КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ОБОГАЩЕНИЯ БИБЛИОТЕК Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6832 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По этой заявке по 35 U.S.C. § 119(e) испрашивается приоритет временной заявки на патент США No. 62/764753, поданной 15 августа 2018, полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Несмотря на быстрые успехи в производительности секвенирования нового поколения (NGS), классические способы получения и обогащения библиотек занимают много времени и могут приводить к ограничивающему производительность узкому месту. Настоящее изобретение относится к композициям, включающим блокатор и/или буфер для гибридизации, к способам применения этих композиций и к способам улучшения эффективности отбора нуклеиновой кислоты перед секвенированием.

[0003] В одном аспекте, настоящее изобретение относится к буферу для гибридизации, включающему средство, оказывающее эффект скученности, и по меньшей мере одно из ДНК Cot-1 человека, дестабилизатора, соли и блокатора.

[0004] В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу, включающему использование буфера для гибридизации. Настоящее изобретение относится также к набору, включающему буфер для гибридизации.

[0005] В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к блокатору, включающему олигонуклеотид, где блокатор является способным связываться с адаптером. Адаптер включает последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI). Область блокатора, способная связываться с индексной областью и/или UMI адаптера, включает: по меньшей мере три основания тимина или универсальных основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание.

[0006] В другом аспекте, настоящее изобретение относится к блокатору, включающему два несвязанных олигонуклеотида. Блокатор является способным связываться по меньшей мере с частью адаптера, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI). Несвязанные олигонуклеотиды включают основания, не соответствующие индексной области и/или UMI адаптера.

[0007] Настоящее изобретение относится также к способу, включающему использование блокаторов, описанных в настоящем описании, и к набору, включающему блокаторы, описанные в настоящем описании.

[0008] В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к способу, включающему приведение библиотеки в контакт с блокатором в присутствии буфера для гибридизации; и приведение библиотеки в контакт с зондом, где зонд гибридизуется с представляющей интерес областью в члене библиотеки. Способ не включает амплификацию членов библиотеки с использованием ПЦР перед секвенированием членов библиотеки.

[0009] В рамках изобретения, термин «нуклеиновая кислота» предназначен, чтобы являться согласованным с его использованием в данной области, и включает природные нуклеиновые кислоты или их функциональные аналоги. Особенно полезные функциональные аналоги являются способными к гибридизации с нуклеиновой кислотой специфическим для последовательности образом или способными к использованию в качестве матрицы для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Природные нуклеиновые кислоты, как правило, имеют остов, содержащий фосфодиэфирные связи. Аналогичная структура может иметь альтернативную связь остова, включающую любую из множества связей, известных в данной области. Природные нуклеиновые кислоты, как правило, имеют сахар дезоксирибозу (например, обнаруженный в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК)) или сахар рибозу (например, обнаруженный в рибонуклеиновая кислота (РНК)). Нуклеиновая кислота может содержать любой из множества аналогов этих групп сахаров, известных в данной области. Нуклеиновая кислота может включать природные или неприродные основания. В этой связи, природная дезоксирибонуклеиновая кислота может иметь одно или несколько оснований, выбранных из группы, состоящей из аденина, тимина, цитозина или гуанина, и рибонуклеиновая кислота может иметь одно или несколько оснований, выбранных из группы, состоящей из урацила, аденина, цитозина или гуанина. Полезные неприродные основания, которые можно включать в нуклеиновую кислоту, известны в данной области. Термин «мишень», при использовании со ссылкой на нуклеиновую кислоту, предназначен в качестве семантического идентификатора для нуклеиновой кислоты в контексте способа или композиции, указанных в настоящем описании, и необязательно ограничивает структуру или функцию нуклеиновой кислоты сверх того, что явно указано иным образом.

[0010] В рамках изобретения, термин «T_m» относится к температуре, при которой половина цепей ДНК образца находятся в двуспиральном состоянии, и половина цепей ДНК образца находятся в случайном спиральном состоянии.

[0011] В рамках изобретения, термин «адаптер» и его производные (например, универсальный адаптер, нецелевой адаптер и т.д.), относится в общем к любому линейному, одноцепочечному олигонуклеотиду, который можно лигировать с молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, адаптер является по существу некомплементарным 3'-концу или 5'-концу любой последовательности-мишени, присутствующей в образце. В некоторых вариантах осуществления, пригодная длина адаптера лежит в диапазоне длины 10-100 нуклеотидов, 12-60 нуклеотидов и 15-50 нуклеотидов. Как правило, адаптер может включать любую комбинацию нуклеотидов и/или нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах, адаптер может включать одну или несколько отщепляемых групп в одной или нескольких локализациях. В другом аспекте, адаптер может включать последовательность, которая является по существу идентичной, или по существу комплементарной, по меньшей мере части праймера, например, универсального праймера. В некоторых вариантах осуществления, адаптер может включать индекс или метку, чтобы способствовать нижестоящей коррекции ошибок, идентификации или секвенированию.

[0012] В рамках изобретения, термин «универсальная последовательность» относится к области последовательности, которая является общей для двух или более молекул нуклеиновой кислоты, например, адаптерных молекул адаптер-мишень, где молекулы также имеют области последовательности, отличающиеся друг от друга. Универсальная последовательность, которая присутствует в различных членах коллекции молекул, может позволять связывание множества различных нуклеиновых кислот с использованием популяции универсальных связывающих нуклеиновых кислот, которые являются комплементарными части универсальной последовательности, например, участку связывания универсального праймера для удлинения. Неограничивающие примеры участков связывания универсального праймера для удлинения включают последовательности, которые являются идентичными или комплементарными праймерам P5 и P7. Подобным образом, универсальная последовательность, присутствующая в различных членах коллекции молекул, может позволять репликацию или амплификацию множества различных нуклеиновых кислот с использованием популяции универсальных праймеров, которые являются комплементарными части универсальной последовательности, например, участку связывания универсального праймера. Таким образом, универсальная связывающая нуклеиновая кислота или универсальный праймер включает последовательность, которая может специфически гибридизоваться с универсальной последовательностью. Молекулы-мишени нуклеиновой кислоты можно модифицировать для присоединения универсальных адаптеров, например, на одном или обеих концах различных последовательностей-мишеней, как описано в настоящем описании.

[0013] Термины «P5» и «P7» можно использовать при обозначении праймеров для амплификации, например, праймеров для удлинения универсального праймера. Термины «P5'» (P5-штрих) и «P7'» (P7-штрих) относятся к праймерам, комплементарным P5 и P7, соответственно. Понятно, что любые пригодные праймеры для амплификации можно использовать в способах, представленных в настоящем описании, и что использование P5 и P7 представляют собой только иллюстративные варианты осуществления. Применения праймеров для амплификации, таких как P5 и P7, в проточных ячейках, известны в данной области, как проиллюстрировано описаниями из WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151 и WO 2000/018957. Например, любой пригодный прямой праймер для амплификации, либо иммобилизованный, либо в растворе, может являться полезным в способах, представленных в настоящем описании, для гибридизации с комплементарной последовательностью и амплификации последовательности. Подобным образом, любой пригодный обратный праймер для амплификации, либо иммобилизованный, либо в растворе, может являться полезным в способах, представленных в настоящем описании, для гибридизации с комплементарной последовательностью и амплификации последовательности. Специалисту в данной области понятно, каким образом конструировать и использовать последовательности праймеров, которые являются пригодными для связывания и амплификации нуклеиновых кислот, как представлено в настоящем описании.

[0014] В рамках изобретения, «амплифицировать», «амплификация» или «реакция амплификации» и их производные, в общем, относятся к любому действию или процессу, посредством которого по меньшей мере часть молекулы нуклеиновой кислоты реплицируется или копируется по меньшей мере в одну дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты. Дополнительная молекула нуклеиновой кислоты, необязательно, включает последовательность, которая является по существу идентичной или по существу комплементарной по меньшей мере некоторой части молекулы-матрицы нуклеиновой кислоты. Молекула-матрица нуклеиновой кислоты может являться одноцепочечной или двухцепочечной, и дополнительная молекула нуклеиновой кислоты может независимо являться одноцепочечной или двухцепочечной. Амплификация, необязательно, включает линейную или экспоненциальную репликацию молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, такую амплификацию можно проводить с использованием изотермических условий; в других вариантах осуществления, такая амплификация может включать термоциклирование. В некоторых вариантах осуществления, амплификация представляет собой мультиплексную амплификацию, которая включает одновременную амплификацию множества последовательностей-мишеней в одной реакции амплификации. В некоторых вариантах осуществления, «амплификация» включает амплификацию по меньшей мере некоторой части нуклеиновых кислот на основе ДНК и РНК, отдельно или в комбинации. Реакция амплификации может включать любой из способов амплификации, известный специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления, реакция амплификации включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

[0015] В рамках изобретения, «условия амплификации» и их производные, в общем относятся к условиям, подходящим для амплификации одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты. Такая амплификация может являться линейной или экспоненциальной. В некоторых вариантах осуществления, условия амплификации могут включать изотермические условия или альтернативно, могут включать условия термоциклирования, или комбинацию изотермических условий и условий термоциклирования. В некоторых вариантах осуществления, условия, подходящие для амплификации одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты, включают условия полимеразной цепной реакции (ПЦР). Как правило, условия амплификации относятся к реакционной смеси, достаточной для амплификации нуклеиновых кислот, таких как одна или несколько последовательностей-мишеней, или для амплификации амплифицированной последовательности-мишени, лигированной с одним или несколькими адаптерами, например, лигированной с адаптером амплифицированной последовательности-мишени. Как правило, условия амплификации включают катализатор для амплификации или для синтеза нуклеиновой кислоты, например, полимеразу; праймер, обладающий некоторой степенью комплементарности с нуклеиновой кислотой, подлежащей амплификации; и нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотид-трифосфаты (dNTP) для стимуляции удлинения праймера после гибридизации с нуклеиновой кислотой. Условия амплификации могут требовать гибридизации или отжига праймера с нуклеиновой кислотой, удлинения праймера и стадии денатурации, на которой удлиненный праймер отделяется от последовательности нуклеиновой кислоты, подвергаемой амплификации. Как правило, однако, необязательно, условия амплификации могут включать термоциклирование; в некоторых вариантах осуществления, условия амплификации включают множество циклов, где стадии гибридизации, удлинения и разделения повторяют. Как правило, условия амплификации включают катионы, такие как Mg²⁺ или Mn²⁺, и могут также включать различные модификаторы ионной силы.

[0016] В рамках изобретения, термин «полимеразная цепная реакция» («ПЦР») относится к способу, как описано в Патентах США No. 4683195 и 4683202, в которых описан способ увеличения концентрации представляющего интерес фрагмента полинуклеотида в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Этот способ амплификации представляющего интерес полинуклеотида состоит из введения большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, содержащую желательный представляющий интерес полинуклеотид, с последующими сериями термоциклирования в присутствии ДНК-полимеразы. Два праймера являются комплементарными соответствующим им цепям двухцепочечного представляющего интерес полинуклеотида. Смесь сначала денатурируют при более высокой температуре, и затем праймеры гибридизуют с комплементарными последовательностями внутри молекулы представляющего интерес полинуклеотида. После гибридизации, праймеры удлиняют с использованием полимеразы для получения новой пары комплементарных цепей. Стадии денатурации, гибридизации праймера и удлинения посредством полимеразы можно повторять множество раз (обозначено как термоциклирование) для получения высокой концентрации амплифицированного фрагмента желательного представляющего интерес полинуклеотида. Длину амплифицированного фрагмента желательного представляющего интерес полинуклеотида (ампликона) определяют посредством относительных положений праймеров по отношению друг к другу, и таким образом, эта длина является контролируемым параметром. Из-за повторения этого процесса, способ обозначен как «полимеразная цепная реакция» (далее в настоящем описании «ПЦР»). Поскольку желательные амплифицированные фрагменты представляющего интерес полинуклеотида становятся преобладающими последовательностями нуклеиновой кислоты (в отношении концентрации) в смеси, их называют «амплифицированными посредством ПЦР». В модификации способа, обсуждаемого выше, молекулы-мишени нуклеиновой кислоты можно амплифицировать посредством ПЦР с использованием множества различных пар праймеров, в некоторых случаях, одной или нескольких пар праймеров на молекулу-мишень представляющей интерес нуклеиновой кислоты, таким образом, формируя мультиплексную реакцию ПЦР.

[0017] Как определено в настоящем описании, «мультиплексная амплификация» относится к одновременной амплификации двух или более последовательностей-мишеней в образце. В некоторых вариантах осуществления, мультиплексную амплификацию проводят таким образом, что некоторые или все из последовательностей-мишеней амплифицируют в одном реакционном сосуде. «Множественность» или «плексность» данной мультиплексной амплификации, в общем, относится к количеству различных специфических последовательностей-мишеней, амплифицированных в ходе этой одной мультиплексной амплификации. Является также возможным детектировать амплифицированные последовательности-мишени посредством нескольких различных способов (например, электрофореза в геле с последующей денситометрией, количественной оценки с использованием биоанализатора или количественной ПЦР, гибридизации с меченым зондом; включения биотинилированных праймеров с последующей детекцией посредством конъюгата авидин-фермент; включения 32P-меченных дезоксинуклеотид-трифосфатов в амплифицированную последовательность-мишень).

[0018] В рамках изобретения, термин «праймер» и его производные, в общем, относится к любому полинуклеотиду, который может гибридизоваться с представляющей интерес последовательностью-мишенью. Как правило, праймер функционирует в качестве субстрата, на котором нуклеотиды можно полимеризовать посредством полимеразы; в некоторых вариантах осуществления, однако, праймер может становится включенным в синтезированную цепь нуклеиновой кислоты и предоставлять участок, с которым другой праймер может гибридизоваться для праймирования синтеза новой цепи, которая является комплементарной синтезированной молекуле нуклеиновой кислоты. Праймер может состоять из любой комбинации нуклеотидов или их аналогов. В некоторых вариантах осуществления, праймер представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид или полинуклеотид. Термины «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» использованы в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимерной формы нуклеотидов любой длины и могут включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, их аналоги или их смеси. Термины следует понимать как включающие, в качестве эквивалентов, аналоги либо ДНК, либо РНК, состоящие из аналогов нуклеотидов, и как применимые к одноцепочечным (таким как смысловой или антисмысловой) и двухцепочечным полинуклеотидам. Этот термин, в рамках изобретения, включает также кДНК, то есть комплементарную ДНК или копию ДНК, полученную с РНК-матрицы, например, под действием обратной транскриптазы. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, термин включает трех-, двух- и одноцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту («ДНК»), так же как трех-, двух- и одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту («РНК»).

