КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК Российский патент 2020 года по МПК C07H21/04 C12Q1/68 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет и преимущество предварительной заявки на Патент США No.61/982784, поданной 22 апреля 2014, которая полностью включена в настоящее изобретение путем ссылки.

Уровень техники изобретения

Несмотря на то, что амплификация нуклеиновых кислот является рутинной и хорошо известной, реакции амплификации нуклеиновых кислот до сих пор страдают от непредсказуемости и/или низкой эффективности, в значительной степени из-за трудностей, связанных с дизайном праймеров. Непредсказуемость реакций амплификации нуклеиновых кислот в значительной степени обусловлена отсутствием определяющих последовательность параметров дизайна праймеров и зондов, которые позволяют проводить количественную оценку специфичной по отношению к мишени гибридизации праймеров и зондов по сравнению с неспецифичным связыванием, самодимеризацией и димеризацией этих праймеров и зондов между собой. В действительности, разнообразие в выборе возможных последовательностей праймеров и ограничений последовательности, налагаемых нуклеотидными последовательностями мишени, делает затруднительным эмпирическое и систематическое исследование массива комбинаций праймеров и последствий выбора этих комбинаций.

Основанные на ПЦР анализе параметры дизайна сфокусированы на температуре плавления праймера и зонда, содержании GC (гуанина и цитозина), длине праймера и минимизации взаимодействий праймера со всеми нуклеотидными последовательностями, кроме нуклеотидной последовательности мишени (см., например, www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html). В частности, использование праймера, имеющего межмолекулярные взаимодействия с самим собой (например, праймерные димеры) является крайне нежелательным, так как считается, что такие праймеры оказывают нежелательное влияние на взаимодействие праймера с целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Кроме того, предполагается, что оптимальная длина нуклеотидных праймеров составляет 18-22 нуклеотидов, которая считается достаточно длинной для адекватной специфичности и достаточно короткой для того, чтобы праймеры легко связывались с матрицей при темпертуре отжига. Что касается содержания GC, то рекомендуемым является содержание GC равное 40-60%. В обычной практике дизайна праймеров ошибочно полагается, что когда все вышеуказанные параметры являются одинаковыми для используемых в амплификации прямого и обратного праймеров, то кинетика гибридизации этих двух праймеров также является одинаковой. Ни один из этих стандартно используемых параметров дизайна не коррелирует адекватно со сложной термодинамикой двухстадийной гибридизации олигонуклеотидов, которая включает изменения энтальпии, энтропии, сольватации, эффектов ближайших соседних нуклеотидов и водородных связей при переходе от одноцепочечной к двухцепочечной гибридной стадии. Кроме того, даже использование двухстадийной модели гибридизации олигонуклеотидов в качестве основы термодинамических алгоритмов является чрезмерным упрощением и не отражает точно реальную ситуацию. Таким образом, функциональные характеристики праймеров, соответствующих всем рекомендуемым критериям, остаются непредсказуемыми.

Прогресс в определении эффективности набора праймеров для предсказуемой амплификации целевой нуклеиновой кислоты в практически изотермических условиях способен уменьшить расходование ресурсов, включая усилия, время и затраты на синтез и эмпирическую проверку большого количества наборов праймеров (например, дизайн множества праймеров и попарный скрининг множества праймерных комбинаций). Новые параметры и способы необходимы для увеличения и лучшего прогнозирования эффективности и выхода реакций амплификации нуклеиновых кислот.

Сущность изобретения

Как описано здесь, настоящее изобретение относится к улучшенным способам дизайна праймеров, способных предсказуемо амплифицировать целевую молекулу нуклеиновой кислоты, и способам применения этих праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, включая увеличение амплификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты и/или уменьшение или устранение образования фоновых продуктов. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям и способам для амплификации и обнаружения образца целевого олигонуклеотида. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиции и способы настоящего изобретения являются совместимыми с изотермическими реакциями амплификации нуклеиновых кислот.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному праймерному олигонуклеотиду, включающему в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей со второй областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному праймерному димеру, имеющему два нуклеотидных мономера, включающих в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей со второй областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному олигонуклеотидному зонду для обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты, содержащему олигонуклеотид; флуоресцентный репортер; и молекулу-гаситель, способную поглощать энергию возбуждения от флуоресцентного репортера; где флуоресцентный репортер и молекула-гаситель ковалентно связаны с противоположными 5ʹ- и 3ʹ-концами олигонуклеотида, где олигонуклеотид включает первую область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и вторую область перед 5ʹ-концом первой области, и третью область после 3ʹ-конца первой области, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную второй области, где этот олигонуклеотид способен образовывать шпилечную структуру «петля-на-стебле» путем гибридизации второй и третьей областей, когда олигонуклеотид не связан с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, и где ΔG двухцепочечного гибрида между целевой последовательностью и первой последовательностью олигонуклеотидного зонда, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей с олигонуклеотидным зондом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу амплификации специфичного продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой, данный способ включает приведение в практически изотермических условиях целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с полимеразой, двумя или несколькими праймерами, каждый из которых специфично связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, никирующим ферментом и обнаруживаемым полинуклеотидным зондом, где, по меньшей мере, один праймер включает в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей со второй областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов; и получение ампликонов, содержащих, по меньшей мере, часть целевой молекулы нуклеиновой кислоты.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения специфичного продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой, данный способ включает приведение в практически изотермических условиях целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с полимеразой, двумя или несколькими праймерами, каждый из которых специфично связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, никирующим ферментом и обнаруживаемым полинуклеотидным зондом, где, по меньшей мере, один праймер включает в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей со второй областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов; получение ампликонов, содержащих, по меньшей мере, часть целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и обнаружение сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где этот сигнал указывает на наличие целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору реагентов для амплификации целевой последовательности в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой, данный набор реагентов содержит один или несколько праймерных олигонуклеотида, включающих в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей со второй областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов; и указания по использованию этих праймерных олигонуклеотидов в способах настоящего изобретения.

В связанном аспекте настоящее изобретение относится к способу выбора праймерного олигонуклеотида в соответствии с любым аспектом настоящего изобретения, описанным в данной заявке, включающим создание инструкций для компьютерной программы на материальном, энергонезависимом, машиночитаемом носителе для реализации таких способов выбора праймерного олигонуклеотида.

В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов первая область имеет длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов. В различных вариантах осуществления изобретения первая область является полностью самокомплементарной. В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов палиндромная последовательность в первой области имеет длину 2, 4 или 6 нуклеотидов. В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов вторая область имеет длину 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов альтернативная структура представляет собой один или несколько частично двухцепочечных гибридов, которые вторая область может образовывать сама с собой (например, самодимеры), с частью последовательности первой области (например, гетеродимеры), с другими олигонуклеотидами, праймерами или зондами в реакции амплификаци или с частично комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот за пределами области целевой последовательности (например, нецелевые гибриды).

В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов олигонуклеотид (например, праймерный олигонуклеотид, олигонуклеотидный мономер) находится в форме гомодимера (например, праймерного димера), образованного самокомплементарными последовательностями первой области двух молекул праймерных олигонуклеотидов. В различных вариантах осуществления изобретения гомодимер имеет ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей с праймерным олигонуклеотидом, включая наиболее стабильную альтернативную структуру, содержащую праймерный олигонуклеотид. В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов свободная энергия (ΔG) определяется или рассчитывается для нуклеиновой кислоты при температуре 25°C (ΔG_25°C) и/или давлении 1 атмосфера (атм) (~101, кПа). В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов свободная энергия (ΔG) определяется или рассчитывается при помощи алгоритма mFold.

В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов вторая область олигонуклеотида (например, праймерного олигонуклеотида, олигонуклеотидного мономера) включает один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида, где 2ʹ-модификация выбрана из группы, состоящей из 2ʹ-O-метил, 2ʹ-метоксиэтокси, 2ʹ-фтор, 2ʹ-гидроксил, 2ʹ-алкил, 2ʹ-аллил, 2ʹ-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4ʹ-тио, 4ʹ-CH₂-O-2ʹ-мостик и 2ʹ-O-(N-метилкарбамат), или модификаций, содержащих аналоги оснований. В конкретных вариантах осуществления изобретения один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида расположены на 3ʹ-конце второй области. В других вариантах осуществления изобретения два или более 2ʹ-модифицированных нуклеотида являются смежными. В еще других вариантах осуществления изобретения количество смежных 2ʹ-модифицированных нуклеотидов составляет 2, 3, 4, 5 или 6. В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов никирующий фермент представляет собой один или несколько из Nt.BspD6I и Nt.BsfNBI. В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов распознаваемая никирующим ферментом последовательность в первой области представляет собой 5ʹ-GAGTC-3ʹ (и обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности представляет собой 5ʹ-GACTC-3ʹ). В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов олигонуклеотид (например, праймерный олигонуклеотид, олигонуклеотидный мономер) имеет распознаваемую никирующим ферментом последовательность, расположенную таким образом, чтобы происходило расщепление фосфодиэфирной связи между первой и второй областью. В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов полимераза представляет собой ДНК-полимеразу I из Geobacillus spp. или Bacillus stearothermophilus или ее активные фрагменты и производные. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимераза представляет собой один или несколько из следующих ферментов: Bst ДНК-полимераза I, Gst ДНК-полимераза I или Gka ДНК-полимераза I.

В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов олигонуклеотид (например, праймерный олигонуклеотид, олигонуклеотидный мономер) имеет первую область, включающую нуклеотидную последовательность, приведенную ниже:

5ʹ-GACTCN₁N_1ʹGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₁N_1ʹGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ- N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN_5ʹN-3ʹ; и

5ʹ-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN_5ʹN_6ʹ-3ʹ,

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCNN-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCNNN-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCNNNN-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹNN-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹNNN-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN_6ʹ-3ʹ;

5ʹ- N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN_6ʹN -3ʹ; и

5ʹ-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN_6ʹN_7ʹ-3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)). N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ, N₄ - N_4ʹ, N₅ - N_5ʹ, N₆ - N_6ʹ и N₇ - N_7ʹ. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид (например, праймерный олигонуклеотид, олигонуклеотидный мономер) содержит 5ʹ-концевую область, содержит последовательность, приведенную в Списке последовательностей, прилагаемом к данной заявке.

В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов олигонуклеотидный зонд для обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты содержит олигонуклеотид; флуоресцентный репортер; и молекулу-гаситель, способную поглощать энергию возбуждения от флуоресцентного репортера; где флуоресцентный репортер и молекула-гаситель ковалентно связаны с противоположными 5ʹ- и 3ʹ-концами олигонуклеотида, где олигонуклеотид включает первую область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и вторую область перед 5ʹ-концом первой области, и третью область после 3ʹ-конца первой области, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную второй области, где этот олигонуклеотид способен образовывать шпилечную структуру «петля-на-стебле» путем гибридизации второй и третьей областей, когда олигонуклеотид не связан с целевой молекулой нуклеиновой кислоты. В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов ΔG двухцепочечного гибрида между целевой последовательностью и первой последовательностью олигонуклеотидного зонда, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей или взаимодействующей с олигонуклеотидным зондом. В различных аспектах вторая и третья области олигонуклеотидного зонда имеют длину 4-8 нуклеотидов.

В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов приводятся инструкции по применению праймерных олигонуклеотидов и/или олигонуклеотидных зондов настоящего изобретения. В различных вариантах осуществления любого из описанных здесь аспектов праймеры и зонды в реакции сконструированы и/или выбраны таким образом, чтобы они вместе работали в реакции амплификации и обнаружения.

Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из подробного описания и формулы изобретения.

Определения

Термин «ампликон» означает полинуклеотид, образующийся в процессе амплификации целевого полинуклеотида. В одном примере ампликон образуется в процессе полимеразной цепной реакции.

Термин «модификаторы скорости амплификации» означает агент, способный оказывать влияние на скорость удлинения цепи с участием полимеразы.

Термин «замена основания» означает заместитель нуклеотидного основания в полимере, который не вызывает значительного нарушения гибридизации между комплементарными нуклеотидными цепями.

В настоящем описании термины «содержит», «имеет», «содержащий» и «имеющий» и тому подобное могут иметь значение, приписываемое им Патентным законодательством США, и могут означать «включает », «включающий » и тому подобное; термин «в основном состоящий из» или «в основном состоит из» также имеют значение, приписываемое им Патентным законодательством США и этот термин является неограничивающим, допускающим наличие более широкого, чем указано, перечня перечисленных объектов, при условии, что основные или новые характеристики перечисленных объектов не изменяются при наличии более широкого, чем указано, перечня перечисленных объектов, но исключая варианты осуществления, известные из уровня техники.

Термин «комплементарный» или «комплементарность» означает, что нуклеиновая кислота может образовывать водородную связь(и) с другой нуклеотидной последовательностью путем традиционного спаривания оснований по Уотсону-Крику или спаривания по Хугстену. Комплементарное спаривание оснований включает не только спаривание G-C и A-T оснований, но также включает спаривание оснований, включающее универсальные основания, такие как инозин. Процент комплементарности указывает процент расположенных друг за другом остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, спаривание оснований по Уотсону-Крику) со второй нуклеотидной последовательностью (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из общего количества 10 нуклеотидов в первом олигонуклеотиде, попарно связанные со второй нуклеотидной последовательностью, имеющей 10 нуклеотидов, соответствуют 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарности, соответственно). Для определения того, что процент комплементарности составляет, по меньшей мере, определенный процент вычисляют процент расположенных друг за другом остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, спаривание оснований по Уотсону-Крику) со второй нуклеотидной последовательностью, и полученное значение округляют до ближайшего целого числа (например, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов из общего количества 23 нуклеотида в первом олигонуклеотиде, попарно связанные со второй нуклеотидной последовательностью, имеющей 23 нуклеотида, соответствуют 52%, 67%, 61%, 65%, 70% и 74%, соответственно, что составляет, по меньшей мере, 50%, 50%, 60%, 60%, 70% и 70% комплементарности, соответственно). Используемый здесь термин «в значительной степени комплементарный» относится к такой комплементарности между цепями, что они способны гибридизоваться в биологических условиях. В значительной степени комплементарные последовательности имеют 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100% комплементарности. Кроме того, методики определения того, способны ли две цепи гибридизоваться в биологических условиях, путем изучения их нуклеотидных последовательностей хорошо известны из уровня техники.

Используемый здесь термин «дуплекс» относится к двойной спиральной структуре, образованной путем взаимодействия двух одноцепочечных нуклеиновых кислот. Как правило, дуплекс образуется путем попарного связывания оснований водородными связями, т.е. «спаривания оснований» между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, которые находятся в антипараллельной ориентации по отношению друг к другу. Спаривание оснований в дуплексе, как правило, происходит путем спаривания оснований по Уотсону-Крику, например, гуанин (G) образует пару оснований с цитозином (C) в ДНК и РНК, аденин (A) образует пару оснований с тимином (T) в ДНК, и аденин (A) образует пару оснований с урацилом (U) в РНК. Условия, при которых могут образовываться пары оснований, включают физиологически и биологически релевантные условия (например, внутриклеточные: значение pH 7,2, концентрация ионов калия 140 мМ; внеклеточные: значение pH 7,4, концентрация ионов натрия 145 мМ). Кроме того, дуплексы стабилизируются при помощи стэкинг-взаимодействий, возникающих между соседними нуклеотидами. В контексте настоящего изобретения дуплекс может быть образован или поддерживаться за счет спаривания оснований или при помощи стэкинг-взаимодействий. Дуплекс образован двумя комплементарными нуклеотидными цепями, которые могут быть в значительной степени комплементарными или полностью комплементарными.

Термин «обнаружить» относится к идентификации наличия, отсутствия количества или количества обнаруживаемого аналита.

Термин «обнаруживаемый компонент» означает композицию, которая при связывании с целевой молекулой делает последнюю обнаруживаемой при помощи спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических методов. Например, используемые метки включают радиоактивные изотопы, магнитные частицы, металлические частицы, коллоидные частицы, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, те, которые обычно используются в ИФА), биотин, дигоксигенин или гаптены.

Термин «фрагмент» означает часть молекулы нуклеиновой кислоты. Эта часть, предпочтительно, включает , по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% полной длины соответствующей молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов.

Термин «свободная энергия (ΔG)» означает обмен энергией между системой и окружающей ее средой при постоянных температуре и давлении, описываемый формулой ΔG=ΔH-TΔS. Свободная энергия показывает насколько образование структуры выгодно с энергетической точки зрения, где образование структуры, имеющей более отрицательное значение ΔG (например, выраженное в ккал/моль), является термодинамически более выгодным в динамическом равновесии нескольких альтернативных структур. Соответственно, ΔΔG измеряет разницу в предпочтительности между образованием двух различных структур, имеющих два различных значения ΔG. В одном аспекте ΔΔG служит балльной оценкой для измерения предпочтительности образования желаемой олигонуклеотидной структуры по сравнению с возможностью образования других нежелательных структур в динамическом равновесии. В одном варианте осуществления изобретения первая структура представляет собой дуплексный гибрид, образованный между первой областью (5ʹ-концевая область) одного олигонуклеотида и первой областью (5ʹ-концевая область) второго олигонуклеотида, имеющего такую же нуклеотидную последовательность, что и первый олигонуклеотид; и вторая структура представляет собой любую другую альтернативную структуру, содержащую этот олигонуклеотид.

Термин «гибридизоваться» означает образование двухцепочечной молекулы между комплементарными полинуклеотидными последовательностями (например, описанный здесь ген) или их частями в различных условиях жесткости (см., например, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507). Гибридизация происходит путем образования водородных связей, которые могут быть водородными связями, образованными по Уотсону-Крику, по Хугстену, или обратными водородными связями, образованными по Хугстену, между комплементарными нуклеотидными основаниями. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидными основаниями, которые образуют пару за счет образования водородных связей.

Термин «гибрид нуклеиновой кислоты» означает в значительной степени двухцепочечную молекулу, образованную путем связывания комплементарных молекул нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления изобретения двухцепочечная молекула является частично или полностью двухцепочечной.

Термин «выделенный полинуклеотид» означает нуклеиновую кислоту (например, ДНК), которая не содержит генов, которые в существующем в природе геноме организма, из которого получена молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, фланкируют этот ген. Таким образом, этот термин включает , например, рекомбинантную ДНК, которая встроена в вектор; в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус; или в геномную ДНК прокариота или эукариота; или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмент геномной или кДНК, получаемый при помощи ПЦР или расщепления эндонуклеазой рестрикции) независимо от других последовательностей. Кроме того, этот термин включает молекулу РНК, которая транскрибируется с молекулы ДНК, а также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность.

Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который в различной степени свободен от компонентов, которые обычно сопутствуют ему, так как были обнаружены в его нативном состоянии. Термин «выделять» означает степень отделения от исходного источника или окружения. Термин «очищать» означает степень отделения, которая выше, чем выделение. «Очищенный» или «биологически чистый» белок практически не содержит других материалов в такой степени, что любые примеси не оказывают существенного влияния на биологические свойства этого белка или не являются причиной других неблагоприятных последствий. То есть, нуклеиновая кислота или пептид настоящего изобретения являются очищенными, если они практически не содержат клеточный материал, вирусный материал или культуральную среду в случае получения при помощи технологий рекомбинантных ДНК, или химических предшественников или других химических реактивов в случае получения при помощи химического синтеза. Чистоту и однородность, как правило, определяют при помощи методов аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Термин «очищенный» может означать нуклеиновая кислота или белок образуют в основном одну полосу в электрофоретическом геле. В случае белка, который может быть подвергнут модификациям, например, фосфорилированию или гликозилированию, различные модификации могут приводить к образованию различных выделенных белков, которые могут быть очищены отдельно.

Термин «температура плавления (Tm)» означает температуру системы в равновесии, где 50% всей совокупности молекул находится в одном состоянии, а 50% этой совокупности находится в другом состоянии. В отношении нуклеиновых кислот настоящего изобретения Tm представляет собой температуру, при которой 50% всей совокупности молекул находится в одноцепочечном, а 50% в двухцепочечном (например, внутримолекулярном или межмолекулярном) состоянии.

Термин «мониторинг реакции» означает обнаружение хода реакции. В одном варианте осуществления изобретения мониторинг хода реакции включает обнаружение удлинения цепи с участием полимеразы и/или обнаружение завершения реакции амплификации.

Используемый здесь термин «получение», в частности, «получение агента» включает синтез, приобретение или какое-либо другое обеспечение наличия этого агента.

Используемый здесь термин «нуклеиновая кислота» относится к дезоксирибонуклеотидам, рибонуклеотидам или модифицированным нуклеотидам и их полимерам в одноцепочечной или двухцепочеченой форме. Этот термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные основы остатков или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые обладают связывающими свойствами сходными с исходной нуклеиновой кислотой, и которые метаболизируются аналогично исходным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают без ограничений 2ʹ-модифицированные нуклеотиды (например, 2ʹ-O-метилрибонуклеотиды, 2ʹ-F-нуклеотиды).

