсингу Fc MOR03207. Версия дикого типа (не подвергнутая сайленсингу) специфического в отношении C5aR контрольного антитела явно индуцировала продуцирование люциферазы в сконструированных клетках Jurkat в присутствии экспрессирующих C5aR клеток СНО.

В целом, эксперимент четко подтвердил, что введенные мутации в Fc-область IgG1 человека дикого типа эффективны в предотвращении активности ADCC и ADCP.

Функциональная характеристика МАВ№1 и МАВ№2

Нейтрализующие активности МАВ№1 и МАВ№2 анализировали в разных in vitro анализах, в которых контролировали индуцированную С5а активацию C5aR.

Поскольку повышенные уровни С5а были описаны при патофизиологических состояниях, ожидается, что способность антагонистического антитела в отношении C5aR нейтрализовать высокие концентрации С5а, которые могут присутствовать локально в участке заболевания, обеспечит благоприятный терапевтический эффект in vivo. Следовательно, также ставили in vitro эксперименты для отражения таких патологических состояний in vivo.

Пример 14. Анализ PathHunter® β-аррестина (DiscoveRx)

Способы

Анализ PathHunter® β-аррестина от DiscoveRx выполняли согласно инструкциям изготовителя. Вкратце, индуцированную С5а человека активность C5aR человека измеряли путем выявления взаимодействия β-аррестина с активированным C5aR с применением комплементации фрагмента фермента β-галактозидазы.

Рекрутирование β-аррестина индуцировали с использованием рекомбинантного С5а человека, а активность фермента измеряли с использованием хемилюминесцентных реагентов для выявления от DiscoverRx. Клетки яичников китайского хомячка (СНО), экспрессирующие сконструированную версию C5aR человека, высевали на протяжении ночи, добавляли серийные разбавления С5а человека (R&D Systems) и инкубировали при 37°С и 5% CO2 в течение 1,5 часа (построение кривых титрования в отсутствие антагониста). Параллельно определяли кривые титрования С5а человека в присутствии специфических в отношении C5aR антител (фиксированная концентрация IgG 50 нМ). Для этого к клеткам добавляли IgG перед стимуляцией С5а человека и инкубировали в течение 1 часа при 37°С и 5% СО₂. Результаты выражали в относительных единицах люминесценции. Кривые титрования С5а человека в присутствии и в отсутствие антагонистических IgG строили с помощью GraphPad Prism.

Для анализа β-аррестина сдвиги кривых зависимости ответа от дозы для С5а человека в сторону более высоких доз (т.е. по горизонтали вправо по оси дозы) сравнивали для МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l (фигура 4А). Кроме того, вычисляли и сравнивали % подавления при трех возрастающих концентрациях С5а (1,2 нМ, 11 нМ и 100 нМ) (фигура 4В).

Результаты

Результаты анализов β-аррестина показаны на фигуре 4А и 4В и кратко описаны в таблице 20 и таблице 21. В отсутствие антитела получали кривую зависимости ответа от дозы для С5а человека со средней концентрацией ЕС₅₀ 2,9 нМ (фигура 4А).

Добавление МАВ№1 или МАВ№2 к С5а человека при конечной концентрации IgG 50 нМ приводило к существенному сдвигу в кривой зависимости ответа от дозы в более чем 12 раз в сторону более высоких доз С5а человека. Точнее говоря, в присутствии 50 нМ МАВ№1 или МАВ№2 получали кривую зависимости ответа от дозы для С5а человека со средней концентрацией ЕС₅₀ 37 нМ (фигура 4А, таблица 20). Другими словами, присутствие МАВ№1 или МАВ№2 значительно снижает способность С5 человека индуцировать активацию C5aR или, в качестве альтернативы, в присутствии МАВ№1 или МАВ№2 С5 человека необходимо добавлять по меньшей мере в 12 раз более высокую концентрацию для индуцирования такойже активности C5aR по сравнению с его активностью в отсутствие антитела.

Это наблюдение также было отражено при вычислении % подавления при трех возрастающих концентрациях С5а (фигура 4В). При 1,2 нМ С5а человека все три тестируемых антитела МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l демонстрировали сопоставимое подавление индуцированной С5а активности C5aR более чем на 80% при концентрации IgG 50 нМ. Однако, если для активации C5aR использовали в приблизительно 10 раз более высокую концентрацию С5а человека (11 нМ), RefMAB№l было способно нейтрализовать только приблизительно 50% индуцированной С5а активности C5aR. Это резко контрастирует с МАВ№1 и МАВ№2, которые все еще были способны нейтрализовать до 80% индуцированной С5а активности C5aR.

Этот эффект был еще более выражен, когда для активации C5aR использовали концентрацию С5а человека (100 нМ) в 100 раз выше. В данном случае практически не выявляли нейтрализующей активности у RefMAB№l, тогда как МАВ№1 и МАВ№2 все еще были способны нейтрализовать приблизительно 40% и 30% индуцированной С5а активности C5aR человека соответственно.

Следовательно, как МАВ№1, так и МАВ№2 эффективны в нейтрализации патофизиологических концентраций С5а in vitro и значительно более эффективны по сравнению с RefMAB№1.

Пример 15. Подавление активации нейтрофилов и моноцитов с помощью МАВ№1 и МАВ№2 - анализ CD11b

Эффективность нейтрализации МАВ№1 и МАВ№2 дополнительно определяли в функциональном анализе CD11b цельной крови, представляющем более физиологическую модель. CD11b соединяется с CD18 с образованием комплекса интегрина Мас-1, который служит мультилигандным рецептором. CD11b конститутивно экспрессируется на поверхности >50% лейкоцитов периферической крови; при активации лейкоцитов его экспрессия повышается вследствие слияния содержащих CD11b секреторных гранул с клеточной мембраной. Таким образом, экспрессия CD11b широко используется в качестве маркера активации лейкоцитов как in vivo, так и in vitro.

С5а, как эффективный активатор нейтрофилов и моноцитов человека, индуцирует положительную регуляцию антигена CD11b поверхности. Таким образом, способность МАВ№1 и МАВ№2 предотвращать индуцированную С5а активацию гранулоцитов и моноцитов исследовали путем оценивания уровней CD11b в гранулоцитах и моноцитах, полученных из цельной крови. Эксперименты в основном проводили, как описано в заявке на патент США US2013/0295116 (NOVO NORDISK).

Способ

В постановке первого анализа цельную гепаринизированную кровь смешивали с IgG (в серийных разбавлениях) и инкубировали в течение 20 минут при 37°С, 5% СО₂. С5а человека добавляли при стандартной концентрации 15 нМ и инкубировали в течение 20 минут при 37°С, 5% СО₂. Добавляли антитело к CD11b-PE или антитело изотипического контроля MOR03207 и планшет инкубировали в течение 20 минут при 37°С, 5% СО₂. Наконец, добавляли буфер для лизирования эритроцитов и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте, клетки промывали и снова ресуспендировали в буфере для лизирования.

В постановке второго эксперимента С5а человека добавляли при более клинически соответсвующей патофизиологической концентрации 150 нМ без модифицирования постановки остальных анализов, как описано выше.

Для исследования времени удерживания рецептора МАВ№1 анализ дополнительно адаптировали путем продления времени инкубирования гепаринизированной цельной крови с IgG с 20 минут до 300 минут.

Уровень флуоресценции измеряли с использованием матричного устройства FACS или Novocyte. Образцы гейтировали, чтобы исключить погибшие клетки и дебрис.Моноциты и гранулоциты идентифицировали в соответствии с их профилями FSC и SSC и гейтировали. Вычисляли медианную интенсивность флуоресценции (MFI) гейтированных гранулоцитов и/или моноцитов в канале CD11b-PE (Yellow-А). Результаты выражали как процент подавления (% подавления). Максимальный уровень экспрессии CD11b (MFI_Max) представлял собой среднюю MFI клеток, инкубированных с С5а, но без IgG. Минимальный (фоновый) уровень экспрессии CD11b (MFI_Min) представлял собой среднюю MFI клеток, инкубированных без С5а и без IgG. Формула, использованная для вычисления % подавления для каждого образца, была следующей:

Данные оценивали с использованием FlowJo, вводили в GraphPad Prism (v4.0) и подгоняли к сигмоидальной кривой зависимости ответа от дозы с использованием нелинейной регрессии для расчета IC₅₀.

Результаты для МАВ№1 с использованием 15 нМ лиганда С5а

Результаты для МАВ№1 из анализов CD11b в цельной крови кратко описаны в таблице 22. Для обеих популяций гейтированных клеток (моноцитов и гранулоцитов) определяли значения IC₅₀ в однозначном диапазоне нМ с максимальным подавлением почти 88% для гранулоцитов и 83% для моноцитов.

Результаты для МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l с использованием 15 нМ по сравнению с 150 нМ лиганда С5а

Помимо добавления 15 нМ С5а человека для стимуляции гранулоцитов (как описано выше) использовали в десять раз более высокую концентрацию (150 нМ) лиганда для имитации более патофизиологической концентрации лиганда.

Опять же, МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l титровали по дозе и строили кривые подавления с использованием GraphPad Prism с помощью функции нелинейной регрессии. Результаты количественно выражали как "концентрацию антагониста, необходимую для индуцирования 50% подавления".

Результаты этого анализа CD11b в цельной крови показаны на фигуре 5А и В.

На фигуре 5А показана нейтрализующая активность МАВ№1, МАВ№2 и RefMAB№l при 15 нМ С5а, а на фигуре 5В показана соответствующая нейтрализующая активность при 150 нМ С5а. В качестве количественно определяемых считываемых показателей вычисляли концентрацию IgG для достижения 50% подавления положительной регуляции CD11b, и результаты показаны под осью абсцисс на обеих фигурах.