[0019] В рамках изобретения, термины «лигирующий», «лигирование», и их производные, в общем, относятся к способу ковалентного связывания двух или более молекул, например, ковалентного связывания двух или более молекул нуклеиновой кислоты друг с другом. В некоторых вариантах осуществления, лигирование включает соединение ников между соседними нуклеотидами нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, лигирование включает формирование ковалентной связи между концом первой и концом второй молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, лигирование может включать формирование ковалентной связи между 5'-фосфатной группой одной нуклеиновой кислоты и 3'-гидроксильной группой второй нуклеиновой кислоты, таким образом, получение лигированной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, последовательность-мишень можно лигировать с адаптером для получения последовательности адаптер-мишень. Специалисту в данной области известно, что реакция лигирования может не приводить к связыванию всех молекул, присутствующих в реакции.

[0020] В рамках изобретения, «лигаза» и ее производные в общем относится к любому средству для катализа лигирования двух молекул субстрата. В некоторых вариантах осуществления, лигаза включает фермент, способный катализировать соединение ников между соседними нуклеотидами нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, лигаза включает фермент, способный к катализу ковалентной связи между 5'-фосфатом одной молекулы нуклеиновой кислоты с 3'-гидроксилом другой молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, к формированию лигированной молекулы нуклеиновой кислоты. Пригодные лигазы могут включать, но без ограничения, ДНК-лигазу T4, РНК-лигазу T4, термостабильную ДНК-лигазу T4 и ДНК-лигазу E. coli.

[0021] Термин «проточная ячейка» в рамках изобретения относится к камере, содержащей твердую поверхность, через которую могут протекать один или несколько жидких реагентов. Примеры проточных ячеек и связанных жидкостных систем и платформ для детекции, которые можно легко использовать в способах по настоящему описанию, описаны, например, в Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008); WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744; Патент США No. 7057026; Патенте США No. 7211414; Патенте США No. 7315019; Патенте США No. 7329492; Патенте США No. 7405281; и Публикации патента США No. 2008/0108082.

[0022] В рамках изобретения, термин «библиотека» относится к коллекции членов. В одном варианте осуществления, библиотека включает коллекцию членов нуклеиновых кислот, например, коллекцию полногеномных, субгеномных фрагментов, кДНК, фрагментов кДНК, РНК, фрагментов РНК или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления, часть или все члены библиотеки включают не являющуюся мишенью адаптерную последовательность. Адаптерная последовательность может быть локализована на одном или обоих концах. Адаптерную последовательность можно использовать, например, в способе секвенирования (например, способе NGS), для амплификации, для обратной транскрипции или для клонирования в вектор.

[0023] «Член» или «член библиотеки», или другой сходный термин, в рамках изобретения, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, например, ДНК, РНК или их комбинации, которая является членом библиотеки. Как правило, член представляет собой молекулу ДНК, например, геномной ДНК или кДНК. Член может представлять собой фрагментированную, например, посредством сдвига или подготовленную с использованием ферментов, геномную ДНК. Члены включают последовательность от субъекта и могут также включать последовательность, не происходящую от субъекта, например, не являющуюся мишенью последовательность, такую как адаптерная последовательность, последовательность праймера и/или другие последовательности, позволяющие идентификацию, например, индекс.

[0024] В рамках изобретения, «индекс» (также обозначенный как «индексная область» или «индексный адаптер») относится к метке нуклеиновой кислоты, которую можно использовать для идентификации образца или источника материала нуклеиновой кислоты. Когда образцы нуклеиновой кислоты получены из множества источников, нуклеиновые кислоты в каждом образце нуклеиновой кислоты можно метить различными метками нуклеиновой кислоты, так чтобы источник образца можно было идентифицировать. Можно использовать любой пригодный индекс или набор индексов, как известно в данной области и как проиллюстрировано описаниями из Патента США No. 8053192, Публикации PCT No. WO 05/068656 и Публикации патента США No. 2013/0274117. В некоторых вариантах осуществления, индекс может включать последовательность индекса 1 из шести оснований (i7), последовательность индекса 1 из восьми оснований (i7), последовательность индекса 2 из восьми оснований (i5), последовательность индекса 1 из десяти оснований (i7) или последовательность индекса 2 из десяти оснований (i5) от Illumina, Inc. (San Diego, CA).

[0025] В рамках изобретения, термин «уникальный молекулярный идентификатор» или «UMI», или «штрих-код» относится к молекулярной метке, которую можно присоединять к молекуле нуклеиновой кислоты. При включении в молекулу нуклеиновой кислоты, UMI можно использовать для коррекции на последующее смещение амплификации посредством прямого подсчета уникальных молекулярных идентификаторов (UMI), секвенированных после амплификации.

[0026] В рамках изобретения, термин «тагментация» относится к модификации ДНК посредством транспосомного комплекса, содержащего фермент транспозазу в комплексе с адаптерами, содержащими двухцепочечную последовательность узнавания (гибридизованные концевые последовательности транспозона). Тагментация приводит к одновременным фрагментации ДНК и лигированию адаптеров с 5′-концами обеих цепей фрагментов дуплекса. После очистки для удаления фермента транспозазы, заполнения пропусков и лигирования, получают полностью двухцепочечный продукт. Дополнительные последовательности можно добавлять к концам снабженных адаптерами фрагментов, например, посредством ПЦР, лигирования или любого другого пригодного способа, известного специалисту в данной области. См., например, Публикацию патента США No. 2017/0044525.

[0027] Термин «и/или» означает один или несколько из перечисленных элементов, или комбинацию любых двух или более из перечисленных элементов.

[0028] Выражения «предпочтительный» и «предпочтительно» относятся к вариантам осуществления изобретения, в которых можно получать определенные преимущества, в определенных условиях. Однако, другие варианты осуществления также могут являться предпочтительными, в таких же или других условиях. Более того, перечисление одного или нескольких предпочтительных вариантов осуществления не подразумевает, что другие варианты осуществления являются неприменимыми, и не предназначены для исключения других вариантов осуществления из объема изобретения.

[0029] Термин «содержит» и его варианты не имеют ограничивающего значения, когда эти термины встречаются в описании и формуле изобретения.

[0030] Понятно, что во всех случаях, когда варианты осуществления описаны в настоящем описании с использованием выражения «включать», «включает» или «включающий», и т.п., аналогичные в ином отношении варианты осуществления, описанные в отношении «состоящий из» и/или «в основном состоящий из», также представлены. Термин «состоящий из» ограничен тем, что следует после фразы «состоящий из». То есть, «состоящий из» показывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что другие элементы не могут присутствовать. Термин «в основном состоящий из» показывает, что любые элементы, перечисленные после этой фразы, включены, и что элементы, отличные от перечисленных, можно включать, при условии, что эти элементы не создают помех или не вносят вклада в активность или действие, указанное в описании для перечисленных элементов.

[0031] Если не указано иное, формы единственного числа и «по меньшей мере один» использованы взаимозаменяемо и обозначают один или более одного.

[0032] В рамках изобретения, термин «каждый», при использовании применительно к коллекции объектов, предназначен для идентификации индивидуального термина в коллекции, но не обязательно относится к каждому термину в коллекции, если контекст явно не требует иного.

[0033] Перечисления числовых диапазонов по конечным точкам включают все числа, включенные в диапазон (например, 1-5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и т.д.).

[0034] Для любого способа, описанного в настоящем описании, который включает дискретные стадии, стадии можно проводить в любом целесообразном порядке. И, при необходимости, любую комбинацию двух или более стадий можно проводить одновременно.

[0035] Вышеуказанная сущность настоящего изобретения не предназначена для описания каждого раскрытого варианта осуществления или каждого воплощения настоящего изобретения. В следующем ниже описании приведены более конкретные примеры иллюстративных вариантов осуществления. В нескольких местах на протяжении заявки, представлено руководство посредством списка примеров, которые можно использовать в различных комбинациях. В каждом случае, перечисленный список служит только в качестве репрезентативной группы и его не следует интерпретировать как исключительный список.

[0036] Ссылка во всем тексте этого описания на «один вариант осуществления», «вариант осуществления», «конкретные варианты осуществления» или «некоторые варианты осуществления», и т.д., означает, что конкретные признак, конфигурация, композиция или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления, включены по меньшей мере в один вариант осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление таких фраз в различных местах на протяжении этого описания не обязательно относится к одному и тому же варианту осуществления настоящего изобретения. Кроме того, конкретные признаки, конфигурации, композиции или характеристики можно комбинировать любым подходящим образом в одном или нескольких вариантах осуществления.

[0037] Если не указано иное, все числа, выражающие количества компонентов, молекулярных масс и т.д., использованные в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». Соответственно, если иным образом не указано обратное, числовые параметры, указанные в описании и формуле изобретения, представляют собой приближения, которые могут меняться в зависимости от желательных свойств, которые пытаются получить по настоящему изобретению. Самое меньшее, и не в попытке ограничения доктрины эквивалентов объема пунктов формулы изобретения, каждый числовой параметр следует по меньшей мере рассматривать в свете количества приведенных значимых цифр и с использованием обычных способов округления.

[0038] Все заголовки приведены для удобства читателя и не должны быть использованы для ограничения значения текста, следующего за заголовком, если не указано иное.

[0039] Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, излагающие широкий объем изобретения, представляют собой приближения, числовые значения, указанные в конкретных примерах, приведены настолько точно, насколько возможно. Все числовые значения, однако, по своей природе содержат диапазон, неизбежно возникающий в результате стандартного отклонения, обнаруженного в их соответствующих тестовых измерениях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0040] ФИГ. 1A - ФИГ. 1B представляют собой схемы, показывающие иллюстративный вариант осуществления гибридного связывания во время обогащения и сравнительное нецелевое связывание. ФИГ. 1A. Зонд включает область, сконструированную для гибридизации с представляющей интерес областью в геноме-мишени, и лиганд, позволяющий последующее связывание зонда (например, группу биотина). После завершения гибридизации и формирования гибрида ДНК-матрица-зонд, средства для связывания (то есть, компонент, имеющий аффинность для зонда, включающий, например, покрытую стрептавидином магнитную бусину) используют для связывания зонда, гибридизующегося с ДНК-мишенью, удаляя мишень из пула олигонуклеотидов. ФИГ. 1B. Нежелательные или нецелевые олигонуклеотиды можно выделять во время гибридного связывания из-за взаимодействий между концевыми адаптерными последовательностями в последовательностях-мишенях и адаптерными последовательностями в нецелевых продуктах препарата библиотеки.

[0041] На ФИГ. 2 показан иллюстративный механизм, посредством которого блокаторы предотвращают гибридизацию адаптерных последовательностей и предотвращают нецелевое связывание.

[0042] На ФИГ. 3A - ФИГ. 3I показаны диаграммы иллюстративных блокаторов. ФИГ. 3A. Диаграмма блокаторов NEXTERA с основаниями, комплементарными индексной области адаптера из 8 или 10 оснований. ФИГ. 3B. Диаграмма блокаторов NEXTERA, модифицированных с использованием 8 или 10 оснований дезоксиинозина в области блокатора, соответствующей индексной области адаптера. ФИГ. 3C. Диаграмма блокаторов TRUSEQ модифицированных с использованием 6, 8 или 10 оснований дезоксиинозина в области блокатора, соответствующей индексной области адаптера. ФИГ. 3D. Диаграмма блокаторов NEXTERA и TRUSEQ с 6 или 8 основаниями тимина в области блокатора, соответствующей индексной области адаптера. ФИГ. 3E. Диаграмма разделенных блокаторов NEXTERA, включающих компонент, соответствующий области 5' от индексной области из 8 или 10 оснований и компонент, соответствующий области 3' от индексной области. Эти конструкции не включают никаких оснований, соответствующих индексной области адаптера (указано посредством пропуска 8 или 10 оснований, соответствующих индексной области). ФИГ. 3F. Диаграмма разделенных блокаторов TRUSEQ, включающих компонент, соответствующий области 5' от индексной области из 8 или 10 оснований, и компонент, соответствующий области 3' от индексной области. Эти конструкции не включают никаких оснований, соответствующих индексной области адаптера (указано посредством пропуска 8 или 10 оснований, соответствующих индексной области). ФИГ. 3G. Диаграмма блокаторов NEXTERA, соответствующих только части области адаптера 3' от индексной области. ФИГ. 3H. Диаграмма блокаторов TRUSEQ, спаривающихся только с частью области адаптера 3' от индексной области. ФИГ. 3I. Диаграмма блокаторов Nextera или TRUSEQ, соответствующих только части области адаптера 5' от индексной области (например, последовательности p5 или p7).

[0043] ФИГ. 4 представляет собой график результатов обогащения с дополненным считыванием (показателя количества связанной целевой ДНК), полученного с использованием блокаторов, как описано в примере 2.

[0044] На ФИГ. 5 показана диаграмма блокаторов, включающих модифицированный G (+G) или случайный (A, T, G или C) (N) нуклеотид в пятом положении части последовательности блокатора, соответствующей индексной последовательности, как описано в примере 3.

