РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS AWAMORI - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ Российский патент 2012 года по МПК C12N9/34 C12N9/42 C12N15/09 C12N15/56 C12R1/665 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности для получения комплексных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы с целью дальнейшего их применения для гидролиза крахмалосодержащего сырья в различных отраслях пищевой и перерабатывающей промышленности (спиртовой, хлебопекарной, пивоваренной, кондитерской промышленности, при производстве диетического питания, пищевых добавок, кормов для животных).

Изобретение касается создания высокоактивного рекомбинантного штамма гриба Aspergillus awamori - продуцента комплекса ферментов: основных - глюкоамилазы, ксиланазы, и сопутствующих - α-амилазы, КМЦ-азы, β-глюканазы, ксилоглюканазы, полигалактоуроназы, α-L арабинофуранозидазы, α-глюкозидазы, β-галактозидазы, сахаразы).

Штамм создан на основе промышленного продуцента, мутантного штамма - Aspergillus awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) - с использованием методов генной инженерии [1].

Изобретение обеспечивает получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы в результате глубинного культивирования нового рекомбинантного штамма на мучных ферментационных средах.

Глюкоамилаза - (α-1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.3.) - глюкозообразующая амилаза, экзофермент, атакует крахмал с нередуцирующего конца полисахаридной цепочки, последовательно отщепляя глюкозные остатки и полностью превращая крахмал в глюкозу.

Отличительной особенностью глюкоамилаз является широкая субстратная специфичность и способность гидролизовать как α-1,4, так и α-1,6 глюкозидные связи в полисахаридах и олигосахаридах, в том числе низкомолекулярных, таких как паноза и изомальтоза. Вследствие этого глюкоамилаза является основным ферментом при осахаривании крахмалосодержащего сырья, а штаммы микроорганизмов, продуцирующие активную глюкоамилазу, имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии [2].

Различные виды зерна кроме крахмала содержат некрахмальные полисахариды (НПС) - ксиланы, β-глюканы, целлюлозу. Наличие НПС приводит к набуханию зерна и увеличению вязкости водно-мучных суспензий, что уменьшает эффективность действия амилолитических ферментов, поэтому целесообразно осуществлять одновременное применение амилаз и ферментов, способных гидролизовать НПС, т.е. обладающих целлюлазной, β-глюканазной или ксиланазной активностью.

Так в связи с высоким содержанием ксилана в зерне пшеницы, ржи и кукурузы при получении спирта из данного сырья применяют препараты ксиланазы [3].

Ксиланазы (эндо-1,4-β-ксиланазы, 3.2.1.8) - это О-гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз 1,4-β-ксилозидной связи в ксиланах по эндодеполимеразному механизму.

Ксиланазы обладают широкой вариабельностью таких характеристик, как физико-химические свойства, структура и субстратная специфичность, в зависимости от источника.

рН-оптимум действия большинства грибных ксиланаз лежит в диапазоне значений от 3,5 до 7 ед. Температурный оптимум ксиланаз из грибов обычно находится в интервале температур 50-600°С [4].

В спиртовом производстве глюкоамилазу и ферменты целлюлитического комплекса применяют в виде индивидуальных ферментных препаратов, что существенно удорожает и усложняет процесс водно-тепловой обработки сырья. Поэтому актуальным является создание штамма - продуцента глюкоамилазы и ксиланазы, что позволит получать мультиферментные препараты, обеспечивающие более полный гидролиз углеводных компонентов зерна на стадии осахаривания.

В мировой практике одними из основных продуцентов глюкоамилазы являются штаммы грибов рода Aspergilllus - Asp. niger, Asp. oryzae, Asp. usamii, Asp. awamori, Asp. batatae.

Наиболее известны штаммы Asp. awamori 466 [5], Asp. awamori ВУД T-2 F-203 [6], Asp. awamori ВНИИгенетика 120/М77 ЦМПМ F-166 [7], Asp.awamori N 400 (ВКМ F-3689 D) [8].

Недостатком вышеуказанных штаммов является низкая продуктивность по глюкоамилазе и отсутствие ксиланазной активности, сложность процессов (стадий) ведения и подготовки посевного материала, использование многокомпонентных дорогостоящих питательных сред для производственных ферментации и, как следствие этого, - низкая рентабельность технологии производства ферментных препаратов.

Источниками ксиланаз могут являться грибы, дрожжи, бактерии, растения. Однако основными продуцентами для промышленного производства ксиланаз являются мицелиальные грибы рода Aspergillus, Penicillum и Trichoderma [9].

Известны штаммы, в том числе мультикопийные, - высокоактивные продуценты ксиланазы (Penicillium canescens [10], Aspergillus niger [11], Tr.reesei [12], Thermoascus auranticus [13], H.insolens [14]). Но данные штаммы не способны продуцировать глюкоамилазу, что исключает применение полученных на их основе ферментных препаратов в качестве основных на стадии осахаривания замеса при производстве спирта.

