СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2008 года по МПК A61N5/10 

Изобретение относится к онкологии и может быть использовано в лучевой терапии злокачественных опухолей.

Известны способы подавления пролиферации опухолевых клеток путем воздействия рентгеновского и излучения [1, 2]. В лучевой терапии злокачественных новообразований используются источники ионизирующего излучения (ИИ) непрерывного действия: рентгеновское и γ-излучение, получаемое с помощью электронных ускорителей или изотопных источников, а также потоки корпускулярных альфа-частиц, электронов или нейтронов. Общей закономерностью для всех типов ИИ является то, что для эффективного противоопухолевого действия необходимо обеспечить высокую дозу облучения. В лучевой терапии опухолей используются суммарные очаговые дозы облучения от 15 до 65 Гр в режиме фракционирования: по 2 Гр/сут. Однако уже при таких дозах облучения (ЛПЭ = 2 кэВ/мкм, характерно для тормозного излучения электронных ускорителей с ускоряющим напряжением 250 кВ) наблюдается 10% гибель нормальных клеток за счет нерепарированных двухнитевых разрывов ДНК [3]. Дальнейшее повышение дозы облучения может приводить к значительному нарастанию побочных эффектов ИИ на нормальные ткани и организм в целом вплоть до отмены лечения [4-6]. Из-за высокой дозы облучения, необходимой для достижения противоопухолевого эффекта, трудно преодолеть его побочное действие на нормальные органы и ткани. Несмотря на определенный прогресс в этой области, связанный с пространственно-временной оптимизацией лучевой терапии, использованием радиосенсибилизаторов различной природы, увеличивающих чувствительность опухоли к облучению и позволяющих снизить дозы облучения, защитой здоровых тканей с помощью радиопротекторов и других подходов, значительно сократить вероятность осложнений при лучевой терапии не удается [7-9].

Известно использование низкодозовой терапии злокачественных новообразований.

Однако в литературе отмечается отсутствие прямого ингибирующего действия низких доз ИИ на рост опухолевых клеток. Так Zhiyun Chen and Kazuo Sakai показали, что облучение культуры клеток человеческой лейкемии MOLT-4 рентгеновским излучением в дозе 0,2 Гр не оказывало на опухолевые клетки значимого эффекта [10]. В ряде работ была продемонстрирована противоопухолевая эффективность малых доз ИИ in vivo только за счет активации клеток иммунной системы. Низкие дозы рентгеновского излучения (75 мГр) тормозили рост саркомы S180 на 30-50% при облучении мышей перед перевивкой опухоли [11]. Рентгеновское облучение в дозе 0,1-0,2 Гр ингибировало метастазирование саркомы L1 [12]. S.Kojima с соавторами показали, что облучение мышей с трансплантированной карциномой Эрлиха в дозе 0,5 Гр приводит к снижению на 7% роста опухоли за счет активации NK клеток [13].

Таким образом, в доступной научно-технической литературе не описаны способы эффективного подавления роста опухоли с использованием ионизирующего излучения в низких дозах.

Наиболее близким к предлагаемому по получаемому эффекту является способ подавления пролиферации опухолевых клеток путем воздействия непрерывного рентгеновского излучения [1]. Однако применение его связано с большим числом осложнений.

Новая техническая задача - создание оптимальных условий для подавления пролиферации опухолевых клеток при воздействии рентгеновским излучением в низких дозах и снижение осложнений.

Для решения поставленной задачи в способе подавления пролиферации опухолевых клеток путем воздействия рентгеновского излучения воздействуют рентгеновским излучением 0,7-6 мГр в импульсно-периодическом режиме с одной из частот повторения импульсов в диапазоне 10-16 Гц, длительностью импульса на полувысоте 4 нс.

Данные существенные признаки не выявлены из анализа научно-медицинской и патентной литературы. Они явным образом не следуют из уровня техники для специалистов из уровня техники. Предлагаемый способ прошел экспериментальное исследование в экспериментальном отделе ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г.Томска.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Способность подавления пролиферации опухолевых клеток воздействием рентгеновского излучения в низких дозах (в пределах 0,7-6 мГр) в импульсно-периодическом режиме с одной из частот повторения импульсов в диапазоне 10-16 Гц была доказана экспериментальным путем.