[0045] На ФИГ. 6A - ФИГ. 6B показаны конструкции блокаторов и результаты, как описано в примере 4. На ФИГ. 6A показана схема различных конструкций блокаторов, включающих (1) пару разделенных блокаторов с первой последовательностью, комплементарной 25-30-членной области 5' от индексной области, и второй последовательностью, комплементарной 34-35-членной области 3' от индексной области, (2) блокатор, спаривающийся только с 3'-частью адаптера («Внутренний» блокатор), (3) блокатор, спаривающийся только с 5'-частью адаптера («Внешний» блокатор), и (4) короткий (8 нуклеотидов) блокатор, соответствующей индексной области («Короткий из 8 н.»). На ФИГ. 6B показаны результаты обогащения с дополненным считыванием, достигнутые с использованием блокирующих олигонуклеотидов XGEN (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), разделенных блокаторов или блокаторов, связывающихся только с частью адаптера.

[0046] На ФИГ. 7A - ФИГ. 7F показаны результаты с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации, включающего декстрансульфат, как описано в примере 5. На ФИГ. 7A показаны результаты обогащения с дополненным считыванием, достигнутые с использованием различных концентраций декстрансульфата в буфере для гибридизации. На ФИГ. 7B показаны результаты обогащения с дополненным считыванием, достигнутые с использованием гибридизации в объеме 100 мкл и четырех различных панелей зондов, и условий трех различных буферов (буфер для гибридизации IDT, неусовершенствованный буфер для гибридизации Illumina и усовершенствованный буфер для гибридизации Illumina). На ФИГ. 7C показаны результаты обогащения с дополненным считыванием и результаты равномерности покрытия для всех четырех панелей зондов при различных периодах времени инкубации при гибридизации, и в присутствии и в отсутствие дополнительной стадии линейного изменения температуры. Пунктирная черная линия на левой панели показывает результат гибридизации в буфере без декстрансульфата. Показаны три группы результатов секвенирования, включающие NOVASEQ (ФИГ. 7D), NEXTSEQ (ФИГ. 7E) и ISEQ (ФИГ. 7F) (процент идентифицированных считываний (PF) для NOVASEQ и NEXTSEQ, и процент (%) индекса для ISEQ) и ассоциированные коэффициенты изменчивости (CV) для реакций с использованием буфера для гибридизации с декстрансульфатом и объема библиотеки 30 мкл.

[0047] На ФИГ. 8A - ФИГ. 8C показаны результаты анализов гибридизации, описанных в примере 6. На ФИГ. 8A показаны результаты обогащения с дополненным считыванием при использовании модифицированных блокаторов, увеличения температуры промывки и/или средства, оказывающего эффект скученности (декстрансульфата), в буфере для гибридизации. На ФИГ. 8B показаны результаты обогащения с дополненным считыванием, достигнутые с использованием способов, описанных в примере 6, для девяти панелей зондов с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации с блокаторами XGEN, по сравнению с результатами для панели экзома IDT с использованием способа для набора XGEN LOCKDOWN IDT. На ФИГ. 8C показана детекция соматических вариантов посредством способа обогащения с одной гибридизацией с использованием панели из 12 генов, 535 зондов, для обогащения библиотек, полученных из количественного мультиплексного (QM) стандарта ДНК HD701 Horizon Discover.

[0048] На ФИГ. 9A - ФИГ. 9D показаны схемы иллюстративных технологических процессов. eBBN обозначает тагментацию на основе бусин с использованием связанных с бусинами комплексов транспосом; H обозначает гибридизацию; C обозначает связывание; W обозначает промывку; E обозначает элюцию; ПЦР обозначает амплификацию ПЦР; S обозначает секвенирование; Q обозначает количественную оценкау; SpVac обозначает концентрирование в вакуумной центрифуге Speed Vacuum. На ФИГ. 9A показана схема иллюстративного технологического процесса для гибридного связывания, показывающего получение библиотеки с использованием способа тагментации на основе бусин; любой пригодный способ получения библиотеки можно использовать перед обогащением. Примечательно, что включен только один цикл гибридизации и связывания. На ФИГ. 9B показана схема иллюстративного технологического процесса для гибридного связывания. На ФИГ. 9C показана схема иллюстративного технологического процесса для не включающего ПЦР гибридного связывания. На ФИГ. 9D показана схема иллюстративного технологического процесса для не включающего ПЦР гибридного связывания с укороченным временем гибридизации.

[0049] На ФИГ. 10 показаны результаты обогащения с дополненным считыванием, достигнутые с использованием BN001 и BN002 (немодифицированных блокаторов); BX003 и BX007 (модифицированных блокаторов с G-фиксатором); BN007 и BN008 (блокаторов, модифицированных с использованием БНК и дезоксиинозина); BN005 и BN006 (БНК и модифицированных специфических для последовательности блокаторов); или BN023, BN024, BN025 и BN026 (разделенных блокаторов, модифицированных с использованием ЗНК), как описано в примере 8.

[0050] На ФИГ. 11 показаны результаты обогащения с дополненным считыванием, достигнутые с использованием BN001 и BN002 (немодифицированных блокаторов) или BN023, BN024, BN025 и BN026 (модифицированных с использованием ЗНК разделенных блокаторов), когда соответствующий адаптер включает 8-нуклеотидный индекс или 10-нуклеотидный индекс, как описано в примере 9.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0051] Настоящее изобретение относится к композициям, включающим блокатор и/или буфер для гибридизации, и к способам улучшения эффективности отбора нуклеиновой кислоты перед секвенированием, включающим способы применения этих композиций и способов, включающие гибридное связывание.

Обогащение посредством гибридного связывания

[0052] Множество способов можно использовать для обогащения желательных последовательностей из комплексного пула нуклеиновых кислот. Эти способы включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), инвертируемые молекулярные зонды (MIP), или связывание последовательности посредством формирования гибрида («гибридное связывание»). См., например, Mamanova et al., Nat. Methods 7:111-118 (2010)); Публикацию патента США No. 2014/0031240; и Публикацию патента США No. 2017/0114404.

[0053] В секвенировании нового поколения (NGS), как правило, используют способ гибридного связывания для обогащения. Полученный пул матриц для NGS - библиотеку - денатурируют нагреванием и смешивают с пулом связывающих олигонуклеотидов-зондов («зондов»). Зонды сконструированы для гибридизации с представляющими интерес областями в геноме-мишени и обычно имеют длину 60-200 оснований, и дополнительно модифицированы для содержания лиганда, позволяющего последующее связывание связанных зондов. Обычный способ связывания включает группу (или группы) биотина на зондах. После завершения гибридизации для формирования гибридов ДНК-матрица-зонд, проводят связывание с компонентом, имеющим аффинность только для зонда, как показано в одном варианте осуществления на ФИГ. 1A. Например, покрытые стрептавидином магнитные бусины можно использовать для связывания группы биотина из биотинилированных зондов, гибридизующихся с желательными ДНК-мишенями из библиотеки. Промывка удаляет несвязанные нуклеиновые кислоты, уменьшая комплексность удержанного материала. Затем удержанный материал элюируют с магнитных бусин и вводят в способ автоматизированного секвенирования.

[0054] Несмотря на то, что гибридизация ДНК с зондами может являться исключительно специфической, нежелательные последовательности остаются в обогащенном пуле после завершения способа гибридного связывания. Наибольшая фракция этих нежелательных последовательностей присутствует из-за событий нежелательной гибридизации между членами библиотеки, не имеющими комплементарности с зондами, и членами библиотеки, имеющими комплементарность (то есть, целевым членом библиотеки). Два типа последовательностей приводят к нежелательной гибридизации во время способов гибридного связывания: (1) элементы ДНК с высоким содержанием повторяющихся последовательностей, обнаруженные в эндогенной геномной ДНК; и (2) концевые адаптерные последовательности, сконструированные в каждом из членов библиотеки.

[0055] Повторяющиеся эндогенные элементы ДНК, такие как последовательность Alu или последовательность длинных диспергированных ядерных повторов (LINE), присутствующие в одном фрагменте ДНК в комплексном пуле, могут гибридизоваться с другим сходным элементом, присутствующим в другом неродственном фрагменте ДНК. Эти фрагменты, которые могут исходно происходить из совсем различных локализаций в геноме, становятся связанными в ходе процесса гибридизации в способе гибридного связывания. Если один из этих фрагментов ДНК представляет собой желательный фрагмент, содержащий участок связывания для зонда, нежелательный фрагмент может связываться вместе с желательным фрагментом. Этот класс нецелевых членов библиотеки можно уменьшать посредством добавления избытка повторяющихся элементов в буфер для гибридизации в реакции гибридизации. Наиболее часто, ДНК Cot-1 человека (которая связывает Alu, LINE и другие участки повторов в мишени, и блокирует способность матриц для NGS взаимодействовать друг с другом на этой основе) добавляют в буфер для гибридизации.

[0056] Неспецифические (также обозначенные как нецелевые) члены библиотеки могут также связываться из-за взаимодействий между концевыми адаптерными последовательностями в индивидуальных членах библиотеки. Как правило, члены библиотеки включают фрагмент последовательности из представляющего интерес гена, например, фрагмент для секвенирования. Если член является целевым, последовательность из представляющего интерес гена формирует дуплекс со связывающим зондом. Целевые последовательности могут включать, например, экзон или интрон (или его фрагмент), кодирующую область или некодирующую область, энхансер, нетранслируемую область, специфический SNP и т.д. Как правило, члены библиотеки также включают одну или несколько нецелевых последовательностей. Эти нецелевые последовательности, как правило, не включают представляющую интерес последовательность-мишень, но включают, например, адаптер. Поскольку пул членов библиотеки, как правило, может содержать по меньшей мере некоторые идентичные концевые адаптерные последовательности, адаптерные последовательности присутствуют в очень высокой эффективной концентрации(концентрациях) в растворе для гибридизации. Следовательно, члены библиотеки, содержащие нецелевые последовательности, могут гибридизоваться со связанными последовательностями-мишенями посредством частей присоединенных к ним адаптерных последовательностей, таким образом, приводя к связыванию нецелевых последовательностей вместе с целевыми членами библиотеки (например, посредством конкатенации или «гирлянды» последовательностей, связанных вместе), как показано в одном варианте осуществления на ФИГ. 1B. Поскольку гибридизованная последовательность-мишень включает участок связывания для зонда, вся гирлянда может связываться. Таким образом, связывание одного желательного фрагмента может захватывать с собой большое количество нежелательных фрагментов, уменьшая общую эффективность обогащения для желательного фрагмента.

[0057] В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к способам и композициям для минимизации отбора нецелевой нуклеиновой кислоты посредством гибридного связывания.

Олигонуклеотид-блокатор

[0058] В одном аспекте, настоящее изобретение относится к «олигонуклеотиду-блокатору» (также обозначенному в настоящем описании как «блокатор») и к способу предотвращения отбора нецелевой нуклеиновой кислоты во время гибридного связывания посредством использования блокатора для связывания (например, формирования дуплекса) по меньшей мере с частью адаптерной последовательности. При использовании, как показано в одном варианте осуществления на ФИГ. 2, связывание блокатора с адаптерной последовательностью предотвращает взаимодействия между адаптерными последовательностями в нецелевых продуктах препарата библиотеки - включающие, например, формирование конкатенированных цепей - которые могут приводить к выделению нежелательных членов библиотеки во время гибридного связывания.

[0059] В некоторых вариантах осуществления, можно использовать по меньшей мере два блокатора, со связыванием (например, формированием дуплекса) первого блокатора с первой адаптерной последовательностью, и связыванием (например, формированием дуплекса) второго блокатора с второй адаптерной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления, первая адаптерная последовательность может находиться на 5'-конце члена библиотеки и вторая адаптерная последовательность может находиться на 3'-конце члена библиотеки. В некоторых вариантах осуществления, можно использовать множество различных блокаторов.

[0060] В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид формирует дуплекс с адаптерной последовательностью по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 членов библиотеки, и полученный дуплекс имеет T_m, превышающую T_m дуплекса, сформированного адаптерной последовательностью с фоновой нуклеиновой кислотой, включающей, например, комплементарную адаптеру последовательность.

[0061] В некоторых вариантах осуществления, комплекс блокатор-адаптер имеет более высокую T_m, чем комплекс адаптер-адаптер. Такая увеличенная T_m означает, что комплекс блокатор-адаптер с большей вероятностью формируется до комплекса адаптер-адаптер, что может предотвращать нецелевое связывание (например, посредством предотвращения формирования гирлянд). В некоторых вариантах осуществления, T_m олигонуклеотидного дуплекса блокатор-адаптер по меньшей мере на 1,5°C, по меньшей мере на 2°C, по меньшей мере на 3°C, по меньшей мере на 4°C, по меньшей мере на 5°C, по меньшей мере на 10°C, по меньшей мере на 15°C, по меньшей мере на 20°C или по меньшей мере на 25°C больше, чем T_m дуплекса адаптера с точно комплементарной ему последовательностью. В некоторых вариантах осуществления, T_m олигонуклеотидного дуплекса блокатор-адаптер составляет самое большее на 2°C, самое большее на 3°C, самое большее на 4°C, самое большее на 5°C, самое большее на 10°C, самое большее на 15°C, самое большее на 20°C, самое большее на 25°C или самое большее на 30°C больше, чем T_m дуплекса адаптера с точно комплементарной ему последовательностью.

[0062] В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид имеет скорость связывания с адаптерной последовательностью по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, или по меньшей мере 200 членов библиотеки, превышающую скорость связывания адаптерной последовательности с фоновой нуклеиновой кислотой, включающей, например, комплементарную адаптеру последовательность. В некоторых вариантах осуществления, скорость связывания является по меньшей мере в 2 раза большей, по меньшей мере в 4 раза большей, по меньшей мере в 6 раз большей, по меньшей мере в 8 раз большей или по меньшей мере в 10 раз большей. В некоторых вариантах осуществления, скорость связывания является самое большее, в 4 раза большей, самое большее в 6 раза большей, самое большее в 8 раз большей, самое большее в 10 раз большей, или самое большее в 12 раз большей.

[0063] В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид имеет скорость диссоциации от адаптерной последовательности по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 членов библиотеки, меньшую, чем скорость диссоциации адаптерной последовательности от фоновой нуклеиновой кислоты, включающей, например, комплементарную адаптеру последовательность. В некоторых вариантах осуществления, скорость диссоциации является по меньшей мере в 2 раза более низкой, по меньшей мере в 4 раза более низкой, по меньшей мере в 6 раз более низкой, по меньшей мере в 8 раз более низкой или по меньшей мере в 10 раз более низкой. В некоторых вариантах осуществления, скорость связывания является самое большее в 4 раза более низкой, самое большее в 6 раз более низкой, самое большее в 8 раз более низкой, самое большее в 10 раз более низкой или самое большее в 12 раз более низкой.

