Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07, который может быть применен для получения белково-витаминных комплексов для балансирования кормов с/х животных.

Микробная белковая масса может использоваться в сельском хозяйстве для кормления животных и аквакультуры, а также в качестве сырья для глубокой переработки.

На сегодняшний день общая картина в России по производству кормовых белков неблагоприятна. Дефицит кормовых продуктов составляет не менее 2 млн. тонн в год.

Основным источником белкового продукта является соевый шрот. Однако природные условия нашей страны не подходят для выращивания сои в достаточных количествах. Специалистам приходится искать другие способы производства кормового белка.

Среди продуцентов кормовой биомассы известны микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах.

В качестве продуцентов белка и биомассы применяют штаммы бактерий, известные как продуценты белка на основе метанола и относящиеся к роду Acetobacter: Acetobacter methylicum ВСБ-924 ЦМПМ В-2942 (патент РФ N 116363); Acetobacter methylicum ВСБ-867 ЦМПМ В-1947 (патент РФ N 925112,); Acetobacter methylovorans ВСБ-914 ЦМПМ В-2479 (патент РФ N 1070916).

Все штаммы характеризуются содержанием белка - до 76% к абсолютно сухому веществу (АСВ).

Штаммы различаются чувствительностью к типовым фагам и термоустойчивостью: оптимальный рост у Acetobacter methylicum ВСБ-867 при 28-30°С, у Acetobacter methylicum ВСБ-924 - 30-36°С и Acetobacter methylovorans ВСБ-914 при 36-40°С.

Однако, при нестерильном культивировании в ферментере на ферментолизатах отрубей и/или муки в кислой среде при рН ниже 6,0 происходит, как показали опыты, быстрое инфицирование дрожжами и грибами и вытеснение продуцента из процесса на 30-40% и более от общего числа клеток. В результате в получаемом продукте в сильной степени снижается содержание белка.

В результате проведенного патентного поиска были отобраны следующие патенты.

Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-942 – продуцент биомассы, обогащенной белком (Патент РФ №2031115). Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-1987.

Недостатком данного изобретения является способность продуцента расти при невысоких концентрациях н-парафинов (0,8%), невысокая продуктивность ферментационного процесса, необходимость очистки биомассы от остатков не потребленных парафинов, а содержание сырого протеина в биомассе не превышает 60-65%.

Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-928К - продуцент кормового белка (Патент РФ №2042713.) Недостатком данного известного штамма является использование для получения кормового белка дрожжей рода Candida, которые являются условно патогенными микроорганизмами, что требует выполнения дополнительного процесса термолиза и наличия специального оборудования, сложной системы обезвреживания стоков и воздушных выбросов при значительных объемах используемого воздуха.

Известен штамм дрожжей Saccharomy cescerevisiae ВКПМ У-760 - источник белка и биологически активных веществ (Авт. св. СССР N 1575570). Недостатком штамма S. cerevisiae ВКПМ У-760 является способность роста при низкой концентрации субстрата в среде, что нетехнологично и снижает экономическую эффективность процесса культивирования. Другой недостаток штамма заключается в низкой продуктивности и высоком расходном коэффициенте (около 2), что снижает производственные показатели штамма. К числу недостатков штамма можно отнести способность к сбраживанию различных Сахаров (глюкоза, галактоза, сахароза, мальтоза и раффиноза), что может приводить к вздутию животов при скармливании животным.

Использование бактерий в качестве продуцента белкового корма является более эффективным, так как бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%.

Одним из перспективных путей получения полноценного белкового кормового продукта является использование метанокисляющих бактерий. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными соединениями.

Известен штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874 - продуцент кормовой биомассы. Штамм хранится в коллекции культур института «ВНИИГенетика» под коллекционным номером ЦМПМ В-1743 (авт. свид. СССР №770200). В качестве источника углерода и энергии штамм использует метан, как чистый, так и в составе природного газа. Недостатком данного штамма является его чувствительность к продуктам, образующимся при соокислении гомологов метана, которые неизменно, в большем или меньшем количестве, присутствуют в природном газе. Образующиеся продукты ингибируют рост продуцента.

