Способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы в русской популяции на основе ПЦР-ПДРФ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для диагностики предрасположенности к раку молочной железы человека из популяции центральной части России.

Рак молочной железы является одним из наиболее распространенных и наиболее смертоносных видов рака среди женщин. Заболеваемость раком молочной железы быстро растет во всем мире (2,1 миллиона новых случаев и 700000 смертей в год) [F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. Siegel, L. Torre, A. Jemal, Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries., CA A J. Clin. 00 (2018) 1-31].

Белки BRCA1 и BRCA2 способствуют транскрипционной регуляции некоторых генов, участвующих в восстановлении повреждения ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптозе. Белки BRCA необходимы для поддержания стабильности хромосом, тем самым защищая геном от повреждения [K. Yoshida, Y. Miki, Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage, Cancer Sci. (2004)]. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 отвечают почти за половину наследственных мутаций при раке молочной железы [N. Tung, С. Battelli, В. Allen, R. Kaldate, S. Bhatnagar, K. Bowles, K. Timms, J.E. Garber, C. Herold, L. Ellisen, J. Krejdovsky, K. DeLeonardis, K. Sedgwick, K. Soltis, B. Roa, R.J. Wenstrup, A.R. Hartman, Frequency of mutations in individuals with breast cancer referred for BRCA1 and BRCA2 testing using next-generation sequencing with a 25-gene panel, Cancer. (2015).]. Мутации BRCA1 (5382insC, 4154delA, 185delAG) находят в 15% случаев рака молочной железы высокого риска в России [A.G. Iyevleva, E.N. Suspitsin, K. Kroeze, Т.V. Gorodnova, А.Р. Sokolenko, K.G. Buslov, D.A. Voskresenskiy, A.V. Togo, S.P. Kovalenko, N. van der Stoep, P. Devilee, E.N. Imyanitov, Non-founder BRCA1 mutations in Russian breast cancer patients, Cancer Lett. (2010)]. Модификации сдвига рамки считывания 5382insC в экзоне 20 являются наиболее частыми мутациями у пациентов, относящимся к славянским популяциям с раком молочной железы и раком яичников.

Известен способ прогнозирования риска возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез (RU 2578459, опубл. 27.03.2016). Для осуществления способа у женщин репродуктивного возраста выявляют признаки наследственных нарушений (ННСТ) соединительной ткани в разных системах и органах, как минимум одного генетического и как минимум одного анамнестического факторов тромбогенного риска (ФТР) и инфицирования генитального тракта. В соответствии с выявленными признаками устанавливают низкий, средний или высокий риск возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез. Недостатком данного способа является потребность в оценке сразу нескольких факторов, в том числе генетических, что длительно как по времени, так и по трудозатратам.

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы на основе идентификации мутации в гене BLM (RU 2522501, опубл. 20.07.2014). Способ характеризуется тем, что проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 п.о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°С и медленное снижение температуры до 50°С; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы. Недостатком данного способа является потребность в секвенировании фрагмента ДНК, что увеличивает трудоемкость, время и стоимость анализа.

Известен способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы (RU 2470998, опубл. 27.12.2012), взятый за прототип. Это способ выявления повышенного риска заболевания субъекта-человека раком молочной железы, основан на результатах анализа образца ДНК на наличие SNP в позициях 142, 355 и 4326 гена CYP1B1; делеционных вариантов 1100 delC, del5395, а также IVS2+1G>A гена СНЕК2 и замены С5972Т в гене BRCA2. При этом в способе определены комбинированные генотипы по всем указанным позициям трех названных генов, при которых риск развития рака молочной железы превышает сумму эффектов, определяемых соответствующими вариантами каждого из трех генов в отдельности, которые рассматриваются как признак особой предрасположенности субъекта к заболеванию (непропорционально высокого риска заболевания) раком молочной железы. Недостатком данного способа является сложность в расчете предрасположенности человека к раку молочной железы после проведения генотипирования, которая в конечном итоге может привести к неоднозначному интерпретированию полученных результатов. Кроме того, в одном гене анализируются сразу несколько мутаций в гене CYP1B1, а также делеция и нуклеотидные замены в других генах, что значительно увеличивает трудоемкость, стоимость и время анализа.