[0064] В некоторых вариантах осуществления, дуплекс, сформированный между блокирующим олигонуклеотидом и адаптерной последовательностью по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, или по меньшей мере 200 членов библиотеки, длиннее, чем дуплекс, сформированный между адаптерной последовательностью и комплементарной ей последовательностью, включая, например, дуплекс между цепями Уотсона и Крика двухцепочечного адаптера. В некоторых вариантах осуществления, дуплекс между блокирующим олигонуклеотидом и адаптерной последовательностью по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 2, по меньшей мере на 3, по меньшей мере на 4, по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 6, по меньшей мере на 7, по меньшей мере на 8, по меньшей мере на 9, по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 15 или по меньшей мере на 20 нуклеотидов длиннее, чем дуплекс, сформированный между адаптерной последовательностью и комплементарной ей последовательностью.

[0065] В некоторых вариантах осуществления, блокатор предпочтительно включает модификацию, увеличивающую T_m блокатора, по сравнению с олигонуклеотидом, имеющим такую же последовательность, как блокатор, который не включает модификацию. Например, в некоторых вариантах осуществления, блокатор может представлять собой «олигонуклеотид с увеличенной T_m», представляющий собой олигонуклеотид, который включает по меньшей мере одну модифицированную группу, обеспечивающую увеличенное значение температуры плавления для дуплекса нуклеиновой кислоты, который включает, в качестве партнера по гибридизации, этот олигонуклеотид, по сравнению с дуплексом нуклеиновой кислоты который включает, в качестве партнера по гибридизации, олигонуклеотид, имеющий идентичный состав нуклеиновых оснований и немодифицированные группы. «Олигонуклеотид с увеличенной T_m» дополнительно описан в Публикации патента США No. 2014/0031240.

[0066] В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает один или несколько неприродных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, дуплекс, сформированный между блокирующим олигонуклеотидом, имеющим неприродные нуклеотиды, и адаптерной последовательностью по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 членов библиотеки, имеет значение параметра, относящегося к взаимодействию связывания (например, аффинности, скорости связывания, величины, обратной скорости диссоциации, или T_m), превышающее значение для нецелевой последовательности нуклеиновой кислоты и фоновой нуклеиновой кислоты, например, других комплементарных нецелевых последовательностей нуклеиновой кислоты.

[0067] В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает модифицированное основание. Любое пригодное модифицированное основание можно включать в блокатор. В некоторых вариантах осуществления, модификация, предпочтительно, включает увеличивающую T_m модификацию, то есть, модификацию, которая увеличивает T_m комплекса блокатор-адаптер, включающего модифицированное основание, по сравнению с T_m комплекса блокатор-адаптер, который имеет такую же последовательность, но не включает модифицированное основание. Такая увеличивающая T_m- модификация может включать, например, ДНК- или РНК-олигонуклеотид, модифицированный для связывания областей с низким содержанием GC; перекрестно сшитый олигонуклеотид; модифицированный 5-метилдезоксицитидин (5-метил-dc); 2,6-диаминопурин; запертую нуклеиновую кислоту (ЗНК); мостиковую нуклеиновую кислоту (также обозначенную как бициклическая нуклеиновая кислота или БНК); трициклическую нуклеиновую кислоту; пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК); C5-модифицированное пиримидиновое основание; пропинилпиримидин; морфолино; фосфорамидит; 5'-пиреновый кэп; и т.д. В некоторых вариантах осуществления, ЗНК включает группу рибозы из нуклеотида, модифицированного с использованием дополнительного мостика, соединяющего 2′-кислород и 4′-углерод. Иллюстративные БНК описаны, например, в Патенте США No. 7399845, Патенте США No. 7427672, Патенте США No. 7547684, Патенте США No. 7696345, Патенте США No. 7741457, Патенте США No. 8022193, Патенте США No. 8268980, Патенте США No. 8278425, Патенте США No. 8278426, Патенте США No. 8846637, Патенте США No. 8846639 и Патенте США No. 9546368. В некоторых вариантах осуществления, БНК могут включать конформационно ограниченную этилом нуклеиновую кислоту от Ionis Pharmaceuticals (Carlsbad, CA) или нуклеиновую кислоту с 2'-O,4'-аминоэтиленовым мостиком от Biosynthesis, Inc. (Lewisville, TX). В некоторых вариантах осуществления, ПНК включает повторяющиеся N-(2-аминоэтил)-глициновые звенья, связанные пептидными связями. В некоторых вариантах осуществления, трициклическая нуклеиновая кислота включает трициклическую нуклеиновую кислоту, описанную, например, в Патенте США No. 9221864. Иллюстративные фосфорамидиты включают 1-[5'-O-(4,4'-диметокситритил)-β-D-2'-дезоксирибофуранозил]-9-(2-трифторацетамидоэтокси)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин,3'-[(2-цианоэтил)-(N, N-диизопропил)]фосфорамидит (AP-dC-CE фосфорамидит), 5'-диметокситритилуридин,2'-O-метил,3'-[(2-цианоэтил)-(N, N-диизопропил)]-фосфорамидит (2'-OMe-U-CE фосфорамидит), 5'-диметокситритил-N-ацетил-5-метилцитидин,2'-O-метил,3'-[(2-цианоэтил)-(N, N-диизопропил)]-фосфорамидит (2'-OMe-5-Me-C-CE фосфорамидит), 5'-диметокситритил-N-ацетилцитидин,2'-O-метил,3'-[(2-цианоэтил)-(N, N-диизопропил)]-фосфорамидит (2'-OMe-Ac-C-CE-фосфорамидит) и т.д.

[0068] В некоторых вариантах осуществления, модификация, увеличивающая T_m блокатора, по сравнению с олигонуклеотидом, имеющим такую же последовательность, как блокатор, который не включает модификацию, может включать не относящуюся к основанию модификацию. Такая модификация может включать, например, средство, связывающее малую бороздку (MGB), спермин, G-фиксатор, или антрахиноновый кэп Uaq.

[0069] В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид имеет длину самое большее 45, самое большее 50, самое большее 55, самое большее 60, самое большее 70, самое большее 80, самое большее 90, самое большее 100, самое большее 150 или самое большее 200 нуклеотидов.

[0070] В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид может включать множество модификаций, увеличивающих T_m блокатора. В некоторых вариантах осуществления, предпочтительное количество модификаций представляет собой то количество, которое обеспечивает увеличение оптимального значения T_m в строгих условиях (0,1×SSC) («оптимальное увеличенное значение T_m») по меньшей мере приблизительно на 1,4°C для дуплекса ДНК, содержащего модификацию(модификации), как одной комплементарной цепи. В некоторых вариантах осуществления, предпочтительное количество модификаций в блокирующем олигонуклеотиде с увеличенной T_m обеспечивает T_m олигонуклеотидного дуплекса блокатор-адаптер по меньшей мере на 1,5°C, по меньшей мере на 2°C, по меньшей мере на 3°C, по меньшей мере на 4°C, по меньшей мере на 5°C, по меньшей мере на 10°C, по меньшей мере на 15°C, по меньшей мере на 20°C или по меньшей мере на 25°C больше, чем T_m дуплекса адаптера с точно комплементарной ему последовательностью. В некоторых вариантах осуществления, предпочтительное количество модификаций в блокирующем олигонуклеотиде с увеличенной T_m обеспечивает T_m олигонуклеотидного дуплекса блокатор-адаптер самое большее на 2°C, самое большее на 3°C, самое большее на 4°C, самое большее на 5°C, самое большее на 10°C, самое большее на 15°C, самое большее на 20°C, самое большее на 25°C, или самое большее на 30°C больше, чем T_m дуплекса адаптера с точно комплементарной ему последовательностью.

[0071] В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид может включать модификации по меньшей мере 2 процентов (%), по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% оснований в блокирующем олигонуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид может включать модификации самое большее 5%, самое большее 10%, самое большее 20%, самое большее 30%, самое большее 40%, самое большее 50%, самое большее 60%, самое большее 70%, самое большее 80%, самое большее 90%, или самое большее 100% оснований в блокирующем олигонуклеотиде.

[0072] В некоторых вариантах осуществления, модификация блокатора может быть включена в конкретный паттерн. Например, модифицированное основание можно включать через каждые 2 основания (см., например, таблицу 2A, BN021 и BN022), через каждые 3 основания (см., например, таблицу 2A, BN035 и BN036), через каждые 4 основания или через каждые 5 оснований, или в некоторой их комбинации (см., например, таблицу 2A, BN036). В некоторых вариантах осуществления, каждое основание в блокаторе может являться модифицированным (см., например, таблицу 2A, BN027 и BN028). В некоторых вариантах осуществления, гуанин - который имеет более высокую аффинность, чем другие нуклеотиды, когда модифицирован - может являться предпочтительно модифицированным. Например, в некоторых вариантах осуществления, форму ЗНК или БНК гуанина можно включать в блокатор.

[0073] В некоторых вариантах осуществления, блокатор может включать концевую модификацию. Например, блокатор может включать 3'-концевую группу, которая препятствует доступности блокатора, чтобы служить праймером для синтеза ДНК. Такая 3'-концевая группа может включать, например, 3′-dC, 2′,3′-ddC (также обозначенный в настоящем описании как 3ddc), инвертированный dT, 3′-спейсер C3 (также обозначенный в настоящем описании как 3SpC3) и т.д.

[0074] Блокатор может связываться (например, формировать дуплекс) с любой пригодной адаптерной последовательностью (включая любую ее часть). В рамках изобретения, часть последовательности блокатора, которая связывается (например, формирует дуплекс) с частью последовательности адаптера, обозначена как часть последовательности блокатора, которая «соответствует» части последовательности адаптера. В некоторых вариантах осуществления, соответствующая последовательность может являться точно комплементарной последовательности адаптера. В некоторых вариантах осуществления, однако, самое большее 1, самое большее 2, самое большее 3, самое большее 4, самое большее 5, самое большее 6, самое большее 7, самое большее 8, самое большее 9 или самое большее 10 оснований в соответствующей последовательности могут не являться комплементарными.

[0075] В некоторых иллюстративных вариантах осуществления, блокатор может связываться с адаптером, как показано в таблице 1. (Адаптерные последовательности показаны в таблице 1A и дополнительная информация о последовательности компонентов показана в таблице 1B.) В некоторых иллюстративных вариантах осуществления, блокатор может связываться с адаптером, включающим последовательность, описанную в адаптерных последовательностях Illumina (доступных во всемирной сети интернет на support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences-1000000002694-07.pdf

[0076] В некоторых вариантах осуществления, блокатор связывается с адаптером, где адаптер включает универсальную последовательность, включающую, например, последовательность универсального адаптера и/или универсального праймера. В некоторых вариантах осуществления, последовательность универсального праймера может включать P5, P7, P5' и/или P7'. В некоторых вариантах осуществления, последовательность универсального праймера может включать последовательность V2.A14.METS, последовательность V2.B15.METS, последовательность, комплементарную V2.A14.METS, и/или последовательность, комплементарную V2.B15.METS. Например, BN001, как показано в таблице 2A, включает P5 и последовательность V2.A14.METS; BN002, как показано в таблице 2A, включает P7 и последовательность V2.B15.METS; BN003, как показано в таблице 2A, включает P5' и последовательность, обратно комплементарную V2.A14.METS; BN004, как показано в таблице 2A, включает P7' и последовательность, обратно комплементарную V2.B15.METS.

[0077] В некоторых применениях секвенирования, является желательным, чтобы члены библиотеки включали по меньшей мере одну последовательность индекса и/или UMI. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, блокатор связывается с адаптером, где адаптер включает по меньшей мере один из индекса и UMI. В Публикации патента США No. 2014/0031240 описаны «три способа, которые можно использовать для получения блокирующих олигонуклеотидов» для адаптеров, включающих индекс (где Публикация патента США No. 2014/0031240 относится к «домену штрих-кода»): «1) синтезировать серию блокаторов, которые точно совпадают с каждым адаптером, 2) синтезировать один блокатор с N-членным доменом для спаривания с доменом штрих-кода адаптера, или 3) синтезировать один блокатор с доменом из универсальных оснований для спаривания с доменом штрих-кода адаптера». Поскольку каждый отличный индекс и/или UMI имеет уникальную последовательность, полностью комплементарный блокатор, как в способе 1, представляет собой последовательность, включающую точное комплементарное совпадение с каждой присутствующей последовательностью индекса и/или UMI (см. ФИГ. 3A). Однако, если используют множество отдельных индексов и/или UMI, включение блокатора, имеющего точное комплементарное совпадение, требует десятков или сотен уникальных блокаторов для мультиплексной амплификации - способ, который является экономически неэффективным.

[0078] В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к блокаторам для адаптеров, включающих индекс и/или включающих UMI, и к способам использования таких блокаторов, например,

блокатор, который включает тимин в области блокатора, соответствующей индексу и/или UMI (ФИГ. 3D и пример 2);

блокатор, который включает универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание (ФИГ. 5 и пример 3); или блокатор, который не включает индексную область (включая, например, «разделенный блокатор» или блокатор, который спаривается только с частью адаптера) (ФИГ. 3E-ФИГ. 3I, ФИГ. 6A,и примеры 4, 8, и 9).