Известен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 для получения микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде (РФ №2728345).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, регистрационный номер ВКПМ В-12549 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (РФ №2613365). Используется для получения микробной белковой массы. Штамм обладает устойчивостью к гомологам метана в природном газе, способностью к гетеротрофной фиксации углекислого газа и к росту при повышенном давлении (до 16 атм). Недостатком прототипа является недостаточно высокая скорость роста культуры (0,25 ч^-1) в непрерывном режиме культивирования, а также использование для культивирования штамма питательной среды с высоким содержанием минеральных компонентов. Компоненты минерального питания потребляются культурой метанотрофов не полностью, их остаточные концентрации в культуральной жидкости достаточно высокие. Это в свою очередь приводит к необходимости дополнительной очистки биомассы (как продукта) от минеральных солей, а образующиеся стоки оказывают большую нагрузку на очистные сооружения.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового штамма метанокисляющего микроорганизма с более высоким технологическим потенциалом, а именно с более высокими ростовыми характеристиками, расширение ассортимента биологического сырья для получения микробной белковой массы.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности вновь полученного штамма для получения микробной белковой массы за счет увеличения скорости роста, уменьшения расхода минеральных компонентов питания, повышение выхода микробной белковой массы и устойчивость штамма к изменению условий культивирования (температура, рН, содержание солей) без снижения продуктивности.

Технический результат достигнут при использовании штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07, депонированного в Национальном Биоресурсном центре Всероссийская коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ “Курчатовский институт”-ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-13764, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы. Обозначение штамма, присвоенное депозитором BF19-07.

Штамм Methylococcus capsulatus BF19-07 выделен из образца компоста, отобранного с глубины 5 см. Штамм выделен методом накопительных культур с последующей ступенчатой автоселекцией на простой минеральной среде без добавления факторов роста и органических соединений, при температуре 42-45°С и рН среды 5,6-5,9 в атмосфере метан-воздух (1:3).

Была произведена идентификация по физиологическим и биохимическим признакам. Систематическое положение подтверждено результатами анализа гена 16S рРНК, а также расшифровкой генома. Работы проводились Федеральным бюджетным учреждением науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН «ГНЦ ПМБ»). Полученные последовательности были депонированы в NCBI под номерами МТ509869 и PRJNA638512 соответственно.

Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды:

Культура грамотрицательная, аэробна. Клетки имеют форму кокков, часто диплококков, диаметром 0,9-1,4 мкм, неподвижны. Образуют микрокапсулу. Клеточная стенка имеет ровные контуры и плотно прилегает к цитоплазматической мембране. Цитоплазма заполнена плотно упакованными стопками внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ). По характеру расположения ВЦМ клетки относятся к 1 типу метанотрофов.

Колонии на агаризованной минеральной среде кремового цвета, выпуклые, глянцевые, с ровным краем и гладкой поверхностью. Размером 1-2 мм. Рост при температуре 15-50°С (оптимум 38-45°С) и рН4,0-8,0 (оптимум 5,6-5,8). Штамм способен к автотрофии, азотфиксации. Не использует органические субстраты. Устойчив к примесям гомологов метана и сернистых соединений. Не нуждается в витаминах и других стимуляторах роста. Повышенная чувствительность к органическим соединениям как экзо-, так и эндо-происхождения, что свидетельствует об усилении признака облигатности штамма по отношению к метану. В клетках синтезируется убихинон (преимущественно Q₇ и Q₈).

Штамм сохраняет ограниченную жизнеспособность в отсутствии природного газа за счет способности образовывать микро- и макрокапсулы; покоящиеся формы - незрелые цисты типа Azotobacter. Рост культуры в таких условиях отсутствует.

Активность (продуктивность) штамма составляет до 12 кг×м³/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: на жидкой минеральной среде в газовой фазе состава метан : воздух = 1:3.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии; криоконсервация при -80°С в качестве криопротектора применяется 30% раствор глицерина.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Вариант 1

Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 1; MgSO₄×7H₂O - 0,2; CaCl₂ - 0,02; Na₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 0,7; раствор микроэлементов 1 мл. Раствор микроэлементов (мг/100 мл): нитрилтриуксусная кислота (НТА) - 150; MgSO₄×7H₂O - 300; MnSO₄×2H₂O - 50; NaCl - 100; FeSO₄×7H₂O - 10; CoCl₂ - 10; CaCl₂×2H₂O - 10; ZnSO₄ - 10; CuSO₄×5H₂O - 1; AlK(SO₄)₂ - 1; H₃BO₃ - 1; Na₂MoO₄×2H₂O - 1.