Используемый здесь термин «модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду, который имеет одну или несколько модификаций нуклеоизида, нуклеотидного основания, пентозного кольца или фосфатной группы. Например, модифицированные нуклеотиды исключают рибонуклеотиды, содержащие аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, уридинмонофосфат и цитидинмонофосфат, и дезоксирибонуклеотиды, содержащие дезоксиаденозинмонофосфат, деоксигуанозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат и дезоксицитидинмонофосфат. Модификации включают модификации, встречающиеся в природе, которые являются результатом модификаций при помощи ферментов, которые изменяют нуклеотиды, таких как метилтрансферазы. Модифицированные нуклеотиды также включают синтетические или не встречающиеся в природе нуклеотиды. Синтетические или не встречающиеся в природе модификации в нуклеотидах включают 2ʹ-модификации, например, 2ʹ-O-метил, 2ʹ-метоксиэтокси, 2ʹ-фтор, 2ʹ-гидроксил(РНК), 2ʹ-аллил, 2ʹ-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4ʹ-тио, 4ʹ-CH₂-O-2ʹ-мостик, 4ʹ-(CH₂)₂-O-2ʹ-мостик и 2ʹ-O-(N-метилкарбамат), или модификации, содержащие аналоги оснований.

Термин «нуклеотидный аддукт» означает молекулу, которая ковалентно связана или иным образом прикреплена к стандартному нуклеотидному основанию.

Термин «никирующий агент» означает химическое соединение, способное распознавать и связываться со специфичной структурой в двухцепочечных молекулах нуклеиновых кислот и разрывать фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами в одной цепи после связывания с распознаваемой им специфичной структурой, создавая тем самым свободную 3ʹ-гидроксильную группу на терминальном нуклеотиде, предшествующем ник-сайту. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения 3ʹ-конец может быть удлинен при помощи полимеразы, не обладающей эндонуклеазной активностью. Примеры никирующих агентов включают никирующие ферменты, рибозимы, ДНКзимы и хелаторы переходных металлов.

Термин «палиндромный» означает нуклеотидные последовательности, которые являются идентичными при прочтении в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу на одной цепи или в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу на комплементарной цепи. Термин «совершенный палиндром» относится к последовательности, содержащей две соседние подпоследовательности, такие, что при прочтении одной подпоследовательности в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу, она является идентичной другой подпоследовательности, прочитанной в направлении от 3ʹ- к 5ʹ-концу.

Термин «задерживающая полимеразу молекула» означает химическую группу, связанную с полинуклеотидной матрицей или праймером, которая предотвращает или существенно замедляет перемещение полимеразы по полинуклеотидной матрице. Предпочтительно, эта химическая группа встроена в полинуклеотид. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения эта химическая группа предотвращает перемещение полимеразы по матрице.

Термин «удлинение цепи с участием полимеразы» означает перемещение полимеразы вперед с включением в растущую цепь соответствующих мономеров, комплементарных их партнерам по связыванию, находящимся в полинуклеотидной матрице.

Используемый здесь термин «праймерный димер» означает димер двух мономерных олигонуклеотидных праймеров. У олигонуклеотидных праймеров настоящего изобретения димеризуются 5ʹ-области мономерных праймеров.

Термин «специфичный продукт» означает полинуклеотидный продукт, образующийся в результате гибридизации праймерных олигонуклеотидов с комплементарной целевой последовательностью и последующим удлинением целевой последовательности при помощи полимеразы.

Термин «практически изотермические условия» означает условия при одной температуре или внутри узкого диапазона температур, где температура существенно не меняется. В одном варианте осуществления изобретения реакция, проводимая в практически изотермических условиях, протекает при температуре, которая изменяется только на примерно 1-5°C (например, изменяется на 1, 2, 3, 4 или 5 градусов). В другом варианте осуществления изобретения реакция проводится при одной температуре в пределах рабочих характеристик используемого прибора.

Термин «референсный» означает стандартные или контрольные условия. Как очевидно специалисту в данной области техники, соответствующими референсными условиями являются те, при которых элемент изменяется для того, чтобы определить влияние этого элемента.

Термин «субъект» означает млекопитающее, включая без ограничений человека или не являющееся человеком млекопитающее, такое как корова, лошадь, собака, овца или кошка.

Термин «целевая молекула нуклеиновой кислоты» означает анализируемый полинуклеотид. Такой полинуклеотид может представлять собой смысловую или антисмысловую цепь целевой последовательности. Термин «целевая молекула нуклеиновой кислоты» также относится к ампликонам исходной целевой последовательности.

Следует понимать, что приведенные в настоящем описании диапазоны значений являются сокращенной записью всех значений внутри этого диапазона. Например, предполагается, что диапазон значений от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.

Если иное специально не указано или явным образом не следует из контекста, то используемый здесь термин «или» следует понимать как включительный. Если иное специально не указано или явным образом не следует из контекста, то используемая здесь форма единственного числа включает форму как единственного, так и множественного числа.

Если иное специально не указано или явным образом не следует из контекста, то используемый здесь термин «примерно» следует понимать как находящийся в диапазоне нормального допуска, существующего в данной области техники, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. Термин «примерно» можно понимать как находящийся в диапазоне 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%,, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанного значения. Если иное явным образом не следует из контекста, то все приведенные здесь числовые значения являются модифицированными термином «примерно».

Перечисление здесь списка химических групп в любом определении переменной включает определения этой переменной в качестве любой одной группы или комбинации перечисленных групп. Упоминание здесь варианта осуществления переменной или аспекта включает этот вариант осуществления в качестве одного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.

Любые описанные здесь композиции или способы могут быть объединены с одной или несколькими из любых других описанных здесь композиций и способов.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показан механизм, описывающий замещение цепи нуклеиновой кислоты в ходе реакции амплификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей эффективную экспоненциальную амплификацию. Показано взаимодействие 3ʹ-конца целевой молекулы нуклеиновой кислоты (серый) с соответствующим специфичным к последовательности праймером, имеющим 3ʹ-область распознавания (красная) и 5ʹ-концевую область, способную к димеризации (черная). Для мишень-специфичной амплификации 3ʹ-область распознавания (красная) является комплементарной по последовательности и способной специфично гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой. Праймер в активной конфигурации представляет собой стабильный гомодимер (называемый «праймерный димер»), образованный путем димеризации 5ʹ-концевых областей двух праймерных мономеров. В одном конкретном варианте осуществления изобретения праймер обладает самокомплементарностью с симметрично инвертированной последовательностью. Полученный в результате праймерный димер имеет двухцепочечную или в значительной степени двухцепочечную область димеризации (черная), которая представляет собой 5ʹ-конец по отношению к одноцепочечным областям распознавания (красные). То есть, мишень-специфичная часть праймера (способная отжигаться на целевой молекуле нуклеиновой кислоты) находится в праймерном димере в виде 3ʹ-одноцепочечных областей. В начале реакции 3ʹ-одноцепочечная часть праймерного димера отжигается на целевой молекуле нуклеиновой кислоты и инициирует репликацию целевой молекуле нуклеиновой кислоты. В ходе реакции мономерные праймеры высвобождаются из удлиненных праймерных димеров путем замещения цепи под действием полимеразы при синтезе комплементарной цепи. Для повышения специфичности и/или эффективности реакции амплификации, дизайн мономерных праймеров осуществляют таким образом, чтобы они имели (1) 5ʹ-концевую область, имеющую последовательность, которая является самокомплементарной, симметричной или в значительной степени симметричной, и способной к спариванию оснований в себе самой, и (2) 3ʹ-область распознавания, полностью или в значительной степени комплементарную по последовательности и способную специфично гибридизоваться с целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Когда ΔG для образования праймерного димера является низкой, время, в течение которого праймер находится в виде мономера с открытой конфигурацией, является минимальным. Мономерные праймеры являются нежелательными, так как они могут служить еще одной матрицей или праймером в неспецифичных по отношению к мишени реакциях удлинения праймеров, тем самым создавая или усиливая фон. Предпочтительно, переход от мономера к димеру является «практически мгновенным» или настолько коротким, насколько это возможно кинетически. Термодинамические факторы (например, очень низкая ΔG образования праймерных димеров, высокая концентрация праймера, высокая Tm димера) используются для того, чтобы способствовать образованию праймерных димеров.

На Фигуре 2 показан механизм, описывающий замещение цепи нуклеиновой кислоты в ходе реакции амплификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей неэффективную амплификацию. Показано взаимодействие 3ʹ-конца целевой молекулы нуклеиновой кислоты (серый) с соответствующим специфичным к последовательности праймером (красный и черный). Изотермические реакции, где мономерные праймеры находятся в открытой конфигурации в течение всей реакции, приводят к линейной неспецифической фоновой амплификации. Праймерные мономеры, которые не способствуют образованию праймерных димеров, обладают, например, минимальной или полностью отсутствующей самокомплементарнойстью по последовательности в 5ʹ-области мономерного праймера (черный), что приводит к высокому значению ΔG для образования праймерных димеров. Так как взаимодействие праймерного димера с целевой молекулой нуклеиновой кислоты запускает реакции отжига и удлинения цепи, образование праймерных димеров влияет на эффективность синтеза и/или амплификации целевой нуклеиновой кислоты. В полностью или частично открытой конфигурации праймерный мономер может служить или в качестве матрицы или в качестве праймера в неспецифичных по отношению к мишени реакциях удлинения праймера (см. вставку), что дополнительно усиливает неэффективность реакции. Когда открытая конфигурация мономерных праймеров не минимизирована (например, при помощи дизайна последовательности), переход от мономера к димеру осуществляется медленно, так как этому не способствуют термодинамические факторы (например, мультидимерная и частично димерная конфигурации совместно обладают аналогичной ΔG и низкой Tm димера).

На Фигуре 3 изображены праймерные структуры, которые ингибируют образование праймерных димеров, в том числе, например, структуры (A)-(C), которые приводят к амплификации неспецифичных побочных продуктов (структуры (H)-(J)) или структуры (D) и (K), которые неспособны к мишень-специфичной гибридизации. Показаны взаимодействия между праймерами (красный и черный) и фрагментами нуклеиновй кислоты (серые). Структура (A) представляет собой праймерный мономер, имеющий прерывающуюся инвертированную последовательность в мишень-специфичной области, которая способна образовывать обратную «петлю» с получением удлиняемого 3ʹ-конца для «саморепликации». Структура (A) также имеет 5ʹ-область, которая образует обратную «петлю» сама на себя с образованием шпилечной структуры. Структура (B) представляет собой праймерный димер, имеющий прерывающиеся инвертированные последовательности в мишень-специфичной области праймера, которые способны образовывать обратную «петлю» с получением удлиняемых 3ʹ-концов для «саморепликации». Структура (C) представляет собой ложную гибридную структуру между праймерным мономером в открытой конфигурации и одноцепочечном фрагментом ДНК (серый), замещенным ДНК-полимеразой в результате реакций с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой из близко расположенных случайных и/или специфичных по последовательности одноцепочечных разрывов в матрице ДНК. Структура (D) представляет собой частично двухцепочечную димерную структуру, где значительная часть мишень-специфичной области недоступна для гибридизации с мишенью. Структура (D) может быть образована повторами с инвертированной последовательностью в праймерном мономере. Структура (E) представляет собой промежуточный продукт реакции ложного удлинения праймера/замещения цепи, полученный из структуры (A). Структура (G) представляет собой промежуточный продукт реакции ложного удлинения праймера/замещения цепи, полученный из структуры (B). Структура (H) представляет собой зрелый продукт ложной реакции типа «nick & kick», приводящей к непрерывному повторению и амплификации одноцепочеченых побочных продуктов. Структура (J) представляет собой зрелый продукт ложной реакции типа «nick & kick», приводящей к непрерывному повторению и амплификации одноцепочеченых побочных продуктов. Структура (K) представляет собой устойчивое сохранение частично двухцепочечного димера структуры (D) в реакции. Так как значительная часть мишень-специфичной области недоступна для гибридизации с мишенью, репликация и/или амплификация целевой нуклеиновой кислоты ингибируется или не может инициироваться. Дизайн праймеров в соответствии с настоящим изобретением способствует оптимальному образованию праймерных димеров, что минимизирует образование нежелательных праймерных структур и их ингибирующее действие на мишень-специфичную амплификацию нуклеиновой кислоты.

На Фигуре 4 показаны желательные (справа) и нежелательные (слева) праймерные структуры. Праймеры настоящего изобретения могут принимать структуру, благоприятную для реакции амплификаци, включая праймерные димеры и/или шпильку, благодаря наличию самокомплементарных последовательностей. Не вдаваясь в теорию, праймерные димеры являются более стабильными и образуются, когда праймеры присутствуют в реакции в высокой концентрации (например, в начале реакции), а шпильки образуются когда концентрация праймеров уменьшается (например, в ходе реакции).

На Фигуре 5 изображена нежелательная конфигурация праймеров, где между конфигурациями неоптимальных праймеров существует динамическое равновесие. Когда ΔG, соответствующие образованию каждой структуры, являются примерно одинаковыми (т.е. ΔG₁≈ΔG₂≈ΔG₃≈ΔG₄), не существует благоприятной конфигурации или структуры праймера. Когда праймер существует в нескольких таких конфигурациях, он не принимает конфигурации оптимальной для способствования реакции амплификации нуклеиновой кислоты.

На Фигуре 6 показано, что оптимальный праймер представляет собой праймер, у которого димерная конфигурация является особенно энергетически выгодной (т.е., ΔG₁>>ΔG₂), особенно по сравнению со следующей энергетически выгодной конфигурацией (например, когда праймер внутримолекулярно взаимодействует сам с собой). Эта конфигурация отличается от ситуации, показанной на Фигуре 5, где между конфигурациями существует динамическое равновесие. Дизайн праймеров может быть осуществлен таким образом, чтобы они имели стабильную конфигурацию и структуру, способствующую реакции амплификации нуклеиновой кислоты, при этом уменьшая или устраняя образование нежелательных праймерных конфигураций и структур. Для праймеров, имеющих 5ʹ-концевую область димеризации, 5ʹ-концевая последовательность выбирается таким образом, чтобы быть более энергетически выгодной и более стабильной, чем другие структуры (ΔG₁≤от -30 до -62 ккал/моль). Для праймеров в реакциях амплификации с внесением одноцепочечного разрыва, 5ʹ-концевая последовательность является в значительной степени самокомплементарной и симметрично инвертированной. Такие праймеры могут обладать потенциалом для образования внутримолекулярных взаимодействий (например, петля-шпилька). Однако такие конфигурации являются минимизированными, когда симметрично инвертированные последовательности являются полностью самокомплементарными, на что указывает стабильность праймерных димеров по сравнению со структурой петля-шпилька (очень низкая ΔG₁ по сравнению с ΔG₂). Таким образом, когда праймер находится в достаточно высокой концентрации, петля-шпилька не образуется эффективно.

На Фигуре 7 изображены последовательности стабильных структур праймерных димеров для праймеров, используемых в реакциях амплификации с внесением одноцепочечного разрыва. На Фигуре 7 изображен гомодимер праймерного димера, имеющий 5ʹ-концевую область с распознаваемой никирующим ферментом последовательностью для никирующего фермента верхней цепи (Nt.BsfNBI). Дизайн ник-сайта осуществляют таким образом, чтобы он был расположен между нуклеотидом на 3ʹ-конце 5ʹ-концевой области и нуклеотидом на 5ʹ-конце 3ʹ-области распознавания. Не вдаваясь в теорию, никирующий фермент не расщепляет ник-сайт, когда 3ʹ-область распознавания является одноцепочечной. Однако расщепление ник-сайта происходит тогда, когда 3ʹ-область распознавания является двухцепочечной (например, когда праймер встраивается в двухцепочечную молекулу целевой нуклеиновой кислоты в процессе реакции амплификации нуклеиновой кислоты).

На Фигурах 8A-8C изображены примеры последовательностей 5ʹ-концевой области. На Фигуре 8A изображены примеры последовательностей 5ʹ-концевой области длиной 24 нуклеотида, имеющие последовательность, распознаваемую Nt.BsfNBI, и основанную на следующей формуле 5ʹ-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ. Исходя из этой формулы, существует 537824 5ʹ-концевых последовательностей, имеющих следующие свойства: ΔG=от -34,2 ккал/моль до -65 ккал/моль; ΔΔG < -40 ккал/моль; и содержание GC от 68% до 84%. Из них приведены 1050 выбранных последовательностей, составляющие 0,2% от всего диапазона последовательностей (248832). На Фигуре 8B изображены примеры последовательностей 5ʹ-концевой области длиной 22 нуклеотида, имеющие последовательность, распознаваемую Nt.BsfNBI, и основанную на следующей формуле 5ʹ-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ. Исходя из этой формулы, существует 248832 5ʹ-концевых последовательностей, имеющих следующие свойства: ΔG=от -47 ккал/моль до -55 ккал/моль; ΔΔG < -40 ккал/моль; и содержание GC от 72% до 82%. Из них приведены 200 выбранных последовательностей, составляющие 0,08% от всего диапазона последовательностей (248832). На Фигуре 8C изображены примеры последовательностей 5ʹ-концевой области, имеющих 6-ти нуклеотидную спейсерную область.

На Фигуре 9 приведены графики, показывающие мишень-специфичную амплификацию нуклеиновой кислоты с использованием праймеров настоящего изобретения, имеющих 5ʹ-концевую область и 3ʹ-область распознавания. Амплификацию определяли при помощи дететекции амплификации ДНК по двум каналам. Мишень-специфичные продукты обнаруживали с использованием зонда типа «молекулярный маяк» (верхнее изображение). Неспецифичную амплификацию нуклеиновой кислоты обнаруживали с использованием красителя SYBRGreen. Как видно на обоих графиках, экспоненциальная амплификация начинается примерно на 6-ой минуте, указывая на то, что амплификация является мишень-специфичной. Контрольные реакции без внесения ДНК-матрицы не продуцируют значительного фона.

На Фигуре 10 приведен график, показывающий, что амплификация нуклеиновой кислоты с использованием праймеров настоящего изобретения, имеющих 5ʹ-концевую область и 3ʹ-область распознавания, имеет характеристики, подходящие для быстрого обнаружения целевых нуклеиновых кислот. Такие реакции характеризуются высоким отношением сигнал-шум (ОЕФ_max-ОЕФ_нл), крутым углом наклона кривой (высокое значение [ОЕФ_max-ОЕФ_нл]/[T_нэфа-T_ОЕФmax], ранним началом экспоненциальной фазы амплификации (T_нэфа < 10 мин) и низкими различиями в значении сигнала между повторными реакциями с одним и тем же образцом.

На Фигуре 11 приведена диаграмма для работоспособных и неработоспособных праймеров, построенная в соответствии с их относительной стабильностью. Праймеры, содержащие 3ʹ-область распознавания, имеющую ΔΔG≤примерно -16 ккал/моль, показали свою работоспособность в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва, в то время как праймеры, имеющие ΔΔG > примерно -16 ккал/моль, были скорее неработоспособными. Все праймеры, содержащие 3ʹ-область распознавания, имеющую ΔΔG≤примерно -16 ккал/моль, и 5ʹ-концевую область, имеющую ΔΔG≤примерно -30 ккал/моль, оказались работоспособными.

На Фигуре 12 показан дизайн изотермической реакции амплификации ДНК для лектина сои для одной пары праймеров со спрогнозированной оптимальной структурой и одного спрогнозированного оптимального зонда без скрининга множества комбинаций кандидатных праймеров с неизвестными рабочими характеристиками.

На Фигуре 13 приведен график, показывающий результаты первого экспериментального испытания изотермической реакции амплификации ДНК для лектина сои, которые эмпирически подтвердили спрогнозированный ход анализа. Мишень-специфичная амплификация наблюдалась в реакциях, содержащих геномную ДНК сои. Амплификация отсутствовала в контрольных реакциях, не содержащих целевую ДНК.

На Фигуре 14 показан дизайн изотермической реакции амплификации ДНК для гена invA патогенной Salmonella enterica для одной пары праймеров со спрогнозированной оптимальной структурой и одного спрогнозированного оптимального зонда без скрининга множества комбинаций кандидатных праймеров с неизвестными рабочими характеристиками.

На Фигуре 15 приведен график, показывающий результаты первого экспериментального испытания изотермической реакции амплификации ДНК для гена invA патогенной Salmonella enterica, которые эмпирически подтвердили спрогнозированный ход анализа. Мишень-специфичная амплификация наблюдалась в реакциях, содержащих геномную ДНК Salmonella enterica. Амплификация отсутствовала в контрольных реакциях, не содержащих целевую ДНК.

На Фигуре 16 изображены два графика, показывающие, что изотермическая реакция амплификации ДНК для гена invA патогенной Salmonella enterica является легко оптимизируемой.