[0079] В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает по меньшей мере одну из последовательностей из таблицы 2A, таблицы 2B, таблицы 2C или таблицы 3. В некоторых вариантах осуществления, последовательности из таблицы 2A можно использовать, следуя способу тагментации (например, NEXTERA) для получения библиотеки (Illumina, Inc., San Diego, CA). В некоторых вариантах осуществления, последовательности из таблицы 2B можно использовать, следуя получению библиотеки на основе лигирования и/или получению TRUSEQ (Illumina, Inc., San Diego, CA). В некоторых вариантах осуществления, последовательности из таблицы 2C можно использовать, следуя способу тагментации (например, NEXTERA) для получения библиотеки (Illumina, Inc., San Diego, CA). В некоторых вариантах осуществления, если последовательность из таблицы 2 включает БНК-модифицированную нуклеиновую кислоту, БНК-модифицированная нуклеиновая кислота может включать 2'-O,4'-аминоэтиленмостиковую нуклеиновую кислоту от Biosynthesis, Inc. (Lewisville, TX). В некоторых вариантах осуществления, если последовательность из таблицы 2 включает ЗНК-модифицированную нуклеиновую кислоту, ЗНК-модифицированная нуклеиновая кислота может включать содержащий ЗНК олигонуклеотид от Qiagen (Hilden, Germany). Дополнительную информацию о компонентах последовательностей из таблицы 2A, таблицы 2B и таблицы 2C можно обнаружить в таблице 1B и таблице 2D.

[0080] В другом аспекте, настоящее изобретение относится к набору, который включает блокирующий олигонуклеотид. Блокирующий олигонуклеотид может включать блокатор, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, блокирующий олигонуклеотид представляет собой множество блокирующих олигонуклеотидов. Набор может дополнительно включать одно или несколько из: буфера для гибридизации, зонда, панели зондов и проточной ячейки. Буфер для гибридизации может включать буфер для гибридизации, как описано в другом месте в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, зонд(ы) являются такими, как описано в другом месте в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, компоненты можно предоставлять в отдельных контейнерах. Например, блокирующий олигонуклеотид можно предоставлять в первом контейнере и другой компонент, например, буфер для гибридизации или зонд, или панель зондов, можно предоставлять в другом контейнере(контейнерах). Альтернативно, блокирующий олигонуклеотид и буфер для гибридизации можно предоставлять в первом контейнере, и зонд или панель зондов можно предоставлять в другом контейнере(контейнерах).

Таблица 1A - Иллюстративные адаптерные последовательности

SEQ ID NO Ссылочный No. Наименование олигонуклеотида Последовательность 1 TN001 NEXTERA 8 н. адаптер - i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 2 TN002 NEXTERA 8 н. адаптер - i7 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG 3 TN003 NEXTERA 10 н. адаптер - i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 4 TN004 NEXTERA 10 н. адаптер - i7 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG 5 TN005 NEXTERA короткий адаптер - i5 5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGT 6 TN006 NEXTERA короткий адаптер - i7 5'- CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC 7 TN007 NEXTERA адаптер nrUMI - i5 5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTNNNNNNT 8 TN008 NEXTERA адаптер nrUMI - i7 /5-фосфо/NNNNNNCTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC 9 TL001 TRUSEQ универсальный адаптер - i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 10 TL002 TRUSEQ 6 н. адаптер - i7 5'- GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 11 TL003 TRUSEQ 8 н. адаптер - i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 12 TL004 TRUSEQ 8 н. адаптер - i7 5'- GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 13 TL005 TRUSEQ 10 н. адаптер - i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 14 TL006 TRUSEQ 10 н. адаптер - i7 5'- GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 15 TL007 TRUSEQ короткий адаптер - i5 5'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 16 TL008 TRUSEQ короткий адаптер - i7 /5-фосфо/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 17 TL009 TRUSEQ адаптер nrUMI - i5 5'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNT 18 TL010 TRUSEQ адаптер nrUMI -i5 /5-фосфо/NNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

Таблица 1B

SEQ ID NO Описание Последовательность 19 Последовательность p5 AATGATACGGCGACCACCGA 20 Последовательность p7 TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 21 Последовательность, обратно комплементарная P7 (P7') CAAGCAGAAGACGGCATACGA 22 TRUSEQ область адаптера i7 GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 23 TRUSEQ Область адаптера i5 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC 24 Последовательность V2.A14.METS TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 25 Последовательность V2.B15.METS GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG Индексная последовательность (8 или 10 нуклеотидов) [i7] или [i5] 26 N-членный домен (смесь из 25% каждого из A, T, C, G) (например, UMI) NNNNNN 5' фосфорилирование /5-фосфо/

Таблица 2A - Иллюстративные последовательности блокаторов

SEQ ID NO Ссылочный No Наименование олигонуклеотида Последовательность 27 BN001 NEXTERA блокатор 1 i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTTTTTTTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG/3ddC/-3' 28 BN002 NEXTERA блокатор 2 i7 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG/3ddC/-3' 29 BN003 Праймер C NRCBLK1 5'- GCT GTC TCT TAT ACA CAT CTG ACG CTG CCG ACG ATT TTT TTT GTG TAG ATC TCG GTG GTC GCC GTA TCA TT 30 BN004 Праймер C NRCBLK2 5'- GCT GTC TCT TAT ACA CAT CTC CGA GCC CAC GAG ACT TTT TTT TAT CTC GTA TGC CGT CTT CTG CTT G 31 BN005 TiS517 с примером спаривания оснований индексной последовательности 5' -AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCTA+CACG+CGTA+AGATCG+TCGG+CAGCG+TCAGATG+TGTATAA+GAGACAG/3SpC3/ 32 BN006 TiS701 с примером спаривания оснований индексной последовательности 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGATT+CGCCTTAG+TCT+CGTGGGC+TCGGAGA+TGTGTATAA+GAGACAG/3SpC3/ 33 BN007 TiБНК7 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 34 BN008 TiБНК8 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 35 BN009 TiЗНК7 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 36 BN010 TiЗНК8 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 37 BN011 TiБНК11 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI//iдезоксиI/+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 38 BN012 TiБНК12 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI/+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 39 BN013 TiБНК15G 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI/+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 40 BN014 TiБНК16G 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 41 BN015 TiБНК15N 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI/+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 42 BN016 TiБНК16N 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI/+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 43 BN017 TiЗНК11 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI//iдезоксиI/+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 44 BN018 TiЗНК12 5'- CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI/+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TATAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 45 BN019 TiЗНК15G 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI/+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 46 BN020 TiЗНК16G 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 47 BN021 TiЗНК15N 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI/+TCG+TCG+GCA+GCG+TCAGATG+TGTA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 48 BN022 TiЗНК16N 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI/+GTC+TCG+TGGGC+TCGG+AGA+TGTG+TA+TAA+GAGA+CAG/3SpC3/ 49 BN023 P5ЗНК 5' - AATGA+TAC+GGC+GAC+CAC+CGA+GAT+CTA+CAC/3SpC3/ 50 BN024 P7ЗНК 5' - CAAGC+AGA+AGA+CGG+CAT+ACG+A+GA+T/3SpC3/ 51 BN025 TiЗНКS1 5' - TCGTC+GGC+AGC+GTC+AGA+TGT+GTA+TAA+GAG+ACA+G/3SpC3/ 52 BN026 TiЗНКS2 5' - GTCT+CGT+GGGC+TCG+GAG+ATG+TGT+ATAA+GAG+ACA+G/3SpC3/ 53 BN027 TiЗНК17 5' - GGCGAC+CAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+TCG+TCG+GCA+GCG+TCA+GATG+TG/3SpC3/ 54 BN028 TiЗНК18 5' - GGCA+TAC+GAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTC+TCG+TGG+GC+TCGG+AGA+TGTG+TATAA+GAG/3SpC3/ 55 BN029 P5БНК-полностью 5' - +A+A+T+G+A+T+A+C+G+G+C+G+A+C+C+A+C+C+G+A+G+A+T+C+T+A+C+A+C/3SpC3/ 56 BN030 P7БНК-полностью 5' - +C+A+A+G+C+A+G+A+A+G+A+C+G+G+C+A+T+A+C+G+A+G+A+T/3SpC3/ 57 BN031 TiБНКS1-полностью 5' - +T+C+G+T+C+G+G+C+A+G+C+G+T+C+A+G+A+T+G+T+G+T+A+T+A+A+G+A+G+A+C+A+G/3SpC3/ 58 BN032 TiБНКS2-полностью 5' - +G+T+C+T+C+G+T+G+G+G+C+T+C+G+G+A+G+A+T+G+T+G+T+A+T+A+A+G+A+G+A+C+A+G/3SpC3/ 59 BN033 P5БНК-половина 5' - AA+TG+AT+AC+GG+CG+AC+CA+CC+GA+GA+TC+TA+CA+C/3SpC3/ 60 BN034 P7БНК-половина 5' - C+AA+GC+AG+AA+GA+CG+GC+AT+A+C+G+A+G+A+T/3SpC3/ 61 BN035 TiБНКS1-половина 5' - TC+GT+CG+GC+AG+CG+TC+AG+AT+GT+GT+AT+AA+GA+GA+CA+G/3SpC3/ 62 BN036 TiБНКS2-половина 5' - G+TC+TC+GT+GG+GC+TC+GG+AG+AT+GT+GT+AT+AA+GA+GA+CA+G/3SpC3/ 63 BN037 P5БНК-Alt 5' - A+AT+GA+TA+CG+GC+GA+CC+AC+CG+AG+AT+CT+AC+A+C/3SpC3/ 64 BN038 P7БНК-Alt 5' - +CA+AG+CA+GA+AG+AC+GG+CA+T+A+C+G+A+G+A+T/3SpC3/ 65 BN039 TiБНКS1-Alt 5' - T+CG+TC+GG+CA+GC+GT+CA+GA+TG+TG+TA+TA+AG+AG+AC+A+G/3SpC3/ 66 BN040 TiБНКS2-Alt 5' - +GT+CT+CG+TG+GG+CT+CG+GA+GA+TG+TG+TA+TA+AG+AG+AC+A+G/3SpC3/ 67 BN041 TiБНК3 5' - AATGATACGGCGACCACCGAGA+TCTACACTTTTTTTTTCG+TCGG+CAGCG+TCAGATG+TGTATAA+GAGACAG/3ddC/ 68 BN042 TiБНК4 5' - 5'CAAGCAGAAGACGGCA+TACGAGATTTTTTTTTG+TCT+CGTGGGC+TCGGAGATG+TGTATAA+GAGACAG/3ddC/ 69 BN043 TiБНК1 5' - AATGATACGGCGACCACCGAGAT+CTACACTTTTTTTTT+CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGA+CAG/3ddC/ 70 BN044 TiБНК2 5' - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGT+CTCGTGGGCT+CGGAGATGTGTATAAGAGA+CAG/3ddC/

Таблица 2B - Иллюстративные последовательности блокаторов

SEQ ID NO Ссылочный No Наименование олигонуклеотида Последовательность 71 BL001 Блокатор 1 CT3 i7 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC/3ddC/ 72 BL002 Блокатор 2 CT3 i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC/3ddC/ 73 BL003 TSLTЗНК13 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 74 BL004 TSLTЗНК14 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGT+GCT+CTTCCG+ATC/3ddC/ 75 BL005 TSHTЗНК13 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 76 BL006 TSHTЗНК14 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ 77 BL007 TSHTЗНК15 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI//iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 78 BL008 TSHTЗНК16 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ 79 BL009 TSHTЗНК15G 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 80 BL010 TSHTЗНК16G 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ 81 BL011 TSHTЗНК15N 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI//iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 82 BL012 TSHTЗНК16N 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ 83 BL013 TSLTБНК13 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 84 BL014 TSLTБНК14 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ 85 BL015 TSHTБНК13 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 86 BL016 TSHTБНК14 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ 87 BL017 TSHTБНК15 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ 88 BL018 TSHTБНК16 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
/iдезоксиI//iдезоксиI/+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/

Таблица 2C - Иллюстративные последовательности блокаторов

SEQ ID NO Ссылочный No Наименование олигонуклеотида Последовательность 89 BX001 NEXTERA блокатор 1_2X 5' - AATGATAXGGCGACCACCGAGATCTACACTTTTTTTTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAxAG/3ddC/ 90 BX002 NEXTERA блокатор 1_3X 5' - AATGATAXGGCGACCACCGAGATXTACACTTTTTTTTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAXAG/3ddC/ 91 BX003 NEXTERA блокатор 1_2Xalt 5' - AATGATACGGCGACCACCGAGATXTACACTTTTTTTTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAxAG/3ddC/ 92 BX004 NEXTERA блокатор 1_3Xalt 5' - AATGATACGGCGACCACCGAGATXTACACTTTTTTTTTXGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAxAG/3ddC/ 93 BX005 NEXTERA блокатор 2_2X 5' - CAAGXAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGAXAG/3ddC/ 94 BX006 NEXTERA блокатор 2_3X 5' - CAAGXAGAAGACGGCATAXGAGATTTTTTTTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGAXAG/3ddC/ 95 BX007 NEXTERA блокатор 2_2Xalt 5' - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGTXTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGAXAG/3ddC/ 96 BX008 NEXTERA блокатор 2_3Xalt 5' - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGTXTCGTGGGCTXGGAGATGTGTATAAGAGAXAG/3ddC/ 97 BX009 NEXTERA блокатор 1_5X4Y 5' - AATGATAXGGCGAXCACCGAGATXTACACTTTTTTTTTCGTCGGXAGCGTCAGAYGYGYAYAAGAGAXAG/3ddC/-3' 98 BX010 NEXTERA блокатор 2_5X4Y 5' - CAAGXAGAAGAXGGCATAXGAGATTTTTTTTTGTCTCGTGGGXTCGGAGAYGYGYAYAAGAGAXAG/3ddC/-3' 99 BX011 NEXTERA блокатор 1_5X4Y-внешний 5' - AATGATAXGGCGAXCACCGAGATXTACAC 100 BX012 NEXTERA блокатор 1_5X4Y-внутренний 5' - TCGTCGGXAGCGTCAGAYGYGYAYAAGAGAXAG/3ddC/-3' 101 BX013 NEXTERA блокатор 2_5X4Y-внешний 5' - CAAGXAGAAGAXGGCATAXGAGAT 102 BX014 NEXTERA блокатор2_5X4Y-внутренний 5' - GTCTCGTGGGXTCGGAGAYGYGYAYAAGAGAXAG/3ddC/-3'

Таблица 2D

Основания тимина в индексном положении в олигонуклеотидах (8 нуклеотидов) TTTTTTTT (SEQ ID NO: 103) /iдезоксиI/ 2'-дезоксиинозин /3ddC/ 2',3'-дидезоксицитозин /3SpC3/ 3'-спейсер C3 ЗНК- или БНК-модифицированное основание (как указано в столбце «Наименование олигонуклеотида» из таблицы 2A) +A +C +T или +G AP-dC-CE-фосфорамидит X 2'-Ome-U-CE-фосфорамидит Y

Блокатор с тимином

[0081] В некоторых вариантах осуществления, блокатор может включать по меньшей мере три основания тимина, по меньшей мере четыре основания тимина, по меньшей мере пять оснований тимина, по меньшей мере шесть оснований тимина, по меньшей мере семь оснований тимина, по меньшей мере восемь оснований тимина, по меньшей мере девять оснований тимина или по меньшей мере десять оснований тимина в области блокатора, соответствующей индексной области адаптера и/или UMI адаптера (например, области блокатора, которая связывается с индексной областью и/или UMI адаптера).