Известен штамм Aspergillus niger ATCC 76061, при культивировании которого поверхностным способом на пшеничных отрубях получают комплексный ферментный препарат, содержащий глюкоамилазу, ксиланазу и протеазу [15]. Однако поверхностный способ культивирования имеет ряд технологических особенностей, затрудняющих его применение в производственных масштабах и получение готового продукта в товарной форме.

Известен штамм Asp.awamori M-2002, ВКМ F-3771D [1] - высокоактивный продуцент глюкоамилазы, который при культивировании в глубинных условиях в течение 192 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода гидролизат муки злаковых культур или прогидролизованный экструдат кукурузной муки, синтезирует глюкоамилазу с активностью 800 и 1080 ед/мл соответственно. Уровень активности ксиланазы составляет 30-40 ед/мл. Данный штамм является наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности существенных признаков и достигаемому результату, однако уровень ксиланазной активности штамма недостаточно высок для получения комплексного ферментного препарата, позволяющего осуществлять гидролиз ксилана при осахаривании зернового сырья.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - это получение высокоактивного штамма гриба Asp. awamori - продуцента комплекса ферментов, позволяющего при глубинном культивировании только одного штамма получать комплексный ферментный препарат с высоким уровнем активности глюкоамилазы и ксиланазы.

Технический результат, получаемый от создания и использования нового рекомбинантного штамма Aspergillus awamori Xyl T-15, содержащего ген ксиланазы Penicillum canescens, заключается в получении высокоактивных комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы для использования в различных отраслях АПК при культивировании продуцента на дешевых технологичных средах.

В настоящее время в мировой практике для повышения уровня биосинтеза целевых ферментов грибными продуцентами широко применяются технологии рекомбинантных ДНК. Увеличения экспрессии секретируемых ферментов достигают за счет получения штаммов с увеличенным числом копий генов целевых ферментов (т.н. мультикопийных штаммов) или направленного изменения в механизме регуляции синтеза этих ферментов [16].

Сущность объекта изобретения - высокоактивный рекомбинантный штамм Aspergillus awamori Xyl T-15 (ВКМ F-4278D) - продуцент глюкоамилазы и ксиланазы.

Задача решается созданием рекомбинантного штамма на основе мутантного штамма A.awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) с использованием методов селекции, индуцированного мутагенеза и ДНК-технологий.

Создание рекомбинантного штамма на основе мутантного штамма A.awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) проводили в несколько этапов. На первом этапе с использованием индуцированного мутагенеза был получен ауксотрофный реципиентный штамм A. awamori 6804-19 niaD-, дефектный по нитратредуктазе, для отбора трансформантов по способности расти на минимальной среде с нитратом натрия в качестве единственного источника азота. На втором этапе реципиентный штамм A.awamori 6804-19 niaD- котрансформировали плазмидой pPrGA-XylAPCA, содержащей гетерологичный ген ксиланазы из Penicillum canescens, находящийся под контролем гомологичного глюкоамилазного промотора и терминатора [17], с плазмидой pSTA10, несущей селективный маркер - ген нитратредуктазы. В результате последующей селекции был получен трансформант с уровнем активности ксиланазы 150-200% относительно исходного штамма, при незначительном снижении глюкоамилазной активности (на 20-30%) (табл.1).

Уровни активности целевых ферментов исходного и рекомбинантного штаммов приведены в табл.1.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus awamori Xyl T-15 при культивировании на питательной среде на основе пшеничной муки, традиционно применяемой в производстве ферментных препаратов, обеспечивает получение комплексного высокоактивного сбалансированного по составу ферментного препарата амилолитического и целлюлитического действия для применения в спиртовой промышленности на стадии осахаривания замеса, а также при производстве кормов для животных с однокамерным желудком и птиц.

Штамм Aspergillus awamori Xyl T-15 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-4278D.

Культурально-морфологические признаки штамма Aspergillus awamori Xyl T-15

Макроскопические характеристики: колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 25°С, имеют диаметр 30-35 мм/7 сут, слабо радиально-бороздчатые, поверхность бархатистая, край тонкий (1-2 мм), конидиальная область темно-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 37°С, имеют диаметр 26-30 мм/7 сут, слабо радиально-борозчатые, поверхность шерстистая, край тонкий (1 мм), конидиальная область серовато-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S), 25°С, имеют диаметр колонии 26-28 мм/7 сут, гладкие, поверхность клочковато-шерстистая, край до 5 мм, конидиальная область темно-коричневая до черной; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на Мальц-агаре (МЕА), имеют диаметр 35-40 мм/7 сут, радиально-борозчатые, поверхность клочковато-шерстистая, край неровный, до 6 мм конидиальная область темно-серая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Микроскопические характеристики: конидиальные головки шаровидные, затем рыхлорадиальные, распадающиеся на отдельные колонки, конидиеносцы слабо окрашенные в терминальной части, гладкостенные 250-1200×6-12 мкм, апикальные расширения шаровидные 20-45 мкм в диаметре, покрыто стеригмами по всей поверхности. Стеригмы преимущественно двухъярусные, метулы 6-16×3,5-7 мкм, фиалиды 5-8×2-4 мкм. Конидии шаровидные, 3,5-6 мкм, гладкие.

Физиолого-биохимические свойства штамма:

Культура штамма хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, и слабо - мальтозу, лактозу, галактозу и рамнозу. Крахмал гидролизует до глюкозы.

Хорошо ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты. Пептонизирует молоко.

Температурный оптимум роста 34-35°С, рН 4,5-6,0. Аэроб.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерии, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Полученный рекомбинантный штамм отличается от исходного наличием в геноме гена ксиланазы Pen. canescens (XylA) под гомологичным глюкоамилазным промотором PrGA, что обеспечивает повышенную способность продуцента к биосинтезу ксиланазы при глубинном культивировании на жидких средах и стабильность при пересевах.

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой Чапека или Мальц-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в 3 месяца. Для дополнительной стабилизации активного посевного материала рекомендуется вносить в агаризованные среды 1% мальтодекстрина, который оказывает индуцирующее действие на глюкоамилазный промотор и способствует увеличению продуктивности штамма.

Культивирование рекомбинантного штамма Asp.awamori Xyl T-15 осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С в течение 168 ч, рН среды 5,2-5,5. Для роста культуры и биосинтеза глюкоамилазы и ксиланазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, мука злаковых культур (кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи) или ее экструдат, аммонийный азот, кукурузный экстракт.

Штамм Aspergillus awamori Xyl T-15 при культивировании в течение 168 ч на среде, содержащей гидролизат пшеничной муки, обеспечивает активность глюкоамилазы в культуральной жидкости от 500 до 550 ед/мл [18], ксиланазы 80-100 ед/мл [19], при удлинении цикла роста до 216 ч активность глюкоамилазы возрастает до 700-750 ед/мл.

Для ферментативной обработки крахмалосодержащего сырья при производстве спирта ферментный препарат может быть использован в виде культуральной жидкости, или в виде ультраконцентрата, или в виде концентрированных препаратов, получаемых известными биохимическими методами, например осаждением этанолом из ультрафильтрата культуральной жидкости.

Глюкоамилаза активна в широком диапазоне рН - от 3,0 до 8,0, с оптимумом при рН 4,2-5,0; в диапазоне температуры от 30 до 75°С с оптимумом при 60-65°С.

Глюкоамилаза обладает высокой стабильностью в широком диапазоне рН, лишь при рН 2,0 и 8,0 наблюдается ее существенная инактивация. Фермент стабилен в течение 2-х часов при 45-55°С; инкубирование при температуре 60°С в течение 2-х часов приводит к снижению активности на 40%. Инкубирование при температуре 65°С в течение 1 часа снижает активность фермента штамма на 40-45%.

Ксиланаза активна в диапазоне рН 4,0-7,5 с максимумом при рН 5,5; в диапазоне температуры от 30 до 70°С с оптимумом при 55-60°С.

Фермент обладает наибольшей стабильностью при рН 5,0 в диапазоне температур 40-50°С.

Таблица 1 Биосинтез целевых ферментов (глюкоамилазы и ксиланазы исходным и рекомбинантным штаммом A.awamori на ферментационной среде на основе пшеничной муки № Штамм Активность целевых ферментов на 168 ч роста ГлА, ед/мл КсилА, ед/мл 1 Asp. awamori M-2002, ВКМ F-3771D (исходный штамм, прототип) 650-720 34 2 Asp. awamori Xyl T-15 (рекомбинантный штамм) 500-550 102

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал в виде споровой суспензии в количестве 0,1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды состава, г/л: пшеничная мука, прогидролизованная препаратом α-амилазы, - 240,0; водопроводная вода - остальное, рН среды 5,2-5,5.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С на качалке с 240 об/мин в течение 168 ч. Каждые 24 ч, начиная с 72 ч роста, отбирают пробы, в которых определяют активность глюкоамилазы и ксиланазы.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 168 ч роста составляет 520 ед/мл, ксиланазная активность - 100 ед/мл, содержание растворимого белка в культуральной жидкости - 26-28 мг/мл.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но с внесением в ферментационную среду 10 г/л мальтодекстрина.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 168 ч роста составляет 550 ед/мл, ксиланазная активность - 115 ед/мл.

Пример 3. Из культуральной жидкости штамма, наработанной в соответствии с примером 1, осаждением ацетоном получают концентрированный комплексный ферментный препарат (табл.2).

Таблица 2 Характеристика образцов ацетоноосажденных ФП № ФП Штамм-продуцент Концентрация белка, мг/г ГлС, ед/мл Ксиланаза, ед/мл 1 Asp.awamori M2002 (исходный штамм, прототип) 353 9353 308 2 Asp.awamori Xyl Т-15 (рекомбинантный штамм) 388 9241 808

Полученные ФП применяют на стадии осахаривания ржаного сусла. Разжижение и декстринизацию ржаного замеса при гидромодуле 1:4 проводят ФП термостабильной α-амилазы из расчета 2 ед. АС/г крахмала в течение 2,5 часов при температуре 85°С.

Осахаривание проводят в течение 20 мин при 60°С, дозируя полученные образцы ФП по глюкоамилазе (6,0 ед.ГлС/г крахмала).

Полученное сусло сбраживают спиртовыми дрожжами Saccharomyces cerevisiae 985-T в течение 72 ч.

Применение ФП, полученного из культуральной жидкости штамма Asp.awamori Xyl T-15, на стадии осахаривания ржаного сусла обеспечивает повышение концентрации глюкозы и мальтозы в осахаренном сусле до 251 и 115 г/л соответственно и снижение вязкости до 47 мПа. При этом концентрация спирта в зрелой бражке составляет 9,1 об.%, выход спирта из 1 т усл. крахмала - 65 дал (табл.3).

Таблица 3 Показатели ржаного сусла и зрелой бражки при использовании ферментного препарата A.awamori на стадии осахаривания № ФП Штамм-продуцент Показатели осахаренного сусла Концентр. спирта в зрелой бражке, об.% Выход спирта из 1 т усл. крахмала, дал. Концентр. глюкозы, г/л Концентр. мальтозы, г/л Вязкость, мПа 1 Asp.awamori М2002 (исходный штамм) 145,8 72,8 58 8,6 64,0 2 Asp.awamori Xyl T-15 (рекомбинантный штамм) 251,0 115,0 47 9,1 65,0

Литература

1. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.

2. Manjunath P., Shenoy В.С., Rao M.R.R. Fungal glucoamylases. // J. Appl. Biochem. 1983. V.5. P. 235-60.

3. Sustainable processing of agricultural products: Ethanol production for fuel. // Biozoom. 2007. Nummer 3.

4. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.56. P.326-338.

5. Авторское свидетелство СССР № 800185, C12D 13/10, 1981.

6. Авторское свидетельство СССР № 1259673, C12N 9/34, 1982.

7. Авторское свидетельство СССР № 1271068, C12N 9/34, 1979.

8. Патент РФ №2196821 от 20.01.2003.

9. Kulkarni N., Shendye A. and Rao M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. // FEMS Microbiol. Rev. 1999. V.23. P.411-456.

10. Патент РФ №2288267 от 27.11.2006.

11. US Patent 5358864. Van den Broek et al. Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin. 1994.

12. US Patent 5298405. Nevalainen et al. Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production. 1994.

13. US Patent 4966850. Yu et al. Production of thermostable xylanase and cellulase. 1990.

14. US Patent 5610048. Schulein et al. Xylanase, DNA sequences, coding for the xylanases and methods of use thereof. 1997.

15. US Patent 6667066. Labeille et al. Multi-enzyme product with glucoamylase, proteolytic and xylanase activities and method for producing same by solid state fermentation of wheat bran with Aspergillus niger. 2003.

16. Turner G. Strategies for cloning genes from filamentous fungi. // Applied Molecular Genetics of Fungi, Cambrige University Press. 1991. P.29-44.

17. Verdoes J.С., Punt P.J., Van den Hondel C. A.M. J.J. Molecular genetic strain improvement for the overproduction of fungal proteins by Filamentous fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V.43. P.195-205.

18. Препараты ферментные. ГОСТ 20264-4.89. - M.: Изд. Государственный комитет СССР по стандартам, 1995. С.70.

19. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. - M.: МГУ, 1995. С.144.

Аналогичные патенты РФ:

1. Патент РФ №2196821 от 20.01.2003.

2. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.

Штамм создан на основе промышленного продуцента, мутантного штамма, Aspergillus awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) с использованием методов индуцированного мутагенеза и ДНК-технологий. Штамм A.awamori Xyl Т-15 депонирован в BKM ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под №4278D, хранится в лиофильно высушенном состоянии на скошенном сусло-агаре в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии г.Москвы. Изобретение обеспечивает получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы с уровнем активности ксиланазы 150-200% относительно исходного штамма для применения в различных отраслях АПК. 3 табл., 3 пр.

Штамм гриба Aspergillus awamori BKM F-4278D - продуцент глюкоамилазы и ксиланазы.