На Фигурах 17A-17I приведен кластерный анализ параметров структуры праймеров (Tm, %GC, длина в п.н., ΔG_25°C, ΔΔG_25°C). На Фигуре 17A приведен график зависимости ΔΔG в ккал/моль самодимера первой области праймера (5ʹ-конец) работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от ΔΔG в ккал/моль гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Кластеризация работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров показала корреляцию с функцией/отсутствием функции. На Фигуре 17B приведен график зависимости длины в нуклеотидах второй мишень-комплементарной области праймера работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от содержания %GC во второй мишень-комплементарной области праймера. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение. На Фигуре 17C приведен график зависимости длины в нуклеотидах второй мишень-комплементарной области праймера работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от ΔG в ккал/моль гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение. На Фигуре 17D приведен график зависимости Tm в °C гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от ΔG в ккал/моль гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры не показали корреляции с функцией/отсутствием функции. На Фигуре 17E приведен график зависимости ΔG в ккал/моль наиболее энергетически выгодного гибридного дуплекса второй области праймера с неспецифичной последовательностью для работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от ΔG в ккал/моль гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение. На Фигуре 17F приведен график зависимости содержания %GC во второй области праймера работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от Tm в °C гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение. На Фигуре 17G приведен график зависимости содержания %GC во второй области праймера работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от ΔG в ккал/моль гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение. На Фигуре 17H приведен график зависимости содержания %GC во второй области праймера работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от Tm в °C гибридного дуплекса второй области праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение. На Фигуре 17I приведен график зависимости длины в нуклеотидах праймера (3ʹ-область распознавания мишени) работоспособных праймеров и неработоспособных праймеров от Tm в °C гибридного дуплекса праймера с мишенью. Работоспособные праймеры и неработоспособные праймеры показали случайное распределение.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам, которые являются применимыми для прогнозируемого дизайна праймеров, и способам применения таких праймеров для амплификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты в реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Эти композиции и способы также являются применимыми для амплификации и обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, в том числе в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва.

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на нескольких открытиях, касающихся олигонуклеотидов, используемых в реакциях амплификации нуклеиновых кислот, в том числе праймеров и зондов, и их влияния на повышение эффективности и обеспечение возможности протекания реакций амплификации нуклеиновых кислот. Заявители первыми обнаружили, что одно или несколько из этих открытий в комбинации могут применяться для дизайна праймеров и зондов для реакций амплификации и/или анализов на обнаружение нуклеиновых кислот.

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на открытии, что олигонуклеотиды (например, праймеры и зонды) в некоторых конфигурациях имеют потенциал для повышения эффективности реакции амплификации нуклеиновой кислоты, и что способность этих олигонуклеотидов принимать желательные конфигурации может быть определена путем изучения разницы в изменении свободной энергии (ΔG) между желательными гибридами, образованными конкретным олигонуклеотидом и целевой последовательностью, и различными неспецифичными внутримолекулярными (частично двухцепочечными мономерами) и межмолекулярными комплексами (димерами праймер-праймер и праймер-зонд, неспецифичными гибридами) этого олигонуклеотида. В настоящее время в дизайне праймеров и зондов не используется информация о разнице в изменении свободной энергии между мишень-специфичными и неспецифичными структурами праймеров и зондов в виде инструмента балльной оценки для идентификации наиболее подходящего набора праймер/зонд амплификации целевой последовательности. Применение вышеизложенных соображений к дизайну праймеров приводит к дизайну праймеров, чья работоспособность является предсказуемой, с минимизацией или устранением необходимости в эмпирическом тестировании. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам выбора последовательности праймера, модификации праймера и/или дизайна зонда, которые облегчают манипуляции при осуществлении реакций амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот.

Заявители обнаружили, что праймер, имеющий 3ʹ-последовательность распознавания, чье образование праймер-мишень является стабильным (например, ΔG_25°C≤примерно -20 ккал/моль или более), имеет потенциал для повышения эффективности реакции амплификации нуклеиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления изобретения 3ʹ-последовательность распознавания мишени содержит 12-24, 12-17 или 12-14 оснований. В конкретных вариантах осуществления изобретения образование праймер-мишень является более стабильным, чем образование самодимера (например, ΔΔG≤примерно -15, -16, -17, -18, -19, -20 ккал/моль или более). В действительности, было обнаружено, что различие между работоспособным и неработоспособным праймером имеет место, когда ΔΔG < примерно -15 ккал/моль (см., например, Фигуру 11).

Кроме того, заявители обнаружили, что праймер, имеющий 5ʹ-концевую область, способную к самодимеризации, повышает эффективность реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Не вдаваясь в теорию, в реакции амплификации нуклеиновой кислоты праймер отжигается на целевой молекуле нуклеиновой кислоты в виде праймерного димера (см., например, Фигуру 1). Неожиданно было обнаружено, что эта конфигурация в виде праймерного димера заметным образом не мешает активности полимеразы и уменьшает или предотвращает неспецифичное взаимодействие 5ʹ-части праймера с самим собой или другими молекулами нуклеиновой кислоты. 5ʹ-концевая область содержит совершенную палиндромную последовательность, благодаря которой мономерные праймеры могут димеризоваться. Например, праймеры имеют сайт распознавания никирующего агента на 5ʹ-конце, который не влияет на специфичность связывания с целевой распознаваемой последовательностью. Неспецифичные фоновые продукты, образующиеся в результате неспецифичных праймерных взаимодействий, способны расходовать компоненты реакции, которые в ином случае были бы использованы для амплификации специфичного продукта. В различных вариантах осуществления изобретения образование гомодимера является стабильным (например, ΔG_25°C≤примерно -30, -35, -40, -45, -50, -55, -60 ккал/моль или более). В различных вариантах осуществления изобретения гомодимер имеет температуру плавления выше, чем температура реакции удлинения цепи. В конкретных вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая область имеет последовательность, которая является палиндромной. В других вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая область имеет длину, по меньшей мере, 20 оснований (например, 20, 21, 22, 23, 24 основания). В дополнительных вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая область имеет содержание GC 80-90%. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образование гомодимера является более стабильным, чем образование других менее стабильных конформаций в виде праймерного димера (ΔΔG≤примерно -15, -20, -25, -30, -35, -40 ккал/моль или более).

Кроме того, заявители обнаружили, что праймеры, содержащие 2ʹ-модифицированный нуклеотид (например, 2ʹ-O-метил, 2ʹ-фтор, 2ʹ-алкил) на 3ʹ-конце 3ʹ-области распознавания уменьшает или устраняет образование неспецифичных фоновых продуктов. Это увеличивает образование специфичных продуктов в реакциях амплификации нуклеиновых кислот без образования фоновых продуктов. В различных вариантах осуществления изобретения один или несколько нуклеотидов в 3ʹ-области распознавания содержит модифицированное нуклеиновое основание, которое дестабилизирует ошибочно спаренные пары оснований. В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированное нуклеиновое основание представляет собой два или более смежных нуклеотида, начинающихся в положении 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 3ʹ-конца, где положение 1 представляет собой нуклеотид на 3ʹ-конце. В конкретных вариантах осуществления изобретения не менее 8 и не более 10 немодифицированных нуклеотидов расположено между первым 5ʹ нуклеотидом 3ʹ-области распознавания и ближайшим 3ʹ модифицированным нуклеотидом.

В конкретных вариантах осуществления изобретения праймер содержит 3ʹ-область распознавания и 5ʹ-концевую область димеризации. В условиях реакции мономерные праймеры димеризуются с образованием праймерных димеров путем связывания их 5ʹ-концевых областей димеризации. Не вдаваясь в теорию, одноцепочечная 3ʹ-область распознавания праймерного димера отжигается на целевой молекуле нуклеиновой кислоты и синтезирует комплементарную целевую цепь. Мономерный праймер высвобождается из удлиненной цепи под действием полимеразы по замещению цепи в результате синтеза комплементарной цепи. Высвобожденный мономерный праймер димеризуется с другим свободным мономером путем связывания 5ʹ-концевой области. Многократные циклы приводят к экспоненциальной амплификации целевой нуклеиновой кислоты.

Дизайн праймеров

Общепринятые способы дизайна праймеров сфокусированы на температуре плавления праймера, температуре отжига праймера, содержании GC (гуанина и цитозина), длине праймера и минимизации взаимодействий праймера со всеми нуклеотидными последовательностями, кроме нуклеотидной последовательности мишени (см., например, www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html). В отличие от этих способов было обнаружено, что праймеры, которые образуют стабильные праймерные димеры, что выражается в виде свободной энергии образования (ΔG), предсказуемым образом функционируют в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Хотя свободная энергия (ΔG) и температура плавления (Tm) являются первичными компонентами энтальпии (ΔH) и энтропии (ΔS), значения ΔG и Tm получаются по-разному, и они не имеют коррелятивной связи, и единственным способом связать данное значение ΔG с данным значением Tm является напрямую узнать значение ΔH и ΔS, из которых они получены (Manthey, «mFold, Delta G, and Melting Temperature» ©2005 and 2011 Integrated DNA Technologies). Фигуры 1-11 относятся к дизайну оптимальных праймеров.

Свободная энергия образования (ΔG) межмолеукулярных праймерных структур может быть вычислена с использованием формул, известных из уровня техники. Ряд программ являются доступными для определения образования различных внутримолекулярных и межмолекулярных праймерных структур и вычисления их ΔG, включая, например, алгоритмы предсказания mFold и UNAfold (см., например, Markham and Zuker. UNAFold: Software for Nucleic Acid Folding and Hybridization. Bioinformatics: Volume 2, Chapter 1, pp 3-31, Humana Press Inc., 2008; Zuker et al. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide In RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, 1999; M. Zuker. Prediction of RNA Secondary Structure by Energy Minimization. Methods in Molecular Biology, 267-294, 1994; Jaeger et al. Predicting Optimal and Suboptimal Secondary Structure for RNA. In Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Methods in Enzymology 183, 281-306, 1990; Zuker. On Finding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule. Science 244, 48-52, 1989). Программа OligoAnalyzer 3.1 является одним из таких вариантов реализации mfold для дизайна праймеров (www.idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoAnalyzer/). Например, в случае OligoAnalyzer 3.1 вычисление ΔG может быть проведено с использованием следующих параметров: Тип мишени: ДНК; Концентрация олигонуклеотида 0,25 мкМ; Концентрация Na⁺: 60 мМ; Концентрация Mg⁺⁺: 15 мМ; и Концентрация dNTPs: 0,3 мМ.

3ʹ-область распознавания

Настоящее изобретение относится к праймеру, имеющему 3ʹ-последовательность распознавания, чье образование праймер-мишень является стабильным (ΔG≤примерно -20 ккал/моль или более) и имеет потенциал для повышения эффективности реакции амплификации нуклеиновой кислоты. 3ʹ-область распознавания специфично связывается с целевой нуклеиновой кислотой, например, комплементарной последовательностью целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения 3ʹ-область распознавания имеет последовательность, которая является комплементарной 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более основаниям целевой нуклеотидной последовательности. В различных вариантах осуществления изобретения температура плавления образования праймер-мишень равна или более чем на 8° или 6°C ниже температуры реакции удлинения цепи в анализе (Tm≥температура анализа -8°). В конкретных вариантах осуществления изобретения 3ʹ-последовательность распознавания содержит 12-20, 12-17 или 12-14 нуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления изобретения образование праймер-мишень является более стабильным, чем образование самодимера (например, ΔΔG≤примерно -15, -16, -17, -18, -19, -20 ккал/моль или более). В действительности, было обнаружено, что различие между работоспособным и неработоспособным праймером имеет место, когда ΔΔG < примерно -15 ккал/моль (см., например, Фигуру 11). Предпочтительно, 3ʹ-последовательность распознавания не содержит самокомплементарных последовательностей, коротких инвертированных повторов (например, >4 основания/повтор), или последовательностей, которые иным образом способствуют межмолекулярным взаимодействиям, которые способны помешать процессу отжига праймер-мишень.

В частности, праймер настоящего изобретения, имеющий 3ʹ-последовательность распознавания, применим в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва. Кроме того, мишень-специфичная 3ʹ-область распознавания содержит один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида (например, 2ʹ-O-метил, 2ʹ-метоксиэтокси, 2ʹ-фтор, 2ʹ-алкил, 2ʹ-аллил, 2ʹ-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 2ʹ-гидроксил(РНК), 4ʹ-тио, 4ʹ-CH₂-O-2ʹ-мостик, 4ʹ-(CH₂)₂-O-2ʹ-мостик и 2ʹ-O-(N-метилкарбамат)). Не вдаваясь в теорию, предполагается, что включение одного или нескольких 2ʹ-модифицированных нуклеотидов в области распознавания уменьшает или устраняет межмолекулярные и/или внутримолекулярные взаимодействия праймеров (например, образование праймерных димеров), и, таким образом, уменьшает или устраняет фоновый сигнал при изотермической амплификации. 2ʹ-модифицированный нуклеотид предпочтительно имеет основание, которое образует пару оснований с целевой последовательностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения два или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов (например, 2, 3, 4, 5 или более 2ʹ-модифицированных нуклеотидов) в мишень-специфичной области распознавания являются смежными (например, блок модифицированных нуклеотидов). В некоторых вариантах осуществления изобретения блок из 2ʹ-модифицированных нуклеотидов расположен на 3ʹ-конце мишень-специфичной области распознавания. В других вариантах осуществления изобретения блок из 2ʹ-модифицированных нуклеотидов расположен на 5ʹ-конце мишень-специфичной области распознавания. Когда блок из 2ʹ-модифицированных нуклеотидов расположен на 5ʹ-конце мишень-специфичной области распознавания, 2ʹ-модифицированные нуклеотиды могут быть отделены от ник-сайта одним или несколькими немодифицированными нуклеотидами (например, 2, 3, 4, 5 или более 2ʹ-немодифицированными нуклеотидами). Заявители обнаружили, что местоположение одного или нескольких 2ʹ-модифицированных нуклеотидов или бока из 2ʹ-модифицированных нуклеотидов изменяет кинетику амплификации. Когда один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов или блок из 2ʹ-модифицированных нуклеотидов расположены на или вблизи 5ʹ-конца области распознавания или близко к ник-сайту, реакции амплификации в реальном времени показали уменьшение времени детекции. Кроме того, происходит сжатие кривой сигнала и смещение наклона кривой.

В связанном варианте осуществления изобретения соотношения праймера, имеющего один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов, могут быть использованы для изменения времени детекции и/или эффективности реакции для «настройки» реакций, что приводит к предсказуемому контролю кинетики реакции. Увеличение отношения праймера, имеющего один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов на 3ʹ-конце последовательности распознавания, к праймеру, имеющему один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов на 5ʹ-конце последовательности распознавания, приводит к сжатию кривой сигнала и смещению наклона кривой. Предпочтительно иметь возможность «настраивать» реакцию, чтобы иметь средство манипуляции как временем детекции, так и эффективностью реакции. Настройка реакций может быть использована для того уравнять эффективность амплификации целевой нуклеиновой кислоты и амплификацию референсной нуклеиновой кислоты (например, внутреннего стандарта) в количественной ПЦР (кПЦР). Кроме того, кривые амплификации целевой нуклеиновой кислоты и внутреннего стандарта могут быть изменены таким образом, чтобы время детекции их продуктов амплификации было разделено, сохраняя при этом ту же эффективность для амплификации целевой нуклеиновой кислоты и амплификации внутреннего стандарта. Путем использования конкретных комбинаций и соотношений олигонуклеотидных структур в реакции можно создавать условия, которые позволяют регулировать эффективность реакции.

5ʹ-концевая область димеризации

Настоящее изобретение относится к праймеру, имеющему 5ʹ-концевую область, способную к самодимеризации, которая повышает эффективность реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Не вдаваясь в теорию, в реакции амплификации нуклеиновой кислоты праймер отжигается на целевой нуклеиновой кислоте в виде праймерного димера (см., например, Фигуру 1). Например, праймеры для реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва имеют сайт распознавания никирующего агента, находящийся на 5ʹ-конце, который не влияет на специфичность связывания последовательности распознавания мишени праймера. Неспецифичные фоновые продукты, образующиеся в результате неспецифичных праймерных взаимодействий, способны расходовать компоненты реакции, которые в ином случае были бы использованы для амплификации специфичного продукта. В различных вариантах осуществления изобретения образование гомодимера является стабильным (например, ΔG≤примерно -30, -35, -40, -45, -50, -55, -60 ккал/моль или более). В различных вариантах осуществления изобретения гомодимер имеет температуру плавления выше, чем температура реакции удлинения цепи. В конкретных вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая область имеет последовательность, которая является палиндромной. В других вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая область имеет длину, по меньшей мере, 12 оснований (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 основания). В дополнительных вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая область имеет содержание GC 80-90%. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образование гомодимера является более стабильным, чем образование других менее стабильных конформаций в виде праймерного димера (ΔΔG≤примерно -12, -13, -14, -15, -16, -17, 18, -19, -20, -25, -30, -35, -40 ккал/моль или более).

В частности, праймер настоящего изобретения, имеющий 5ʹ-концевую последовательность, применим в реакциях амплификации с внесением одноцепочечного разрыва. Для использования в реакциях амплификации с внесением одноцепочечного разрыва 5ʹ-концевая область содержит один или несколько сайтов распознавания никирующего агента, и 5ʹ-концевая область имеет симметрично инвертированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления изобретения дизайн ник-сайта осуществляют таким образом, чтобы он был расположен между нуклеотидом на 3ʹ-конце 5ʹ-концевой области и нуклеотидом на 5ʹ-конце 3ʹ-области распознавания. Не вдаваясь в теорию, никирующий фермент не расщепляет ник-сайт, когда 3ʹ-область распознавания является одноцепочечной. Однако расщепление ник-сайта происходит тогда, когда 3ʹ-область распознавания является двухцепочечной (например, когда праймер встраивается в двухцепочечную молекулу целевой нуклеиновой кислоты в процессе реакции амплификации нуклеиновой кислоты).

В различных вариантах осуществления изобретения 5ʹ-концевая последовательность содержит в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу инвертированную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, функционально связанную с палиндромной последовательностью (или самокомплементарной последовательностью), которая функционально связана с распознаваемой никирующим ферментом последовательностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения спейсерная область представляет собой четное число нуклеотидов (например, 2, 4, 6 и т.д.).

Пример 5ʹ-концевой области на основе распознаваемой никирующим ферментом Nt.BstNBI последовательности (5ʹ-GAGTC-3ʹ), имеющей 2-х нуклеотидный спейсер, включает нуклеотидную последовательность в соответствии с приведенной ниже формулой:

5ʹ-GACTCN₁N_1ʹGAGTC-3ʹ

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ.

Примеры последовательностей для таких концевых последовательностей с 2-х нуклеотидным спейсером включают , например, нуклеотидные последовательности в соответствии с приведенными ниже формулами:

5ʹ-GACTCN₁N_1ʹGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₁N_1ʹGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹN-3ʹ; и

5ʹ-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1ʹGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹN_5ʹ-3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ, N₄ - N_4ʹ, N₅ - N_5ʹ и т.д.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концевые последовательности с 2-х нуклеотидным спейсером исключают последовательности, содержащие нуклеотидные последовательности в соответствии с приведенными ниже формулами:

5ʹ-TCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGA-3ʹ;

5ʹ-TCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGAN-3ʹ;

5ʹ-N₂TCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGAN_2ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₂TCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGAN_2ʹN-3ʹ;

5ʹ-GTCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGAC-3ʹ;

5ʹ-GTCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGACN-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂TCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGAN_2ʹN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃GTCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGACN_3ʹ-3ʹ; и

5ʹ- AGTCGACTCN₁N_1ʹGAGTCGACT -3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ и т.д.

Пример 5ʹ-концевой области на основе распознаваемой никирующим ферментом Nt.BstNBI последовательности (5ʹ-GAGTC-3ʹ), имеющей 4-х нуклеотидный спейсер, включает нуклеотидную последовательность в соответствии с приведенной ниже формулой:

5ʹ-GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTC-3ʹ

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, и N₂ является комплементарным N_2ʹ.

Примеры последовательностей для таких концевых последовательностей с 4-х нуклеотидным спейсером включают , например, нуклеотидные последовательности в соответствии с приведенными ниже формулами:

5ʹ-GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN_5ʹN-3ʹ; и

5ʹ-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCN_3ʹN_4ʹN_5ʹN_6ʹ-3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ, N₄ - N_4ʹ, N₅ - N_5ʹ и N₆ - N_6ʹ и т.д.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концевые последовательности с 4-х нуклеотидным спейсером исключают последовательности, содержащие нуклеотидные последовательности в соответствии с приведенными ниже формулами:

5ʹ-GACTCGATCGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCGATCGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹN_2ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹN_2ʹN-3ʹ;

5ʹ-TCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGA-3ʹ;

5ʹ-TCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGAN-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹN_2ʹN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹN_2ʹN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₃TCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGAN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃TCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGAN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-GTCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGAC-3ʹ;

5ʹ-GTCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGACN-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂N₁GACTCGATCGAGTCN_1ʹN_2ʹN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃TCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGAN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃GTCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGACN_3ʹ-3ʹ; и

5ʹ- AGTCGACTCN₂N₁N_1ʹN_2ʹGAGTCGACT -3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ и т.д.

Пример 5ʹ-концевой области на основе распознаваемой никирующим ферментом Nt.BstNBI последовательности (5ʹ-GAGTC-3ʹ), имеющей 6-х нуклеотидный спейсер, включает нуклеотидную последовательность в соответствии с приведенной ниже формулой:

5ʹ- GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTC -3ʹ

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ является комплементарным N_2ʹ и N₃ является комплементарным N_3ʹ.