В целом, аналогичные наблюдения, что и для анализа β-аррестина (пример 14), делали при использовании возрастающих концентраций С5а в анализе CD11b в цельной крови, при гейтировании гранулоцитов в качестве первичных целевых клеток. Чтобы блокировать эффекты 15 нМ С5а человека до 50%, была необходима концентрация IgG 12 нМ для МАВ№1 и RefMAB№l, тогда как для МАВ№2 концентрация IgG 17 нМ была достаточной. Однако для того, чтобы блокировать 50% положительной регуляции CD11b, индуцированной в 10 раз более высокой концентрацией С5а (150 нМ), требовались значительные различные количества антагонистов. В то время как для МАВ№1 концентрация IgG в 42 нМ теперь была достаточной для подавления 50% индуцированной С5а активации C5aR, для достижения такого же блокирующего эффекта требовалась в 7 раз более высокая концентрация RefMAB№l (291 нМ). Для МАВ№2 концентрация IgG 114 нМ была достаточной.

Следовательно, можно было осуществить такое же ранжирование 3 IgG с точки зрения эффективности, которое уже было показано в анализе b-аррестина (МАВ№1>МАВ№2>RefMAB№l), и оба МАВ№1 и МАВ№2 демонстрировали высокую эффективность в нейтрализации патофизиологических концентраций С5а in vitro и были значительно более эффективными по сравнению с RefMAB№l.

Результаты для МАВ№1 - влияние на время удерживания рецептора

Seow et al. (Seow V et al., Sci Rep.2016; 6: 24575) сообщили, что образование C5a локализовано на клеточной мембране и может быть очень высоким в течение коротких, но повторяющихся периодов. Таким образом, было высказано предположение, что антагонист C5aR с длительным временем удерживания может быть полезным в системах с быстрой и транзиентной передачей сигналов. Был также сделан вывод, что увеличенное время удерживания рецептора, измеренное in vitro, также может влиять на продолжительность действия и степень эффективности in vivo.

Для сравнения времени удерживания рецептора для двух антител в аналогичной постановке, опубликованной Seow et al., оценивали логарифмические кривые зависимости подавления от дозы для 20 минут и 300 минут инкубирования IgG с гранулоцитами и моноцитами, присутствующими в цельной крови, как описано выше.

Результаты этой экспериментальной постановки анализа CD11b в цельной крови показаны на фигуре 6А - D. Неожиданно для МАВ№1 наблюдали значительное повышение нейтрализующей активности на протяжении длительного периода времени инкубацирования. Как показано на фигуре 6А и С, для популяций как гранулоцитов, так и для моноцитов расчетная концентрация IC₅₀ для МАВ№1 снизилась с течением времени в приблизительно 6 раз (значения IC₅₀ кратко описаны в таблице 23). Для RefMAB№l не наблюдали сдвига или уменьшения на кривых подавления через 300 минут (фигура 6В и D).

В целом, ожидается, что комбинация эффективной нейтрализации патофизиологических уровней С5а и повышенной эффективности с течением времени будет полезной in vivo.

Пример 16. Индуцированная С5а миграция нейтрофилов

Анализировали индуцированный С5а хемотаксис очищенных нейтрофилов. Эксперимент в основном проводили, как описано в заявке на патент США US2013/0295116.

Способы

Нейтрофилы выделяли и очищали из цельной крови трех разных доноров-людей с использованием набора для выделения нейтрофилов из цельной крови MACSxpress для человека (Miltenyi Biotec, №по каталогу 130-104-434) и набора для истощения эритроцитов MACSxpress для человека (Miltenyi Biotec, №по каталогу 130-098-196).

Эффективность IgG в подавлении зависимой от hC5a миграции нейтрофилов анализировали с помощью методики с камерой Бойдена с использованием 96-луночных планшетов FluoroBlok® с размером пор 3,0 мкм. Мембрану пор камеры Бойдена покрывали 1 мг/мл фибриногена человека в течение 2 часов при 37°С. После промывания мембраны блокировали раствором, содержащим 2% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 часа при 37°С. Затем очищенные нейтрофилы окрашивали кальцеином и 10⁵ окрашенных клеток добавляли в верхнее отделение камеры Бойдена с антагонистическими IgG (100 и 600 нМ) и без них. hC5a (R&D Systems, 10 нМ) вносили в нижнее отделение камеры Бойдена. Планшет подвергали измерениям при 485/538 нм при 37°С каждые 5 минут в течение 60 минут в устройстве для считывания планшетов (Tecan M1000Pro). Способность нейтрофилов мигрировать в нижнюю камеру определяли путем измерения окрашенных кальцеином нейтрофилов, проходящих через мембрану FluoroBlok. Результаты выражали в виде кривых кинетических показателей миграции (5-60 минут), а также процента подавления, вычисленного в выбранные моменты времени (15, 25 и 35 минут).

Формула, использованная для вычисления % подавления, была следующей:

Результаты

Средний процент подавления миграции нейтрофилов в выбранные моменты времени при двух тестируемых концентрациях IgG вычисляли из 3 независимых экспериментов с использованием нейтрофилов от трех разных доноров-людей.

Как показано на фигуре 7, после 15 минут миграции почти полное подавление индуцированной С5а миграции нейтрофилов достигалось для МАВ№1. После 35 минут миграции и самой высокой тестируемой концентрации IgG (600 нМ) МАВ№1 все еще демонстрировал >50% подавления. Антитело отрицательного изотипического контроля MOR03207 не демонстрировало подавляющий эффект в отношении миграции нейтрофилов.

Пример 17. Индуцированное С5а высвобождение цитокинов макрофагами

Макрофаги высвобождают провоспалительные или противовоспалительные цитокины при активации в зависимости от их поляризации. Следовательно, оценивали, влияет ли блокада взаимодействия C5a/C5aR с МАВ№1 на индуцированное С5а высвобождение цитокинов макрофагами Ml и М2. ELISA цитокинов проводили для выявления продуцирования противовоспалительного IL-10 макрофагами М2 и провоспалительного IL-12 макрофагами Ml.

Способы

Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали из цельной крови здоровых доноров-людей путем центрифугирования в градиенте плотности с разделяющим раствором Biocoll и пробирками SepMate (Stemcell). Моноциты выделяли из РВМС с использованием набора для отбора CD 14+ (Miltenyi Biotech) и культивировали в RPMI, дополненной 10% FCS и 1x GlutaMax, в 96-луночных планшетах. Моноциты, высеянные в ночное время, поляризовали в течение 24 часов при 37°С для макрофагов Ml с использованием LPS (20 нг/мл) и IFNγ (50 нг/мл) и предварительно инкубировали с МАВ№1 (30 нМ) в течение 30 минут с последующим добавлением С5а (15 нМ) в течение еще 24 часов. Были включены макрофаги M1, стимулированные С5а в отсутствие МАВ№1, и необработанные контроли. Через 24 часа клеточные надосадочные жидкости анализировали с помощью IL-12/IL23 DuoSet ELISA (R&D Systems) согласно инструкциям изготовителя. Для создания макрофагов М2 моноциты предварительно дифференцировали в макрофаги путем культивирования в течение 5 дней в RPML10% FCS, дополненной M-CSF, и добавления M-CSF, IL-4, IL-13 и IL-6 (40 нг/мл каждый) в день 5. С5а (15 нМ)+/- МАВ№1 (30 нМ) добавляли ежедневно с дня 5 по 9. В день 9 клеточные надосадочные жидкости анализировали с помощью IL-10 DuoSet ELISA (R&D Systems) согласно инструкциям изготовителя.

Результаты

Хотя инкубация с С5а приводила к снижению продуцирования IL-12 макрофагами Ml, после предварительной обработки с помощью МАВ№1 снижения уровней IL-12 не наблюдали по сравнению с необработанным контролем. С другой стороны, обработка МАВ№1 приводила к подавлению индуцированного С5а продуцирования IL-10 в макрофагах М2 (см. фигуру 11).

В заключение, МАВ№1 эффективно подавляет индуцированное С5а продуцирование противовоспалительного IL-10 макрофагами М2 и восстанавливает продуцирование провоспалительного IL-12 макрофагами Ml, тем самым демонстрируя механизм действия МАВ№1 in vitro.

Фармакокинетика

Пример 18. Фармакокинетика

Фармакокинетический профиль МАВ№1 оценивали на самцах крыс Han-Wistar (n=3 животных) после однократного внутривенного (i.v.) введения 10 мг/кг IgG.

Способы

Собирали образцы плазмы крови у каждого животного через пункцию ретроорбитального синуса или нижнечелюстной вены в следующие моменты времени: до введения дозы, через 0,083, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336 и 504 часа после введения.

Определяли концентрации свободных, биоактивных МАВ№1 в плазме крови крыс определяли с использованием анализа связывания лигандов на основе MSD. Вкратце, биотинилированный N-концевой пептид C5aR человека наносили на поверхность 96-луночного покрытого стрептавидином планшета MSD. Связанный аналит выявляли с использованием специфического для лекарственного средства антиидиотипического меченного ECL антитела. Фармакокинетические свойства МАВ№1 оценивали с использованием некомпартментального анализа данных (NCA) на основе концентраций свободного лекарственного средства в плазме крови. Результаты

Средние концентрации в плазме крови с течением времени показаны на фиг. 9. Средние максимальные концентрации МАВ№1 в плазме крови после однократного i.v. введения наблюдали через 5 минут (т.е. 0,083 часа) после введения (T_max) у всех трех животных (т.е. первая временная точка отбора образцов после введения). Средний объем распределения (Vz) в 106 мл/кг находился между объемом плазмы крови и внеклеточным объемом (Davies et al., 1993). Средний конечный период полувыведения после i.v. введения определяли через 9,0 дней, средний общий клиренс определяли на уровне 0,341 мл/ч./кг.

