Психротолерантный штамм мицелиального гриба Geomyces pannorum - продуцент α-амилазы Российский патент 2020 года по МПК C12N1/14 C12N9/30 C12R1/645 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве α-амилазы, применяемой для ферментативного гидролиза крахмалосодержащего сырья, а именно в хлебопечении, спиртовой, пивоваренной, кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), при производстве крупяных изделий, овощных продуктов, изделий из фруктов (соков, сиропов, экстрактов, варений, пектина), детского питания, в текстильной, бумажной промышленности при производстве моющих средств, а также в медицине.

Микробные α-амилазы применяется в пищевой промышленности, в медицине, в текстильном и бумажном производствах, а также в качестве биодобавок в моющие средства [1, 2]. Показан положительный эффект от использования микробных амилаз для повышения усвояемости крахмалсодержащих кормов в животноводстве [3, 4]. В качестве промышленных продуцентов α-амилазы используются бактерии p. Bacillus (преимущественно В. subtilis, В. stearothermophilus, В. licheniformis, В. amyloliquefaciens), а также мицелиальные грибы. Среди грибов основными продуцентами являются представители р. Aspergillus (преимущественно A. niger, A. oryzae, A. awamori) [5, 6]. Себестоимость производства микробных α-амилаз определяется в первую очередь биологическими характеристиками используемых штаммов. Все используемые в настоящее время грибные штаммы относятся к мезофилам и для своего культивирования требуют поддержания высоких температур. Известен [7] штамм Aspergillus K27 - продуцент амилазы с температурным оптимумом роста 35-45°С.

Известен [8] штамм Aspergillus awamori - продуцент глюкоамилазы с температурным оптимумом роста 34-35°С.

Известен [9] штамм Aspergillus oryzae - продуцент α-амилазы с температурным оптимумом роста 35°С. Данный штамм является наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности существенных признаков и достигаемому результату, однако его температурный оптимум на 13°С выше, чем у заявляемого объекта.

Известен ряд других продуцентов α-амилазы с температурными оптимумами роста от 35°С и выше.

Недостатками всех вышеперечисленных продуцентов является необходимость осуществлять процесс культивирования при температуре выше 30-35°С, что ведет к дополнительным энергозатратам на подогрев питательной среды и повышает риск загрязнения ферментера посторонней мезофильной микрофлорой.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в получении нового штамма мицелиальных грибов - продуцента α-амилазы, позволяющего эффективно осуществлять процесс получения засевного материала и фермента при температуре 20-22°С. Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в возможности производства грибной амилазы при температуре на 10-15°С ниже температуры, которая используется сейчас для таких продуцентов, как Aspergillus awamori и другие виды p. Aspergillus. Это позволяет снизить затраты энергии на производство амилазы и замедлить рост посторонней мезофильной микрофлоры в случае микробного загрязнения ферментера.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать новый психротолерантный штамм мицелиального гриба Geomyces pannorum (Link) Sigler & J.W. Carmich. (1976) (синонимы: Sporotrichum pannorum Link (1824), Chrysosporium pannorum (Link) Hughes (1958), Geomyces pannorus (Link) Sigler & J.W. Carmich. (1976)) КО-3 - продуцент α-амилазы.

Штамм G. pannorum КО-3 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под №ВКМ F-4779D.

Штамм G. pannorum КО-3 выделен в низкотемпературной (температура воздуха и грунта около +4°С) карстовой карбонатной пещере Караульная-2 (Красноярский край, Емельяновский район, Карауленский спелеоучасток Приенисейской складчато-блоковой зоны) методом высева на минеральную среду с крахмалом в качестве единственного источника углерода при температуре +4°С.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма. Колонии белые, плоские, с «мучнистой» поверхностью. Мицелий септированный. Толщина гиф в молодой культуре - от 1,8 до 3,1 мкм, в старой - до 7,2 мкм. Спороносные гифы мутовчато разветвленные, конидии -одиночные, расположены на верхушке конидиеносцев. Конидии овальные и грушевидные, 3,4-4,2 × 4,5-6,3 мкм. На среде с пептоном и гидролизатом казеина на поверхности колонии формируются визуально заметные конические пучки спороносных гиф. Способен к росту в диапазоне температур от 0°С до +29°С. При +30°С и выше рост отсутствует. По результатам измерения скорости роста проростковых гиф, температурный оптимум находится в районе +22°С (фиг. 1).

Способен к росту на средах с минеральными формами азота, фосфора, серы и с крахмалом, либо глюкозой, либо сахарозой в качестве единственного источника углерода. Пример среды (г/л): сахароза - 20.0, NH₄NO₃ - 2.0, KH₂PO₄ - 1.0, MgSO₄*7H₂O - 0.5, KCl - 0.5, FeSO₄ - следовые количества, агар микробиологический - 20.0, рН=6,5..7,0.

Способен к росту на средах с пептоном и гидролизатом казеина в качестве источника углерода и азота. Пример среды (г/л): пептон ферментативный - 9.0, гидролизат казеина ферментативный - 8.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaCl -5.0, Na₂HPO₄ - 2.0, агар микробиологический - 20.0, рН=7.0..7.2.

Рекомендуется культивирование в диапазоне температур +19.. +23°С (см. фиг. 1).

Условия хранения.

Рекомендуется хранение в виде культуры, выращенной на среде с минеральными формами азота, фосфора, серы и с крахмалом, либо глюкозой, либо сахарозой в качестве единственного источника углерода при температуре от +4 до +12°С. Предельный срок хранения не установлен, однако после высыхания среды конидии при температуре +9.. +12°С сохраняют жизнеспособность не менее 1,5 лет.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в соответствии с санитарно-эпидемиологические правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителям паразитарных болезней» (СП 1.3.2322-08), утвержденными Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ №4 от 28 января 2008 г.

При культивировании на жидкой среде при температуре 20-21°С максимальная амилазная активность культуральной жидкости достигается через 6-7 суток. Для ферментативной обработки крахмалосодержащего сырья при производстве ферментный препарат может быть использован в виде культуральной жидкости, или в виде ультраконцентрата, или в виде концентрированных препаратов, получаемых известными биохимическими методами, например осаждением этанолом из ультрафильтрата культуральной жидкости.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Abbas, K.А., Khalil, S.K., Hussin A.S.M. Modified Starches and Their Usages in Selected Food Products: A Review Study // Journal of Agricultural Science, Vol. 2, No. 2, June 2010, P. 90-100.

2. De Souza P.M., Oliveira Magalhaes P. Application of microbial α-amylase in industry - A review // Brazilian Journal of Microbiology. - 2010. - №4. - P. 850-861.

3. Tricarico J.M., Johnston J.D., Dawson K.A. Dietary supplementation of ruminant diets with an Aspergillus oryzae α-amylase // Animal Feed Science and Technology. - 2008. - Vol. 145(1-4). - P. 136-150.

4. Noziere P., Steinberg W., Silberberg M., Morgavi D.P. Amylase addition increases starch ruminal digestion in first-lactation cows fed high and low starch diets // Journal of Dairy Science. - 2014. - Vol. 97(4). - P. 2319-2328.

5. Tiwari S.P., Srivastava R., Singh C.S., Shukla K., Singh. R.K., Singh P., Singh R., Singh N.L. and Sharma R. Amylases: An overview with special reference to alpha amylase //Journal of Global Biosciences. - 2015. - Vol. 4(1). - P. 1886-1901.

6. Karam E.A., Abdel Wahab W.A., Saleh S.A.A., Hassan M.E., Kansoh A.L., Esawy M.A. Production, immobilization and thermodynamic studies of free and immobilized Aspergillus awamori amylase // International Journal of Biological Macromolecules. - 2017. - Vol. 102. - P. 694-703.

7. US, патент US 4593005 A. https://patents.google.com/patent/US 4593005.

8. RU, патент RU 2245364 C2. https://patents.google.com/patent/RU 2245364 C2/ru.

9. RU, патент RU 2354697 C2. https://patents.google.com/patent/RU 2354697 C2/ru.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен психротолерантный штамм мицелиального гриба Geomyces pannorum, обладающий способностью к синтезу α-амилазы при пониженном температурном оптимуме, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ F-4779D. Изобретение обеспечивает ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья при пониженной температуре. 1 ил.

Психротолерантный штамм мицелиального гриба Geomyces pannorum ВКМ F-4779D - продуцент α-амилазы.