Примеры последовательностей для таких концевых последовательностей с 6-х нуклеотидным спейсером включают , например, нуклеотидные последовательности в соответствии с приведенными ниже формулами:

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCNN-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCNNN-3ʹ;

5ʹ-GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCNNNN-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹNN-3ʹ;

5ʹ-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹNNN-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN_6ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN_6ʹN-3ʹ; и

5ʹ-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCN_4ʹN_5ʹN_6ʹN_7ʹ-3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ, N₄ - N_4ʹ, N₅ - N_5ʹ, N₆ - N_6ʹ и N₇ - N_7ʹ и т.д.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концевые последовательности с 6-х нуклеотидным спейсером исключают последовательности, содержащие нуклеотидные последовательности в соответствии с приведенными ниже формулами:

5ʹ-GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTC-3ʹ;

5ʹ-GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN-3ʹ;

5ʹ-N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹN_3ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₃N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹN_3ʹN-3ʹ;

5ʹ-TCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGA-3ʹ;

5ʹ-TCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGAN-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄N₃N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹN-3ʹ;

5ʹ-N₄GTCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGACN_4ʹ-3ʹ;

5ʹ-GTCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGAC-3ʹ;

5ʹ-GTCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGACN-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄N₃N₂GACTCGAN₁N_1ʹTCGAGTCN_2ʹN_3ʹN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₅N₄TCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGAN_4ʹN_5ʹ-3ʹ;

5ʹ-N₄GTCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGACN_4ʹ-3ʹ; и

5ʹ- AGTCGACTCN₃N₂N₁N_1ʹN_2ʹN_3ʹGAGTCGACT -3ʹ,

где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N₁ является комплементарным N_1ʹ, N₂ - N_2ʹ, N₃ - N_3ʹ, N₄ - N_4ʹ, N₅ - N_5ʹ и т.д.

Примеры последовательностей 5ʹ-концевой области приведены на Фигурах 8A-8E. Примеры последовательностей 5ʹ-концевой области длиной 24 нуклеотида, имеющие последовательность распознавания Nt.BstNBI, могут быть получены на основе следующей матрицы 5ʹ-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ (Фигура 8A). На основе этой матрицы существует 537824 5ʹ-концевых последовательностей, имеющих следующие свойства: ΔG=от -48 ккал/моль до -62 ккал/моль; ΔΔG < -40 ккал/моль; и содержание GC от 68% до 84%. Из них приведены 1050 выбранных последовательностей, составляющие 0,2% от всего диапазона последовательностей (248832). Примеры последовательностей 5ʹ-концевой области длиной 22 нуклеотида, имеющие последовательность распознавания Nt.BstNBI, могут быть получены на основе следующей матрицы 5ʹ-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ (Фигура 8B). На основе этой матрицы существует 248832 5ʹ-концевых последовательностей, имеющих следующие свойства: ΔG=от -47 ккал/моль до -55 ккал/моль; ΔΔG < -40 ккал/моль; и содержание GC от 72% до 82%. Из них приведены 200 выбранных последовательностей, составляющие 0,08% от всего диапазона последовательностей (248832).

Способы амплификации нуклеиновых кислот

Технологии амплификации нуклеиновых кислот обеспечивают средства понимания сложных биологических процессов, обнаружения и идентификации патогенных и непатогенных организмов, судебно-криминалистического анализа, проведения связанных с заболеваниями исследований и обнаружения событий в генетически модифицированных организмах и т.д. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой общепринятую технологию амплификации нуклеиновых кислот с температурными циклами, применяемую для амплификации ДНК, состоящую из циклов повторяющихся нагрева и охлаждения реакционной смеси для плавления ДНК и ферментативной репликации ДНК с использованием ДНК-полимеразы. Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР) представляет собой метод, используемый для количественного определения числа копий данной нуклеотидной последовательности в биологическом образце. В настоящее время кПЦР используется для обнаружения продуктов реакции в режиме реального времени в течение всей реакции и сравнения профиля амплификации с амплификацией контролей, которые содержат известное количество нуклеиновых кислот в начале каждой реакции (или известное относительное соотношение нуклеиновых кислот к неизвестной исследуемой нуклеиновой кислоте). Результаты контролей используются для построения стандартных кривых, как правило, на основе логарифмической части кривых стандартных реакций амплификации. Эти значения используются для интерполяции неизвестных количества на основе данных сравнения их кривых амплификации со стандартными контрольными количествами.

Кроме ПЦР существуют системы амплификации не связанные с температурными циклами, иначе именуемые изотермические технологии амплификации нуклеиновых кислот, которые включают без ограничений реакцию амплификации с внесением одноцепочечного разрыва, амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), хеликаза-зависимую амплификацию (HAD), амплификацию с формированием петель (LAMP), амплификацию с замещением цепей (SDA), транскрипционно-опосредованную амплификацию (TMA), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR), амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), изотермическую амплификацию с одним праймером (SPIA), систему с Q-β репликазой и рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA).

Изотермические реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва имеют сходство с ПЦР с температурными циклами. Как и в ПЦР, в реакциях амплификации с внесением одноцепочечного разрыва используются олигонуклеотидные последовательности, которые являются комплементарными целевым последовательностям, именуемые праймеры. Кроме того, реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва целевых последовательностей приводят к логарифмическому увеличению количества целевой последовательности, как это происходит в стандартной ПЦР. В отличие от стандартной ПЦР, реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва протекают в изотермических условиях. В стандартной ПЦР температура повышается, чтобы обеспечить разделение двух цепей ДНК. В реакциях амплификации с внесением одноцепочечного разрыва в целевой нуклеотидной последовательности происходит одноцепочечный разрыв в определенных ник-сайтах, присутствующих в исследуемом образце. Полимераза внедряется в ник-сайт и начинает синтез цепи, комплементарной целевой нуклеотидной последовательности с одноцепочечным разрывом (добавленная экзогенная ДНК), одновременно с замещением существующей комплементарной цепи ДНК. Процесс репликации с замещением цепи устраняет необходимость в термическом разделении цепей. В этот момент праймерные молекулы отжигаются на замещенной комплементарной последовательности добавленной экзогенной ДНК. Теперь полимераза удлиняет 3ʹ-конец праймера, синтезируя цепь, комплементарную ранее замещенной цепи. Затем второй праймерный олигонуклеотид отжигается на вновь синтезированной комплементарной цепи и удлиняется, образуя дуплекс ДНК, который включает последовательность распознавания никирующего агента. Затем эта цепь подвергается внесению одноцепочечного разрыва с последующим удлинением с замещением цепи, осуществляемым полимеразой, которое приводит к образованию промежуточного ампликона дуплекса ДНК, который имеет ник-сайты на каждой стороне исходной целевой ДНК. После синтеза промежуточного ампликона молекула продолжает амплифицироваться экспоненциально за счет репликации замещенных цепей с новыми праймерными молекулами. Кроме того, амплификация также происходит линейно с каждой молекулы продукта за счет повторяющегося синтеза ник-трансляцией с введенных матрицей ник-сайтов. Результатом является быстрое увеличение сигнала целевой амплификации, намного более быстрое, чем это происходит при ПЦР с температурными циклами, с получением результатов амплификации менее чем за десять минут.

Анализ с использованием зависимых от никирующего агента изотермических реакций амплификации нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение относится к обнаружению целевых молекул нуклеиновых кислот, амплифицированных в изотермической реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва. Полимеразы, пригодные для использования в описанных здесь способах, способны катализировать включение нуклеотидов для удлинения 3ʹ-гидроксильного конца олигонуклеотида (например, праймера), связанного с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, и/или 3ʹ-гидроксильного конца в ник-сайте в двухцепочечной молекуле ДНК, в сочетании с активностью по замещению цепи. Такие полимеразы также не обладают или обладают в значительной мере пониженной 5ʹ-3ʹ экзонуклеазной активностью, и могут включать полимеразы, являющиеся термофильными. ДНК-полимеразы, пригодные для использования в способах включения праймеров, имеющих 2ʹ-модифицированные нуклеотиды в области праймера, содержащей шесть 3ʹ-концевых нуклеотида, включают производные и варианты ДНК-полимеразы I, выделенные из Bacillus stearothermophilus, также классифицируемой как Geobacillus stearothermophilus, и из близкородственных бактериальных штаммов, изолятов и видов, относящихся к роду Geobacillus, которые не обладают или обладают в значительной мере пониженной 5ʹ-3ʹ экзонуклеазной активностью и обладают активностью по замещению цепи. Примеры полимераз включают без ограничений большие фрагменты Bst ДНК-полимеразв I, Gst ДНК-полимеразы I, Gka ДНК-полимеразы I.

Никирующий агент, пригодный для использования в описанных здесь способах, представляет собой химическое соединение, способное распознавать и связываться со специфичной структурой в двухцепочечных молекулах нуклеиновых кислот и разрывать фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами в верхней цепи со значительно более высокой вероятностью, чем расщепление фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами в нижней цепи, после связывания с распознаваемой им специфичной структурой, создавая тем самым свободную 3ʹ-гидроксильную группу на терминальном нуклеотиде, предшествующем ник-сайту, который может быть удлинен замещающей цепь полимеразой, не обладающей 5ʹ-3ʹ экзонуклеазной активностью. В предпочтительных вариантах осуществления описанных здесь способов, вероятность расщепления фосфодиэфирной связи в верхней цепи «никирующим агентом» приближается к 100%, в то время как вероятность расщепления фосфодиэфирной связи в нижней цепи приближается к 0%. Никирующие агенты, пригодные для использования в описанных здесь способах, могут представлять собой или ферменты, т.е. самовосстанавливающиеся катализаторы, преобразующие несколько молекул субстрата, или невосстанавливающиеся катализаторы, преобразующие только одну молекулу субстрата в эквимолярном соотношении.

Никирующий фермент связывается с двухцепочечной ДНК и расщепляет одну цепь двухцепочечного дуплекса. В способах настоящего изобретения никирующий фермент расщепляет верхнюю цепь (цепь, содержащую 5ʹ-3ʹ последовательность сайта распознавания никирующего агента). Никирующий фермент может вносить разрыв как перед, так и после сайта связывания или сайта распознавания никирующего фермента. В конкретном варианте осуществления раскрытого здесь изобретения никирующий фермент расщепляет верхнюю цепь только после 3ʹ-конца сайта распознавания. В приведенных в качестве примера вариантах осуществления изобретения реакция включает использование никирующего фермента, который расщепляет или вносит одноцепочечный разрыв после сайта связывания, таким образом, что являющаяся продуктом последовательность не содержит ник-сайта. Использование фермента, который вносит одноцепочечный разрыв после сайта связывания, позволяет полимеразе с большей легкостью удлинять цепь без необходимости вытеснять никирующий фермент. В идеальном случае никирующий фермент является функциональным при тех же условиях реакции, что и полимраза. Примеры никирующих ферментов включают без ограничений N.Bst9I, N.BstSEI, Nb.BbvCI(NEB), Nb.Bpu1OI(Fermantas), Nb.BsmI(NEB), Nb.BsrDI(NEB), Nb.BtsI(NEB), Nt.AlwI(NEB), Nt.BbvCI(NEB), Nt.Bpu1OI(Fermentas), Nt.BsmAI, Nt.BspD6I, Nt.BspQI(NEB), Nt.BstNBI(NEB) и Nt.CviPII(NEB). Последовательности сайтов распознавания никирующих ферментов приведены в Таблице 1.

Никирующие ферменты также включают сконструированные никирующие ферменты, полученные путем модификации расщепляющей активности эндонуклеаз рестрикции (NEB expressions July 2006, vol 1.2). Когда эндонуклеазы рестрикции связываются со своими последовательностями распознавания в ДНК, два каталитических сайта, существующих в каждом ферменте для гидролиза каждой цепи, запускают две независимые гидролитические реакции, которые протекают параллельно. Измененные ферменты рестрикции могут быть сконструированы таким образом, что они гидролизуют только одну цепь дуплекса с образованием молекул ДНК, которые являются «никированными» (3ʹ-гидроксил, 5ʹ-фосфат), а не расщепленными. Никирующие ферменты также могут включать модифицированные белки CRISPR/Cas, подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALENs) и нуклеазы с доменом цинкового пальца, обладающие никазной активностью.

Реакция амплификации с внесением одноцепочечного разрыва, как правило, включает нуклеотиды, такие как, например, дидезоксирибонуклеозид трифосфаты (dNTPs). Реакция также может быть проведена в присутствии dNTPs, которые содержат обнаруживаемый компонент, включающий без ограничений радиоактивную метку (например, ³²P, ³³P, ¹²⁵I, ³⁵S), фермент (например, щелочная фосфатаза), флуоресцентную метку (например, флуоресцинизотиоцианат (FITC)), биотин, авидин, дигоксигенин, антигены, гаптены или флуорохромы. Реакция также включает определенные соли и буферы, которые обеспечивают активность никирующего фермента и полимеразы.

Предпочтительно, реакция амплификации с внесением одноцепочечного разрыва осуществляется в практически изотермических условиях, где температура реакции остается более или менее постоянной в течение реакции амплификации. Поскольку температура не должна циклически изменяться от высокой температуры к более низкой температуре, реакция амплификации с внесением одноцепочечного разрыва может осуществляться в условиях, в которых проводить обычную ПЦР было бы затруднительно. Как правило, реакцию проводят при температуре примерно от 35°C до 90°C (например, примерно 35, 37, 42, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85°C). Преимуществом является то, что нет необходимости поддерживать температуру с высокой степенью точности. Небольшие колебания температуры являются приемлемыми.

Для реакций амплификации выбирают наборы праймеров, имеющих ΔΔG≤-15, -16, 17,-18, -19, -20, -25, -30 ккал/моль или более. Рабочие характеристики реакций амплификации могут быть изменены, путем повышения концентрации одного или нескольких олигонуклеотидов (например, одного или нескольких праймеров и/или зондов) и/или изменения их соотношений. Высокие концентрации праймеров также способствуют образованию праймерных димеров. В различных вариантах осуществления изобретения концентрация праймеров составляет 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 нМ или более. Модификаторы температуры плавления (Tm) скорости реакции также могут быть использованы для понижения температуры плавления олигонуклеотидов, например, без ограничений этиленгликоль и глицерин. Кроме того, модификаторы скорости работы ДНК-полимеразы (такие как концентрация dNTP и магния) могут использоваться для изменения скорости реакции. В конкретных вариантах осуществления 5ʹ-концевые последовательности прямого и обратного праймеров имеют одинаковую нуклеотидную последовательность.

Настоящее изобретение также относится к способу дизайна анализа с использованием зависимых от никирующего агента изотермических реакций амплификации нуклеиновых кислот с замещением цепи без экспериментального скрининга множества комбинаций кандидатных прямых праймеров и/или кандидатных обратных праймеров. В целевой последовательности идентифицируют область длиной 35-70 п.н., имеющую в своей центральной части последовательность, состоящую из 12-20 п.н. с Tm≥температуре реакции (например, ~55°C). Соседние последовательности длиной 12-20 п.н. непосредственно после или перед центральной областью длиной 15-20 п.н. идентифицируют в соответствии с указанными выше критериями. Tm выбранных двухцепочечных соседних последовательностей, расположенных после или перед центральной областью, отличаются друг от друга менее чем на±3°C. Мишень-специфичную пару прямого и обратного праймеров получают путем присоединения 5ʹ-концевой области для стабильного образования праймерного димера к 5ʹ-концу последовательности длиной 12-20 оснований, расположенной непосредственно перед соседней последовательностью, и к 5ʹ-концу комплементарной цепи длиной 12-20 оснований, расположенной непосредственно после соседней последовательности. При объединении прямого праймера, обратного праймера и зонда праймер, определяющий синтез цепи, комплементарной зонду, находится в избытке по отношению к другому праймеру в молярном соотношении от примерно 1,1:1 до 10:1. Общая концентрация праймеров в реакции не превышает 1000 нМ. Этот способ дизайна анализа может также использоваться для преобразования ранее апробированного ПЦР анализа для ампликона≤70 п.н. в анализа с использованием зависимых от никирующего агента изотермических реакций амплификации нуклеиновых кислот с замещением цепи.

Целевые молекулы нуклеиновой кислоты

Способы и композиции настоящего изобретения применимы для амплификации и/или идентификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты в исследуемом образце. Целевые последовательности амплифицируются из практически любых образцов, которые содержат целевую молекулу нуклеиновой кислоты, включая без ограничений образцы, содержащие грибы, споры, вирусы или клетки (например, прокариоты, эукариоты). В конкретных вариантах осуществления изобретения композиции и способы настоящего изобретения обнаруживают Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pseudomonas syringae pv Tomato, Xanthomonas campestris pv Vesicatoria, Alternaria spp, Cladosporium spp, Fusarium oxysporum, Verticilium dahlia, Pseudomonas currugata, Erwina carotovora и Ralstonia solanacearum. Примеры исследуемых образцов включают жидкости организма (например, кровь, сыворотка крови, плазма, амниотическая жидкость, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, лимфа, слезная жидкость, фекалии или желудочный сок), тканевые экстракты, культуральные среды (например, жидкость в которой выращивались клетки, такие как клетки патогена), образцы из окружающей среды, сельскохозяйственную продукцию или другие продукты питания и их экстракты и идентификационные ДНК. При необходимости перед включением в реакцию амплификации с внесением одноцепочечного разрыва образец очищают при помощи стандартного способа, обычно используемого для выделения молекулы нуклеиновой кислоты из биологического образца.

В одном варианте осуществления изобретения праймеры амплифицируют целевую нуклеиновую кислоту патогена для обнаружения наличия патогена в образце. Примеры патогенов включают без ограничений грибы, бактерии, вирусы и дрожжи. Такие патогены могут быть обнаружены путем идентификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок патогена, такой как токсин, в исследуемом образце. Примеры токсинов включают без ограничений афлатоксин, холерный токсин, дифтерийный токсин, токсин сальмонеллы, токсин Шига, токсин Clostridium botulinum, эндотоксин и микотоксин. Для природоохранного применения исследуемые образцы могут включать воду, жидкие экстракты или воздушные фильтры, образцы почвы, строительные материалы (например, гипсокартон, потолочная плитка, обшивочные доски, ткани, обои и напольные покрытия), тампоны для отбора проб с поверхностей и другие образцы. В одном варианте осуществления изобретения праймерные олигонуклеотиды амплифицируют целевую нуклеиновую кислоту растения, используемую в качестве внутреннего контроля в экспериментах по молекулярной селекции, направленных на улучшение, например, устойчивости растений к засухе, устойчивости растений к гербицидам или к нападению вредных насекомых.

Целевые молекулы нуклеиновых кислот включают двухцепочечные и одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот (например, ДНК и другие полимеры нуклеиновых оснований, известные из уровня техники, способные гибридизоваться с описанной здесь молекулой нуклеиновой кислоты). Молекулы ДНК, пригодные для обнаружения детектируемым олигонуклеотидным зондом или праймером настоящего изобретения включают без ограничений двухцепочечную ДНК (например, геномную ДНК, плазмидную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК и синтетическую двухцепочечную ДНК). Целевые молекулы нуклеиновых кислот, представляющие собой одноцепочечную ДНК, включают , например, вирусную ДНК, кДНК и синтетическую одноцепочечную ДНК или другие типы ДНК, известные из уровня техники.

Как правило, целевая последовательность для обнаружения имеет длину от 10 до 100 нуклеотидов, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 нуклеотидов. Содержание GC в целевой молекуле нуклеиновой кислоты выбирается таким образом, чтобы оно было меньше примерно 45, 50, 55 или 60%. Желательно, чтобы целевая последовательность и никирующие ферменты выбирались таким образом, чтобы целевая последовательность не содержала ник-сайтов любого из никирующих ферментов, который будет включен в реакционную смесь.

Применения

Амплификация целевой нуклеиновой кислоты с использованием праймеров настоящего изобретения обладает свойствами, делающими ее пригодной для быстрого обнаружения целевых нуклеиновых кислот (Фигура 10). Такие реакции характеризуются высоким отношением сигнал-шум ([ОЕФ_max-ОЕФ_нл]), крутым углом наклона кривой (высокое значение [ОЕФ_max-ОЕФ_нл]/[T_нэфа-T_ОЕФmax], ранним началом экспоненциальной фазы амплификации (T_нэфа < 10 мин) и низкими различиями в значении сигнала между повторными реакциями с одним и тем же образцом. В некоторых вариантах осуществления изобретения T_нэфа-ОЕФ_max ≈3 минуты.

Настоящее изобретение относится к мониторингу в режиме реального времени изотермической реакции амплификации. Композиции и способы настоящего изобретения являются пригодными для проведения диагностики у человека, когда необходимо быстрое обнаружение (например, обнаружение результатов амплификации через 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 минут или меньше). В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва для диагностики у человека в клинических условиях. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва для диагностики в полевых условиях, где отсутствует доступ к оборудованию для термоциклирования, или это может быть слишком дорого. В еще других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва в академических исследованиях, в которых необходимо проводить быстрые амплификацию и обнаружение нуклеиновых кислот.