В ходе проведенных исследований на базе Воронежского государственного университета, при котором с помощью высокопроизводительного секвенирования были проанализированы генотипы 192 пациентов с раком молочной железы, были выявлены мутации в генах BRCA1 и BRCA2, которые были строго ассоциированы с раком молочной железы пациентов популяции центральной части России (код CEU (northern and western Europe), согласно международному проекту "1000 Genomes", в трех сайтах: rs1799966, rs1799967 и rs4987117.

Технический результат - выявление предрасположенности к раку молочной железы в русской популяции людей в течение 4,5-6 часов (в зависимости от выбранного способа выделения ДНК). Идентификация мутаций в описываемом способе осуществляется на основе рестрикционного анализа путем проведения ПЦР-ПДРФ.

Технический результат достигается тем, что в способе диагностики предрасположенности к раку молочной железы в русской популяции, включающем выделение ДНК из крови пациент, проведение ПЦР-ПДРФ на разных регионах генов BRCA1 и BRCA2, рестрикционный анализ полученных ампликонов, согласно изобретению, ПЦР проводится со следующими наборами праймеров: реакция №1 прямой CCCTGCTCACACTTTCTTCC; обратный AAGACAGAGCCCCAGAGTCA; Реакция №2 прямой CAAATTCTTCTGGGGTCA; обратный CCCAATTGAAAGTTGCAG; Реакция №3 прямой мутагенный CTCTCTAGATAATGATGAATGTAGCG; обратный GAAACTTTCTCCAATCCAGACA; при рестрикционном анализе ампликона, полученного в ходе реакции №1, используют рестриктазу HinfI I, для ампликона, полученного в ходе реакции №2, - рестриктазу NcoI, для ампликона, полученного в ходе реакции №3, - рестриктазу HspAI; про проводят визуализацию продуктов рестрикции с помощью электрофореза; при этом наличию мутации соответствует получение одного продукта рестрикции длиной 162 п.н. для реакции №1, длиной 180 п.н. для реакции №2, длиной 112 п.н. для реакции №3; при этом при наличии мутации при реакции №1 пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы в 6,95 раз больший, чем у людей, не имеющих этой мутации, при выявлении мутации при реакции №2 - в 6,66 раз меньший, при выявлении мутации при реакции №3 - в 2,76 раз больший, при выявлении мутации при реакций №2 и №3 одновременно - в 2,41 раз меньший, при выявлении мутации при реакций №1 и №3 одновременно - в 19,18 раз больший, при выявлении мутации при реакций №1, №2 и №3 одновременно - в 2,88 раз больший.

Способ выявления предрасположенности к раку молочной железы на основе амплификации трех регионов генов BRCA1 и BRCA2 с последующим рестрикционным анализом амплифицированных регионов реализуется следующим образом:

1. Осуществляется выделение ДНК из крови пациента. Для этого могут быть использованы как методы органической экстракции, так и коммерческие доступные наборы для выделения ДНК и крови.

2. Проводится 3 отдельные реакции ПЦР со следующими праймерами и условиями реакции.

Реакция №1 (анализ rs1799966). Прямой праймер CCCTGCTCACACTTTCTTCC; обратный праймер AAGACAGAGCCCCAGAGTCA. Условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек 58°С 30 сек, 72°С 30 сек.), конечная элонгация 72°С 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 162 п.н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, и 5-10 ед. рестриктазы HinfI. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствии мутации (в норме) будут два фрагмента рестрикции длиной 66 п.н. и 96 п.н. При наличии мутации на электрофореграмме будет виден продукт длиной 162 п.н.

Реакция №2 (анализ rs1799967). Прямой праймер CAAATTCTTCTGGGGTCA; обратный праймер CCCAATTGAAAGTTGCAG. Условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек 56°С 30 сек, 72°С 30 сек.), конечная элонгация 72°С 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 180 п.н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, и 5-10 ед. рестриктазы NcoI. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствии мутации будут два фрагмента рестрикции длиной 31 п.н. и 149 п.н. При наличии мутации (в норме) на электрофореграмме будет виден продукт длиной 180 п.н.