Для проведения экспериментов была создана рентгеновская установка в Институте сильноточной электроники СО РАН (Томск) на основе малогабаритного электронного ускорителя прямого действия СИНУС-150, позволяющая генерировать импульсно-периодическое излучение [14]. Высоковольтный импульс напряжения имел длительность на полувысоте 4 нс и амплитуду 270 кВ. Геометрия планарного диода с катодом диаметром 2 см, работающим в режиме взрывной электронной эмиссии, обеспечивала ток сильноточного электронного пучка до 4 кА. С учетом поперечного разлета частиц в промежутке катод-анод (6 мм) диаметр электронного пучка на аноде составлял около 3 см. Охлаждаемый проточной водой анод из 0,8 мм нержавеющей стали выполнял также функцию конверсии энергии электронов в поток тормозного рентгеновского излучения. Фильтрация низкоэнергетичной компоненты излучения осуществлялась двумя пластинами из стали суммарной толщиной 1,6 мм и промежуточным слоем воды толщиной 6 мм. Стабильность амплитуды импульсов диодного напряжения в режиме тактовой частоты непрерывно контролировалась с помощью емкостного датчика и цифрового осциллографа. Среднеквадратичное отклонение амплитуд импульсов в диапазоне частот повторения от 3 до 40 Гц не превышало 1,5%.

В соответствии с численными расчетами коэффициент конверсии при передаче энергии из электронного потока в тормозное излучение составляет около 0,2%. Расчетный энергетический спектр фотонов имеет максимум в области 90 кэВ, а основная часть потока квантов (около 90%) находится в диапазоне 60-200 кэВ.

В качестве основной дозиметрической методики использовалась стандартная процедура измерений поглощенной дозы LiF-детекторами в комплекте поверенного дозиметра КДТ-02М. Наборы таблеток по 3 шт. устанавливались на различных расстояниях от коллектора, а необходимая для минимизации погрешности суммарная поглощенная доза за акт измерения набиралась числом импульсов. В частности, на расстоянии 20 см от анода ускорителя по оси системы измеренное значение поглощенной дозы в среднем составило 2,1 Рад (0,021 Гр) за 10³ импульсов. Таким образом, в данной точке пространства обеспечивается 21 мкГр за один импульс при мощности экспозиционной дозы в одном импульсе порядка 5*10⁵ Р/с. Погрешность измерения дозы оценивается величиной около ±15% при достоверности 95%. Полученные данные по дозам на различных расстояниях от анода ускорителя были использованы для сравнения с показаниями вспомогательных средств дозиметрического контроля: электростатических дозиметров с кварцевым волокном VICTOREEN 541R ("Victoreen Quartz Dosimeters", США), а также их аналогов фирмы "Arrow-Tech" в пластиковом корпусе и шкалой 200 mR. Для этих дозиметров не наблюдалось снижение эффективности собирания ионов вплоть до уровня мощности доз порядка 3*10⁶ Р/с. Таким образом, в экспериментах поглощенная доза рентгеновского излучения за один импульс (D₀) могла варьироваться при удалении пробирки с клеточной суспензией от анода в пределах от максимальной дозы 200 мкГр/имп до минимальной дозы порядка 0.1 мкГр/имп (на расстоянии 220 см). Все сеансы облучения имели продолжительность 5 минут. Поэтому суммарная доза облучения в соответствии с частотой повторения импульсов f(Гц) могла рассчитываться по формуле D_Σ=300*f*D₀.

Эффекты импульсно-периодического излучения сравнивали с эффектами непрерывного рентгеновского излучения, которое использовали в качестве способа-прототипа. Объекты облучались на установке RUM-17 (ускоряющее напряжение 210 кВ, ток пучка 15 мА) при том же времени экспозиции (5 мин) с аналогичными поглощенными дозами. В данном случае стандартные тестовые дозиметры помещались в зону облучения.

В качестве объекта использовались клетки мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха, поддерживаемые в асцитной форме на мышах линии DBA2j и C57B1/6j соответственно. Пролиферацию клеток оценивали по уровню включения Н³-тимидина в ДНК опухолевых клеток в течение 24 часов после облучения. Клеточную суспензию в объеме 2 мл (1,25×10⁶ кл/мл) помещали в стеклянные флаконы, которые подвергались облучению (опыт), либо экспонировали перед выключенным ускорителем (группа SHAM). После облучения клетки переносили в 96-луночные планшеты по 0,2 мл на лунку из расчета по 10 лунок на каждый флакон и добавляли H³-тимидин по 1 мкКи/лунку. Клетки инкубировались 24 часа при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Включение метки в ДНК измеряли с помощью β-счетчика MicroBeta Trilux (Perkin Elmer). В качестве результата использовали среднее значение числа импульсов в минуту (cpm - count per minute) по 10 лункам и рассчитывали индекс ингибиции пролиферации (ИИП) = ((SHAM-облучение)/SHAM)×100% DNA [15-17].