[0082] В некоторых вариантах осуществления, область блокатора, соответствующая индексной области адаптера и/или UMI адаптера (например, которая связывается с индексной областью и/или UMI адаптера), включает так много оснований тимина, как количество оснований в индексной области адаптера и/или UMI адаптера.

[0083] В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает по меньшей мере одну последовательность из таблицы 2A, таблицы 2B, таблицы 2C или таблицы 3. Некоторые иллюстративные варианты осуществления такого блокатора описаны в примере 2.

Блокатор с универсальными основаниями и по меньшей мере одним неуниверсальным основанием

[0084] В некоторых вариантах осуществления, блокатор может включать универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание в области блокатора, соответствующей индексной области. В рамках изобретения, «универсальное основание» представляет собой модифицированное нуклеиновое основание, которое гибридизуется по меньшей мере с двумя из обычных оснований (например, дезоксиаденозина (A), дезокситимидина (T), дезоксицитидина (C), дезоксигуанозина (G) и уридина (U)). В некоторых вариантах осуществления, универсальное основание гибридизуется с любым из обычных оснований. В рамках изобретения, «неуниверсальное основание» представляет собой нуклеиновое основание (включающее, в некоторых вариантах осуществления, модифицированное нуклеиновое основание), которое гибридизуется только в традиционном взаимодействии пар оснований Уотсона-Крика (например, дезоксиаденозин (A) - дезокситимидин (T) или дезоксигуанозин (G) - дезоксицитидин (C)).

[0085] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одно неуниверсальное основание можно включать в каждое третье основание последовательности блокатора, соответствующей индексной области. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одно неуниверсальное основание может находиться в третьем и/или пятом положениях (от 5'-конца) последовательности блокатора соответствующий индексной области. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одно неуниверсальное основание может находиться во втором и/или четвертом положениях последовательности блокатора соответствующий индексной области. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одно неуниверсальное основание включает модифицированный гуанин. В некоторых вариантах осуществления, модифицированный гуанин может являться ЗНК-модифицированным или БНК-модифицированным. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одно неуниверсальное основание включает случайный (A, T, G или C) нуклеотид.

[0086] Без намерения быть связанными с теорией, считают, что включение модифицированного гуанина или случайного нуклеотида, в дополнение к универсальным основаниям в области блокатора, соответствующей индексной области (как показано в одном варианте осуществления на ФИГ. 5), улучшает аффинность блокатора для члена библиотеки. Некоторые иллюстративные варианты осуществления такого блокатора описаны в примере 3.

[0087] Универсальное основание может включать любое известное универсальное основание. В некоторых вариантах осуществления, универсальное основание, используемое в индексной области, может включать, например, 2'-дезоксиинозин, 2'-дезоксинебуларин, 3-нитропиррол-2'-дезоксинуклеозид или 5-нитроиндол-2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах осуществления, комбинацию универсальных оснований можно использовать в индексной области.

[0088] Модифицированный гуанин может представлять собой гуанин, модифицированный любым пригодным способом, включая, например, ЗНК-модифицированный гуанин, БНК-модифицированный гуанин и т.д. В некоторых вариантах осуществления, модифицированный гуанин, предпочтительно, представляет собой ЗНК-модифицированный гуанин.

[0089] В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает по меньшей мере одну последовательность из таблицы 2A, таблицы 2B, таблицы 2C или таблицы 4.

Разделенные блокаторы

[0090] В некоторых вариантах осуществления, блокатор может включать по меньшей мере два несвязанных олигонуклеотида, где несвязанные олигонуклеотиды включают основания, которые не соответствуют индексной области и/или UMI адаптера (например, включают основания которые не связываются с индексной областью и/или UMI адаптера), или включают основания, которые только частично соответствуют индексной области и/или UMI адаптера (например, включают основания, которые связываются только с частью индексной области и/или UMI адаптера). В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает четыре несвязанных олигонуклеотида.

[0091] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере два несвязанных олигонуклеотида гибридизуются с одной и той же цепью последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере часть блокатора соответствует 5'-концу адаптера и по меньшей мере часть блокатора соответствует 3'-концу того же самого адаптера. В некоторых вариантах осуществления, включая, например, случай, когда блокатор включает четыре несвязанных олигонуклеотида, два несвязанных олигонуклеотида могут гибридизоваться с одной и той же цепью первой последовательности-мишени, и два несвязанных олигонуклеотида могут гибридизоваться с одной и той же цепью второй последовательности-мишени. Иллюстративные варианты осуществления таких блокаторов показаны на ФИГ. 3E-ФИГ. 3I и ФИГ. 6A, и описаны в примерах 4, 8 и 9.

[0092] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере часть блокатора соответствует универсальному праймеру для удлинения. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере часть блокатора соответствует P5, P7, P5' и/или P7'. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере часть блокатора соответствует V2.A14.METS, V2.B15.METS, последовательности, комплементарной V2.A14.METS, и/или последовательности, комплементарной V2.B15.METS.

[0093] В некоторых вариантах осуществления, блокатор может включать такое же количество оснований, как адаптер, исключая часть адаптера, содержащую основания индексной области и/или UMI адаптера. В некоторых вариантах осуществления блокатор может включать на одно основание меньше, на два основания меньше, на три основания меньше, на четыре основания меньше или на пять оснований меньше, чем количество оснований, составляющее часть адаптера, исключая основания индексной области и/или UMI адаптера.

[0094] В некоторых вариантах осуществления, блокатор, включающий больше оснований, может являться предпочтительным включая, например, случай, когда увеличенная эффективность обогащения является желательной. В некоторых вариантах осуществления, блокатор, включающий меньше оснований, может являться предпочтительным, включая, например, случай, когда стоимость блокатора, чистота и/или выход синтеза являются фактором.

[0095] В некоторых вариантах осуществления, самое большее пять оснований блокатора, самое большее четыре основания блокатора, самое большее три основания блокатора, самое большее два основания блокатора, только одно основание блокатора или ни одного основания блокатора могут спариваться с индексной областью адаптера и/или UMI адаптера.

[0096] В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает по меньшей мере одну последовательность (или часть последовательности) из таблицы 2A, таблицы 2B, таблицы 2C или таблицы 5. В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает по меньшей мере один из BN023, BN024, BN025 и BN026 из таблицы 2A. В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает BN023 и BN025 из таблицы 2A. В некоторых вариантах осуществления, блокатор включает BN024 и BN026 из таблицы 2A.

Буфер для гибридизации

[0097] В другом аспекте, настоящее изобретение относится к буферу для гибридизации, включающему средство, оказывающее эффект скученности, и к способам использования этого буфера для гибридизации. В рамках изобретения, «средство, оказывающее эффект скученности», включает соединение, позволяющее, усиливающее или облегчающее молекулярную скученность. В некоторых вариантах осуществления, средство, оказывающее эффект скученности, включает инертную макромолекулу, используемую в концентрации, изменяющей взаимодействие ДНК-белок. «Буфер для гибридизации» определяют как любой буфер, в котором гибрид нуклеотид-зонд может формироваться в качестве части анализа гибридного связывания.

[0098] В некоторых вариантах осуществления, средство, оказывающее эффект скученности, может включать по меньшей мере один из декстрана, декстрансульфата, полиэтиленгликоля (PEG), фиколла, глицерина, бетаина и т.д. Декстран и декстрансульфат могут включать высокомолекулярный декстран (например, декстран, имеющий молекулярную массу по меньшей мере 500000 Да) и/или низкомолекулярный декстран (например, декстран, имеющий молекулярную массу самое большее 10000 Да, самое большее 50000 Да или самое большее 100000 Да). В некоторых вариантах осуществления, средство, оказывающее эффект скученности, предпочтительно, включает декстрансульфат.

[0099] В некоторых вариантах осуществления, средство, оказывающее эффект скученности, можно включать в буфер для гибридизации в количестве по меньшей мере 0,5% массы/объем (масс./об.), по меньшей мере 1% (масс./об.), по меньшей мере 1,5% (масс./об.), по меньшей мере 2% (масс./об.), по меньшей мере 3% (масс./об.) или по меньшей мере 4% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления, средство, оказывающее эффект скученности, можно включать в буфер для гибридизации в количестве самое большее 1% (масс./об.), самое большее 1,5% (масс./об.), самое большее 2% (масс./об.), самое большее 3% (масс./об.), самое большее 4% (масс./об.), самое большее 5% (масс./об.), самое большее 6% (масс./об.), самое большее 8% (масс./об.) или самое большее 10% (масс./об.).

[00100] Как описано в некоторых вариантах осуществления в примере 5 (см., например, ФИГ. 7D-7F), включение средства, оказывающего эффект скученности (например, декстрансульфата), в буфер для гибридизации может, в некоторых вариантах осуществления, позволять уменьшенное время гибридизации и/или гибридизацию в увеличенных объемах (например, более высокое разведение целевого олигонуклеотида) буфера для гибридизации, чем буфера для гибридизации в отсутствие средства, оказывающего эффект скученности. Например, включение декстрансульфата в буфер для гибридизации может являться способным уменьшать время гибридизации от ночи до приблизительно 80 минут при одной температуре или 60 минут с дополнительной стадией линейного изменения температуры.

[00101] В некоторых вариантах осуществления, включение средства, оказывающего эффект скученности, может улучшать специфичность обогащения. Например, один вариант осуществления показан в примере 5 (см. ФИГ. 8A), где специфичность обогащения увеличивали от 45% до 80-95%. В некоторых вариантах осуществления, улучшение специфичности обогащения благодаря включению средства, оказывающего эффект скученности, может являться более выраженным с укорочением времени инкубации.

[00102] В некоторых вариантах осуществления, включение средства, оказывающего эффект скученности, в буфер для гибридизации позволяет реакции обогащения проходить более быстро при более низкой концентрации ДНК (включая, например, в большем относительном объеме буфера для гибридизации). Такое увеличение можно использовать для облегчения «пулирования по объему» и/или исключения стадии концентрирования образца. Как правило, для достижения быстрой реакции гибридизации необходимо использование высокой концентрации ДНК, полученной из препарата библиотеки, и высокой концентрации зондов и, таким образом, в некоторых вариантах осуществления, соответственно малого объема буфера для гибридизации (например, менее чем 20 мкл). Достижение такого малого объема требует стадии концентрирования образца после получения библиотеки (что приводит к увеличению времени и стоимости анализа в целом). С включением средства, оказывающего эффект скученности, в буфер для гибридизации, реакции обогащения можно достигать более быстро, при более низкой концентрации ДНК и/или концентрации зонда (и, в некоторых вариантах осуществления, в большем объеме). В некоторых вариантах осуществления, включение средства, оказывающего эффект скученности, в буфер для гибридизации позволяет комбинирование множества образцов препаратов библиотек в отсутствие стадии концентрирования перед гибридизацией. В некоторых вариантах осуществления, образцы, полученные из различных препаратов библиотек, можно пулировать по объему, как далее описано в настоящем описании, позволяя мультиплексная обогащение. «Множественность» или «плексность» данного мультиплексного обогащения относится к количеству различных препаратов библиотек, которые объединяют до обогащения (например, гибридизации и связывания). В некоторых вариантах осуществления, множественность мультиплексного обогащения может являться самое большее 2-плексной, самое большее 4-плексной, самое большее 6-плексной, самое большее 12-плексной, самое большее 24-плексной, самое большее 48-плексной, самое большее 96-плексной, или выше.

[00103] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации, включающий средство, оказывающее эффект скученности, дополнительно включает по меньшей мере одно из ДНК Cot-1 человека, дестабилизатора, соли и блокатора. В некоторых вариантах осуществления, компоненты буфера для гибридизации, такие как ДНК Cot-1 и блокатор, сохраняют отдельно от компонентов буфера для гибридизации, включающих дестабилизатор и средство, оказывающее эффект скученности, до проведения реакции гибридизации.

[00104] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать ДНК Cot-1 человека в количестве по меньшей мере 0,05 мг/мл, по меньшей мере 0,1 мг/мл, по меньшей мере 0,2 мг/мл, или по меньшей мере 0,3 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать ДНК Cot-1 человека в количестве самое большее 0,1 мг/мл, самое большее 0,2 мг/мл, самое большее 0,3 мг/мл, или самое большее 0,5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может, предпочтительно, включать ДНК Cot-1 человека в количестве 0,2 мг/мл.

[00105] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать дестабилизатор. В некоторых вариантах осуществления, дестабилизатор может включать формамид и/или мочевину. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать по меньшей мере 1% (об.:об.), по меньшей мере 5% (об.:об.) или по меньшей мере 10% (об.:об.) формамид. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать самое большее 5% (об.:об.), самое большее 10% (об.:об.) или самое большее 15% (об.:об.) формамид. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать по меньшей мере 1 M мочевину, по меньшей мере 2 M мочевину или по меньшей мере 4 M мочевину. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать самое большее 2 M мочевину, самое большее 4 M мочевину или самое большее 6 M мочевину. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может, предпочтительно, включать 10% формамид.