Реакция №3 (анализ rs4987117). Прямой мутагенный праймер CTCTCTAGATAATGATGAATGTAGCG; обратный праймер GAAACTTTCTCCAATCCAGACA. Условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек 54°С 30 сек, 72°С 30 сек.), конечная элонгация 72°С 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 112 п.н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, и 5-10 ед. рестриктазы HspAI. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствии мутации (в норме) будут два фрагмента рестрикции длиной 27 п.н. и 85 п.н. При наличии мутации на электрофореграмме будет виден продукт длиной 112 п.н.

При выявлении мутации в ходе реакции №1, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 6,95 раз больший, чем у людей, не имеющих этой мутации (OR=6,95).

При выявлении мутации в ходе реакции №2, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 6,66 раз меньший, чем у людей, не имеющих этой мутации (OR=0,15).

При выявлении мутации в ходе реакции №3 пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 2,76 раз больший, чем у людей, не имеющих этой мутации (OR=2,76).

При выявлении мутации в ходе реакций №2 и №3 одновременно, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 2,41 раз меньший, чем у людей, не имеющих этих мутаций (OR=0,414).

При выявлении мутации в ходе реакций №1 и №3 одновременно, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 19,18 раз больший, чем у людей, не имеющих этих мутаций (OR=19,18).

При выявлении мутации в ходе реакций №1, №2 и №3 одновременно, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 2,88 раз больший, чем у людей, не имеющих этих мутаций (OR=2,88).

Предлагаемый способ выявления предрасположенности к раку молочной железы на основе трех регионов генов BRCA1 и BRCA2 с последующим рестрикционным анализом амплифицированных регионов является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы, и расходные материалы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы человека из популяции центральной части России на основе ПЦР-ПДРФ. Способ включает выделение ДНК из предварительно отобранного биологического материала пациента, проведение трех реакций ПЦР с тремя наборами праймеров для разных регионов генов BRCA1 и BRCA2, рестрикционный анализ полученных ампликонов, визуализацию продуктов рестрикции с помощью электрофореза. При этом используемые рестриктазы образуют уникальные фрагменты рестрикции при наличии мутации и в норме, исходя из чего, оценивается относительный риск развития наследственного рака молочной железы у пациента. Изобретение обеспечивает выявление предрасположенности к раку молочной железы в течение 4,5-6 часов (в зависимости от выбранного способа выделения ДНК) без необходимости секвенирования образцов ДНК, и может быть использовано для диагностики.

Способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы человека из популяции центральной части России, включающий выделение ДНК из крови пациента, проведение ПЦР-ПДРФ в разных регионах генов BRCA1 и BRCA2, рестрикционный анализ полученных ампликонов, отличающийся тем, что ПЦР проводится со следующими наборами праймеров: реакция 1 проводится с прямым праймером CCCTGCTCACACTTTCTTCC и обратным праймером AAGACAGAGCCCCAGAGTCA; реакция 2 - с прямым праймером CAAATTCTTCTGGGGTCA и обратным праймером CCCAATTGAAAGTTGCAG; реакция 3 - с прямым мутагенным праймером CTCTCTAGATAATGATGAATGTAGCG и обратным праймером GAAACTTTCTCCAATCCAGACA; при рестрикционном анализе ампликона, полученного в ходе реакции 1, используют рестриктазу HinfI I, для ампликона, полученного в ходе реакции 2 - рестриктазу NcoI, для ампликона, полученного в ходе реакции 3 - рестриктазу HspAI; проводят визуализацию продуктов рестрикции с помощью электрофореза; при этом наличию мутации соответствует получение одного продукта рестрикции длиной 162 п.н. для реакции 1, длиной 180 п.н. - для реакции 2, длиной 112 п.н. - для реакции 3; при этом при наличии мутации при реакции 1 пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы в 6,95 раз больший, чем у людей, не имеющих этой мутации, при выявлении мутации при реакции 2 - в 6,66 раз меньший, при выявлении мутации при реакции 3 - в 2,76 раз больший, при выявлении мутации при реакциях 2 и 3 одновременно - в 2,41 раз меньший, при выявлении мутации при реакциях 1 и 3 одновременно - в 19,18 раз больший, при выявлении мутации при реакциях 1, 2 и 3 одновременно - в 2,88 раз больший.