Обнаруживаемые олигонуклеотидные зонды

Настоящее изобретение относится к обнаружению целевых молекул нуклеиновой кислоты или их ампликонов при помощи реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва с использованием неамплифицируемых обнаруживаемых полинуклеотидных зондов, содержащих, по меньшей мере, одну задерживающую полимеразу молекулу (например, нуклеотидную модификацию или другую молекулу, которая делает олигонуклеотид способным связываться с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, но неспособным поддерживать удлинение полимеразой, использующей обнаруживаемый олигонуклеотидный зонд в качестве мишени). Не вдаваясь в теорию, наличие одной или нескольких молекул, которые не позволяют полимеразе осуществлять свои функции, вероятно вызвано задержкой полимеразы этими не относящимися к основе нуклеиновых кислот молекулами в олигонуклеотиде или обусловлено проскальзыванием репликативной полимеразы (т.е. C3-спейсер, поврежденные основания ДНК, другие спейсерные молекулы, O-2-Me основания). Таким образом, эти конструкции предотвращают или уменьшают нежелательную амплификацию зонда в ходе реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва. Это отличает их от обычно используемых обнаруживаемых зондов, которые необходимо добавлять в конце реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва для предотвращения их амплификации.

Было показано, что обычные обнаруживаемые зонды не могут применяться для обнаружения в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва в режиме реального времени. Если обычные обнаруживаемые зонды участвуют в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва, то эти обычные обнаруживаемые зонды амплифицируются одновременно с мишенью. Амплификация этих обнаруживаемых молекул маскирует обнаружение желательных целевых ампликонов из-за большого количества исходных молекул обнаруживаемого зонда, присутствующих в начале реакции.

Настоящее изобретение относится к неамплифицируемому обнаруживаемому полинуклеотидному зонду, который содержит, по меньшей мере, одну задерживающую полимеразу молекулу. Задерживающая полимеразу молекула настоящего изобретения включает без ограничений нуклеотидную модификацию или другую молекулу, которая блокирует удлинение репликативной ДНК-полимеразой, чем предотвращает амплификацию обнаруживаемых молекул; но может способствовать правильной гибридизации или расположению нуклеотидов относительно целевой молекулы или амплифицированных копий целевой молекулы. В одном варианте осуществления изобретения обнаруживаемый олигонуклеотидный зонд настоящего изобретения содержит 3-х углеродный спейсер (C3-спейсер), который предотвращает или уменьшает нежелательную амплификацию обнаруживаемой молекулы.

В одном варианте осуществления изобретения обнаруживаемый олигонуклеотидный зонд содержит одно или несколько модифицированных нуклеотидных оснований, обладающих повышенной аффинностью связывания с комплементарным нуклеотидом. Примеры модифицированных оснований включают без ограничений 2ʹ- фторамидиты и 2ʹOMe РНК амидиты (также функционирующие как задерживающие полимеразу молекулы). Обнаруживаемые олигонуклеотидные зонды настоящего изобретения могут быть синтезированы с разноцветными флуорофорами, и их дизайн может быть осуществлен таким образом, чтобы они гибридизовались с фактически любой целевой последовательностью. С учетом его исключительной специфичности, неамплифицируемый обнаруживаемый полинуклеотидный зонд настоящего изобретения используется для обнаружения одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в образце, или он используется в комбинации с обнаруживаемыми олигонуклеотидными зондами, каждый из которых связывается с разной целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Таким образом, неамплифицируемые обнаруживаемые полинуклеотидные зонды настоящего изобретения могут использоваться для обнаружения одной или нескольких целевых молекул нуклеиновой кислоты в одной реакции, что позволяет обнаруживать эти мишени одновременно. Настоящее изобретение включает применение таких флуорофоров в сочетании с описанными здесь обнаруживаемыми олигонуклеотидными зондами.

Применение неамплифицируемых обнаруживаемых полинуклеотидных зондов

Неамплифицируемые обнаруживаемые полинуклеотидные зонды являются пригодными для использования в способах амплификации и обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва. Этот способ включает приведение целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с полимеразой, двумя праймерами, каждый из которых специфично связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, никирующим ферментом и обнаруживаемым олигонуклеотидным зондом в присутствии соответствующего буфера и dNTPs в практически изотермических условиях, получение ампликонов, содержащих, по меньшей мере, часть указанной целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и обнаружение целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в реакции, путем обнаружения олигонуклеотидного зонда, который гибридизуется с целевой молекулой нуклеиновой кислоты в режиме реального времени в процессе реакции, на основе интенсивности флуоресценции от молекул зонда в реакции. Предпочтительно, такие способы применяются для мониторинга реакций амплификации с внесением одноцепочечного разрыва в режиме реального времени.

Как правило, неамплифицируемые обнаруживаемые полинуклеотидные зонды настоящего изобретения включают в реакцию амплификации с внесением одноцепочечного разрыва, которая содержит (1) целевую молекулу нуклеиновой кислоты; (2) два праймера, содержащие некоторое количество олигонуклеотидов, которые являются комплементарными целевой молекуле нуклеиновой кислоты, и сайт, который может быть расщеплен никирующим ферментом; (3) dNTPs; (4) замещающую цепь полимеразу; и (5) никирующий фермент. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу применения этих компонентов для обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты.

Реализация в аппаратных средствах и/или программном обеспечении

Описанные здесь способы могут быть реализованы в программируемых аппаратных средствах и программном обеспечении общего и специального назначения. Например, эти способы могут быть реализованы при помощи машиночитаемого носителя. Таким образом, настоящее изобретение также относится к программному обеспечению и/или компьютерному программному продукту, сконфигурированному с возможностью выполнения алгоритмов и/или способов в соответствии с любым вариантом осуществления настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники хорошо известно, как конфигурировать программное обеспечение, которое сможет выполнять алгоритмы и/или способы, описанные в настоящем изобретении. Машиночитаемый носитель может быть энергонезависимым и/или материальным. Например, машиночитаемый носитель может представлять собой энергозависимое запоминающее устройство (например, оперативное запоминающее устройство) или энергонезависимое запоминающее устройство (например, постоянное запоминающее устройство, жесткие диски, дискеты, магнитная лента, оптические диски, бумажные таблицы, перфокарты и тому подобное). Исполняемые компьютером команды могут быть написаны на любом подходящем компьютерном языке или комбинации нескольких языков. Основные методы вычислительной биологии описаны, например, в Setubal and Meidanis et al, Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) и Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2^nd ed., 2001).

Настоящее изобретение также может использовать различные компьютерные программные продукты и программное обеспечение для различных целей, таких как дизайн зонда, управление данными, анализ и управление прибором. (См. Патенты США Nos. 5593839, 5795716, 5733729, 5974164, 6066454, 6090555, 6185561, 6188783, 6223127, 6229911 и 6308170). Кроме того, настоящее изобретение может иметь предпочтительные варианты осуществления, которые включают способы предоставления генетической информации через сети, такие как Интернет, как показано в заявках на Патент США Nos. 10/197621, 10/063559 (Пуб. США No.20020183936), 10/065856, 10/065868, 10/328818, 10/328872, 10/423403 и 60/482389.

Наборы реагентов

Настоящее изобретение также относится к наборам реагентов для амплификации целевой молекулы нуклеиновой кислоты. Такие наборы реагентов применимы для амплификации и обнаружения целевой нуклеиновой кислоты в биологическом образце, полученном от субъекта. Наборы реагентов настоящего изобретения могут содержать, например, одну или несколько полимераз, прямой и обратный праймеры и один или несколько никирующих ферментов, как описано здесь. В тех случаях, когда необходимо амплифицировать одну мишень, в набор реагентов может быть включено один или два никирующих фермента. В тех случаях, когда необходимо амплифицировать несколько целевых последовательностей, и праймеры, подобранные для этих целевых последовательностей, содержат сайты распознавания никирующего фермента для одного никирующего фермента, в набор реагентов может быть включено один или два никирующих фермента. В тех случаях, когда праймеры распознаются различными никирующими ферментами, в набор реагентов может быть включено больше никирующих ферментов, например, 3 или больше.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к набору реагентов для амплификации нуклеиновых кислот, включающему ДНК-полмеразу; первичный праймер, вторичный праймер, никирующий фермент, который является специфичным по отношению к сайту связывания никирующего фермента в этих праймерах, и дезоксинуклеотид трифосфаты (dNTPs), например, в буферном растворе, содержащем компоненты, необходимые для амплификации. В различных вариантах осуществления изобретения первичный праймер и вторичный праймер каждый имеет 3ʹ-концевую последовательность области специфичного распознавания, комплементарную или в значительной степени комплементарную целевой последовательности, где конец области специфичного распознавания содержит один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида; 5ʹ-концевую область, содержащую сайт связывания никирующего фермента, перед 3ʹ-концевой последовательностью области специфичного распознавания, способную к самодимеризации (например, являющуюся самокомплементарной). В конкретных вариантах осуществления изобретения один или несколько праймеров находятся праймер-димерной конфигурации (например, образуемой путем нагревания примерно до Tm и медленного охлаждения).

Наборы реагентов настоящего изобретения также могут включать один или несколько из компонентов в любом количестве отдельных контейнеров, пакетов, пробирок (например, <0,2 мл, 0,2 мл, 0,6 мл, 1,5 мл, 5,0 мл, >5,0 мл), ампул, микротитрационных планшетов (например, <96-лунок, 96-лунок, 384-лунки, 1536-лунок, >1536-лунок), пластин типа «ArrayTape» и тому подобного, или компоненты могут быт объединены в различных комбинациях в таких контейнерах. В различных вариантах осуществления изобретения набор реагентов дополнительно включает пару праймеров, способных связываться и амплифицировать референсную последовательность. В конкретных вариантах осуществления изобретения набор реагентов включает один или несколько праймеров в праймер-димерной конфигурации (например, образуемой путем нагревания примерно до Tm и медленного охлаждения). В еще других вариантах осуществления изобретения набор реагентов включает стерильный контейнер, который содержит праймеры; такие контейнеры могут представлять собой коробки, ампулы, бутылки, флаконы, пробирки, пакеты, мешочки, блистерные упаковки или другие подходящие формы контейнеров, известные из уровня техники. Такие контейнеры могут быть изготовлены из пластика, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, подходящих для хранения нуклеиновых кислот.

Компоненты набора реагентов могут, например, находиться в одном или нескольких контейнерах, например, все компоненты могут находиться в одном контейнере или, например, ферменты могут находиться в контейнере отдельном от праймеров. Компоненты, например, могут быть высушены (например, в виде порошка) или находиться в стабильном буфере (например, химически стабилизированном, термически стабилизированном). Сухие компоненты могут быть получены, например, путем лиофилизации, вакуумной сушки или сушки центрифугированием и/или сушки в условиях окружающей среды. В различных вариантах осуществления изобретения полимераза и никирующие ферменты находятся в лиофилизированной форме в одном контейнере, а праймеры в лиофилизированном, сублимированном состоянии или в буфере находятся в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимераза, никирующие ферменты и праймеры находятся в лиофилизированной форме в одном контейнере. В других вариантах осуществления изобретения полимераза и никирующий фермент могут находиться в разных контейнерах.

Наборы реагентов могут дополнительно включать , например, dNTPs, используемые в реакции, или модифицированные нуклеотиды, кюветы или другие контейнеры, используемые ля реакции, или флакон воды или буфера для растворения лиофилизированных компонентов. Используемый буфер может, например, быть подходящим как для активности полимеразы, так и для активности никирующего фермента.

Наборы реагентов настоящего изобретения также могут включать инструкции для осуществления одного или нескольких из описанных здесь способов и/или описание одной или нескольких из описанных здесь композиций или реагентов. Инструкции и/или описания могут быть в печатной форме и могут быть включены в набор реагентов в виде вкладыша. Набор реагентов также может включать письменное описание, размещенное на Интернет-сайте, который обеспечивает доступ к таким инструкциям или описаниям.

Наборы реагентов могут дополнительно включать реагенты, используемые в способах обнаружения (например, в реальном времени или по конечной точке), такие как, например, гибридизационные зонды или ДНК-связывающие красители. Наборы реагентов могут дополнительно включать реагенты, используемые в способах обнаружения, такие как, например, реагенты, используемые в методе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), устройства с боковым сдвигом жидкости, тест-полоски, флуоресцентные красители, частиц коллоидного золота, латексные частицы, молекулярный маяк или гранулы полистирола. Компоненты для обнаружения могут быть встроены в устройство с боковым сдвигом жидкости. Устройство с боковым сдвигом жидкости может использоваться в месте предоставления медицинских услуг.

При осуществлении настоящего изобретения используются, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные технологии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах знаний и компетенции специалиста в данной области техники. Такие методы подробно описаны в литературе, такой как «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», second edition (Sambrook, 1989); «Oligonucleotide Synthesis» (Gait, 1984); «Animal Cell Culture» (Freshney, 1987); «Methods in Enzymology» «Handbook of Experimental Immunology» (Weir, 1996); «Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells» (Miller and Calos, 1987); «Current Protocols in Molecular Biology» (Ausubel, 1987); «PCR: The Polymerase Chain Reaction», (Mullis, 1994); «Current Protocols in Immunology» (Coligan, 1991). Эти методики применимы для получения полинуклеотидов и полипептидов настоящего изобретения, и поэтому могут рассматриваться как принимающие участие в создании и практической реализации настоящего изобретения. Особенно подходящие методики для конкретных вариантов осуществления изобретения будут рассмотрены в следующих разделах.

Следующие примеры приводятся для того, чтобы дать среднему специалисту в данной области техники полное раскрытие и описание того как подготовить и применять анализ, скрининг и терапевтические способы настоящего изобретения, и они не предназначены для ограничения объема технического решения, которое авторы считают своим изобретением.

Примеры

Пример 1. Дизайн системы для изотермической амплификации ДНК лектина сои путем определения стабильности связывания праймера с мишенью.

Успешно работающую систему, основанную на изотермической реакции амплификации ДНК, для обнаружения лектина сои создавали, используя только принципы дизайна в соответствии с настоящим изобретением, и не прибегая к экспериментальному тестированию праймеров (Фигура 12).

Целевую последовательность для анализа в гене лектина сои выбирали таким образом, чтобы в ней отсутствовали однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) на участке последовательности длиной 30-60 п.н.

5ʹ-ccaaggttctcattacctatgatgcctccaccagcctcttggttgcttctttggtctacccttcacagagaa-3ʹ

Жирным шрифтом выделены участки последовательности, выбранные для дизайна прямого и обратного праймеров, соответственно.

Для выбора связывающейся с мишенью последовательности прямого праймера (5ʹ-ACCAAAGAAGCAAC-3ʹ), стабильность связывания прямого праймера с мишенью сравнивали со стабильностью самодимера прямого праймера, следующим образом:

ΔG_25°C гибрида прямой праймер-мишень (ГПМ)=-25,99 ккал/моль;

ΔG_25°C самодимера праймер-связывающаяся с мишенью последовательность (СДПСМП)=-3,14 ккал/моль;

ΔΔG_25°C=ΔG_ГМП - ΔG_СДПСМП=-28,85 ккал/моль.

Низкая ΔΔG (≤примерно -16 ккал/моль) указывает на то, что прямой праймер способен отжигаться и инициировать синтез комплементарной цепи целевой молекулы нуклеиновой кислоты.

Для выбора связывающейся с мишенью последовательности обратного праймера (5ʹ-ACCAAAGAAGCAAC-3ʹ), стабильность связывания обратного праймера с мишенью сравнивали со стабильностью самодимера обратного праймера, следующим образом:

Стабильность (ΔG) и относительную стабильность (ΔΔG) связывающейся с мишенью последовательности обратного праймера 5ʹ-ACCAAAGAAGCAAC-3ʹ определяли следующим образом:

ΔG_25°C гибрида обратный праймер-мишень (ГПМ)=-25,35 ккал/моль;

ΔG_25°C самодимера праймер-связывающаяся с мишенью последовательность (СДПСМП)=-3,14 ккал/моль;

ΔΔG_25°C=ΔG_ГМП - ΔG_СДПСМП=-22,21 ккал/моль.

Низкая ΔΔG (≤примерно -16 ккал/моль) указывает на то, что обратный праймер способен отжигаться и инициировать синтез комплементарной цепи целевой молекулы нуклеиновой кислоты.

Реакционные смеси для реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва (50 мкл) содержали 0,3 мМ dNTPs, 0,38 Ед./мл ДНК-полимеразы Bst 2.0 WarmStart (New England Biolabs), 0,15 единиц т Nt.BstNBI (New England Biolabs), 250 нМ прямого праймера, 250 нМ обратного праймера, 200 нМ зонда типа «молекулярный маяк», меченого на 5ʹ-конце меткой CalRed (BioSearch) и на 3ʹ-конце меткой BHQ2 (BioSearch), и геномную ДНК Glycine max (10000) копий. Последовательности праймеров и зонда (синтезированные BioSearch Inc., Novato, CA) были следующими:

Прямой праймер («m»=2ʹ-метокси нуклеотид)

5ʹ-ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTATTACCTATGAmUmGmCmC-3ʹ

Обратный праймер («m»=2ʹ-метокси нуклеотид)

5ʹ-ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTACCAAAGAAmGmCmAmAmC-3ʹ

Зонд типа «молекулярный маяк» («I» обозначает универсальный инозиновый нуклеотид)

5ʹ-CalRed₆₁₀-CGCGCTCCACCAICCTCTTGCGCG-BHQ2-3ʹ

Реакции инкубировали при температуре 56°C в течение приблизительно 10 минут в термоциклере IQ5 (BioRad). Флуоресцентный сигнал фиксировали по каналу ROX (возбуждение: 575 нм; эмиссия: 602 нм). Реакции, содержащие геномную ДНК сои (n=3), имели S-образные кривые (Фигура 13). В отличие от этого, контрольные реакции, не содержащие целевой ДНК (n=3), не давали сигнала. Время начала экспоненциальной фазы амплификации составляло примерно 3 минуты, и время получения максимальной относительной флуоресценции составляло примерно 6 минут. Угловой коэффициент ∅ экспоненциальной фазы амплификации реакций был определен равным 660 ОЕФ/мин.

Пример 2. Дизайн системы для изотермической амплификации ДНК гена invA Salmonella enterica путем определения стабильности связывания праймера с мишенью.

Удобную в использовании систему, основанную на изотермической реакции амплификации ДНК, для обнаружения гена invA Salmonella enterica создавали, используя только принципы дизайна в соответствии с настоящим изобретением, и не прибегая к экспериментальному тестированию праймеров.

Целевую последовательность для анализа в гене invA Salmonella enterica выбирали таким образом, чтобы в ней отсутствовали однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) на участке последовательности длиной 30-60 п.н.

5ʹ- ATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCCAGAGAAAA-3ʹ

Жирным шрифтом выделены участки последовательности, выбранные для дизайна прямого и обратного праймеров, соответственно.

Для выбора связывающейся с мишенью последовательности прямого праймера (5ʹ-ATACTCATCTGTTTACC-3ʹ), стабильность связывания прямого праймера с мишенью сравнивали со стабильностью самодимера прямого праймера, следующим образом:

ΔG_25°C гибрида прямой праймер-мишень (ГПМ)=-26,11 ккал/моль;

ΔG_25°C самодимера праймер-связывающаяся с мишенью последовательность (СДПСМП)=-1,95 ккал/моль;

ΔΔG_25°C=ΔG_ГМП - ΔG_СДПСМП=-24,16 ккал/моль.

Низкая ΔΔG (≤примерно -16 ккал/моль) указывает на то, что прямой праймер способен отжигаться и инициировать синтез комплементарной цепи целевой молекулы нуклеиновой кислоты.

Для выбора связывающейся с мишенью последовательности обратного праймера (5ʹ-TTTTCTCTGGATGG-3ʹ), стабильность связывания обратного праймера с мишенью сравнивали со стабильностью самодимера обратного праймера, следующим образом:

ΔG_25°C гибрида обратный праймер-мишень (ГПМ)=-25,28 ккал/моль;

ΔG_25°C самодимера праймер-связывающаяся с мишенью последовательность (СДПСМП)=-1,57 ккал/моль;

ΔΔG_25°C=ΔG_ГМП - ΔG_СДПСМП=-23,71 ккал/моль.

Низкая ΔΔG (≤примерно -16 ккал/моль) указывает на то, что обратный праймер способен отжигаться и инициировать синтез комплементарной цепи целевой молекулы нуклеиновой кислоты.

Реакционные смеси для реакции амплификации нуклеиновых кислот (26 мкл) содержали 0,3 мМ dNTPs, 0,38 Ед./мл ДНК-полимеразы Bst 2.0 WarmStart (New England Biolabs), 0,15 единиц т Nt.BstNBI (New England Biolabs), 250 нМ прямого праймера, 250 нМ обратного праймера, 300 нМ зонда типа «молекулярный маяк», меченого на 5ʹ-конце меткой CalRed (BioSearch) и на 3ʹ-конце меткой BHQ2 (BioSearch), и геномную ДНК Salmonella (10000) копий. Последовательности праймеров и зонда (синтезированные BioSearch Inc., Novato, CA) были следующими:

Прямой праймер 1 («m»=2ʹ-метокси нуклеотид)

5ʹ- GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCATACTCATCTGmUmUmUmAmCmC-3ʹ

Прямой праймер 2 («m»=2ʹ-метокси нуклеотид)

5ʹ- GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCATACTCATCTGTmUmUmAmCmC-3ʹ

Обратный праймер («m»=2ʹ-метокси нуклеотид)

5ʹ- GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCTTTTCTCTGmGmAmUmGmG-3ʹ

Зонд типа «молекулярный маяк» («I» обозначает универсальный инозиновый нуклеотид)

5ʹ-CalRed₆₁₀- ACCTGTTTACCGGGCATACAAACAGGT-BHQ2-3ʹ

Реакции инкубировали при температуре 56°C в течение приблизительно 10 минут в термоциклере IQ5 (BioRad). Флуоресцентный сигнал фиксировали по каналу ROX (возбуждение: 575 нм; эмиссия: 602 нм). Реакции, содержащие геномную ДНК Salmonella (n=3), имели S-образные кривые (Фигура 15). В отличие от этого, контрольные реакции, не содержащие целевой ДНК (n=3), не давали сигнала. Время начала экспоненциальной фазы амплификации составляло примерно 3 минуты, и время получения максимальной относительной флуоресценции составляло примерно 6 минут. Угловой коэффициент ∅ экспоненциальной фазы амплификации реакций был определен равным 660 ОЕФ/мин.