Состав газовой фазы метан : воздух = 1:3, рН 5,6-5,8, температура культивирования 41-44°С.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для ферментации:

H₃PO₄ (87%) - 2,0-1,5 мл;

K₂SO₄ - 0,24-0,16 г;

MgSO₄×7H₂O - 0,24-0,14 г;

FeSO₄×7H₂O - 0,02-0,018 г;

CuSO₄×5H₂O - 0,02-0,013 г;

MnSO₄×2H₂O - 0,014-0,009 г;

ZnSO₄×7H₂O - 0,003-0,002 г;

Н₃ВО₃ - 0,012-0,008 мг;

CoSO₄×7H₂O - 0,0005-0,0003 мг;

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,0005-0,0003 мг.

Генетические особенности штамма: а) мутации, делеции, инверсии нет; б) фагоустойчив; в) плазмиды не обнаружены; г) профаги не обнаружены. Сведения о безопасности использования штамма: а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик; б) штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным; не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Для заявляемого штамма характерны:

- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры;

- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Культивирование штамма Methylococcus capsulatus BF19-07 проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,7 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в термостатируемой качалке при 42°С. Культивирование проводят в течение 30 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 1,2 г. Полученную культуру используют в качестве посевного материала для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 30 л (рабочий объем 22 л).

Пример 2.

Осуществляли выращивание культуры Methylococcus capsulatus BF19-07 в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 22 л) с непрерывной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

H₃PO₄(87%) - 2,0-1,5 мл;

K₂SO₄ - 0,24-0,16 г;

MgSO₄×7H₂O - 0,24-0,14 г;

FeSO₄×7H₂O - 0,02-0,018 г;

CuSO₄×5H₂O - 0,02-0,013 г;

MnSO₄×5H₂O - 0,014-0,009 г;

ZnSO₄×7H₂O - 0,003-0,002 г;

H₃BO₃ - 0,012-0,008 мг;

CoSO₄×7H₂O - 0,0005-0,0003 мг;

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,0005-0,0003 мг.

Процесс выращивания осуществляли в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 38°С до 45°С и рН 5,6-6,5. При коэффициенте скорости протока 0,34 ч^-1. Значение рН регулировали 5% раствором аммиачной воды или раствором 70% ортофосфорной кислоты. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составляли 15 и 45 л/час соответственно.

В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием природного газа различного состава (с содержанием метана от 90,0% об. до 99,9% об.) и воды из разных источников, продуктивность культуры оставалась стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляла 16-18 г/л.

Пример 3.

Осуществляли выращивание культуры Methylococcus capsulatus BF19-07 в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 22 л) с непрерывной подачей растворов минеральных солей (как в предыдущем примере).

Процесс выращивания осуществляли при температуре 43°С и рН среды 5,6 значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. В ферментер подавали природный газ (с содержанием метана 90% об.) и технический кислород, с содержанием 95% об. кислорода. Коэффициент скорости протока составлял 0,34 ч^-1.

Культуральную жидкость на выходе из ферментера отделяли от клеток в нестерильном режиме и возвращали в ферментационный процесс вместо воды. Доля сопутствующей микрофлоры при таком способе культивирования была неизменной и не превышала 35% от общего количества клеток. Концентрация биомассы на выходе из ферментера составляла 17,6 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе - 72-78%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что культивирование штамма Methylococcus capsulatus BF19-07 в минеральной среде указанного состава с меньшей концентрацией (по сравнению с прототипом приблизительно в 10 раз) солей при непрерывном протоке и в широком диапазоне условий культивирования (температура, рН, содержание солей) позволяет получать стабильный выход биомассы, сопоставимый с прототипом.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07, который может быть применен для получения микробной белковой биомассы. Данный штамм депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт - ГосНИИГенетика» под регистрационным номером ВКПМ В-13764, в качестве продуцента микробного белка, который необходим для производства белково-витаминных комплексов для балансирования кормов с/х животных. Преимуществом изобретения является высокая эффективность штамма при получении микробного белка, повышение выхода белковой биомассы и устойчивость штамма к изменению условий культивирования без снижения продуктивности. 3 пр.

Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07, депонированный в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ “Курчатовский институт” – ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВKПМ В-13764, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы.