Способ прогнозирования риска возникновения почечно-клеточного рака Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку человека из европейской популяции людей (код EUR в соответствии с номенклатурой проекта 1000 Genomes).

Почечно-клеточный рак (ПКР) является серьезной проблемой для здравоохранения. Зарегистрированные во всем мире показатели по данному заболеванию колеблются от 0,6 случаев на 100000 населения до 14,7 случаев на 100000 населения [Parkin D.M., Pisani P., Ferlay J. 1999. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer. 80, 827-841]. Большинство опухолей находят в пятой-седьмой декаде жизни человека, с медианой возраста смерти 70 лет. Заболеваемость в два-три раза выше у мужчин, чем у женщин [Chow W.H., Devesa S.S., Warren J.L., Fraumeni J.F. 1999. Rising incidence of renal cell cancer in the United States. JAMA. 281, 1628-1631].

Определенные генетические условия ассоциированы с повышенной частотой ПКР, включая болезнь фон Гиппеля-Линдау, наследственный папиллярный рак почек и, возможно, туберозный склероз [Bjornsson J., Short М.Р., Kwiatkowski D.J., Henske E.P. 1996. Tuberous sclerosis-associated renal cell carcinoma: clinical, pathological, and genetic features. Am J Pathol. 149, 1201-1208]. ПКР также чаще встречается при приобретенной кистозной болезни почек. Наследственный ПКР является аутосомно-доминантной формой заболевания, ассоциированной с мультифокальными папиллярными опухолями почек. Другие предполагаемые факторы риска включают курение сигарет; ожирение; использование диуретиков; воздействие нефтепродуктов, хлорированных растворителей, кадмия, свинца, асбеста и ионизирующего излучения; высокобелковые диеты; гипертоническую болезнь; трансплантацию почек и ВИЧ-инфекцию [Ng C.S., Wood C.G., Silverman P.M., Tannir N.M., Tamboli P., Sandler C.M. 2008. Renal cell carcinoma: diagnosis, staging, and surveillance. AJR Am J Roentgenol. 191(4), 1220-1232].

Тремя основными прогностическими маркерами, используемыми для ПКР в настоящее время, являются VHL, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и карбоангидраза IX (CAIX) [Mickley A., Kovaleva О., Kzhyshkowska J., Gratchev А. 2015. Molecular and immunologic markers of kidney cancer- potential applications in predictive, preventive and personalized medicine. EPMA J. 6, 20].

До сих пор нет надежных растворимых маркеров ПКР, которые можно обнаружить в крови или моче. Поэтому необходимы более сложные стратегии для раннего выявления или прогнозирования ПКР в соответствии с принципами профилактической и персонализированной медицины. Среди таких стратегий прогнозирование риска возникновения ПКР на основе анализа ДНК пациента будет являться важным инструментом снижения смертности от данного заболевания, который позволит вовремя проводить превентивные диагностические мероприятия и выявлять рак на ранних этапах.

Известен способ прогнозирования риска возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез (RU 2578459 С1, опубл. 27.03.2016, Бюл. №9). Для осуществления проверки у женщин репродуктивного возраста выявляют признаки наследственных нарушений (ННСТ) соединительной ткани в разных системах и органах, как минимум одного генетического и как минимум одного анамнестического факторов тромбогенного риска (ФТР) и инфицирования генитального тракта. В соответствии с выявленными признаками устанавливают низкий, средний или высокий риск возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез. Важным недостатком данного способа является потребность в оценки сразу нескольких факторов, в том числе генетических, что длительно как по времени, так и по трудозатратам. Способ не позволяет выявить предрасположенность к почечно-клеточному раку.

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы на основе идентификации мутации в гене BLM (RU 2522501 С1, опубл. 20.07.2014, Бюл. №20). Способ характеризуется тем, что проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 п.о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°С и медленное снижение температуры до 50°С; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы. Недостатком данного способа является потребность в секвенировании фрагмента ДНК, что увеличивает трудоемкость, время и стоимость анализа. Способ не позволяет выявить предрасположенность к почечно-клеточному раку.

Известен способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы (RU 2470998 С2, опубл. 27.12.2012, Бюл. №36). Это способ выявления повышенного риска заболевания субъекта-человека раком молочной железы, основан на результатах анализа образца ДНК на наличие SNP в позициях 142, 355 и 4326 гена CYP1B1; делеционных вариантов 1100 delC, del5395, а также IVS2+1G>A гена СНЕК2 и замены С5972Т в гене BRCA2. При этом в способе определены комбинированные генотипы по всем указанным позициям трех названных генов, при которых риск развития рака молочной железы превышает сумму эффектов, определяемых соответствующими вариантами каждого из трех генов в отдельности, которые рассматриваются как признак особой предрасположенности субъекта к заболеванию (непропорционально высокого риска заболевания) раком молочной железы. Данный способ определения предрасположенности к раку путем идентификации генотипических комбинаций специфичных вариантов генов cyplb1, brca2 и СНЕК2, взят за прототип. Недостатком данного способа является отсутствие лабораторной методики детекции приведенных мутаций ассоциированных с предрасположенностью к раку почки. Кроме того, в способе не уточняется, для какого именно рака почки определяется предрасположенность.

В ходе проведенных исследований на базе Воронежского государственного университета, при котором с помощью высокопроизводительного секвенирования были проанализированы генотипы пациентов больных почечно-клеточным раком, была выявлена мутация chr10:43613843_G/T (регион rs1800861), которая ассоциирована с почечно-клеточным раком. Идентификация мутации в описываемом способе осуществляется на основе рестрикционного анализа путем проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции - полиморфизма длин рестрикционных фрагментов).

Технический результат - выявление предрасположенности к почечно-клеточному раку у человека из европейской популяции в течение 4,5-6 часов (в зависимости от выбранного способа выделения ДНК) без необходимости секвенирования образцов ДНК.

Технический результат достигается тем, что в способе диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку на основе ПЦР-ПДРФ, включающем выделение ДНК из предварительно отобранного биологического материала пациентов с проведением реакции ПЦР, согласно изобретению используют прямой праймер GCAGGCCTCTCTGTCTGAAC (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер GATGACATGTGGGTGGTTGA (SEQ ID NO: 2), а также проводят рестрикционный анализ полученного ампликона, при этом для рестрикции ампликона используют рестриктазу Tsel, которая образует уникальные фрагменты рестрикции при наличии мутаций и в норме - 31 п.н., 61 п.н. и 104 п.н. в норме; 92 п.н. и 104 п.н. при наличии мутации. При выявлении мутации в ходе реакции человек из европейской популяции имеет предрасположенность к почечно-клеточному раку по отношению к общей европейской популяции людей.

Способ выявления предрасположенности к почечно-клеточным раку на основе амплификации региона rs1800861 с последующим рестрикционным анализом амплифицированного региона реализуется следующим образом:

1. Осуществляется выделение ДНК из крови пациента. Для этого могут быть использованы как методы органической экстракции, так и коммерческие доступные наборы для выделения ДНК и крови.

2. Проводится реакция ПЦР со следующими праймерами и условиями реакции: прямой праймер GCAGGCCTCTCTGTCTGAAC (SEQ ID NO: 1), обратный праймер GATGACATGTGGGTGGTTGA (SEQ ID NO: 2); условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов: 94°С 30 сек, 59°С 30 сек, 72°С 30 сек., конечная элонгация 72°С 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 196 п. н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, и 5-10 ед. рестриктазы Tsel. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 2 часов при 65°С. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствии мутации (в норме) будут три фрагмента рестрикции длиной 31 п.н., 61 п.н. и 104 п.н. При наличии мутации на электрофореграмме будет видно два продукта рестрикции - 104 п.н. и 92 п.н.

При выявлении мутации в ходе реакции человек из европейской популяции имеет предрасположенность к почечно-клеточному раку.

Предлагаемый способ выявления предрасположенности к ПКР на основе амплификации региона rs1800861 с последующим рестрикционным анализом амплифицированного региона является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку на основе ПЦР-ПДРФ, заключающийся в выделении ДНК из предварительно отобранного биологического материала пациентов с проведением реакции ПЦР, с использованием праймеров GCAGGCCTCTCTGTCTGAAC (SEQ ID NO: 2) и GATGACATGTGGGTGGTTGA (SEQ ID NO: 2), а также рестрикционного анализа полученного ампликона. При этом для рестрикции ампликона используют рестриктазу Tsel. Рестриктаза образует уникальные фрагменты рестрикции при наличии мутаций и в норме (31 п.н., 61 п.н. и 104 п.н. в норме; 92 п.н. и 104 п.н. при наличии мутации). При выявлении мутации в ходе реакции человек из европейской популяции имеет предрасположенность к почечно-клеточному раку. Изобретение позволяет выявить предрасположенности к почечно-клеточному раку у человека из европейской популяции в течение 4,5-6 ч (в зависимости от выбранного способа выделения ДНК) без необходимости секвенирования образцов ДНК.

Способ диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку на основе ПЦР-ПДРФ, включающий выделение ДНК из предварительно отобранного биологического материала пациентов с проведением реакции ПЦР, отличающийся тем, что используют праймеры (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) согласно Перечня последовательностей, а также проводят рестрикционный анализ полученного ампликона, при этом для рестрикции ампликона используют рестриктазу Tsel, которая образует уникальные фрагменты рестрикции при наличии мутаций и в норме - 31 п.н., 61 п.н. и 104 п.н. в норме; 92 п.н. и 104 п.н. при наличии мутации; при выявлении мутации в ходе реакции человек из европейской популяции имеет предрасположенность к почечно-клеточному раку по отношению к общей европейской популяции людей.