В таблице 1 представлены данные о влиянии импульсно-периодического и непрерывного рентгеновского излучения на пролиферацию опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 in vitro. В таблице приведены значения уровня включения Н³-тимидина в ДНК опухолевых клеток (cpm) и индекс ингибиции пролиферации (ИИП%), # - различия статистически значимы с SHAM (р≤0,05); * - различия статистически значимы с группой непрерывного рентгеновского облучения (р≤0,05). Из таблицы видно, что после 5-минутного облучения опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 непрерывным рентгеновским излучением в суммарной дозе 36 и 58 мГр не отмечается ингибиции клеточной пролиферации. Импульсно-периодическое рентгеновское излучение при 5-минутном облучении клеток мастоцитомы Р-815 в этих дозах с частотами повторения импульсов 10 либо 16 Гц ингибирует пролиферацию клеток опухоли и ИИП равен 97±0,5% и 96±0,6% соответственно.

На чертеже 1 представлены кривые «доза-эффект» импульсно-периодического рентгеновского излучения для клеток мастоцитомы Р-815 при частотах повторения импульсов 10 Гц (1) и 13 Гц (2). По оси абсцисс - суммарная доза облучения за 5 мин (мГр) в логарифмическом масштабе; по оси ординат - индекс ингибиции пролиферации (ИИП%) = ((SHAM-Облучение)/SHAM)×100% через сутки после облучения (М±m). Из чертежа видно, что эффект ингибирования пролиферации на уровне 84-98% проявляется не только при облучении в дозах 36-58 мГр, но и при более низких дозах (порядка 0,7-1 мГр).

Влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения на пролиферацию опухолевых клеток карциномы Эрлиха in vitro представлено в таблице 2, в которой приведены значения уровня включения H³-тимидина в ДНК опухолевых клеток (cpm) при облучении и без него (SHAM), а также индекс ингибиции пролиферации (ИИП%) (* - статистически значимые различия с SHAM (p≤0,05)). После 5-минутного воздействия на культуры клеток карциномы Эрлиха импульсно-периодическим рентгеновским излучением при частотах повторения импульсов 13 и 16 Гц в суммарных дозах 4,9 мГр и 6,1 мГр ингибиция их пролиферации (ИИП) составила 96,3±0,42% и 87,3±1,02% соответственно (таблица 2).

Таким образом, на модели опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха доказано, что подавление пролиферации опухолевых клеток обеспечивается воздействием рентгеновского излучения в низких дозах (в пределах 0,7-6 мГр) в импульсно-периодическом режиме с одной из частот повторения импульсов в диапазоне 10-16 Гц, длительностью импульса на полувысоте 4 нс, при этом ингибиция клеточного деления в культуре достигает 98%. В то время как непрерывное рентгеновское излучение, уже при облучении в дозах 36 и 58 мГр, не оказывает ингибирующего действия на пролиферацию опухолевых клеток.

Таким образом, предлагаемый способ открывает перспективы разработки на основе импульсно-периодических ионизирующих излучений методов низкодозовой лучевой терапии опухолей, которые при высоком противоопухолевом эффекте благодаря низкой дозе облучения позволяют радикально снизить побочные эффекты терапии на здоровые органы и ткани.

Источники информации

1. Важенин А.В. Радиационная онкология: организация, тактика, пути реализации. М.: Издательство РАМН, 2003. 236 с.

2. Быстрые нейтроны в онкологии. / Под ред. Проф. Л.И.Мусабаевой. - Томск: Изд-во НТЛ, 2000. - 188 с.: ил.

3. Бондарчук И.А. // Биофизика. 2003. Т.48, №5. С.67-68.

4. Ильин Л.А. Радиобиология и радиационная медицина - проблемы и перспективы их взаимодействия в рамках регламентации ионизирующих излучений. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 1998. - Т.43, №1. - с.8-17.

5. Кеирим-Маркус И.Б. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 1997. - Т.41, №2. - с.18-25.

6. Ярмоненко С.П. Кризис радиобиологии и ее перспективы, связанные с изучением гормезиса. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 1997. - Т.41, №2. - с.3-10.

7. Иваницкая В.И., Кисличенко В.А., Геринштейн И.Г. с соавт. Осложнения лучевой терапии у онкологических больных. / К.: Здоровья, 1989. - 184 с.

8. Лютых В.П., Долгих А.П. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 1998. - Т.43. - №2. - С.28-34.

9. Ставицкий Р.В., Гуслистый В.П., Ковальчук И.В. с соавт. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 1999. - Т.44. - №3. - С.66-71.

10. Zhiyun Chen and Kazuo Sakai. Enhancement of radiation-induced apoptosis by preirradiation with low-dose X-rays in human leukemia MOLT-4 cells // J. Radiat. Res., 45, 239-243 (2004).

11. Effects of low-dose radiation on tumor growth, erythrocyte immune function and SOD activity in tumor-bearing mice. // HS Yu, AQ Song, YD Lu, WS Qiu, and FZ Shen // Chin. Med. J. (Engl), July 1, 2004; 117 (7): 1036-9.

12. Single low doses of X rays inhibit the development of experimental tumor metastases and trigger the activities of NK cells in mice. // A Cheda, J Wrembel-Wargocka, E Lisiak, EM Nowosielska, M Marciniak, and MK Janiak // Radiat Res, March 1, 2004; 161 (3): 335-40.

13. Kojima S., Nakayama K., and Ishida S. Low-dose γ-rays activate immune functions via induction ofglutathione and delay tumor growth. // J. Radiat. Res., 2004, 45: 3339.

14. Артемов К.П., Ельчанинов А.А., Кутенков О.П., Ростов В.В., Турчановский И.Ю. // Приборы и техника эксперимента. - 2004. - №5. - С.67-68.

15. Armstrong, D.T., Xia, P., Gannes, G., Tekpetey, F.R., and Khamsi, F. (1996) Differencial effects of insulin-like growth factor-I and follicle-stimulation hormone on proliferation and differentiation of bovine cumulus cells and granulosa cells. Biology Reproduction. 54: 331-338.

16. Levesque, B.M., Vosatka, R.J., and Nielsen, B.C. (2000) Dihydrotestosterone stimulates branching morphogenesis, cell proliferation, and programmed cell death in mouse embryonic lung explants. Pediatric Res., 47 (4): 481-491.

17. Yip, I., Pang, X-P., Berg, L., and Hershman, J.M. (2006) Antitumor actions of interferon-γ and interleukin-1β on human papillary thyroid carcinoma cell lines. J. of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (5): 16641669.

Таблица 1D_Σ за 5 мин облучения, мГрЧастота следования импульсов, ГцИмпулъсно-периодическое рентгеновское излучение, (М±m), n=10Непрерывное рентгеновское излучение, (М±m), n=10включение Н³-Тимидина в ДНК (срт)ИИП, %включение Н³-Тимидина в ДНК (срт)ИИП, %36102230±354 #*97±0,5*#105967±2830#-30±3,557,6163406±885 #*96±0,6*#80956±53761±6,5SHAM74927±5382-81616±6068-

Таблица 2Частота повторения импульсов и D_Σ за 5 минутВключение Н³-тимидина в ДНК (срт) (М±m), n=10Индекс ингибиции пролиферации % (М±n), n=10SHAM22321±3260-13 Гц 4,9 мГр835±198*96,3±0,42*16 Гц 6,1 мГр2839±478*87,3±1,02*

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в лучевой терапии злокачественных опухолей. Способ включает воздействие рентгеновским излучением 0,7-6 мГр в импульсно-периодическом режиме с одной из частот повторения импульсов в диапазоне 10-16 Гц. Время экспозиции 5 минут. Способ позволяет создать оптимальные условия для подавления пролиферации опухолевых клеток при воздействии рентгеновским излучением в низких дозах и снизить осложнения. 1 ил., 2 табл.

Способ подавления пролиферации опухолевых клеток in vitro путем воздействия рентгеновского излучения, отличающийся тем, что воздействуют рентгеновским излучением 0,7-6 мГр в импульсно-периодическом режиме с одной из частот повторения импульсов в диапазоне 10-16 Гц, и временем экспозиции 5 мин.