Результаты эксперимента по оптимизации приведены на Фигурах 16A и 16B.

Пример 3. Определение ΔΔG как относительного термодинамического параметра, коррелирующего с рабочими характеристиками взятых в качестве кандидатов наборов праймер/зонд, дизайн которых был осуществлен для изотермических реакций амплификации. Определение пороговых значений для прогнозирования работоспособности или неработоспособности праймерных олигонуклеотидов в наборе праймер/зонд, дизайн которых был осуществлен in silico.

Набор из 34 олигонуклеотидных праймеров, содержащих в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу самокомплементарную первую область (5ʹ-конец с распознаваемой никирующим ферментом последовательностью) и вторую область комплементарную целевой последовательности, анализировали по нескольким параметрам, обычно используемым для в алгоритмах дизайна праймеров, таким как температура плавления (Tm) гибридного дуплекса, % содержания GC, длина последовательности и ΔG. Все параметры определяли отдельно для первой и второй областей праймера, соответственно. 25 праймеров принадлежало обладали подтвержденной функциональностью в изотермическом анализе с набором реагентов DNAble®. 9 праймеров принадлежали к взятым в качестве кандидатов наборам праймер/зонд, которые оказались неспособны синтезировать обнаруживаемый при помощи зонда продукт амплификации в экспериментах по скринингу.

Ряд двухмерных матричных графиков (Фигуры 17A-17H) получали с использованием различных комбинаций дизайна праймеров для осей X и Y, соответственно, с целью идентифицировать комбинации параметров, при которых точки данных неработоспособных праймеров будут кластеризоваться отдельно от точек данных функциональных праймеров. Как показано на Фигурах 17B-17H, ни одна из комбинаций стандартных параметров дизайна, используемых в известном уровне техники для дизайна праймеров (Tm, ΔG, %GC, длина последовательности в основаниях) не обеспечивала четкого разделения функциональных и нефункциональных праймеров на двухмерном матричном графике. Точки данных обеих групп праймеров широко перекрывались на этих графиках, как это ожидалось, исходя из широкого перекрывания диапазонов значений стандартных параметров у функциональных и нефункциональных олигонуклеотидных праймеров.

Неожиданно было обнаружено, что только новый относительный термодинамический параметр ΔΔG, определенный авторами настоящего изобретения, обеспечивал получение матрицы на которой точки данных функциональных и нефункциональных праймеров кластеризировались раздельно в соответствии с результатами экспериментов по скринингу наборов праймеров. График на Фигуре 17A представляет собой матрицу, где по оси X показана шкала для нанесения значений ΔΔG самокомплементарной первой области праймера, а по оси Y показана шкала для нанесения значений ΔΔG комплементарной мишени второй области праймера, соответственно. Все неработоспособные праймеры обладали значениями ΔΔG или для дуплекса вторая область/мишень (в большинстве случаев) или для дуплекса самокомплементарной первой области (в одном случае), которые были меньше, чем -15 ккал/моль. Таким образом, значение ΔΔG примерно -15 ккал/моль представляет собой эксперментальный порог для этого набора данных для олигонуклеотидных праймеров, который отделяет функциональные праймеры от нефункциональных.

ΔΔG представляет собой относительный параметр, который измеряет различие, т.е. относительное преимущество, термодинамичской выгодности образования желательной олигонуклеотидной струкутры (специфичного гибрида праймер/мишень и самодимера первой области), по сравнению с выгодностью образования множества спрогнозированных альтернативных структур при комнатной температуре и атмосферном давлении в динамическом равновесии. Неожиданно было обнаружено, что это преимущество ΔG (ΔΔG) является предиктивным параметром успешности анализа при дизайне кандидатов в праймерные олигонуклеотиды in silico. Применение расчетных значений ΔΔG в качестве балльной оценки и предиктора функциональной изотермической реакции было сведено до обычной процедуры в следующих примерах, описывающих дизайн и испытание изотермических реакций с набором реагентов DNAble® для обнаружения гена лектина сои и гена invA Salmonella enterica. Впервые скрининг кандидатов в праймеры и зонды был осуществлен исключительно in silico с использование расчетных значений ΔΔG. В каждом случае только один набор праймер/зонд был выбран и проверен экспериментально. Два функциональных анализа были проведены в первом испытании без затрат времени и дорогостоящего скрининга большого количества наборов кандидатов в праймеры и зонды.

Другие варианты осуществления изобретения

Из приведенного выше описания, будет очевидно, что описанное здесь изобретение может иметь варианты и модификации которые сделают его применимым в различных практических случаях и условиях. Такие варианты осуществления также входят в объем нижеследующей формулы изобретения.

Перечисление здесь списка элементов в любом определении переменной включает определения этой переменной в качестве любого одного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Упоминание здесь варианта осуществления изобретения включает этот вариант осуществления изобретения в качестве одного варианта осуществления изобретения или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления изобретения или их частями.

Эта заявка может быть родственной Международной патентной заявке No.PCT/US2013/035750, поданной 9 апреля 2013, которая заявляет приоритет и преимущество предварительной заявки на Патент США No.61/621975, поданной 9 апреля 2012, полное содержание которых включено в настоящее изобретение путем ссылки.

Эта заявка может быть родственной Международной патентной заявке No.PCT/US2011/047049, поданной 9 августа 2011, которая заявляет приоритет и преимущество предварительной заявки на Патент США No.61/373695, поданной 13 августа 2010, полное содержание которых включено в настоящее изобретение путем ссылки.

Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании, включены в него путем ссылки в той же степени, как если бы каждый независимый патент и публикация была конкретно и отдельно указана для включения в данное описание путем ссылки.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Envirologix, Inc.

Peters, Lars

Judice, Stephen A.

Shaffer, Daniel

Parker, Breck

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК

<130> 049224-1010WO1(00023)