В целом МАВ№1 демонстрировал типичный фармакокинетический профиль антитела IgG1 человека в плазме крови крыс без перекрестной реактивности с C5aR грызунов. Признаков клиренса, опосредованного антителами к лекарственным средствам (ADA), обнаружить не удалось.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> MORPHOSYS AG

<120> Антитела, нацеливающиеся на C5aR

<130> MS294/EP-PROV

<140>

<141>

<160> 96

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Asp Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr

20 25 30

Leu Arg Val Pro Asp Ile Leu Ala Leu Val Ile Phe Ala Val Val Phe

35 40 45

Leu Val Gly Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe

50 55 60

Glu Ala Lys Arg Thr Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val

65 70 75 80

Ala Asp Phe Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile

85 90 95

Val Gln His His His Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ala Cys Ser Ile Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala

115 120 125

Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys

130 135 140

Gln Asn Phe Arg Gly Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala

145 150 155 160

Trp Gly Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Val

165 170 175

Val Arg Glu Glu Tyr Phe Pro Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr

180 185 190

Ser His Asp Lys Arg Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val

195 200 205

Leu Gly Phe Leu Trp Pro Leu Leu Thr Leu Thr Ile Cys Tyr Thr Phe

210 215 220

Ile Leu Leu Arg Thr Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr

225 230 235 240

Leu Lys Val Val Val Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu

245 250 255

Pro Tyr Gln Val Thr Gly Ile Met Met Ser Phe Leu Glu Pro Ser Ser

260 265 270

Pro Thr Phe Leu Leu Leu Lys Lys Leu Asp Ser Leu Cys Val Ser Phe

275 280 285

Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Val Val Ala Gly

290 295 300

Gln Gly Phe Gln Gly Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg

305 310 315 320

Asn Val Leu Thr Glu Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr

325 330 335

Arg Ser Thr Val Asp Thr Met Ala Gln Lys Thr Gln Ala Val

340 345 350

<210> 2

<211> 350

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Asn Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Asp Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr

20 25 30

Leu Arg Val Pro Asp Ile Leu Ala Leu Val Ile Phe Ala Val Val Phe

35 40 45

Leu Val Gly Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe

50 55 60

Glu Ala Lys Arg Thr Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val

65 70 75 80

Ala Asp Phe Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile

85 90 95

Val Gln His His His Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ala Cys Ser Ile Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala

115 120 125

Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys

130 135 140

Gln Asn Phe Arg Gly Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala

145 150 155 160

Trp Gly Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Val

165 170 175

Val Arg Glu Glu Tyr Phe Pro Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr

180 185 190

Ser His Asp Lys Arg Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val

195 200 205

Leu Gly Phe Leu Trp Pro Leu Leu Thr Leu Thr Ile Cys Tyr Thr Phe

210 215 220

Ile Leu Leu Arg Thr Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr

225 230 235 240

Leu Lys Val Val Val Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu

245 250 255

Pro Tyr Gln Val Thr Gly Ile Met Met Ser Phe Leu Glu Pro Ser Ser

260 265 270

Pro Thr Phe Leu Leu Leu Asn Lys Leu Asp Ser Leu Cys Val Ser Phe

275 280 285

Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Val Val Ala Gly

290 295 300

Gln Gly Phe Gln Gly Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg

305 310 315 320

Asn Val Leu Thr Glu Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr

325 330 335

Arg Ser Thr Val Asp Thr Met Ala Gln Lys Thr Gln Ala Val

340 345 350

<210> 3

<211> 350

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 3

Met Asp Pro Phe Ser Ser Thr Thr Leu Asp Tyr Glu His Tyr Asp Gly

1 5 10 15

Lys Asn Val Leu Asp Ser Asp Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr

20 25 30

Leu Arg Val Pro Asp Ile Leu Ala Leu Val Val Phe Ala Val Val Phe

35 40 45

Leu Val Gly Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe

50 55 60

Glu Val Lys Arg Thr Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val

65 70 75 80

Ala Asp Phe Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile

85 90 95

Val Gln His His His Trp Pro Phe Gly Gly Thr Ala Cys Arg Ile Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala

115 120 125

Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Asn Pro Ile Trp Cys

130 135 140

Gln Asn Phe Arg Gly Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala

145 150 155 160

Trp Gly Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Ala

165 170 175

Val Arg Gln Glu Glu Tyr Ser Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr

180 185 190

Asn Asn Asp Thr Arg Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val

195 200 205

Leu Gly Phe Leu Trp Pro Leu Leu Thr Leu Met Ile Cys Tyr Thr Phe

210 215 220

Leu Leu Leu Arg Thr Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr

225 230 235 240

Leu Lys Val Val Val Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu

245 250 255

Pro Tyr Gln Val Thr Gly Thr Met Met Ser Phe Leu Arg Pro Ser Ser

260 265 270

Pro Thr Tyr Leu Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ser Leu Ser Ile Ser Phe

275 280 285

Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Ile Asn Pro Val Ile Tyr Val Val Ala Gly

290 295 300

Gln Gly Phe Gln Gly Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg

305 310 315 320

Asn Val Leu Thr Glu Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr

325 330 335

Arg Ser Thr Val Asp Thr Met Thr Glu Lys Thr Gln Ala Val

340 345 350

<210> 4

<211> 351

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 4

Met Asp Pro Ile Asp Asn Ser Ser Phe Glu Ile Asn Tyr Asp His Tyr

1 5 10 15

Gly Thr Met Ala Pro Asn Ile Pro Ala Asp Gly Ile His Leu Pro Lys

20 25 30

Arg Gln Pro Gly Asp Val Ala Ala Leu Ile Ile Tyr Ser Val Val Phe

35 40 45

Leu Val Gly Val Pro Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe

50 55 60

Glu Ala Arg Arg Ala Val Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val

65 70 75 80

Ala Asp Leu Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Val Leu Phe Thr Thr Val

85 90 95

Leu Asn His Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Ala Thr Ala Cys Ile Val Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala

115 120 125

Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys

130 135 140

Gln Lys Val Arg Gly Thr Gly Leu Ala Trp Met Ala Cys Gly Val Ala

145 150 155 160

Trp Val Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Val Tyr Arg Glu

165 170 175

Ala Tyr Lys Asp Phe Tyr Ser Glu His Thr Val Cys Gly Ile Asn Tyr

180 185 190

Gly Gly Gly Ser Phe Pro Lys Glu Lys Ala Val Ala Ile Leu Arg Leu

195 200 205

Met Val Gly Phe Val Leu Pro Leu Leu Thr Leu Asn Ile Cys Tyr Thr

210 215 220

Phe Leu Leu Leu Arg Thr Trp Ser Arg Lys Ala Thr Arg Ser Thr Lys

225 230 235 240

Thr Leu Lys Val Val Met Ala Val Val Ile Cys Phe Phe Ile Phe Trp

245 250 255

Leu Pro Tyr Gln Val Thr Gly Val Met Ile Ala Trp Leu Pro Pro Ser

260 265 270

Ser Pro Thr Leu Lys Arg Val Glu Lys Leu Asn Ser Leu Cys Val Ser

275 280 285

Leu Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Val Asn Pro Ile Ile Tyr Val Met Ala

290 295 300

Gly Gln Gly Phe His Gly Arg Leu Leu Arg Ser Leu Pro Ser Ile Ile

305 310 315 320

Arg Asn Ala Leu Ser Glu Asp Ser Val Gly Arg Asp Ser Lys Thr Phe

325 330 335

Thr Pro Ser Thr Thr Asp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gln Ala Val

340 345 350

<210> 5

<211> 352

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 5

Met Asp Pro Ile Ser Asn Asp Ser Ser Glu Ile Thr Tyr Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Asp Gly Thr Pro Asn Pro Asp Met Pro Ala Asp Gly Val Tyr Ile Pro

20 25 30

Lys Met Glu Pro Gly Asp Ile Ala Ala Leu Ile Ile Tyr Leu Ala Val

35 40 45

Phe Leu Val Gly Val Thr Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala

50 55 60

Phe Glu Ala Lys Arg Thr Val Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala

65 70 75 80

Val Ala Asp Leu Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser

85 90 95

Ile Val Lys His Asn His Trp Pro Phe Gly Asp Gln Ala Cys Ile Val

100 105 110

Leu Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ser Ser Ile Leu Leu Leu

115 120 125

Ala Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp

130 135 140

Cys Gln Lys Phe Arg Arg Pro Gly Leu Ala Trp Met Ala Cys Gly Val

145 150 155 160

Thr Trp Val Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Val Phe Arg

165 170 175

Arg Ile His Lys Asp Pro Tyr Ser Asp Ser Ile Leu Cys Asn Ile Asp

180 185 190

Tyr Ser Lys Gly Pro Phe Phe Ile Glu Lys Ala Ile Ala Ile Leu Arg

195 200 205

Leu Met Val Gly Phe Val Leu Pro Leu Leu Thr Leu Asn Ile Cys Tyr

210 215 220

Thr Phe Leu Leu Ile Arg Thr Trp Ser Arg Lys Ala Thr Arg Ser Thr

225 230 235 240

Lys Thr Leu Lys Val Val Met Ala Val Val Thr Cys Phe Phe Val Phe

245 250 255

Trp Leu Pro Tyr Gln Val Thr Gly Val Ile Leu Ala Trp Leu Pro Arg

260 265 270

Ser Ser Ser Thr Phe Gln Ser Val Glu Arg Leu Asn Ser Leu Cys Val

275 280 285

Ser Leu Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Val Asn Pro Ile Ile Tyr Val Met

290 295 300

Ala Gly Gln Gly Phe His Gly Arg Leu Arg Arg Ser Leu Pro Ser Ile

305 310 315 320

Ile Arg Asn Val Leu Ser Glu Asp Ser Leu Gly Arg Asp Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Thr Arg Ser Thr Met Asp Thr Ser Thr Gln Lys Ser Gln Ala Val

340 345 350

<210> 6

<211> 74

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser

1 5 10 15

Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu

20 25 30

Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile

35 40 45

Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn

50 55 60

Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg

65 70

<210> 7

<211> 337

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Gly Asn Asp Ser Val Ser Tyr Glu Tyr Gly Asp Tyr Ser Asp Leu

1 5 10 15

Ser Asp Arg Pro Val Asp Cys Leu Asp Gly Ala Cys Leu Ala Ile Asp

20 25 30

Pro Leu Arg Val Ala Pro Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val

35 40 45

Gly Val Pro Gly Asn Ala Met Val Ala Trp Val Ala Gly Lys Val Ala

50 55 60

Arg Arg Arg Val Gly Ala Thr Trp Leu Leu His Leu Ala Val Ala Asp

65 70 75 80

Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ala Val Pro Ile Ala Arg

85 90 95

Gly Gly His Trp Pro Tyr Gly Ala Val Gly Cys Arg Ala Leu Pro Ser

100 105 110

Ile Ile Leu Leu Thr Met Tyr Ala Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Leu

115 120 125

Ser Ala Asp Leu Cys Phe Leu Ala Leu Gly Pro Ala Trp Trp Ser Thr

130 135 140

Val Gln Arg Ala Cys Gly Val Gln Val Ala Cys Gly Ala Ala Trp Thr

145 150 155 160

Leu Ala Leu Leu Leu Thr Val Pro Ser Ala Ile Tyr Arg Arg Leu His

165 170 175

Gln Glu His Phe Pro Ala Arg Leu Gln Cys Val Val Asp Tyr Gly Gly

180 185 190

Ser Ser Ser Thr Glu Asn Ala Val Thr Ala Ile Arg Phe Leu Phe Gly

195 200 205

Phe Leu Gly Pro Leu Val Ala Val Ala Ser Cys His Ser Ala Leu Leu

210 215 220

Cys Trp Ala Ala Arg Arg Cys Arg Pro Leu Gly Thr Ala Ile Val Val

225 230 235 240

Gly Phe Phe Val Cys Trp Ala Pro Tyr His Leu Leu Gly Leu Val Leu

245 250 255

Thr Val Ala Ala Pro Asn Ser Ala Leu Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ala

260 265 270

Glu Pro Leu Ile Val Gly Leu Ala Leu Ala His Ser Cys Leu Asn Pro

275 280 285

Met Leu Phe Leu Tyr Phe Gly Arg Ala Gln Leu Arg Arg Ser Leu Pro

290 295 300

Ala Ala Cys His Trp Ala Leu Arg Glu Ser Gln Gly Gln Asp Glu Ser

305 310 315 320

Val Asp Ser Lys Lys Ser Thr Ser His Asp Leu Val Ser Glu Met Glu

325 330 335

Val

<210> 8

<211> 482

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Ala Ser Phe Ser Ala Glu Thr Asn Ser Thr Asp Leu Leu Ser Gln

1 5 10 15

Pro Trp Asn Glu Pro Pro Val Ile Leu Ser Met Val Ile Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Phe Leu Leu Gly Leu Pro Gly Asn Gly Leu Val Leu Trp Val Ala

35 40 45

Gly Leu Lys Met Gln Arg Thr Val Asn Thr Ile Trp Phe Leu His Leu

50 55 60

Thr Leu Ala Asp Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Pro Phe Ser Leu Ala

65 70 75 80

His Leu Ala Leu Gln Gly Gln Trp Pro Tyr Gly Arg Phe Leu Cys Lys

85 90 95

Leu Ile Pro Ser Ile Ile Val Leu Asn Met Phe Ala Ser Val Phe Leu

100 105 110

Leu Thr Ala Ile Ser Leu Asp Arg Cys Leu Val Val Phe Lys Pro Ile

115 120 125

Trp Cys Gln Asn His Arg Asn Val Gly Met Ala Cys Ser Ile Cys Gly

130 135 140

Cys Ile Trp Val Val Ala Cys Val Met Cys Ile Pro Val Phe Val Tyr

145 150 155 160

Arg Glu Ile Phe Thr Thr Asp Asn His Asn Arg Cys Gly Tyr Lys Phe

165 170 175

Gly Leu Ser Ser Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Phe Tyr Gly Asp Pro Leu

180 185 190

Glu Asn Arg Ser Leu Glu Asn Ile Val Gln Pro Pro Gly Glu Met Asn

195 200 205

Asp Arg Leu Asp Pro Ser Ser Phe Gln Thr Asn Asp His Pro Trp Thr

210 215 220

Val Pro Thr Val Phe Gln Pro Gln Thr Phe Gln Arg Pro Ser Ala Asp

225 230 235 240

Ser Leu Pro Arg Gly Ser Ala Arg Leu Thr Ser Gln Asn Leu Tyr Ser

245 250 255

Asn Val Phe Lys Pro Ala Asp Val Val Ser Pro Lys Ile Pro Ser Gly

260 265 270

Phe Pro Ile Glu Asp His Glu Thr Ser Pro Leu Asp Asn Ser Asp Ala

275 280 285

Phe Leu Ser Thr His Leu Lys Leu Phe Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ser

290 295 300

Phe Tyr Glu Ser Glu Leu Pro Gln Gly Phe Gln Asp Tyr Tyr Asn Leu

305 310 315 320

Gly Gln Phe Thr Asp Asp Asp Gln Val Pro Thr Pro Leu Val Ala Ile

325 330 335

Thr Ile Thr Arg Leu Val Val Gly Phe Leu Leu Pro Ser Val Ile Met

340 345 350

Ile Ala Cys Tyr Ser Phe Ile Val Phe Arg Met Gln Arg Gly Arg Phe

355 360 365

Ala Lys Ser Gln Ser Lys Thr Phe Arg Val Ala Val Val Val Val Ala

370 375 380

Val Phe Leu Val Cys Trp Thr Pro Tyr His Ile Phe Gly Val Leu Ser

385 390 395 400

Leu Leu Thr Asp Pro Glu Thr Pro Leu Gly Lys Thr Leu Met Ser Trp

405 410 415

Asp His Val Cys Ile Ala Leu Ala Ser Ala Asn Ser Cys Phe Asn Pro

420 425 430

Phe Leu Tyr Ala Leu Leu Gly Lys Asp Phe Arg Lys Lys Ala Arg Gln

435 440 445

Ser Ile Gln Gly Ile Leu Glu Ala Ala Phe Ser Glu Glu Leu Thr Arg

450 455 460

Ser Thr His Cys Pro Ser Asn Asn Val Ile Ser Glu Arg Asn Ser Thr

465 470 475 480

Thr Val

<210> 9

<211> 350

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Met Glu Thr Asn Ser Ser Leu Pro Thr Asn Ile Ser Gly Gly Thr Pro

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Gly Tyr Leu Phe Leu Asp Ile Ile Thr Tyr Leu Val

20 25 30

Phe Ala Val Thr Phe Val Leu Gly Val Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile

35 40 45

Trp Val Ala Gly Phe Arg Met Thr His Thr Val Thr Thr Ile Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Cys Phe Thr Ser Thr Leu Pro Phe

65 70 75 80

Phe Met Val Arg Lys Ala Met Gly Gly His Trp Pro Phe Gly Trp Phe

85 90 95

Leu Cys Lys Phe Leu Phe Thr Ile Val Asp Ile Asn Leu Phe Gly Ser

100 105 110

Val Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ala Leu Asp Arg Cys Val Cys Val Leu

115 120 125

His Pro Val Trp Thr Gln Asn His Arg Thr Val Ser Leu Ala Lys Lys

130 135 140

Val Ile Ile Gly Pro Trp Val Met Ala Leu Leu Leu Thr Leu Pro Val

145 150 155 160

Ile Ile Arg Val Thr Thr Val Pro Gly Lys Thr Gly Thr Val Ala Cys

165 170 175

Thr Phe Asn Phe Ser Pro Trp Thr Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ile Asn

180 185 190

Val Ala Val Ala Met Leu Thr Val Arg Gly Ile Ile Arg Phe Ile Ile

195 200 205

Gly Phe Ser Ala Pro Met Ser Ile Val Ala Val Ser Tyr Gly Leu Ile

210 215 220

Ala Thr Lys Ile His Lys Gln Gly Leu Ile Lys Ser Ser Pro Pro Leu

225 230 235 240

Arg Val Leu Ser Phe Val Ala Ala Ala Phe Phe Leu Cys Trp Ser Pro

245 250 255

Tyr Gln Val Val Ala Leu Ile Ala Thr Val Arg Ile Arg Glu Leu Leu

260 265 270

Gln Gly Met Tyr Lys Glu Ile Gly Ile Ala Val Asp Val Thr Ser Ala

275 280 285

Leu Ala Phe Phe Asn Ser Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Val Phe Met

290 295 300

Gly Gln Asp Phe Arg Glu Arg Leu Ile His Ala Leu Pro Ala Ser Leu

305 310 315 320

Glu Arg Ala Leu Thr Glu Asp Ser Thr Gln Thr Ser Asp Thr Ala Thr

325 330 335

Asn Ser Thr Leu Pro Ser Ala Glu Val Ala Leu Gln Ala Lys

340 345 350

<210> 10

<211> 373

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Arg Met Glu Asp Glu Asp Tyr Asn Thr Ser Ile Ser Tyr Gly Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Pro Asp Tyr Leu Asp Ser Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Ser

20 25 30

Pro Leu Glu Ala Arg Val Thr Arg Ile Phe Leu Val Val Val Tyr Ser

35 40 45

Ile Val Cys Phe Leu Gly Ile Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile Ile Ile

50 55 60

Ala Thr Phe Lys Met Lys Lys Thr Val Asn Met Val Trp Phe Leu Asn

65 70 75 80

Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Phe Asn Val Phe Leu Pro Ile His Ile

85 90 95

Thr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr His Trp Val Phe Gly Thr Ala Met Cys

100 105 110

Lys Ile Ser Asn Phe Leu Leu Ile His Asn Met Phe Thr Ser Val Phe

115 120 125

Leu Leu Thr Ile Ile Ser Ser Asp Arg Cys Ile Ser Val Leu Leu Pro

130 135 140

Val Trp Ser Gln Asn His Arg Ser Val Arg Leu Ala Tyr Met Ala Cys

145 150 155 160

Met Val Ile Trp Val Leu Ala Phe Phe Leu Ser Ser Pro Ser Leu Val

165 170 175

Phe Arg Asp Thr Ala Asn Leu His Gly Lys Ile Ser Cys Phe Asn Asn

180 185 190

Phe Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ser Ser Trp Pro Thr His Ser Gln

195 200 205

Met Asp Pro Val Gly Tyr Ser Arg His Met Val Val Thr Val Thr Arg

210 215 220

Phe Leu Cys Gly Phe Leu Val Pro Val Leu Ile Ile Thr Ala Cys Tyr

225 230 235 240

Leu Thr Ile Val Cys Lys Leu His Arg Asn Arg Leu Ala Lys Thr Lys

245 250 255

Lys Pro Phe Lys Ile Ile Val Thr Ile Ile Ile Thr Phe Phe Leu Cys

260 265 270

Trp Cys Pro Tyr His Thr Leu Asn Leu Leu Glu Leu His His Thr Ala

275 280 285

Met Pro Gly Ser Val Phe Ser Leu Gly Leu Pro Leu Ala Thr Ala Leu

290 295 300

Ala Ile Ala Asn Ser Cys Met Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe Met Gly

305 310 315 320

Gln Asp Phe Lys Lys Phe Lys Val Ala Leu Phe Ser Arg Leu Val Asn

325 330 335

Ala Leu Ser Glu Asp Thr Gly His Ser Ser Tyr Pro Ser His Arg Ser

340 345 350

Phe Thr Lys Met Ser Ser Met Asn Glu Arg Thr Ser Met Asn Glu Arg

355 360 365

Glu Thr Gly Met Leu

370

<210> 11

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

130 135 140

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

145 150 155 160

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

165 170 175

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

180 185 190

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

195 200 205

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 12

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Asp Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn

20 25 30

<210> 13

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Asp Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr

20 25 30

Leu Arg Val Pro Asp

35

<210> 14

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 14

Met Asp Pro Phe Ser Ser Thr Thr Leu Asp Tyr Glu His Tyr Asp Gly

1 5 10 15

Lys Asn Val Leu Asp Ser Asp Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr

20 25 30

Leu Arg Val Pro Asp

35

<210> 15

<211> 398

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 15

Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser

1 5 10 15

Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro

20 25 30

Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys

35 40 45

Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu

50 55 60

Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys

85 90 95

Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu

100 105 110

Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly

115 120 125

Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln

130 135 140

Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro

145 150 155 160

His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp

165 170 175

Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly

180 185 190

Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu

195 200 205

Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly

210 215 220

Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu

225 230 235 240

Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His

245 250 255

Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys

260 265 270

Ser Ser Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

275 280 285

Ile Glu Trp His Glu His His His His His His Ile Gln Arg Thr Pro

290 295 300

Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn

305 310 315 320

Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val

325 330 335

Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp

340 345 350

Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu

355 360 365

Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val

370 375 380

Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met

385 390 395

<210> 16

<211> 398

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 16

Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser

1 5 10 15

Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro

20 25 30

Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Arg Gly Gln Ala Glu Pro Cys

35 40 45

Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu

50 55 60

Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys

85 90 95

Glu Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu

100 105 110

Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly

115 120 125

Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln

130 135 140

Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro

145 150 155 160

His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp

165 170 175

Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Pro Gly

180 185 190

Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu

195 200 205

Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Met Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly

210 215 220

Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu

225 230 235 240

Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His

245 250 255

Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Thr Pro Ala Lys

260 265 270

Ser Ser Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

275 280 285

Ile Glu Trp His Glu His His His His His His Ile Gln Arg Thr Pro

290 295 300

Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn

305 310 315 320

Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val

325 330 335

Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Lys Met Gly Lys Val Glu His Ser Asp

340 345 350

Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu

355 360 365

Phe Thr Pro Asn Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val

370 375 380

Thr Leu Ser Gly Pro Arg Thr Val Lys Trp Asp Arg Asp Met

385 390 395

<210> 17

<211> 400

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 17

Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Asn

1 5 10 15

Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Pro

20 25 30

Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys

35 40 45

Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu

50 55 60

Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Leu Lys

65 70 75 80

Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu

85 90 95

Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val Pro Thr Ala Val Phe

100 105 110

Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn Pro Arg Ile Gly Asn

115 120 125

Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val Ala Asn Leu Trp Met

130 135 140

Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Asn Ser

145 150 155 160

Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly Arg Arg Asn Leu

165 170 175

Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn

180 185 190

Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro

195 200 205

Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser

225 230 235 240

Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val

245 250 255

Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Ser

260 265 270

Ala Arg Ser Ser Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala

275 280 285

Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His Ile Gln Lys

290 295 300

Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile

325 330 335

Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met

340 345 350

Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His

355 360 365

Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys

370 375 380

His Asp Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met

385 390 395 400

<210> 18

<211> 274

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 18

Gln Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val

1 5 10 15

Ser Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His

20 25 30

Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr

35 40 45

Gln Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp

50 55 60

Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro

65 70 75 80

Ile Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser

85 90 95

Arg Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp

100 105 110

Lys Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala

115 120 125

Phe Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn

130 135 140

Ile Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala

165 170 175

Pro Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu

180 185 190

Val Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu

195 200 205

Gln Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg

210 215 220

Asn Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys

245 250 255

Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Asn Ser Arg His His His His

260 265 270

His His

<210> 19

<211> 186

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 19

Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp

1 5 10 15

Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala

20 25 30

Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu

35 40 45

Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn

50 55 60

Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp

65 70 75 80

Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro

85 90 95

His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser

100 105 110

Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys

115 120 125

Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala

130 135 140

Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr

145 150 155 160

Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser

165 170 175

Val Asn Ser Arg His His His His His His

180 185

<210> 20

<211> 186

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 20

Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp

1 5 10 15

Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala

20 25 30

Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu

35 40 45

Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn

50 55 60

Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp

65 70 75 80

Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro

85 90 95

His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser

100 105 110

Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys

115 120 125

Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala

130 135 140

Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr

145 150 155 160

Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser

165 170 175

Val Asn Ser Arg His His His His His His

180 185

<210> 21

<211> 187

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 21

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

20 25 30

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

50 55 60

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

130 135 140

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

165 170 175

Gly Val Asn Ser Arg His His His His His His

180 185

<210> 22

<211> 187

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 22

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

20 25 30

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

50 55 60

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

130 135 140

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

165 170 175

Gly Val Asn Ser Arg His His His His His His

180 185

<210> 23

<211> 186

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 23

Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp

1 5 10 15

Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr

20 25 30

His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu

35 40 45

Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn

50 55 60

Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp

65 70 75 80

Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro

85 90 95

His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser

100 105 110

Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys

115 120 125

Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala

130 135 140

Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr

145 150 155 160

Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser

165 170 175

Asp Asn Ser Arg His His His His His His

180 185

<210> 24

<211> 907

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 24

Asp Gly Ser His His His His His His Gly Thr Met Asp Ser Phe Asn

1 5 10 15

Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp Lys Asp Thr Leu Asp

20 25 30

Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr Leu Arg Val Pro Asp

35 40 45

Ile Leu Ala Leu Val Ile Phe Ala Val Val Phe Leu Val Gly Val Leu

50 55 60

Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe Glu Ala Lys Arg Thr

65 70 75 80

Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Ser

85 90 95

Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile Val Gln His His His

100 105 110

Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ala Cys Ser Ile Leu Pro Ser Leu Ile Leu

115 120 125

Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala Thr Ile Ser Ala Asp

130 135 140

Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys Gln Asn Phe Arg Gly

145 150 155 160

Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala Trp Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Val Val Arg Glu Glu Tyr

180 185 190

Phe Pro Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr Ser His Asp Lys Arg

195 200 205

Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val Leu Gly Phe Leu Trp

210 215 220

Pro Leu Leu Thr Leu Thr Ile Cys Tyr Thr Phe Ile Leu Leu Arg Thr

225 230 235 240

Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr Leu Lys Val Val Val

245 250 255

Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu Pro Tyr Gln Val Thr

260 265 270

Gly Ile Met Met Ser Phe Leu Glu Pro Ser Ser Pro Thr Phe Leu Leu

275 280 285

Leu Lys Lys Leu Asp Ser Leu Cys Val Ser Phe Ala Tyr Ile Asn Cys

290 295 300

Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Val Val Ala Gly Gln Gly Phe Gln Gly

305 310 315 320

Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg Asn Val Leu Thr Glu

325 330 335

Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr Arg Ser Thr Val Asp

340 345 350

Thr Met Ala Gln Lys Thr Gln Ala Val Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp

355 360 365

Asp Asp Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu

370 375 380

Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly

385 390 395 400

Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu

405 410 415

Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly

420 425 430

Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser

435 440 445

Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val

450 455 460

His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile

465 470 475 480

Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala

485 490 495

Asp Thr Gly His Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln

500 505 510

Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu

515 520 525

Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val

530 535 540

Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu

545 550 555 560

Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met

565 570 575

Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His

580 585 590

Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg

595 600 605

Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly

610 615 620

Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg

625 630 635 640

Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr

645 650 655

Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr

660 665 670

Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu

675 680 685

Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro

690 695 700

Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu

705 710 715 720

Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala

725 730 735

Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr Ile

740 745 750

Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Cys

755 760 765

Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro

770 775 780

Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys

785 790 795 800

Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser

805 810 815

Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr

820 825 830

Ala Pro Pro Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu

835 840 845

Glu Ser Phe Arg Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gln Lys Gln

850 855 860

Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu

865 870 875 880

Phe Gly Asn Asp Pro Ser Ser Gln Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn Asp

885 890 895

Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

900 905

<210> 25

<211> 874

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 25

Asp Gly Ser His His His His His His Gly Thr Met Asn Ser Phe Asn

1 5 10 15

Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp Lys Asp Thr Leu Asp

20 25 30

Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr Leu Arg Val Pro Asp

35 40 45

Ile Leu Ala Leu Val Ile Phe Ala Val Val Phe Leu Val Gly Val Leu

50 55 60

Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe Glu Ala Lys Arg Thr

65 70 75 80

Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Ser

85 90 95

Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile Val Gln His His His

100 105 110

Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ala Cys Ser Ile Leu Pro Ser Leu Ile Leu

115 120 125

Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala Thr Ile Ser Ala Asp

130 135 140

Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys Gln Asn Phe Arg Gly

145 150 155 160

Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala Trp Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Val Val Arg Glu Glu Tyr

180 185 190

Phe Pro Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr Ser His Asp Lys Arg

195 200 205

Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val Leu Gly Phe Leu Trp

210 215 220

Pro Leu Leu Thr Leu Thr Ile Cys Tyr Thr Phe Ile Leu Leu Arg Thr

225 230 235 240

Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr Leu Lys Val Val Val

245 250 255

Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu Pro Tyr Gln Val Thr

260 265 270

Gly Ile Met Met Ser Phe Leu Glu Pro Ser Ser Pro Thr Phe Leu Leu

275 280 285

Leu Asn Lys Leu Asp Ser Leu Cys Val Ser Phe Ala Tyr Ile Asn Cys

290 295 300

Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Val Val Ala Gly Gln Gly Phe Gln Gly

305 310 315 320

Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg Asn Val Leu Thr Glu

325 330 335

Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr Arg Ser Thr Val Asp

340 345 350

Thr Met Ala Gln Lys Thr Gln Ala Val Asp Ile Gly Ala Arg Ala Ser

355 360 365

Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg

370 375 380

Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser

385 390 395 400

Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser

405 410 415

Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr

420 425 430

Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr

435 440 445

Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp

450 455 460

Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala

465 470 475 480

Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile

485 490 495

Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg

500 505 510

Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro

515 520 525

Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln

530 535 540

Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met

545 550 555 560

Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg

565 570 575

Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu

580 585 590

Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln

595 600 605

Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr

610 615 620

Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser

625 630 635 640

Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg

645 650 655

Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser

660 665 670

Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala

675 680 685

Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr

690 695 700

Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His

705 710 715 720

Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala

725 730 735

Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val

740 745 750

Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg

755 760 765

Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln

770 775 780

Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp

785 790 795 800

Pro Ser Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu

805 810 815

Pro Thr Ala Pro Pro Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro

820 825 830

Pro Glu Glu Ser Phe Arg Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gln

835 840 845

Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg

850 855 860

Ser Leu Phe Gly Asn Asp Pro Ser Ser Gln

865 870

<210> 26

<211> 908

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 26

Asp Gly Ser His His His His His His Gly Thr Met Asp Pro Ile Asp

1 5 10 15

Asn Ser Ser Phe Glu Ile Asn Tyr Asp His Tyr Gly Thr Met Ala Pro

20 25 30

Asn Ile Pro Ala Asp Gly Ile His Leu Pro Lys Arg Gln Pro Gly Asp

35 40 45

Val Ala Ala Leu Ile Ile Tyr Ser Val Val Phe Leu Val Gly Val Pro

50 55 60

Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe Glu Ala Arg Arg Ala

65 70 75 80

Val Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Ser

85 90 95

Cys Leu Ala Leu Pro Val Leu Phe Thr Thr Val Leu Asn His Asn Tyr

100 105 110

Trp Tyr Phe Asp Ala Thr Ala Cys Ile Val Leu Pro Ser Leu Ile Leu

115 120 125

Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala Thr Ile Ser Ala Asp

130 135 140

Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys Gln Lys Val Arg Gly

145 150 155 160

Thr Gly Leu Ala Trp Met Ala Cys Gly Val Ala Trp Val Leu Ala Leu

165 170 175

Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Val Tyr Arg Glu Ala Tyr Lys Asp Phe

180 185 190

Tyr Ser Glu His Thr Val Cys Gly Ile Asn Tyr Gly Gly Gly Ser Phe

195 200 205

Pro Lys Glu Lys Ala Val Ala Ile Leu Arg Leu Met Val Gly Phe Val

210 215 220

Leu Pro Leu Leu Thr Leu Asn Ile Cys Tyr Thr Phe Leu Leu Leu Arg

225 230 235 240

Thr Trp Ser Arg Lys Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr Leu Lys Val Val

245 250 255

Met Ala Val Val Ile Cys Phe Phe Ile Phe Trp Leu Pro Tyr Gln Val

260 265 270

Thr Gly Val Met Ile Ala Trp Leu Pro Pro Ser Ser Pro Thr Leu Lys

275 280 285

Arg Val Glu Lys Leu Asn Ser Leu Cys Val Ser Leu Ala Tyr Ile Asn

290 295 300

Cys Cys Val Asn Pro Ile Ile Tyr Val Met Ala Gly Gln Gly Phe His

305 310 315 320

Gly Arg Leu Leu Arg Ser Leu Pro Ser Ile Ile Arg Asn Ala Leu Ser

325 330 335

Glu Asp Ser Val Gly Arg Asp Ser Lys Thr Phe Thr Pro Ser Thr Thr

340 345 350

Asp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gln Ala Val Asp Ile Asp Tyr Lys Asp

355 360 365

Asp Asp Asp Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Gly Ala Arg Ala Ser Val

370 375 380

Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro

385 390 395 400

Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg

405 410 415

Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu

420 425 430

Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly

435 440 445

Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys

450 455 460

Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys

465 470 475 480

Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala

485 490 495

Ala Asp Thr Gly His Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val

500 505 510

Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr

515 520 525

Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu

530 535 540

Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp

545 550 555 560

Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln

565 570 575

Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val

580 585 590

His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro

595 600 605

Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile

610 615 620

Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys

625 630 635 640

Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro

645 650 655

Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp

660 665 670

Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln

675 680 685

Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn

690 695 700

Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu

705 710 715 720

Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys

725 730 735

Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr

740 745 750

Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys

755 760 765

Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala

770 775 780

Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met

785 790 795 800

Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro

805 810 815

Ser Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro

820 825 830

Thr Ala Pro Pro Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro

835 840 845

Glu Glu Ser Phe Arg Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gln Lys

850 855 860

Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser

865 870 875 880

Leu Phe Gly Asn Asp Pro Ser Ser Gln Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn

885 890 895

Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

900 905

<210> 27

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 27

Ser Tyr Ala Met His

1 5

<210> 28

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 28

Arg Ile Lys Ser Lys Ala Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala His

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 29

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 29

Val Ser Phe Ser Thr Phe Asp Val

1 5

<210> 30

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 30

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 31

Lys Ser Lys Ala Gln Gly Gly Thr

1 5

<210> 32

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 32

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 33

Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 34

Asp Ser Trp Asp His Ser Ser Met Asn Val

1 5 10

<210> 35

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Ala Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

His Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Ser Phe Ser Thr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 36

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asp Ser Trp Asp His Ser Ser

85 90 95

Met Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 37

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Ala Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

His Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Ser Phe Ser Thr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 38

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 38

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asp Ser Trp Asp His Ser Ser

85 90 95

Met Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 39

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 39

Arg Ile Lys Ser Val Ala Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala His

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 40

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 40

Val Ser His Ser Thr Phe Asp Val

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид"

<400> 41

Lys Ser Val Ala Gln Gly Gly Thr

1 5

<210> 42

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Val Ala Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

His Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Ser His Ser Thr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 43

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asp Ser Trp Asp His Ser Ser

85 90 95

Met Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 44

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Val Ala Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

His Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Ser His Ser Thr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 45

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 45

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asp Ser Trp Asp His Ser Ser

85 90 95

Met Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 46

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 46

agctatgcga tgcac

15

<210> 47

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 47

cgtatcaaat ccaaagccca gggcggtacg accgactacg cggcgcacgt gaaaggc

57

<210> 48

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 48

gtttctttct ccactttcga tgtt

24

<210> 49

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 49

ggatttacct tcagcagcta t

21

<210> 50

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 50

aaatccaaag cccagggcgg tacg

24

<210> 51

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 51

agcggcagct cctccaatat tggtagctat tacgtgagc

39

<210> 52

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 52

cgtaataatc aacgtcctag c

21

<210> 53

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 53

gacagctggg atcacagctc catgaatgtt

30

<210> 54

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 54

gaggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg

60

agctgcgccg cctccggatt taccttcagc agctatgcga tgcactgggt gcgccaggcc

120

ccgggcaaag gtctcgaatg ggtgggtcgt atcaaatcca aagcccaggg cggtacgacc

180

gactacgcgg cgcacgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc

240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt

300

gtttctttct ccactttcga tgtttggggc caaggcaccc tggtgactgt ctcgagc

357

<210> 55

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 55

cagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt

60

agctgtagcg gcagctcctc caatattggt agctattacg tgagctggta tcagcagctg

120

ccgggcacgg cgccgaaagt tctgatctat cgtaataatc aacgtcctag cggcgtgccg

180

gatcgcttta gcggatccaa aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa

240

gcagaagatg aagcggatta ttactgcgac agctgggatc acagctccat gaatgttttt

300

ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cag

333

<210> 56

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 56

gaggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg

60

agctgcgccg cctccggatt taccttcagc agctatgcga tgcactgggt gcgccaggcc

120

ccgggcaaag gtctcgaatg ggtgggtcgt atcaaatcca aagcccaggg cggtacgacc

180

gactacgcgg cgcacgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc

240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt

300

gtttctttct ccactttcga tgtttggggc caaggcaccc tggtgactgt ctcgagcgcg

360

tcgaccaaag gccccagcgt gttccctctg gcccccagca gcaagagcac ctctggcgga

420

acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg

480

aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctcca gagcagcggc

540

ctgtacagcc tgagcagcgt cgtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac

600

atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac acaaaggtgg acaagcgggt ggaacccaag

660

agctgcgaca agacccacac ctgtcccccc tgccctgccc ctgaagcgga gggagccccc

720

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcctaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa

780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt taattggtac

840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gtacaacagc

900

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag

960

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccttcctcca tcgagaaaac catcagcaag

1020

gccaaaggcc agccccgcga gccccaggtg tacacactgc cccctagccg ggaagagatg

1080

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctc gtgaagggct tctaccccag cgacattgcc

1140

gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg

1200

gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccggtggcag

1260

cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag

1320

aagtccctga gcctgagccc cggcaag

1347

<210> 57

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 57

cagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt

60

agctgtagcg gcagctcctc caatattggt agctattacg tgagctggta tcagcagctg

120

ccgggcacgg cgccgaaagt tctgatctat cgtaataatc aacgtcctag cggcgtgccg

180

gatcgcttta gcggatccaa aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa

240

gcagaagatg aagcggatta ttactgcgac agctgggatc acagctccat gaatgttttt

300

ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cagcccaaag ccgcccctag cgtgaccctg

360

ttccccccct cgagtgagga actccaggcc aacaaggcca ccctcgtgtg cctgatcagc

420

gacttctacc ctggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg atagcagccc tgtgaaggcc

480

ggcgtggaaa ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca aatacgccgc cagcagctac

540

ctgagcctga cccccgagca gtggaagtcc cacagatcct acagctgcca ggtcacacac

600

gagggcagca ccgtggaaaa gaccgtggcc cccaccgagt gcagc

645

<210> 58

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 58

agctatgcga tgcac

15

<210> 59

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 59

cgtatcaaat ccgtggccca gggcggtacg accgactacg cggcgcacgt gaaaggc

57

<210> 60

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 60

gtttctcatt ccactttcga tgtt

24

<210> 61

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 61

ggatttacct tcagcagcta t

21

<210> 62

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 62

aaatccgtgg cccagggcgg tacg

24

<210> 63

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 63

agcggcagct cctccaatat tggtagctat tacgtgagc

39

<210> 64

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 64

cgtaataatc aacgtcctag c

21

<210> 65

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 65

gacagctggg atcacagctc catgaatgtt

30

<210> 66

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 66

gaggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg

60

agctgcgccg cctccggatt taccttcagc agctatgcga tgcactgggt gcgccaggcc

120

ccgggcaaag gtctcgaatg ggtgggtcgt atcaaatccg tggcccaggg cggtacgacc

180

gactacgcgg cgcacgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc

240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt

300

gtttctcatt ccactttcga tgtttggggc caaggcaccc tggtgactgt ctcgagc

357

<210> 67

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 67

cagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt

60

agctgtagcg gcagctcctc caatattggt agctattacg tgagctggta tcagcagctg

120

ccgggcacgg cgccgaaagt tctgatctat cgtaataatc aacgtcctag cggcgtgccg

180

gatcgcttta gcggatccaa aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa

240

gcagaagatg aagcggatta ttactgcgac agctgggatc acagctccat gaatgttttt

300

ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cag

333

<210> 68

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 68

gaggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg

60

agctgcgccg cctccggatt taccttcagc agctatgcga tgcactgggt gcgccaggcc

120

ccgggcaaag gtctcgaatg ggtgggtcgt atcaaatccg tggcccaggg cggtacgacc

180

gactacgcgg cgcacgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc

240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt

300

gtttctcatt ccactttcga tgtttggggc caaggcaccc tggtgactgt ctcgagcgcg

360

tcgaccaaag gccccagcgt gttccctctg gcccccagca gcaagagcac ctctggcgga

420

acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg

480

aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctcca gagcagcggc

540

ctgtacagcc tgagcagcgt cgtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac

600

atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac acaaaggtgg acaagcgggt ggaacccaag

660

agctgcgaca agacccacac ctgtcccccc tgccctgccc ctgaagcgga gggagccccc

720

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcctaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa

780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt taattggtac

840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gtacaacagc

900

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag

960

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccttcctcca tcgagaaaac catcagcaag

1020

gccaaaggcc agccccgcga gccccaggtg tacacactgc cccctagccg ggaagagatg

1080

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctc gtgaagggct tctaccccag cgacattgcc

1140

gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg

1200

gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccggtggcag

1260

cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag

1320

aagtccctga gcctgagccc cggcaag

1347

<210> 69

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 69

cagagcgtgc tgacccagcc tcctagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt

60

agctgtagcg gcagctcctc caatattggt agctattacg tgagctggta tcagcagctg

120

ccgggcacgg cgccgaaagt tctgatctat cgtaataatc aacgtcctag cggcgtgccg

180

gatcgcttta gcggatccaa aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa

240

gcagaagatg aagcggatta ttactgcgac agctgggatc acagctccat gaatgttttt

300

ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cagcccaaag ccgcccctag cgtgaccctg

360

ttccccccct cgagtgagga actccaggcc aacaaggcca ccctcgtgtg cctgatcagc

420

gacttctacc ctggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg atagcagccc tgtgaaggcc

480

ggcgtggaaa ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca aatacgccgc cagcagctac

540

ctgagcctga cccccgagca gtggaagtcc cacagatcct acagctgcca ggtcacacac

600

gagggcagca ccgtggaaaa gaccgtggcc cccaccgagt gcagc

645

<210> 70

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 70

agctacgcta tgcac

15

<210> 71

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 71

cggatcaaga gcaaggctca aggcggcacc accgattacg ccgctcatgt gaagggc

57

<210> 72

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 72

gtgtccttct ccaccttcga tgtg

24

<210> 73

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 73

ggcttcacct tctccagcta c

21

<210> 74

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 74

aagagcaagg ctcaaggcgg cacc

24

<210> 75

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 75

tccggctcct cctccaacat cggctcctac tacgtgtcc

39

<210> 76

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 76

cggaacaacc agcggccttc t

21

<210> 77

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 77

gactcttggg accactcctc catgaacgtg

30

<210> 78

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 78

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga cttgtgaaac ctggcggctc tctgagactg

60

tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgcactgggt ccgacaggcc

120

cctggcaaag gattggagtg ggtcggacgg atcaagagca aggctcaagg cggcaccacc

180

gattacgccg ctcatgtgaa gggcagattc accatctctc gggacgactc caagaacacc

240

ctgtacctgc agatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga

300

gtgtccttct ccaccttcga tgtgtggggc cagggcacac tggttacagt ctcgagc

357

<210> 79

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 79

cagtccgtgc tgacccagcc tccttctgtt tctggtgctc ctggccagag agtgaccatc

60

tcttgctccg gctcctcctc caacatcggc tcctactacg tgtcctggta tcagcagctg

120

cctggcaccg ctcctaaggt gctgatctac cggaacaacc agcggccttc tggcgtgccc

180

gatagattct ccggctctaa gtctggcacc tctgccagcc tggctatcac tggactgcag

240

gctgaggacg aggccgacta ctactgcgac tcttgggacc actcctccat gaacgtgttc

300

ggcggaggta ccaagctgac cgtgctggga cag

333

<210> 80

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 80

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga cttgtgaaac ctggcggctc tctgagactg

60

tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgcactgggt ccgacaggcc

120

cctggcaaag gattggagtg ggtcggacgg atcaagagca aggctcaagg cggcaccacc

180

gattacgccg ctcatgtgaa gggcagattc accatctctc gggacgactc caagaacacc

240

ctgtacctgc agatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga

300

gtgtccttct ccaccttcga tgtgtggggc cagggcacac tggttacagt ctcgagcgcc

360

tccaccaaag gaccctctgt gtttcctctg gctccctcca gcaagtctac ctctggtgga

420

acagctgccc tgggctgcct ggtcaaggat tactttcctg agcctgtgac cgtgtcctgg

480

aactctggcg ctctgacatc tggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca gtcctctggc

540

ctgtacagcc tgtcctctgt cgtgaccgtg ccttctagct ctctgggcac ccagacctac

600

atctgcaatg tgaaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagagagt ggaacccaag

660

tcctgcgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaagctga gggcgctcct

720

tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatctctcg gacccctgaa

780

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggacccag aagtgaagtt caattggtac

840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc

900

acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag

960

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccttccagca tcgaaaagac catctccaag

1020

gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacaccctgc ctccaagccg ggaagagatg

1080

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctc gtgaagggct tctacccttc cgatatcgcc