[00106] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать буфер. Можно использовать любой пригодный буфер. В некоторых вариантах осуществления, буфер может включать фосфат, включая, например, фосфат калия или фосфат натрия; Трис-HCl; пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновую кислоту) (PIPES); пиперазин-N, N'-бис(3-пропансульфоновую кислоту) (PIPPS); 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES); (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту) (HEPES) и т.д. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать по меньшей мере 40 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 55 мМ, по меньшей мере 60 мМ, по меньшей мере 65 мМ или по меньшей мере 70 мМ фосфат. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать самое большее 50 мМ, самое большее 55 мМ, самое большее 60 мМ, самое большее 65 мМ, самое большее 70 мМ, самое большее 75 мМ или самое большее 80 мМ фосфат. В некоторых вариантах осуществления, содержащий фосфат буфер может включать одноосновный дигидрофосфат и/или двухосновный моногидрофосфат. В некоторых вариантах осуществления, содержащий фосфат буфер может включать KH₂PO₄ - K₂HPO. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может, предпочтительно, включать 66,6 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄.

[00107] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать соль. Можно включать любую пригодную соль. В некоторых вариантах осуществления, соль может представлять собой, например, NaCl, или цитрат натрия (например, цитрат тринатрия) и т.д. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать по меньшей мере 0,1 M, по меньшей мере 0,2 M, по меньшей мере 0,3 M, по меньшей мере 0,4 M, по меньшей мере 0,5 M, по меньшей мере 0,6 M, по меньшей мере 0,7 M, по меньшей мере 0,8 M, по меньшей мере 0,9 M или по меньшей мере 1 M соль. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать самое большее 0,2 M, самое большее 0,3 M, самое большее 0,4 M, самое большее 0,5 M, самое большее 0,6 M, самое большее 0,7 M, самое большее 0,8 M, самое большее 0,9 M, самое большее 1 M, самое большее 2 M, самое большее 3 M или самое большее 4 M соль. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может, предпочтительно, включать 0,8 M NaCl.

[00108] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать детергент, включая, например, анионный детергент (например, додецилсульфат натрия, соль сульфоновой кислоты, сульфат спирта, алкилбензолсульфонат, сложный эфир фосфорной кислоты или соль карбоновой кислоты), неионный детергент (например, полиоксиэтиленовый или гликозидный детергент, такой как детергент Tween, Triton или Brij), катионный детергент (например, катионное поверхностно-активное вещество с катионом четвертичного аммония) или цвиттер-ионный детергент (например, CHAPS). В некоторых вариантах осуществления, детергент представляет собой анионный детергент. В некоторых вариантах осуществления, детергент представляет собой неионный детергент. В некоторых вариантах осуществления, детергент представляет собой TWEEN 20, TWEEN 80, додецилсульфат натрия (SDS) и т.д. В некоторых вариантах осуществления, детергент может составлять по меньшей мере 0,001% объем/объем (об./об.), по меньшей мере 0,01% (об./об.), по меньшей мере 0,05% (об./об.), по меньшей мере 0,1% (об./об.), по меньшей мере 1% (об./об.) или по меньшей мере 5% (об./об.) буфера для гибридизации. В некоторых вариантах осуществления, детергент может составлять самое большее 0,01% (об./об.), самое большее 0,05% (об./об.), самое большее 0,1% (об./об.), самое большее 1% (об./об.), самое большее 5% (об./об.) или самое большее 10% (об./об.) буфера для гибридизации. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может, предпочтительно, включать 0,04% (об./об.) TWEEN 20.

[00109] Например, в некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать 0,5% - 10% декстрансульфата, 0,05 мг/мл - 0,5 мг/мл ДНК Cot-1 человека, 1% - 15% (об./об.) формамид, 40 мМ - 80 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄, 0,1 M - 4 M NaCl, и 0,001% - 10% (об./об.) Tween 20. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать (например, в конечной реакции) 1,5% декстрансульфат, 0,2 мг/мл Cot-1, 10% (об./об.) формамид, 66,6 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄, 0,8 M NaCl и 0,04% (об./об.) TWEEN 20.

[00110] В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать блокатор. В некоторых вариантах осуществления, блокатор является таким, как описано в другом месте в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, блокатор присутствует в концентрации по меньшей мере 0,001 мМ, по меньшей мере 0,005 мМ, по меньшей мере 0,01 мМ, по меньшей мере 0,05 мМ или по меньшей мере 0,1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, блокатор присутствует в концентрации самое большее 0,01 мМ, самое большее 0,05 мМ, самое большее 0,1 мМ, самое большее 0,2 мМ или самое большее 0,5 мМ.

[00111] В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, который включает буфер для гибридизации, например, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления, набор дополнительно включает по меньшей мере один из блокатора и зонда. В вариантах осуществления компоненты представлены в отдельных контейнерах. Например, буфер для гибридизации можно предоставлять в первом контейнере и другой компонент, например, блокатор или зонд, можно предоставлять в другом контейнере(контейнерах). В некоторых вариантах осуществления, блокатор и/или зонд являются такими, как описано в другом месте в настоящем описании.

Гибридное связывание

[00112] В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к способу гибридного связывания. В некоторых вариантах осуществления, способ включает стадии, включающие гибридизацию зондов с членами библиотеки и связывание зондов. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает пулирование библиотек до гибридизации зондов. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает амплификацию связанных последовательностей после связывания. В некоторых вариантах осуществления, способ можно использовать в комбинации с олигонуклеотидом-блокатором, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, способ может включать использование буфера для гибридизации, включающего средство, оказывающее эффект скученности, как описано в настоящем описании.

Пулирование библиотек

[00113] В некоторых вариантах осуществления, образцы, полученные из различных препаратов библиотек, объединяют до гибридизации. В некоторых вариантах осуществления, каждая библиотека, подлежащая объединению, предпочтительно включает последовательности с индексными областями, которые можно отличать от индексных областей последовательностей в любой другой библиотеке, подлежащей объединению.

[00114] В некоторых вариантах осуществления, образцы, полученные из различных препаратов библиотек, можно пулировать по объему, позволяя мультиплексное обогащение. «Множественность» или «плексность» данного мультиплексного обогащения относится к количеству различных препаратов библиотек, которые объединяют до обогащения (например, гибридизации и связывания). В некоторых вариантах осуществления, множественность мультиплексного обогащения может являться самое большее 2-плексной, самое большее 4-плексной, самое большее 6-плексной, самое большее 12-плексной, самое большее 24-плексной, самое большее 48-плексной, самое большее 96-плексной или выше.

[00115] В некоторых вариантах осуществления, образец, полученный из препарата библиотеки, получен в результате реакции тагментации. См., например, Патент США No. 9574226. В некоторых вариантах осуществления, образец, полученный из препарата библиотеки, получен в результате получения библиотеки NEXTERA (Illumina, Inc., San Diego, CA). В некоторых вариантах осуществления, препарат библиотеки можно добавлять непосредственно в реакцию гибридизации.

[00116] В некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, подвергаемого объединению, может составлять по меньшей мере 0,1 нг/мкл, по меньшей мере 0,3 нг/мкл, по меньшей мере 0,4 нг/мкл, по меньшей мере 0,5 нг/мкл, по меньшей мере 1 нг/мкл, по меньшей мере 2 нг/мкл, по меньшей мере 4 нг/мкл, по меньшей мере 6 нг/мкл, по меньшей мере 8 нг/мкл, по меньшей мере 10 нг/мкл, по меньшей мере 12 нг/мкл, по меньшей мере 20 нг/мкл, по меньшей мере 50 нг/мкл, по меньшей мере 60 нг/мкл, по меньшей мере 100 нг/мкл или по меньшей мере 200 нг/мкл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, подвергаемого объединению, может составлять самое большее 0,4 нг/мкл, самое большее 0,5 нг/мкл, самое большее 1 нг/мкл, самое большее 2 нг/мкл, самое большее 4 нг/мкл, самое большее 6 нг/мкл, самое большее 8 нг/мкл, самое большее 10 нг/мкл, самое большее 12 нг/мкл, самое большее 15 нг/мкл, самое большее 20 нг/мкл, самое большее 50 нг/мкл, самое большее 100 нг/мкл, самое большее 120 нг/мкл, самое большее 200 нг/мкл, самое большее 300 нг/мкл или самое большее 400 нг/мкл. Например, в некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, может лежать в диапазоне 0,3 нг/мкл - 400 нг/мкл. Например, в некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, может лежать в диапазоне 0,1 нг/мкл - 120 нг/мкл. Например, в некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК комбинации образцов, полученных из препаратов библиотек, может лежать в диапазоне 0,1 нг/мкл - 120 нг/мкл (например, в 100 мкл). Например, в некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, может лежать в диапазоне 0,5 нг/мкл - 12 нг/мкл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК комбинации образцов, полученных из препаратов библиотек, может лежать в диапазоне 0,5 нг/мкл - 12 нг/мкл (например, в 100 мкл). Например, в некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, может лежать в диапазоне 0,5 нг/мкл - 120 нг/мкл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК комбинации образцов, полученных из препаратов библиотек, может лежать в диапазоне 0,5 нг/мкл - 120 нг/мкл (например, в 100 мкл).

[00117] В некоторых вариантах осуществления, можно объединять по меньшей мере 1 мкл, по меньшей мере 2 мкл, по меньшей мере 3 мкл, по меньшей мере 5 мкл, по меньшей мере 10 мкл, по меньшей мере 15 мкл, по меньшей мере 20 мкл или по меньшей мере 25 мкл каждого образца, полученного из препарата библиотеки. В некоторых вариантах осуществления, можно объединять самое большее 2 мкл, самое большее 3 мкл, самое большее 5 мкл, самое большее 10 мкл, самое большее 15 мкл, самое большее 20 мкл, самое большее 25мкл, самое большее 30 мкл, самое большее 40 мкл или самое большее 50 мкл каждого образца, полученного из препарата библиотеки.

[00118] В некоторых вариантах осуществления, можно объединять по меньшей мере 10 нг, по меньшей мере 15 нг, по меньшей мере 25 нг, по меньшей мере 50 нг, по меньшей мере 100 нг, по меньшей мере 200 нг, по меньшей мере 500 нг, по меньшей мере 1000 нг или по меньшей мере 5000 нг ДНК из каждого препарата библиотеки. В некоторых вариантах осуществления, можно объединять самое большее 15 нг, самое большее 25 нг, самое большее 50 нг, самое большее 100 нг, самое большее 200 нг, самое большее 500 нг, самое большее 1000 нг, самое большее 5000 нг, самое большее 10000 нг или самое большее 12000 нг ДНК из каждого препарата библиотеки. Например, в некоторых вариантах осуществления, можно объединять 10 нг - 12000 нг ДНК из каждого препарата библиотеки.

Гибридизация зондов

[00119] В некоторых аспектах, способ гибридного связывания включает приведение библиотеки в контакт с зондом, где зонд гибридизуется с представляющей интерес областью в члене библиотеки. Представляющая интерес область является отдельной от адаптерной области и включает представляющий интерес геномный материал. Зонд включает лиганд, позволяющий последующее связывание зонда. В некоторых вариантах осуществления, лиганд предпочтительно включает группу биотина.

[00120] Библиотеку приводят в контакт с зондом в присутствии буфера для гибридизации. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать средство, оказывающее эффект скученности, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать блокатор, как описано в настоящем описании.

[00121] В некоторых вариантах осуществления, способ гибридного связывания включает стадию термической денатурации. Например, смесь для гибридизации, включающую члены библиотеки, блокаторы и зонд в буфере для гибридизации, можно нагревать до по меньшей мере 90°C, по меньшей мере 92°C или по меньшей мере 95°C. В некоторых вариантах осуществления, смесь для гибридизации можно нагревать до самое большее 92°C, самое большее 95°C, самое большее 97°C или самое большее 100°C. В некоторых вариантах осуществления, смесь для гибридизации, предпочтительно, дополнительно включает ДНК Cot-1. В некоторых вариантах осуществления, буфер для гибридизации может включать блокатор до добавления в смесь для гибридизации; в некоторых вариантах осуществления, блокатор можно добавлять в смесь для гибридизации независимо от буфера для гибридизации.

[00122] В некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК в смеси для гибридизации (например, конечной реакции гибридизации) может составлять по меньшей мере 0,1 нг/мкл, по меньшей мере 0,3 нг/мкл, по меньшей мере 0,4 нг/мкл, по меньшей мере 0,5 нг/мкл, по меньшей мере 1 нг/мкл, по меньшей мере 2 нг/мкл, по меньшей мере 4 нг/мкл, по меньшей мере 6 нг/мкл, по меньшей мере 8 нг/мкл, по меньшей мере 10 нг/мкл, по меньшей мере 12 нг/мкл, по меньшей мере 15 нг/мкл, по меньшей мере 20 нг/мкл, по меньшей мере 50 нг/мкл, по меньшей мере 75 нг/мкл, по меньшей мере 100 нг/мкл, по меньшей мере 120 нг/мкл, по меньшей мере 150 нг/мкл, по меньшей мере 200 нг/мкл. В некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК в смеси для гибридизации (например, конечной реакции гибридизации) может составлять самое большее 0,3 нг/мкл, самое большее 0,4 нг/мкл, самое большее 0,5 нг/мкл, самое большее 1 нг/мкл, самое большее 2 нг/мкл, самое большее 4 нг/мкл, самое большее 6 нг/мкл, самое большее 8 нг/мкл, самое большее 10 нг/мкл, самое большее 12 нг/мкл, самое большее 15 нг/мкл, самое большее 20 нг/мкл, самое большее 50 нг/мкл, самое большее 75 нг/мкл, самое большее 100 нг/мкл, самое большее 120 нг/мкл, самое большее 150 нг/мкл, самое большее 200 нг/мкл или самое большее 500 нг/мкл. Например, в некоторых вариантах осуществления, концентрация ДНК в смеси для гибридизации (например, конечной реакции гибридизации) может лежать в диапазоне 0,1 нг/мкл - 120 нг/мкл.