<150> US 61/982,784

<151> 2014-04-22

<160> 15240

<170> Патентная версия 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 1

nnnngactcc gatcggagtc nnnn 24

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 2

ggcggactcc gatcggagtc cgcc 24

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 3

agcggactcc gatcggagtc cgct 24

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 4

gacggactcc gatcggagtc cgtc 24

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 5

ggaggactcc gatcggagtc ctcc 24

<210> 6

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 6

ggcagactcc gatcggagtc tgcc 24

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 7

tgcggactcc gatcggagtc cgca 24

<210> 8

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 8

gtcggactcc gatcggagtc cgac 24

<210> 9

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 9

ggtggactcc gatcggagtc cacc 24

<210> 10

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 10

ggctgactcc gatcggagtc agcc 24

<210> 11

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 11

gcccgactcc gatcggagtc gggc 24

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 12

acccgactcc gatcggagtc gggt 24

<210> 13

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 13

gaccgactcc gatcggagtc ggtc 24

<210> 14

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 14

gcacgactcc gatcggagtc gtgc 24

<210> 15

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 15

gccagactcc gatcggagtc tggc 24

<210> 16

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 16

tcccgactcc gatcggagtc ggga 24

<210> 17

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 17

gtccgactcc gatcggagtc ggac 24

<210> 18

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 18

gcctgactcc gatcggagtc aggc 24

<210> 19

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 19

gggcgactcc gatcggagtc gccc 24

<210> 20

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 20

aggcgactcc gatcggagtc gcct 24

<210> 21

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 21

gagcgactcc gatcggagtc gctc 24

<210> 22

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 22

ggacgactcc gatcggagtc gtcc 24

<210> 23

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 23

gggagactcc gatcggagtc tccc 24

<210> 24

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 24

tggcgactcc gatcggagtc gcca 24

<210> 25

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 25

gtgcgactcc gatcggagtc gcac 24

<210> 26

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 26

gggtgactcc gatcggagtc accc 24

<210> 27

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 27

acgggactcc gatcggagtc ccgt 24

<210> 28

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 28

cagggactcc gatcggagtc cctg 24

<210> 29

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 29

ccaggactcc gatcggagtc ctgg 24

<210> 30

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 30

ccgagactcc gatcggagtc tcgg 24

<210> 31

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 31

tcgggactcc gatcggagtc ccga 24

<210> 32

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 32

ctgggactcc gatcggagtc ccag 24

<210> 33

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 33

cctggactcc gatcggagtc cagg 24

<210> 34

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 34

ccgtgactcc gatcggagtc acgg 24

<210> 35

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 35

cggcgactcc gatcggagtc gccg 24

<210> 36

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 36

cagcgactcc gatcggagtc gctg 24

<210> 37

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 37

cgacgactcc gatcggagtc gtcg 24

<210> 38

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 38

cggagactcc gatcggagtc tccg 24

<210> 39

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 39

ctgcgactcc gatcggagtc gcag 24

<210> 40

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 40

cggtgactcc gatcggagtc accg 24

<210> 41

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 41

cacggactcc gatcggagtc cgtg 24

<210> 42

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 42

cccagactcc gatcggagtc tggg 24

<210> 43

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 43

ctcggactcc gatcggagtc cgag 24

<210> 44

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 44

ccctgactcc gatcggagtc aggg 24

<210> 45

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 45

ccacgactcc gatcggagtc gtgg 24

<210> 46

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 46

agccgactcc gatcggagtc ggct 24

<210> 47

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 47

tgccgactcc gatcggagtc ggca 24

<210> 48

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 48

gcgagactcc gatcggagtc tcgc 24

<210> 49

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 49

gcgtgactcc gatcggagtc acgc 24

<210> 50

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 50

gcaggactcc gatcggagtc ctgc 24

<210> 51

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 51

gctggactcc gatcggagtc cagc 24

<210> 52

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 52

cgaggactcc gatcggagtc ctcg 24

<210> 53

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 53

cgtggactcc gatcggagtc cacg 24

<210> 54

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 54

caccgactcc gatcggagtc ggtg 24

<210> 55

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 55

ctccgactcc gatcggagtc ggag 24

<210> 56

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 56

gcgggactcc gatcggagtc ccgc 24

<210> 57

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 57

gagggactcc gatcggagtc cctc 24

<210> 58

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 58

gtgggactcc gatcggagtc ccac 24

<210> 59

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 59

nnnngactcc gtacggagtc nnnn 24

<210> 60

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 60

ggcggactcc gtacggagtc cgcc 24

<210> 61

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 61

agcggactcc gtacggagtc cgct 24

<210> 62

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 62

gacggactcc gtacggagtc cgtc 24

<210> 63

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 63

ggaggactcc gtacggagtc ctcc 24

<210> 64

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 64

ggcagactcc gtacggagtc tgcc 24

<210> 65

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 65

tgcggactcc gtacggagtc cgca 24

<210> 66

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 66

gtcggactcc gtacggagtc cgac 24

<210> 67

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 67

ggtggactcc gtacggagtc cacc 24

<210> 68

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 68

ggctgactcc gtacggagtc agcc 24

<210> 69

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 69

gcccgactcc gtacggagtc gggc 24

<210> 70

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 70

acccgactcc gtacggagtc gggt 24

<210> 71

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 71

gaccgactcc gtacggagtc ggtc 24

<210> 72

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 72

gcacgactcc gtacggagtc gtgc 24

<210> 73

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 73

gccagactcc gtacggagtc tggc 24

<210> 74

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 74

tcccgactcc gtacggagtc ggga 24

<210> 75

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 75

gtccgactcc gtacggagtc ggac 24

<210> 76

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 76

gcctgactcc gtacggagtc aggc 24

<210> 77

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 77

gggcgactcc gtacggagtc gccc 24

<210> 78

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 78

aggcgactcc gtacggagtc gcct 24

<210> 79

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 79

gagcgactcc gtacggagtc gctc 24

<210> 80

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 80

ggacgactcc gtacggagtc gtcc 24

<210> 81

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 81

gggagactcc gtacggagtc tccc 24

<210> 82

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 82

tggcgactcc gtacggagtc gcca 24

<210> 83

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 83

gtgcgactcc gtacggagtc gcac 24

<210> 84

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 84

gggtgactcc gtacggagtc accc 24

<210> 85

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 85

acgggactcc gtacggagtc ccgt 24

<210> 86

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 86

cagggactcc gtacggagtc cctg 24

<210> 87

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 87

ccaggactcc gtacggagtc ctgg 24

<210> 88

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 88

ccgagactcc gtacggagtc tcgg 24

<210> 89

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 89

tcgggactcc gtacggagtc ccga 24

<210> 90

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 90

ctgggactcc gtacggagtc ccag 24

<210> 91

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 91

cctggactcc gtacggagtc cagg 24

<210> 92

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 92

ccgtgactcc gtacggagtc acgg 24

<210> 93

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 93

cggcgactcc gtacggagtc gccg 24

<210> 94

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 94

cagcgactcc gtacggagtc gctg 24

<210> 95

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 95

cgacgactcc gtacggagtc gtcg 24

<210> 96

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 96

cggagactcc gtacggagtc tccg 24

<210> 97

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 97

ctgcgactcc gtacggagtc gcag 24

<210> 98

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 98

cggtgactcc gtacggagtc accg 24

<210> 99

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 99

cacggactcc gtacggagtc cgtg 24

<210> 100

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 100

cccagactcc gtacggagtc tggg 24

<210> 101

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 101

ctcggactcc gtacggagtc cgag 24

<210> 102

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 102

ccctgactcc gtacggagtc aggg 24

<210> 103

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 103

ccacgactcc gtacggagtc gtgg 24

<210> 104

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 104

agccgactcc gtacggagtc ggct 24

<210> 105

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 105

tgccgactcc gtacggagtc ggca 24

<210> 106

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 106

gcgagactcc gtacggagtc tcgc 24

<210> 107

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 107

gcgtgactcc gtacggagtc acgc 24

<210> 108

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 108

gcaggactcc gtacggagtc ctgc 24

<210> 109

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 109

gctggactcc gtacggagtc cagc 24

<210> 110

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 110

cgaggactcc gtacggagtc ctcg 24

<210> 111

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 111

cgtggactcc gtacggagtc cacg 24

<210> 112

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 112

caccgactcc gtacggagtc ggtg 24

<210> 113

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 113

ctccgactcc gtacggagtc ggag 24

<210> 114

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 114

gcgggactcc gtacggagtc ccgc 24

<210> 115

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 115

gagggactcc gtacggagtc cctc 24

<210> 116

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 116

gtgggactcc gtacggagtc ccac 24

<210> 117

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 117

nnnngactcc ggccggagtc nnnn 24

<210> 118

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 118

ggcggactcc ggccggagtc cgcc 24

<210> 119

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 119

agcggactcc ggccggagtc cgct 24

<210> 120

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 120

gacggactcc ggccggagtc cgtc 24

<210> 121

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 121

ggaggactcc ggccggagtc ctcc 24

<210> 122

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 122

ggcagactcc ggccggagtc tgcc 24

<210> 123

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 123

tgcggactcc ggccggagtc cgca 24

<210> 124

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 124

gtcggactcc ggccggagtc cgac 24

<210> 125

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 125

ggtggactcc ggccggagtc cacc 24

<210> 126

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 126

ggctgactcc ggccggagtc agcc 24

<210> 127

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 127

gcccgactcc ggccggagtc gggc 24

<210> 128

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 128

acccgactcc ggccggagtc gggt 24

<210> 129

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 129

gaccgactcc ggccggagtc ggtc 24

<210> 130

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 130

gcacgactcc ggccggagtc gtgc 24

<210> 131

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 131

gccagactcc ggccggagtc tggc 24

<210> 132

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 132

tcccgactcc ggccggagtc ggga 24

<210> 133

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 133

gtccgactcc ggccggagtc ggac 24

<210> 134

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 134

gcctgactcc ggccggagtc aggc 24

<210> 135

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 135

gggcgactcc ggccggagtc gccc 24

<210> 136

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 136

aggcgactcc ggccggagtc gcct 24

<210> 137

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 137

gagcgactcc ggccggagtc gctc 24

<210> 138

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 138

ggacgactcc ggccggagtc gtcc 24

<210> 139

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 139

gggagactcc ggccggagtc tccc 24

<210> 140

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 140

tggcgactcc ggccggagtc gcca 24

<210> 141

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 141

gtgcgactcc ggccggagtc gcac 24

<210> 142

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 142

gggtgactcc ggccggagtc accc 24

<210> 143

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 143

acgggactcc ggccggagtc ccgt 24

<210> 144

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 144

cagggactcc ggccggagtc cctg 24

<210> 145

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 145

ccaggactcc ggccggagtc ctgg 24

<210> 146

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 146

ccgagactcc ggccggagtc tcgg 24

<210> 147

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 147

tcgggactcc ggccggagtc ccga 24

<210> 148

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 148

ctgggactcc ggccggagtc ccag 24

<210> 149

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 149

cctggactcc ggccggagtc cagg 24

<210> 150

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 150

ccgtgactcc ggccggagtc acgg 24

<210> 151

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 151

cggcgactcc ggccggagtc gccg 24

<210> 152

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 152

cagcgactcc ggccggagtc gctg 24

<210> 153

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 153

cgacgactcc ggccggagtc gtcg 24

<210> 154

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 154

cggagactcc ggccggagtc tccg 24

<210> 155

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 155

ctgcgactcc ggccggagtc gcag 24

<210> 156

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 156

cggtgactcc ggccggagtc accg 24

<210> 157

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 157

cacggactcc ggccggagtc cgtg 24

<210> 158

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 158

cccagactcc ggccggagtc tggg 24

<210> 159

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 159

ctcggactcc ggccggagtc cgag 24

<210> 160

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 160

ccctgactcc ggccggagtc aggg 24

<210> 161

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 161

ccacgactcc ggccggagtc gtgg 24

<210> 162

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 162

agccgactcc ggccggagtc ggct 24

<210> 163

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 163

tgccgactcc ggccggagtc ggca 24

<210> 164

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 164

gcgagactcc ggccggagtc tcgc 24

<210> 165

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 165

gcgtgactcc ggccggagtc acgc 24

<210> 166

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 166

gcaggactcc ggccggagtc ctgc 24

<210> 167

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 167

gctggactcc ggccggagtc cagc 24

<210> 168

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 168

cgaggactcc ggccggagtc ctcg 24

<210> 169

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 169

cgtggactcc ggccggagtc cacg 24

<210> 170

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 170

caccgactcc ggccggagtc ggtg 24

<210> 171

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 171

ctccgactcc ggccggagtc ggag 24

<210> 172

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 172

gcgggactcc ggccggagtc ccgc 24

<210> 173

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 173

gagggactcc ggccggagtc cctc 24

<210> 174

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 174

gtgggactcc ggccggagtc ccac 24

<210> 175

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 175

nnnngactcc gcgcggagtc nnnn 24

<210> 176

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 176

ggcggactcc gcgcggagtc cgcc 24

<210> 177

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 177

agcggactcc gcgcggagtc cgct 24

<210> 178

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 178

gacggactcc gcgcggagtc cgtc 24

<210> 179

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 179

ggaggactcc gcgcggagtc ctcc 24

<210> 180

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 180

ggcagactcc gcgcggagtc tgcc 24

<210> 181

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 181

tgcggactcc gcgcggagtc cgca 24

<210> 182

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 182

gtcggactcc gcgcggagtc cgac 24

<210> 183

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 183

ggtggactcc gcgcggagtc cacc 24

<210> 184

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 184

ggctgactcc gcgcggagtc agcc 24

<210> 185

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 185

gcccgactcc gcgcggagtc gggc 24

<210> 186

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 186

acccgactcc gcgcggagtc gggt 24

<210> 187

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 187

gaccgactcc gcgcggagtc ggtc 24

<210> 188

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 188

gcacgactcc gcgcggagtc gtgc 24

<210> 189

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 189

gccagactcc gcgcggagtc tggc 24

<210> 190

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 190

tcccgactcc gcgcggagtc ggga 24

<210> 191

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 191

gtccgactcc gcgcggagtc ggac 24

<210> 192

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 192

gcctgactcc gcgcggagtc aggc 24

<210> 193

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 193

gggcgactcc gcgcggagtc gccc 24

<210> 194

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 194

aggcgactcc gcgcggagtc gcct 24

<210> 195

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 195

gagcgactcc gcgcggagtc gctc 24

<210> 196

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 196

ggacgactcc gcgcggagtc gtcc 24

<210> 197

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 197

gggagactcc gcgcggagtc tccc 24

<210> 198

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 198

tggcgactcc gcgcggagtc gcca 24

<210> 199

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 199

gtgcgactcc gcgcggagtc gcac 24

<210> 200

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 200

gggtgactcc gcgcggagtc accc 24

<210> 201

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 201

acgggactcc gcgcggagtc ccgt 24

<210> 202

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 202

cagggactcc gcgcggagtc cctg 24

<210> 203

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 203

ccaggactcc gcgcggagtc ctgg 24

<210> 204

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 204

ccgagactcc gcgcggagtc tcgg 24

<210> 205

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 205

tcgggactcc gcgcggagtc ccga 24

<210> 206

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 206

ctgggactcc gcgcggagtc ccag 24

<210> 207

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 207

cctggactcc gcgcggagtc cagg 24

<210> 208

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 208

ccgtgactcc gcgcggagtc acgg 24

<210> 209

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 209

cggcgactcc gcgcggagtc gccg 24

<210> 210

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 210

cagcgactcc gcgcggagtc gctg 24

<210> 211

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 211

cgacgactcc gcgcggagtc gtcg 24

<210> 212

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 212

cggagactcc gcgcggagtc tccg 24

<210> 213

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 213

ctgcgactcc gcgcggagtc gcag 24

<210> 214

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 214

cggtgactcc gcgcggagtc accg 24

<210> 215

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 215

cacggactcc gcgcggagtc cgtg 24

<210> 216

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 216

cccagactcc gcgcggagtc tggg 24

<210> 217

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 217

ctcggactcc gcgcggagtc cgag 24

<210> 218

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 218

ccctgactcc gcgcggagtc aggg 24

<210> 219

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 219

ccacgactcc gcgcggagtc gtgg 24

<210> 220

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 220

agccgactcc gcgcggagtc ggct 24

<210> 221

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 221

tgccgactcc gcgcggagtc ggca 24

<210> 222

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 222

gcgagactcc gcgcggagtc tcgc 24

<210> 223

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 223

gcgtgactcc gcgcggagtc acgc 24

<210> 224

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 224

gcaggactcc gcgcggagtc ctgc 24

<210> 225

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 225

gctggactcc gcgcggagtc cagc 24

<210> 226

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 226

cgaggactcc gcgcggagtc ctcg 24

<210> 227

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 227

cgtggactcc gcgcggagtc cacg 24

<210> 228

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 228

caccgactcc gcgcggagtc ggtg 24

<210> 229

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 229

ctccgactcc gcgcggagtc ggag 24

<210> 230

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 230

gcgggactcc gcgcggagtc ccgc 24

<210> 231

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 231

gagggactcc gcgcggagtc cctc 24

<210> 232

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 232

gtgggactcc gcgcggagtc ccac 24

<210> 233

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 233

nnnngactct gatcagagtc nnnn 24

<210> 234

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 234

ggcggactct gatcagagtc cgcc 24

<210> 235

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 235

agcggactct gatcagagtc cgct 24

<210> 236

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 236

gacggactct gatcagagtc cgtc 24

<210> 237

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 237

ggaggactct gatcagagtc ctcc 24

<210> 238

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 238

ggcagactct gatcagagtc tgcc 24

<210> 239

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 239

tgcggactct gatcagagtc cgca 24

<210> 240

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 240

gtcggactct gatcagagtc cgac 24

<210> 241

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 241

ggtggactct gatcagagtc cacc 24

<210> 242

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 242

ggctgactct gatcagagtc agcc 24

<210> 243

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 243

gcccgactct gatcagagtc gggc 24

<210> 244

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 244

acccgactct gatcagagtc gggt 24

<210> 245

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 245

gaccgactct gatcagagtc ggtc 24

<210> 246

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 246

gcacgactct gatcagagtc gtgc 24

<210> 247

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 247

gccagactct gatcagagtc tggc 24

<210> 248

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 248

tcccgactct gatcagagtc ggga 24

<210> 249

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 249

gtccgactct gatcagagtc ggac 24

<210> 250

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 250

gcctgactct gatcagagtc aggc 24

<210> 251

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 251

gggcgactct gatcagagtc gccc 24

<210> 252

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 252

aggcgactct gatcagagtc gcct 24

<210> 253

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 253

gagcgactct gatcagagtc gctc 24

<210> 254

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 254

ggacgactct gatcagagtc gtcc 24

<210> 255

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 255

gggagactct gatcagagtc tccc 24

<210> 256

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 256

tggcgactct gatcagagtc gcca 24

<210> 257

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 257

gtgcgactct gatcagagtc gcac 24

<210> 258

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 258

gggtgactct gatcagagtc accc 24

<210> 259

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 259

acgggactct gatcagagtc ccgt 24

<210> 260

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 260

cagggactct gatcagagtc cctg 24

<210> 261

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 261

ccaggactct gatcagagtc ctgg 24

<210> 262

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 262

ccgagactct gatcagagtc tcgg 24

<210> 263

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 263

tcgggactct gatcagagtc ccga 24

<210> 264

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 264

ctgggactct gatcagagtc ccag 24

<210> 265

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 265

cctggactct gatcagagtc cagg 24

<210> 266

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 266

ccgtgactct gatcagagtc acgg 24

<210> 267

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 267

cggcgactct gatcagagtc gccg 24

<210> 268

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 268

cagcgactct gatcagagtc gctg 24

<210> 269

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 269

cgacgactct gatcagagtc gtcg 24

<210> 270

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 270

cggagactct gatcagagtc tccg 24

<210> 271

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 271

ctgcgactct gatcagagtc gcag 24

<210> 272

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 272

cggtgactct gatcagagtc accg 24

<210> 273

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 273

cacggactct gatcagagtc cgtg 24

<210> 274

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 274

cccagactct gatcagagtc tggg 24

<210> 275

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 275

ctcggactct gatcagagtc cgag 24

<210> 276

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 276

ccctgactct gatcagagtc aggg 24

<210> 277

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 277

ccacgactct gatcagagtc gtgg 24

<210> 278

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 278

agccgactct gatcagagtc ggct 24

<210> 279

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 279

tgccgactct gatcagagtc ggca 24

<210> 280

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 280

gcgagactct gatcagagtc tcgc 24

<210> 281

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 281

gcgtgactct gatcagagtc acgc 24

<210> 282

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 282

gcaggactct gatcagagtc ctgc 24

<210> 283

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 283

gctggactct gatcagagtc cagc 24

<210> 284

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 284

cgaggactct gatcagagtc ctcg 24

<210> 285

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 285

cgtggactct gatcagagtc cacg 24

<210> 286

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 286

caccgactct gatcagagtc ggtg 24

<210> 287

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 287

ctccgactct gatcagagtc ggag 24

<210> 288

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 288

gcgggactct gatcagagtc ccgc 24

<210> 289

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 289

gagggactct gatcagagtc cctc 24

<210> 290

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 290

gtgggactct gatcagagtc ccac 24

<210> 291

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 291

nnnngactct gtacagagtc nnnn 24

<210> 292

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 292

ggcggactct gtacagagtc cgcc 24

<210> 293

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 293

agcggactct gtacagagtc cgct 24

<210> 294

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 294

gacggactct gtacagagtc cgtc 24

<210> 295

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 295

ggaggactct gtacagagtc ctcc 24

<210> 296

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 296

ggcagactct gtacagagtc tgcc 24

<210> 297

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 297

tgcggactct gtacagagtc cgca 24

<210> 298

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 298

gtcggactct gtacagagtc cgac 24

<210> 299

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 299

ggtggactct gtacagagtc cacc 24

<210> 300

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 300

ggctgactct gtacagagtc agcc 24

<210> 301

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 301

gcccgactct gtacagagtc gggc 24

<210> 302

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 302

acccgactct gtacagagtc gggt 24

<210> 303

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 303

gaccgactct gtacagagtc ggtc 24

<210> 304

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 304

gcacgactct gtacagagtc gtgc 24

<210> 305

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 305

gccagactct gtacagagtc tggc 24

<210> 306

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 306

tcccgactct gtacagagtc ggga 24

<210> 307

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 307

gtccgactct gtacagagtc ggac 24

<210> 308

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 308

gcctgactct gtacagagtc aggc 24

<210> 309

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 309

gggcgactct gtacagagtc gccc 24

<210> 310

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 310

aggcgactct gtacagagtc gcct 24

<210> 311

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 311

gagcgactct gtacagagtc gctc 24

<210> 312

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 312

ggacgactct gtacagagtc gtcc 24

<210> 313

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 313

gggagactct gtacagagtc tccc 24

<210> 314

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 314

tggcgactct gtacagagtc gcca 24

<210> 315

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 315

gtgcgactct gtacagagtc gcac 24

<210> 316

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 316

gggtgactct gtacagagtc accc 24

<210> 317

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 317

acgggactct gtacagagtc ccgt 24

<210> 318

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 318

cagggactct gtacagagtc cctg 24

<210> 319

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 319

ccaggactct gtacagagtc ctgg 24

<210> 320

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 320

ccgagactct gtacagagtc tcgg 24

<210> 321

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 321

tcgggactct gtacagagtc ccga 24

<210> 322

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 322

ctgggactct gtacagagtc ccag 24

<210> 323

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 323

cctggactct gtacagagtc cagg 24

<210> 324

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 324

ccgtgactct gtacagagtc acgg 24

<210> 325

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 325

cggcgactct gtacagagtc gccg 24

<210> 326

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 326

cagcgactct gtacagagtc gctg 24

<210> 327

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 327

cgacgactct gtacagagtc gtcg 24

<210> 328

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 328

cggagactct gtacagagtc tccg 24

<210> 329

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 329

ctgcgactct gtacagagtc gcag 24

<210> 330

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 330

cggtgactct gtacagagtc accg 24

<210> 331

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 331

cacggactct gtacagagtc cgtg 24

<210> 332

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 332

cccagactct gtacagagtc tggg 24

<210> 333

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 333

ctcggactct gtacagagtc cgag 24

<210> 334

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 334

ccctgactct gtacagagtc aggg 24

<210> 335

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 335

ccacgactct gtacagagtc gtgg 24

<210> 336

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 336

agccgactct gtacagagtc ggct 24

<210> 337

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 337

tgccgactct gtacagagtc ggca 24

<210> 338

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 338

gcgagactct gtacagagtc tcgc 24

<210> 339

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 339

gcgtgactct gtacagagtc acgc 24

<210> 340

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 340

gcaggactct gtacagagtc ctgc 24

<210> 341

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 341

gctggactct gtacagagtc cagc 24

<210> 342

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 342

cgaggactct gtacagagtc ctcg 24

<210> 343

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 343

cgtggactct gtacagagtc cacg 24

<210> 344

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 344

caccgactct gtacagagtc ggtg 24

<210> 345

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 345

ctccgactct gtacagagtc ggag 24

<210> 346

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 346

gcgggactct gtacagagtc ccgc 24

<210> 347

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 347

gagggactct gtacagagtc cctc 24

<210> 348

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 348

gtgggactct gtacagagtc ccac 24

<210> 349

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 349

nnnngactct ggccagagtc nnnn 24

<210> 350

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 350

ggcggactct ggccagagtc cgcc 24

<210> 351

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 351

agcggactct ggccagagtc cgct 24

<210> 352

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 352

gacggactct ggccagagtc cgtc 24

<210> 353

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 353

ggaggactct ggccagagtc ctcc 24

<210> 354

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 354

ggcagactct ggccagagtc tgcc 24

<210> 355

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 355

tgcggactct ggccagagtc cgca 24

<210> 356

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 356

gtcggactct ggccagagtc cgac 24

<210> 357

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 357

ggtggactct ggccagagtc cacc 24

<210> 358

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 358

ggctgactct ggccagagtc agcc 24

<210> 359

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 359

gcccgactct ggccagagtc gggc 24

<210> 360

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 360

acccgactct ggccagagtc gggt 24

<210> 361

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 361

gaccgactct ggccagagtc ggtc 24

<210> 362

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 362

gcacgactct ggccagagtc gtgc 24

<210> 363

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 363

gccagactct ggccagagtc tggc 24

<210> 364

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 364

tcccgactct ggccagagtc ggga 24

<210> 365

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 365

gtccgactct ggccagagtc ggac 24

<210> 366

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 366

gcctgactct ggccagagtc aggc 24

<210> 367

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 367

gggcgactct ggccagagtc gccc 24

<210> 368

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 368

aggcgactct ggccagagtc gcct 24

<210> 369

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 369

gagcgactct ggccagagtc gctc 24

<210> 370

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 370

ggacgactct ggccagagtc gtcc 24

<210> 371

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 371

gggagactct ggccagagtc tccc 24

<210> 372

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 372

tggcgactct ggccagagtc gcca 24

<210> 373

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 373

gtgcgactct ggccagagtc gcac 24

<210> 374

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 374

gggtgactct ggccagagtc accc 24

<210> 375

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 375

acgggactct ggccagagtc ccgt 24

<210> 376

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 376

cagggactct ggccagagtc cctg 24

<210> 377

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 377

ccaggactct ggccagagtc ctgg 24

<210> 378

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 378

ccgagactct ggccagagtc tcgg 24

<210> 379

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 379

tcgggactct ggccagagtc ccga 24

<210> 380

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 380

ctgggactct ggccagagtc ccag 24

<210> 381

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 381

cctggactct ggccagagtc cagg 24

<210> 382

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 382

ccgtgactct ggccagagtc acgg 24

<210> 383

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 383

cggcgactct ggccagagtc gccg 24

<210> 384

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 384

cagcgactct ggccagagtc gctg 24

<210> 385

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 385

cgacgactct ggccagagtc gtcg 24

<210> 386

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 386

cggagactct ggccagagtc tccg 24

<210> 387

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 387

ctgcgactct ggccagagtc gcag 24

<210> 388

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 388

cggtgactct ggccagagtc accg 24

<210> 389

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 389

cacggactct ggccagagtc cgtg 24

<210> 390

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 390

cccagactct ggccagagtc tggg 24

<210> 391

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 391

ctcggactct ggccagagtc cgag 24

<210> 392

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 392

ccctgactct ggccagagtc aggg 24

<210> 393

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 393

ccacgactct ggccagagtc gtgg 24

<210> 394

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 394

agccgactct ggccagagtc ggct 24

<210> 395

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 395

tgccgactct ggccagagtc ggca 24

<210> 396

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 396

gcgagactct ggccagagtc tcgc 24

<210> 397

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 397

gcgtgactct ggccagagtc acgc 24

<210> 398

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 398

gcaggactct ggccagagtc ctgc 24

<210> 399

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 399

gctggactct ggccagagtc cagc 24

<210> 400

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 400

cgaggactct ggccagagtc ctcg 24

<210> 401

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 401

cgtggactct ggccagagtc cacg 24

<210> 402

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 402

caccgactct ggccagagtc ggtg 24

<210> 403

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 403

ctccgactct ggccagagtc ggag 24

<210> 404

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 404

gcgggactct ggccagagtc ccgc 24

<210> 405

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 405

gagggactct ggccagagtc cctc 24

<210> 406

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 406

gtgggactct ggccagagtc ccac 24

<210> 407

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 407

nnnngactct gcgcagagtc nnnn 24

<210> 408

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 408

ggcggactct gcgcagagtc cgcc 24

<210> 409

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 409

agcggactct gcgcagagtc cgct 24

<210> 410

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 410

gacggactct gcgcagagtc cgtc 24

<210> 411

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 411

ggaggactct gcgcagagtc ctcc 24

<210> 412

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 412

ggcagactct gcgcagagtc tgcc 24

<210> 413

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 413

tgcggactct gcgcagagtc cgca 24

<210> 414

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 414

gtcggactct gcgcagagtc cgac 24

<210> 415

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 415

ggtggactct gcgcagagtc cacc 24

<210> 416

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 416

ggctgactct gcgcagagtc agcc 24

<210> 417

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 417

gcccgactct gcgcagagtc gggc 24

<210> 418

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 418

acccgactct gcgcagagtc gggt 24

<210> 419

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 419

gaccgactct gcgcagagtc ggtc 24

<210> 420

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 420

gcacgactct gcgcagagtc gtgc 24

<210> 421

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 421

gccagactct gcgcagagtc tggc 24

<210> 422

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 422

tcccgactct gcgcagagtc ggga 24

<210> 423

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 423

gtccgactct gcgcagagtc ggac 24

<210> 424

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 424

gcctgactct gcgcagagtc aggc 24

<210> 425

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 425

gggcgactct gcgcagagtc gccc 24

<210> 426

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 426

aggcgactct gcgcagagtc gcct 24

<210> 427

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 427

gagcgactct gcgcagagtc gctc 24

<210> 428

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 428

ggacgactct gcgcagagtc gtcc 24

<210> 429

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 429

gggagactct gcgcagagtc tccc 24

<210> 430

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 430

tggcgactct gcgcagagtc gcca 24

<210> 431

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 431

gtgcgactct gcgcagagtc gcac 24

<210> 432

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 432

gggtgactct gcgcagagtc accc 24

<210> 433

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 433

acgggactct gcgcagagtc ccgt 24

<210> 434

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 434

cagggactct gcgcagagtc cctg 24

<210> 435

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 435

ccaggactct gcgcagagtc ctgg 24

<210> 436

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 436

ccgagactct gcgcagagtc tcgg 24

<210> 437

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 437

tcgggactct gcgcagagtc ccga 24

<210> 438

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 438

ctgggactct gcgcagagtc ccag 24

<210> 439

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 439

cctggactct gcgcagagtc cagg 24

<210> 440

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 440

ccgtgactct gcgcagagtc acgg 24

<210> 441

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 441

cggcgactct gcgcagagtc gccg 24

<210> 442

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 442

cagcgactct gcgcagagtc gctg 24

<210> 443

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 443

cgacgactct gcgcagagtc gtcg 24

<210> 444

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 444

cggagactct gcgcagagtc tccg 24

<210> 445

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 445

ctgcgactct gcgcagagtc gcag 24

<210> 446

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 446

cggtgactct gcgcagagtc accg 24

<210> 447

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 447

cacggactct gcgcagagtc cgtg 24

<210> 448

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 448

cccagactct gcgcagagtc tggg 24

<210> 449

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 449

ctcggactct gcgcagagtc cgag 24

<210> 450

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 450

ccctgactct gcgcagagtc aggg 24

<210> 451

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 451

ccacgactct gcgcagagtc gtgg 24

<210> 452

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 452

agccgactct gcgcagagtc ggct 24

<210> 453

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 453

tgccgactct gcgcagagtc ggca 24

<210> 454

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 454

gcgagactct gcgcagagtc tcgc 24

<210> 455

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 455

gcgtgactct gcgcagagtc acgc 24

<210> 456

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 456

gcaggactct gcgcagagtc ctgc 24

<210> 457

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 457

gctggactct gcgcagagtc cagc 24

<210> 458

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 458

cgaggactct gcgcagagtc ctcg 24

<210> 459

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 459

cgtggactct gcgcagagtc cacg 24

<210> 460

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 460

caccgactct gcgcagagtc ggtg 24

<210> 461

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 461

ctccgactct gcgcagagtc ggag 24

<210> 462

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 462

gcgggactct gcgcagagtc ccgc 24

<210> 463

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 463

gagggactct gcgcagagtc cctc 24

<210> 464

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 464

gtgggactct gcgcagagtc ccac 24

<210> 465

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 465

nnnngactcg catgcgagtc nnnn 24

<210> 466

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 466

ggcggactcg catgcgagtc cgcc 24

<210> 467

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 467

agcggactcg catgcgagtc cgct 24

<210> 468

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 468

gacggactcg catgcgagtc cgtc 24

<210> 469

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 469

ggaggactcg catgcgagtc ctcc 24

<210> 470

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 470

ggcagactcg catgcgagtc tgcc 24

<210> 471

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 471

tgcggactcg catgcgagtc cgca 24

<210> 472

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 472

gtcggactcg catgcgagtc cgac 24

<210> 473

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 473

ggtggactcg catgcgagtc cacc 24

<210> 474

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 474

ggctgactcg catgcgagtc agcc 24

<210> 475

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 475

gcccgactcg catgcgagtc gggc 24

<210> 476

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 476

acccgactcg catgcgagtc gggt 24

<210> 477

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 477

gaccgactcg catgcgagtc ggtc 24

<210> 478

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 478

gcacgactcg catgcgagtc gtgc 24

<210> 479

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 479

gccagactcg catgcgagtc tggc 24

<210> 480

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 480

tcccgactcg catgcgagtc ggga 24

<210> 481

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 481

gtccgactcg catgcgagtc ggac 24

<210> 482

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 482

gcctgactcg catgcgagtc aggc 24

<210> 483

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 483

gggcgactcg catgcgagtc gccc 24

<210> 484

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 484

aggcgactcg catgcgagtc gcct 24

<210> 485

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 485

gagcgactcg catgcgagtc gctc 24

<210> 486

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 486

ggacgactcg catgcgagtc gtcc 24

<210> 487

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 487

gggagactcg catgcgagtc tccc 24

<210> 488

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 488

tggcgactcg catgcgagtc gcca 24

<210> 489

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 489

gtgcgactcg catgcgagtc gcac 24

<210> 490

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 490

gggtgactcg catgcgagtc accc 24

<210> 491

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 491

acgggactcg catgcgagtc ccgt 24

<210> 492

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 492

cagggactcg catgcgagtc cctg 24

<210> 493

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 493

ccaggactcg catgcgagtc ctgg 24

<210> 494

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 494

ccgagactcg catgcgagtc tcgg 24

<210> 495

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 495

tcgggactcg catgcgagtc ccga 24

<210> 496

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 496

ctgggactcg catgcgagtc ccag 24

<210> 497

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 497

cctggactcg catgcgagtc cagg 24

<210> 498

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 498

ccgtgactcg catgcgagtc acgg 24

<210> 499

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 499

cggcgactcg catgcgagtc gccg 24

<210> 500

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 500

cagcgactcg catgcgagtc gctg 24

<210> 501

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 501

cgacgactcg catgcgagtc gtcg 24

<210> 502

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 502

cggagactcg catgcgagtc tccg 24

<210> 503

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 503

ctgcgactcg catgcgagtc gcag 24

<210> 504

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 504

cggtgactcg catgcgagtc accg 24

<210> 505

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 505

cacggactcg catgcgagtc cgtg 24

<210> 506

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 506

cccagactcg catgcgagtc tggg 24

<210> 507

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 507

ctcggactcg catgcgagtc cgag 24

<210> 508

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 508

ccctgactcg catgcgagtc aggg 24

<210> 509

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 509

ccacgactcg catgcgagtc gtgg 24

<210> 510

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 510

agccgactcg catgcgagtc ggct 24

<210> 511

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 511

tgccgactcg catgcgagtc ggca 24

<210> 512

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 512

gcgagactcg catgcgagtc tcgc 24

<210> 513

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 513

gcgtgactcg catgcgagtc acgc 24

<210> 514

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 514

gcaggactcg catgcgagtc ctgc 24

<210> 515

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 515

gctggactcg catgcgagtc cagc 24

<210> 516

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 516

cgaggactcg catgcgagtc ctcg 24

<210> 517

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 517

cgtggactcg catgcgagtc cacg 24

<210> 518

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 518

caccgactcg catgcgagtc ggtg 24

<210> 519

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 519

ctccgactcg catgcgagtc ggag 24

<210> 520

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 520

gcgggactcg catgcgagtc ccgc 24

<210> 521

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 521

gagggactcg catgcgagtc cctc 24

<210> 522

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 522

gtgggactcg catgcgagtc ccac 24

<210> 523

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 523

nnnngactcg ctagcgagtc nnnn 24

<210> 524

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 524

ggcggactcg ctagcgagtc cgcc 24

<210> 525

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 525

agcggactcg ctagcgagtc cgct 24

<210> 526

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 526

gacggactcg ctagcgagtc cgtc 24

<210> 527

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 527

ggaggactcg ctagcgagtc ctcc 24

<210> 528

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 528

ggcagactcg ctagcgagtc tgcc 24

<210> 529

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 529

tgcggactcg ctagcgagtc cgca 24

<210> 530

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 530

gtcggactcg ctagcgagtc cgac 24

<210> 531

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 531

ggtggactcg ctagcgagtc cacc 24

<210> 532

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 532

ggctgactcg ctagcgagtc agcc 24

<210> 533

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 533

gcccgactcg ctagcgagtc gggc 24

<210> 534

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 534

acccgactcg ctagcgagtc gggt 24

<210> 535

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 535

gaccgactcg ctagcgagtc ggtc 24

<210> 536

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 536

gcacgactcg ctagcgagtc gtgc 24

<210> 537

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 537

gccagactcg ctagcgagtc tggc 24

<210> 538

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 538

tcccgactcg ctagcgagtc ggga 24

<210> 539

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 539

gtccgactcg ctagcgagtc ggac 24

<210> 540

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 540

gcctgactcg ctagcgagtc aggc 24

<210> 541

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 541

gggcgactcg ctagcgagtc gccc 24

<210> 542

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 542

aggcgactcg ctagcgagtc gcct 24

<210> 543

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 543

gagcgactcg ctagcgagtc gctc 24

<210> 544

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 544

ggacgactcg ctagcgagtc gtcc 24

<210> 545

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 545

gggagactcg ctagcgagtc tccc 24

<210> 546

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 546

tggcgactcg ctagcgagtc gcca 24

<210> 547

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 547

gtgcgactcg ctagcgagtc gcac 24

<210> 548

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 548

gggtgactcg ctagcgagtc accc 24

<210> 549

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 549

acgggactcg ctagcgagtc ccgt 24

<210> 550

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 550

cagggactcg ctagcgagtc cctg 24

<210> 551

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 551

ccaggactcg ctagcgagtc ctgg 24

<210> 552

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 552

ccgagactcg ctagcgagtc tcgg 24

<210> 553

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 553

tcgggactcg ctagcgagtc ccga 24

<210> 554

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 554

ctgggactcg ctagcgagtc ccag 24

<210> 555

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 555

cctggactcg ctagcgagtc cagg 24

<210> 556

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 556

ccgtgactcg ctagcgagtc acgg 24

<210> 557

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 557

cggcgactcg ctagcgagtc gccg 24

<210> 558

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 558

cagcgactcg ctagcgagtc gctg 24

<210> 559

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 559

cgacgactcg ctagcgagtc gtcg 24

<210> 560

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 560

cggagactcg ctagcgagtc tccg 24

<210> 561

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 561

ctgcgactcg ctagcgagtc gcag 24

<210> 562

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 562

cggtgactcg ctagcgagtc accg 24

<210> 563

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 563

cacggactcg ctagcgagtc cgtg 24

<210> 564

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 564

cccagactcg ctagcgagtc tggg 24

<210> 565

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 565

ctcggactcg ctagcgagtc cgag 24

<210> 566

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 566

ccctgactcg ctagcgagtc aggg 24

<210> 567

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 567

ccacgactcg ctagcgagtc gtgg 24

<210> 568

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 568

agccgactcg ctagcgagtc ggct 24

<210> 569

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 569

tgccgactcg ctagcgagtc ggca 24

<210> 570

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 570

gcgagactcg ctagcgagtc tcgc 24

<210> 571

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 571

gcgtgactcg ctagcgagtc acgc 24

<210> 572

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 572

gcaggactcg ctagcgagtc ctgc 24

<210> 573

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 573

gctggactcg ctagcgagtc cagc 24

<210> 574

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 574

cgaggactcg ctagcgagtc ctcg 24

<210> 575

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 575

cgtggactcg ctagcgagtc cacg 24

<210> 576

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 576

caccgactcg ctagcgagtc ggtg 24

<210> 577

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 577

ctccgactcg ctagcgagtc ggag 24

<210> 578

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 578

gcgggactcg ctagcgagtc ccgc 24

<210> 579

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 579

gagggactcg ctagcgagtc cctc 24

<210> 580

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 580

gtgggactcg ctagcgagtc ccac 24

<210> 581

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 581

nnnngactcg cgcgcgagtc nnnn 24

<210> 582

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 582

ggcggactcg cgcgcgagtc cgcc 24

<210> 583

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 583

agcggactcg cgcgcgagtc cgct 24

<210> 584

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 584

gacggactcg cgcgcgagtc cgtc 24

<210> 585

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 585

ggaggactcg cgcgcgagtc ctcc 24

<210> 586

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 586

ggcagactcg cgcgcgagtc tgcc 24

<210> 587

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 587

tgcggactcg cgcgcgagtc cgca 24

<210> 588

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 588

gtcggactcg cgcgcgagtc cgac 24

<210> 589

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 589

ggtggactcg cgcgcgagtc cacc 24

<210> 590

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 590

ggctgactcg cgcgcgagtc agcc 24

<210> 591

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 591

gcccgactcg cgcgcgagtc gggc 24

<210> 592

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 592

acccgactcg cgcgcgagtc gggt 24

<210> 593

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 593

gaccgactcg cgcgcgagtc ggtc 24

<210> 594

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 594

gcacgactcg cgcgcgagtc gtgc 24

<210> 595

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 595

gccagactcg cgcgcgagtc tggc 24

<210> 596

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 596

tcccgactcg cgcgcgagtc ggga 24

<210> 597

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 597

gtccgactcg cgcgcgagtc ggac 24

<210> 598

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 598

gcctgactcg cgcgcgagtc aggc 24

<210> 599

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 599

gggcgactcg cgcgcgagtc gccc 24

<210> 600

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 600

aggcgactcg cgcgcgagtc gcct 24

<210> 601

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 601

gagcgactcg cgcgcgagtc gctc 24

<210> 602

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 602

ggacgactcg cgcgcgagtc gtcc 24

<210> 603

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 603

gggagactcg cgcgcgagtc tccc 24

<210> 604

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 604

tggcgactcg cgcgcgagtc gcca 24

<210> 605

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 605

gtgcgactcg cgcgcgagtc gcac 24

<210> 606

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 606

gggtgactcg cgcgcgagtc accc 24

<210> 607

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 607

acgggactcg cgcgcgagtc ccgt 24

<210> 608

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 608

cagggactcg cgcgcgagtc cctg 24

<210> 609

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 609

ccaggactcg cgcgcgagtc ctgg 24

<210> 610

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 610

ccgagactcg cgcgcgagtc tcgg 24

<210> 611

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 611

tcgggactcg cgcgcgagtc ccga 24

<210> 612

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 612

ctgggactcg cgcgcgagtc ccag 24

<210> 613

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 613

cctggactcg cgcgcgagtc cagg 24

<210> 614

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 614

ccgtgactcg cgcgcgagtc acgg 24

<210> 615

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 615

cggcgactcg cgcgcgagtc gccg 24

<210> 616

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 616

cagcgactcg cgcgcgagtc gctg 24

<210> 617

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 617

cgacgactcg cgcgcgagtc gtcg 24

<210> 618

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 618

cggagactcg cgcgcgagtc tccg 24

<210> 619

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 619

ctgcgactcg cgcgcgagtc gcag 24

<210> 620

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 620

cggtgactcg cgcgcgagtc accg 24

<210> 621

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 621

cacggactcg cgcgcgagtc cgtg 24

<210> 622

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 622

cccagactcg cgcgcgagtc tggg 24

<210> 623

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 623

ctcggactcg cgcgcgagtc cgag 24

<210> 624

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 624

ccctgactcg cgcgcgagtc aggg 24

<210> 625

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 625

ccacgactcg cgcgcgagtc gtgg 24

<210> 626

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 626

agccgactcg cgcgcgagtc ggct 24

<210> 627

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 627

tgccgactcg cgcgcgagtc ggca 24

<210> 628

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 628

gcgagactcg cgcgcgagtc tcgc 24

<210> 629

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 629

gcgtgactcg cgcgcgagtc acgc 24

<210> 630

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 630

gcaggactcg cgcgcgagtc ctgc 24

<210> 631

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 631

gctggactcg cgcgcgagtc cagc 24

<210> 632

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 632

cgaggactcg cgcgcgagtc ctcg 24

<210> 633

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 633

cgtggactcg cgcgcgagtc cacg 24

<210> 634

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 634

caccgactcg cgcgcgagtc ggtg 24

<210> 635

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 635

ctccgactcg cgcgcgagtc ggag 24

<210> 636

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 636

gcgggactcg cgcgcgagtc ccgc 24

<210> 637

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 637

gagggactcg cgcgcgagtc cctc 24

<210> 638

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 638

gtgggactcg cgcgcgagtc ccac 24

<210> 639

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 639

nnnngactcg ccggcgagtc nnnn 24

<210> 640

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 640

ggcggactcg ccggcgagtc cgcc 24

<210> 641

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 641

agcggactcg ccggcgagtc cgct 24

<210> 642

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 642

gacggactcg ccggcgagtc cgtc 24

<210> 643

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 643

ggaggactcg ccggcgagtc ctcc 24

<210> 644

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 644

ggcagactcg ccggcgagtc tgcc 24

<210> 645

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 645

tgcggactcg ccggcgagtc cgca 24

<210> 646

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 646

gtcggactcg ccggcgagtc cgac 24

<210> 647

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 647

ggtggactcg ccggcgagtc cacc 24

<210> 648

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 648

ggctgactcg ccggcgagtc agcc 24

<210> 649

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 649

gcccgactcg ccggcgagtc gggc 24

<210> 650

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 650

acccgactcg ccggcgagtc gggt 24

<210> 651

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 651

gaccgactcg ccggcgagtc ggtc 24

<210> 652

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 652

gcacgactcg ccggcgagtc gtgc 24

<210> 653

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 653

gccagactcg ccggcgagtc tggc 24

<210> 654

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 654

tcccgactcg ccggcgagtc ggga 24

<210> 655

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 655

gtccgactcg ccggcgagtc ggac 24

<210> 656

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 656

gcctgactcg ccggcgagtc aggc 24

<210> 657

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 657

gggcgactcg ccggcgagtc gccc 24

<210> 658

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 658

aggcgactcg ccggcgagtc gcct 24

<210> 659

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 659

gagcgactcg ccggcgagtc gctc 24

<210> 660

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 660

ggacgactcg ccggcgagtc gtcc 24

<210> 661

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 661

gggagactcg ccggcgagtc tccc 24

<210> 662

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 662

tggcgactcg ccggcgagtc gcca 24

<210> 663

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 663

gtgcgactcg ccggcgagtc gcac 24

<210> 664

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 664

gggtgactcg ccggcgagtc accc 24

<210> 665

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 665

acgggactcg ccggcgagtc ccgt 24

<210> 666

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 666

cagggactcg ccggcgagtc cctg 24

<210> 667

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 667

ccaggactcg ccggcgagtc ctgg 24

<210> 668

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 668

ccgagactcg ccggcgagtc tcgg 24

<210> 669

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 669

tcgggactcg ccggcgagtc ccga 24

<210> 670

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 670

ctgggactcg ccggcgagtc ccag 24

<210> 671

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 671

cctggactcg ccggcgagtc cagg 24

<210> 672

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 672

ccgtgactcg ccggcgagtc acgg 24

<210> 673

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 673

cggcgactcg ccggcgagtc gccg 24

<210> 674

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 674

cagcgactcg ccggcgagtc gctg 24

<210> 675

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 675

cgacgactcg ccggcgagtc gtcg 24

<210> 676

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 676

cggagactcg ccggcgagtc tccg 24

<210> 677

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 677

ctgcgactcg ccggcgagtc gcag 24

<210> 678

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 678

cggtgactcg ccggcgagtc accg 24

<210> 679

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 679

cacggactcg ccggcgagtc cgtg 24

<210> 680

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 680

cccagactcg ccggcgagtc tggg 24

<210> 681

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 681

ctcggactcg ccggcgagtc cgag 24

<210> 682

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 682

ccctgactcg ccggcgagtc aggg 24

<210> 683

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 683

ccacgactcg ccggcgagtc gtgg 24

<210> 684

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 684

agccgactcg ccggcgagtc ggct 24

<210> 685

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 685

tgccgactcg ccggcgagtc ggca 24

<210> 686

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 686

gcgagactcg ccggcgagtc tcgc 24

<210> 687

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 687

gcgtgactcg ccggcgagtc acgc 24

<210> 688

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 688

gcaggactcg ccggcgagtc ctgc 24

<210> 689

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 689

gctggactcg ccggcgagtc cagc 24

<210> 690

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 690

cgaggactcg ccggcgagtc ctcg 24

<210> 691

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 691

cgtggactcg ccggcgagtc cacg 24

<210> 692

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 692

caccgactcg ccggcgagtc ggtg 24

<210> 693

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 693

ctccgactcg ccggcgagtc ggag 24

<210> 694

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 694

gcgggactcg ccggcgagtc ccgc 24

<210> 695

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 695

gagggactcg ccggcgagtc cctc 24

<210> 696

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 696

gtgggactcg ccggcgagtc ccac 24

<210> 697

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 697

nnnngactca catgtgagtc nnnn 24

<210> 698

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 698

ggcggactca catgtgagtc cgcc 24

<210> 699

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 699

agcggactca catgtgagtc cgct 24

<210> 700

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 700

gacggactca catgtgagtc cgtc 24

<210> 701

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 701

ggaggactca catgtgagtc ctcc 24

<210> 702

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 702

ggcagactca catgtgagtc tgcc 24

<210> 703

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 703

tgcggactca catgtgagtc cgca 24

<210> 704

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 704

gtcggactca catgtgagtc cgac 24

<210> 705

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 705

ggtggactca catgtgagtc cacc 24

<210> 706

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 706

ggctgactca catgtgagtc agcc 24

<210> 707

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 707

gcccgactca catgtgagtc gggc 24

<210> 708

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 708

acccgactca catgtgagtc gggt 24

<210> 709

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 709

gaccgactca catgtgagtc ggtc 24

<210> 710

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 710

gcacgactca catgtgagtc gtgc 24

<210> 711

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 711

gccagactca catgtgagtc tggc 24

<210> 712

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 712

tcccgactca catgtgagtc ggga 24

<210> 713

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 713

gtccgactca catgtgagtc ggac 24

<210> 714

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 714

gcctgactca catgtgagtc aggc 24

<210> 715

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 715

gggcgactca catgtgagtc gccc 24

<210> 716

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 716

aggcgactca catgtgagtc gcct 24

<210> 717

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 717

gagcgactca catgtgagtc gctc 24

<210> 718

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 718

ggacgactca catgtgagtc gtcc 24

<210> 719

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 719

gggagactca catgtgagtc tccc 24

<210> 720

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 720

tggcgactca catgtgagtc gcca 24

<210> 721

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 721

gtgcgactca catgtgagtc gcac 24

<210> 722

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 722

gggtgactca catgtgagtc accc 24

<210> 723

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 723

acgggactca catgtgagtc ccgt 24

<210> 724

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 724

cagggactca catgtgagtc cctg 24

<210> 725

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 725

ccaggactca catgtgagtc ctgg 24

<210> 726

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 726

ccgagactca catgtgagtc tcgg 24

<210> 727

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 727

tcgggactca catgtgagtc ccga 24

<210> 728

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 728

ctgggactca catgtgagtc ccag 24

<210> 729

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 729

cctggactca catgtgagtc cagg 24

<210> 730

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 730

ccgtgactca catgtgagtc acgg 24

<210> 731

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 731

cggcgactca catgtgagtc gccg 24

<210> 732

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 732

cagcgactca catgtgagtc gctg 24

<210> 733

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 733

cgacgactca catgtgagtc gtcg 24

<210> 734

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 734

cggagactca catgtgagtc tccg 24

<210> 735

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 735

ctgcgactca catgtgagtc gcag 24

<210> 736

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 736

cggtgactca catgtgagtc accg 24

<210> 737

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 737

cacggactca catgtgagtc cgtg 24

<210> 738

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 738

cccagactca catgtgagtc tggg 24

<210> 739

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 739

ctcggactca catgtgagtc cgag 24

<210> 740

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 740

ccctgactca catgtgagtc aggg 24

<210> 741

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 741

ccacgactca catgtgagtc gtgg 24

<210> 742

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 742

agccgactca catgtgagtc ggct 24

<210> 743

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 743

tgccgactca catgtgagtc ggca 24

<210> 744

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 744

gcgagactca catgtgagtc tcgc 24

<210> 745

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 745

gcgtgactca catgtgagtc acgc 24

<210> 746

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 746

gcaggactca catgtgagtc ctgc 24

<210> 747

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 747

gctggactca catgtgagtc cagc 24

<210> 748

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 748

cgaggactca catgtgagtc ctcg 24

<210> 749

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 749

cgtggactca catgtgagtc cacg 24

<210> 750

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 750

caccgactca catgtgagtc ggtg 24

<210> 751

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 751

ctccgactca catgtgagtc ggag 24

<210> 752

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 752

gcgggactca catgtgagtc ccgc 24

<210> 753

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 753

gagggactca catgtgagtc cctc 24

<210> 754

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 754

gtgggactca catgtgagtc ccac 24

<210> 755

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (1)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<220>

<221> Отличительные особенности

<222> (21)..(24)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 755

nnnngactca ctagtgagtc nnnn 24

<210> 756

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 756

ggcggactca ctagtgagtc cgcc 24

<210> 757

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 757

agcggactca ctagtgagtc cgct 24

<210> 758

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 758

gacggactca ctagtgagtc cgtc 24

<210> 759

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 759

ggaggactca ctagtgagtc ctcc 24

<210> 760

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 760

ggcagactca ctagtgagtc tgcc 24

<210> 761

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 761

tgcggactca ctagtgagtc cgca 24

<210> 762

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 762

gtcggactca ctagtgagtc cgac 24

<210> 763

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 763

ggtggactca ctagtgagtc cacc 24

<210> 764

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 764

ggctgactca ctagtgagtc agcc 24

<210> 765

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 765

gcccgactca ctagtgagtc gggc 24

<210> 766

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 766

acccgactca ctagtgagtc gggt 24

<210> 767

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 767

gaccgactca ctagtgagtc ggtc 24

<210> 768

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 768

gcacgactca ctagtgagtc gtgc 24

<210> 769

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 769

gccagactca ctagtgagtc tggc 24

<210> 770

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 770

tcccgactca ctagtgagtc ggga 24

<210> 771

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 771

gtccgactca ctagtgagtc ggac 24

<210> 772

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 772

gcctgactca ctagtgagtc aggc 24

<210> 773

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 773

gggcgactca ctagtgagtc gccc 24

<210> 774

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 774

aggcgactca ctagtgagtc gcct 24