1140

gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg

1200

gactccgacg gctcattctt cctgtactcc aagctgacag tggacaagtc cagatggcag

1260

cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacacag

1320

aagtccctgt ctctgtcccc tggcaag

1347

<210> 81

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 81

cagtccgtgc tgacccagcc tccttctgtt tctggtgctc ctggccagag agtgaccatc

60

tcttgctccg gctcctcctc caacatcggc tcctactacg tgtcctggta tcagcagctg

120

cctggcaccg ctcctaaggt gctgatctac cggaacaacc agcggccttc tggcgtgccc

180

gatagattct ccggctctaa gtctggcacc tctgccagcc tggctatcac tggactgcag

240

gctgaggacg aggccgacta ctactgcgac tcttgggacc actcctccat gaacgtgttc

300

ggcggaggta ccaagctgac cgtgctggga cagcctaagg ctgccccttc cgtgacactg

360

ttccctccat cctctgagga actgcaggcc aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctcc

420

gacttttacc ctggcgctgt gaccgtggcc tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc

480

ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac

540

ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca agtgacccat

600

gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtggct cctaccgagt gctct

645

<210> 82

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 82

agctacgcta tgcac

15

<210> 83

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 83

cggatcaaga gcgttgccca aggcggcacc accgattacg ctgctcatgt gaagggc

57

<210> 84

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 84

gtgtcccact ctaccttcga tgtg

24

<210> 85

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 85

ggcttcacct tctccagcta c

21

<210> 86

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 86

aagagcgttg cccaaggcgg cacc

24

<210> 87

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 87

tccggctcct cctccaacat cggctcctac tacgtgtcc

39

<210> 88

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 88

cggaacaacc agcggccttc t

21

<210> 89

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

олигонуклеотид"

<400> 89

gactcttggg accactcctc catgaacgtg

30

<210> 90

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 90

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga cttgtgaaac ctggcggctc tctgagactg

60

tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgcactgggt ccgacaggcc

120

cctggcaaag gattggagtg ggtcggacgg atcaagagcg ttgcccaagg cggcaccacc

180

gattacgctg ctcatgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacgactc caagaacacc

240

ctgtacctgc agatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga

300

gtgtcccact ctaccttcga tgtgtggggc cagggcacac tggttacagt ctcgagc

357

<210> 91

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 91

cagtccgtgc tgacccagcc tccttctgtt tctggtgctc ctggccagag agtgaccatc

60

tcttgctccg gctcctcctc caacatcggc tcctactacg tgtcctggta tcagcagctg

120

cctggcaccg ctcctaaggt gctgatctac cggaacaacc agcggccttc tggcgtgccc

180

gatagattct ccggctctaa gtctggcacc tctgccagcc tggctatcac tggactgcag

240

gctgaggacg aggccgacta ctactgcgac tcttgggacc actcctccat gaacgtgttc

300

ggcggaggta ccaagctgac cgtgctggga cag

333

<210> 92

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 92

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga cttgtgaaac ctggcggctc tctgagactg

60

tcttgtgccg cttccggctt caccttctcc agctacgcta tgcactgggt ccgacaggcc

120

cctggcaaag gattggagtg ggtcggacgg atcaagagcg ttgcccaagg cggcaccacc

180

gattacgctg ctcatgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacgactc caagaacacc

240

ctgtacctgc agatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga

300

gtgtcccact ctaccttcga tgtgtggggc cagggcacac tggttacagt ctcgagcgcc

360

tccaccaaag gaccctctgt gtttcctctg gctccctcca gcaagtctac ctctggtgga

420

acagctgccc tgggctgcct ggtcaaggat tactttcctg agcctgtgac cgtgtcctgg

480

aactctggcg ctctgacatc tggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca gtcctctggc

540

ctgtacagcc tgtcctctgt cgtgaccgtg ccttctagct ctctgggcac ccagacctac

600

atctgcaatg tgaaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagagagt ggaacccaag

660

tcctgcgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaagctga gggcgctcct

720

tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatctctcg gacccctgaa

780

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggacccag aagtgaagtt caattggtac

840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc

900

acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag

960

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccttccagca tcgaaaagac catctccaag

1020

gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacaccctgc ctccaagccg ggaagagatg

1080

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctc gtgaagggct tctacccttc cgatatcgcc

1140

gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg

1200

gactccgacg gctcattctt cctgtactcc aagctgacag tggacaagtc cagatggcag

1260

cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacacag

1320

aagtccctgt ctctgtcccc tggcaag

1347

<210> 93

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полинуклеотид"

<400> 93

cagtccgtgc tgacccagcc tccttctgtt tctggtgctc ctggccagag agtgaccatc

60

tcttgctccg gctcctcctc caacatcggc tcctactacg tgtcctggta tcagcagctg

120

cctggcaccg ctcctaaggt gctgatctac cggaacaacc agcggccttc tggcgtgccc

180

gatagattct ccggctctaa gtctggcacc tctgccagcc tggctatcac tggactgcag

240

gctgaggacg aggccgacta ctactgcgac tcttgggacc actcctccat gaacgtgttc

300

ggcggaggta ccaagctgac cgtgctggga cagcctaagg ctgccccttc cgtgacactg

360

ttccctccat cctctgagga actgcaggcc aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctcc

420

gacttttacc ctggcgctgt gaccgtggcc tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc

480

ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac

540

ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca agtgacccat

600

gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtggct cctaccgagt gctct

645

<210> 94

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gly Ser Tyr Tyr Lys Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 95

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 95

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 96

<211> 400

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический

полипептид"

<400> 96

Ala Glu Pro Arg Leu Pro Leu Met Tyr His Leu Ala Ala Val Ser Asp

1 5 10 15

Leu Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Ala

20 25 30

Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Asn Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys

35 40 45

Gly Ala Trp Ile Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu

50 55 60

Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Thr Leu Glu Asn Gln Ile Asn Gly Thr Phe Thr Leu Gln Gly Leu Leu

85 90 95

Gly Cys Glu Leu Ala Pro Asp Asn Ser Ser Leu Pro Thr Ala Val Phe

100 105 110

Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Arg Phe Asn Pro Arg Thr Gly Asn

115 120 125

Trp Ser Gly Glu Trp Pro Glu Thr Asp Ile Val Gly Asn Leu Trp Met

130 135 140

Lys Gln Pro Glu Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Thr Ser

145 150 155 160

Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly Arg Gln Asn Leu

165 170 175

Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn

180 185 190

Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro

195 200 205

Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser

225 230 235 240

Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val

245 250 255

Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Pro

260 265 270

Ala Arg Ser Ser Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala

275 280 285

Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His Ile Gln Lys

290 295 300

Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile

325 330 335

Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met

340 345 350

Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His

355 360 365

Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys

370 375 380

His Val Thr Leu Lys Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met

385 390 395 400

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с рецептором C5a комплемента человека C5aR. Также раскрыты выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело; экспрессионный вектор и клетка-хозяин, содержащая указанную молекулу нуклеиновой кислоты; фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело. Раскрыт способ получения указанного антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с C5aR. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 18 пр., 23 табл., 11 ил.

1. Выделенные антитело или фрагмент антитела, содержащие

a) область, определяющую комплементарность, тяжелой цепи (HCDR1) под SEQ ID NO: 27, HCDR2 под SEQ ID NO: 28, HCDR3 под SEQ ID NO: 29, область, определяющую комплементарность, легкой цепи (LCDR1) под SEQ ID NO: 32, LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34, или

b) HCDR1 под SEQ ID NO: 27, HCDR2 под SEQ ID NO: 39, HCDR3 под SEQ ID NO: 40, LCDR1 под SEQ ID NO: 32, LCDR2 под SEQ ID NO: 33 и LCDR3 под SEQ ID NO: 34;

где выделенные антитело или фрагмент антитела специфически связываются с рецептором C5a комплемента человека (C5aR).

2. Выделенные антитело или фрагмент антитела по п. 1, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат:

a) вариабельную область тяжелой цепи (VH) под SEQ ID NO: 35 и вариабельную область легкой цепи (VL) под SEQ ID NO 36 или

b) VH под SEQ ID NO: 42 и VL под SEQ ID NO 43.

3. Выделенные антитело или фрагмент антитела по п. 1 или 2, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат:

a) тяжелую цепь (HC) под SEQ ID NO: 37 и легкую цепь (LC) под SEQ ID NO 38

или

b) HC под SEQ ID NO: 44 и LC под SEQ ID NO 45.

4. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело относится к классу IgG1 человека.

5. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело практически не индуцирует эффекторную функцию in vitro.

6. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело содержит аминокислотные замены L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, с нумерацией согласно индексу EU.

7. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела являются

специфическими в отношении C5aR человека и перекрестно реагируют с C5aR макака-крабоеда.

8. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела подавляют индуцированную C5a человека экспрессию CD11b в гранулоцитах человека при концентрации IC50, составляющей 42 нМ, в присутствии 150 нМ C5a человека in vitro.

9. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой моноклональное антитело.

10. Выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из предыдущих пунктов, где указанные выделенные антитело или фрагмент антитела представляют собой человеческое или химерное антитело.

11. Применение выделенного антитела или фрагмента антитела по любому из предыдущих пунктов для лечения заболевания, связанного с нежелательным присутствием C5aR.

12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая выделенные антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-10.

13. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 12.

14. Клетка-хозяин для получения выделенного антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 1-10, содержащая вектор по п. 13 или молекулу нуклеиновой кислоты по п. 12.

15. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, ассоциированного с нежелательным присутствием C5aR, содержащая эффективное количество выделенного антитела или фрагмента антитела по пп. 1-10 и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.

16. Способ получения выделенного антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-10, включающий:

(a) получение клетки-хозяина по п.14 в условиях, подходящих для экспрессии антитела или фрагмента антитела; и

(b) выделение антитела или фрагмента антитела.

17. Способ получения по п.16, дополнительно включающий очистку выделенного антитела или фрагмента антитела.

18. Способ получения по п.17, где очистку осуществляют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), ионообменной хроматографии (IEC), гель-электрофореза, аффинной хроматографии, эксклюзионной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии (SEC).