[00123] В некоторых вариантах осуществления, способ может включать использование объема смеси для гибридизации самое большее 150 мкл, самое большее 140 мкл, самое большее 130 мкл, самое большее 120 мкл, самое большее 110 мкл, самое большее 100 мкл, самое большее 90 мкл, самое большее 80 мкл, самое большее 70 мкл, самое большее 60 мкл или самое большее 50 мкл. В некоторых вариантах осуществления, способ может включать использование объема смеси для гибридизации по меньшей мере 10 мкл, по меньшей мере 20 мкл, по меньшей мере 30 мкл, по меньшей мере 40 мкл, по меньшей мере 50 мкл, по меньшей мере 60 мкл или по меньшей мере 70 мкл

[00124] В некоторых вариантах осуществления, смесь для гибридизации можно нагревать со скоростью по меньшей мере 1°C/минуту, по меньшей мере 1,5°C/минуту, по меньшей мере 2°C/минуту, по меньшей мере 2,5°C/минуту, по меньшей мере 3°C/минуту или по меньшей мере 5°C/минуту. В некоторых вариантах осуществления, смесь для гибридизации можно нагревать со скоростью самое большее 1,5°C/минуту, самое большее 2°C/минуту, самое большее 2,5°C/минуту, самое большее 3°C/минуту, самое большее 5°C/минуту или самое большее 10°C/минуту. В некоторых вариантах осуществления, смесь для гибридизации можно поддерживать при температуре для термической денатурации в течение по меньшей мере 1 минуты, по меньшей мере 2 минут, по меньшей мере 5 минут, по меньшей мере 10 минут или по меньшей мере 20 минут. В некоторых вариантах осуществления, смесь для гибридизации можно поддерживать при температуре для термической денатурации в течение самое большее 2 минут, самое большее 5 минут, самое большее 10 минут, самое большее 20 минут или дольше.

[00125] После стадии термической денатурации, способ гибридного связывания включает охлаждение смеси для гибридизации. По мере того, как смесь для гибридизации охлаждается от температуры стадии термической денатурации до температуры гибридизации, могут формироваться гибриды зонд:мишень (то есть, гибриды зонд:член библиотеки).

[00126] В некоторых вариантах осуществления, температура гибридизации может составлять по меньшей мере 50°C, по меньшей мере 55°C, по меньшей мере 56°C, по меньшей мере 57°C, по меньшей мере 58°C, по меньшей мере 59°C, по меньшей мере 60°C, по меньшей мере 61°C, по меньшей мере 62°C, по меньшей мере 63°C, по меньшей мере 64°C, по меньшей мере 65°C или по меньшей мере 70°C. В некоторых вариантах осуществления, температура гибридизации может составлять самое большее 56°C, самое большее 58°C, самое большее 60°C, самое большее 61°C, самое большее 62°C, самое большее 63°C, самое большее 64°C, самое большее 65°C или самое большее 70°C. В некоторых вариантах осуществления, гибридизация может включать линейное уменьшение температуры от температуры денатурации до температуры гибридизации. В некоторых вариантах осуществления, линейное изменение температуры может включать скорость по меньшей мере -5°C/минуту, по меньшей мере -2°C/минуту, по меньшей мере -1°C/минуту, по меньшей мере -0,5°C/минуту или по меньшей мере -0,2°C/минуту.

[00127] В некоторых вариантах осуществления, способ может включать поддержание библиотеки в контакте с зондом и/или поддержание смеси для гибридизации при температуре гибридизации в течение самое большее 3 суток, самое большее 2 суток, самое большее 24 часов, самое большее 20 часов, самое большее 16 часов, самое большее 12 часов, самое большее 6 часов, самое большее 3 часов, самое большее 2 часов, самое большее 90 минут, самое большее 1 часа или самое большее 30 минут. В некоторых вариантах осуществления, способ может включать поддержание библиотеки в контакте с зондом и/или поддержание смеси для гибридизации при температуре гибридизации в течение по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 45 минут, по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 90 минут, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 3 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 20 часов или по меньшей мере 24 часов. В некоторых вариантах осуществления, включающих случай, когда T_m блокатора выше, чем T_m адаптера, гибриды блокатор:адаптер могут формироваться до формирования гибридов адаптер:адаптер, таким образом, предотвращая формирование «гирлянд» или конкатенацию гибридов адаптер:адаптер.

Связывание

[00128] В некоторых аспектах, способ гибридного связывания включает связывание зонда после его гибридизации с членом библиотеки с использованием средств для связывания. Зонд можно связывать посредством любых пригодных средств. Например, когда зонд включает группу биотина, зонд можно связывать с использованием стрептавидиновой бусины, включая, например, покрытую стрептавидином магнитную бусину. В некоторых вариантах осуществления, зонд может включать FITC, и средства для связывания могут включать антитело против FITC. В некоторых вариантах осуществления, зонд может включать гаптен, и средства для связывания могут включать молекулу (например, антитело), которая связывает этот гаптен. Можно использовать другие средства для связывания, такие как изотахофорез, эксклюзионная хроматография, жидкостная хроматография, магнитные средства и т.п..

[00129] В некоторых вариантах осуществления, включающих например, случай, когда средства для связывания включают покрытую стрептавидином бусину, способ может включать получение смеси для связывания, включающей зонд (включая, например, гибрид зонд:мишень) и средства для связывания.

[00130] В некоторых вариантах осуществления, способ может включать поддержание смеси для связывания при температуре связывания. В некоторых вариантах осуществления, температура связывания может составлять по меньшей мере 50°C, по меньшей мере 55°C, по меньшей мере 56°C, по меньшей мере 57°C, по меньшей мере 58°C, по меньшей мере 59°C, по меньшей мере 60°C, по меньшей мере 61°C, по меньшей мере 62°C, по меньшей мере 63°C, по меньшей мере 64°C, по меньшей мере 65°C или по меньшей мере 70°C. В некоторых вариантах осуществления, температура связывания может составлять самое большее 56°C, самое большее 58°C, самое большее 60°C, самое большее 61°C, самое большее 62°C, самое большее 63°C, самое большее 64°C, самое большее 65°C или самое большее 70°C. В некоторых вариантах осуществления, смесь для связывания можно поддерживать при температуре связывания в течение по меньшей мере 2 минут, по меньшей мере 5 минут, по меньшей мере 10 минут или по меньшей мере 15 минут. В некоторых вариантах осуществления, смесь для связывания можно поддерживать при температуре связывания в течение самое большее 5 минут, самое большее 10 минут, самое большее 15 минут, самое большее 20 минут, самое большее 30 минут, самое большее 45 минут, или дольше. В некоторых вариантах осуществления, и/или встряхивание-перемешивание можно добавлять через каждые 5 или 10 минут.

[00131] В некоторых вариантах осуществления, способ может дополнительно включать промывку связанного зонда (связанный зонд может включать, например, гибрид зонд:мишень и/или связанные члены библиотеки). В некоторых вариантах осуществления, связанный зонд можно промывать по меньшей мере один раз, по меньшей мере два раза, по меньшей мере три раза или более. В некоторых вариантах осуществления, связанный зонд можно промывать самое большее один раз, самое большее два раза, самое большее три раза или самое большее пять раз.

[00132] В некоторых вариантах осуществления, промывка связанных членов библиотеки может включать нагревание связанного зонда в буфере для промывки до температуры промывки. В некоторых вариантах осуществления, буфер для промывки может включать детергент. Можно использовать любой пригодный буфер, включающий, например, Трис-HCl; пиперазин-N, N′-бис(2-этансульфоновую кислоту) (PIPES); пиперазин-N, N'-бис(3-пропансульфоновую кислоту) (PIPPS); 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES); (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту) (HEPES) и т.д. Можно использовать любой пригодный детергент, включающий, например, TWEEN 20, TWEEN 80, додецилсульфат натрия (SDS) и т.д. В некоторых вариантах осуществления, буфер для промывки может включать соединение, предназначенное для уменьшения формирования вторичной структуры в богатых GC областях, включая, например, бетаин. В некоторых вариантах осуществления, буфер для промывки может включать хелатирующий железо агент, включая, например, мезилат дефероксамина, EGTA, ЭДТА и т.д.

[00133] Температура промывки может составлять по меньшей мере 20°C, по меньшей мере 23°C, по меньшей мере 25°C, по меньшей мере 30°C, по меньшей мере 35°C, по меньшей мере 40°C, по меньшей мере 45°C, по меньшей мере 50°C, по меньшей мере 55°C, по меньшей мере 56°C, по меньшей мере 57°C, по меньшей мере 58°C, по меньшей мере 59°C, по меньшей мере 60°C, по меньшей мере 61°C, по меньшей мере 62°C, по меньшей мере 63°C, по меньшей мере 64°C, по меньшей мере 65°C или по меньшей мере 70°C. В некоторых вариантах осуществления, температура промывки может составлять самое большее 30°C, самое большее 35°C, самое большее 40°C, самое большее 45°C, самое большее 50°C, самое большее 55°C, самое большее 56°C, самое большее 60°C, самое большее 61°C, самое большее 62°C, самое большее 63°C, самое большее 64°C, самое большее 65°C или самое большее 70°C.

[00134] В некоторых вариантах осуществления, способ может дополнительно включать элюцию связанных членов библиотеки со средств для связывания и/или с зонда. Например, связанные члены библиотеки можно элюировать со стрептавидиновой бусины и/или с биотинилированного зонда. В вариантах осуществления, где стрептавидиновая бусина включает магнитную стрептавидиновую бусину, элюция может включать использование магнита. В некоторых вариантах осуществления, элюция может включать использование сильного основания, включая, например, NaOH, KOH, Ca(OH)₂ и т.д.

[00135] В некоторых вариантах осуществления, твердые носители можно использовать в качестве средств для связывания, включая, например, твердые носители, содержащие стрептавидин. В некоторых вариантах осуществления, средства для связывания можно промывать в условиях постепенно увеличивающейся строгости при температуре ниже оцененного значения T_m зонда:мишени и/или выше значения T_m адаптера.

[00136] В некоторых вариантах осуществления, связанные члены библиотеки можно элюировать с лиганда (например, элюировать с биотинилированного зонда) или средств для связывания (например, элюировать со стрептавидиновой бусины) и вносить непосредственно в проточную ячейку.

[00137] В некоторых вариантах осуществления, можно элюировать по меньшей мере 60 фемтомоль, по меньшей мере 80 фемтомоль, по меньшей мере 90 фемтомоль, по меньшей мере 100 фемтомоль или по меньшей мере 150 фемтомоль ДНК. В некоторых вариантах осуществления, можно элюировать самое большее 150 фемтомоль, самое большее 500 фемтомоль, самое большее 1 пикомоль, самое большее 2 пикомоль, или самое большее 3 пикомоль ДНК. Например, в некоторых вариантах осуществления, можно элюировать 100 фемтомоль - 2 пикомоль ДНК.

[00138] В некоторых вариантах осуществления, элюированные члены библиотеки можно вносить в проточную ячейку в объеме менее чем 100 мкл, в объеме менее чем 90 мкл, в объеме менее чем 80 мкл, в объеме менее чем 70 мкл, или в объеме менее чем 60 мкл. В некоторых вариантах осуществления, связанные члены библиотеки можно вносить в проточную ячейку в объеме приблизительно 55 мкл.

[00139] В некоторых вариантах осуществления, после элюции, элюант может иметь концентрацию ДНК, по меньшей мере 1,1 пикомолярную (пМ), по меньшей мере 1,2 пМ, по меньшей мере 1,3 пМ, по меньшей мере 10 пМ или по меньшей мере 100 пМ. В некоторых вариантах осуществления, элюант может иметь концентрацию ДНК самое большее 100 пМ, самое большее 200 пМ, самое большее 250 пМ или самое большее 300 пМ. Например, в некоторых вариантах осуществления, элюант может иметь концентрацию ДНК в диапазоне 1,3 пМ - 250 пМ. В некоторых вариантах осуществления, элюант можно вносить в проточную ячейку без дополнительного разведения и/или без изменения концентрации ДНК.

Амплификация

[00140] В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу, который включает амплификацию членов библиотеки с использованием ПЦР после гибридного связывания, но перед секвенированием связанных членов библиотеки. Альтернативно, настоящее изобретение относится к способу, который не включает подвергание связанного члена библиотеки воздействию условий амплификации после гибридного связывания, перед секвенированием членов библиотеки (например, не включает подвергание связанных членов библиотеки стадии ПЦР для амплификации связанных членов библиотеки перед секвенированием членов библиотеки). Способы секвенирования связанных членов библиотеки, как правило, включают амплификацию членов библиотеки (например, с использованием стадии ПЦР) перед секвенированием членов библиотеки.

[00141] Количество ДНК, связанной во время гибридизации и гибридного связывания, может являться слишком низким для непосредственной количественной оценки либо флуориметрическими, либо аналитическими способами (например, посредством Bioanalyzer). Амплификация библиотеки позволяет количественную оценку и контроль качества процесса.

[00142] Кроме того, является типичным разведение образца, который был амплифицирован с использованием ПЦР, после гибридного связывания и перед секвенированием. Например, для типичной количественной оценки, образец, полученный с использованием набора NEXTERA Rapid Capture от Illumina, Inc., после ПЦР находится в среднем наномолярном диапазоне, в то время как концентрации для секвенирования находятся в нижнем пикомолярном диапазоне. Таким образом, на несколько порядков величины больше молекул получают посредством амплификации связанных членов библиотеки, чем необходимо для секвенирования.

[00143] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу секвенирования связанных членов библиотеки после гибридного связывания. Такой способ может включать непосредственное внесение связанных членов библиотеки и/или элюированных членов библиотеки в проточную ячейку (например, с использованием устройства для прямой загрузки проточной ячейки, как описано, например, в Предварительной патентной заявке США No. 62/564466, поданной 28 сентября 2017 г.).

[00144] В некоторых вариантах осуществления, способ может дополнительно включать секвенирование связанных членов библиотеки после гибридного связывания.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Иллюстративные варианты осуществления блокатора

[00145] 1. Блокатор, содержащий олигонуклеотид;

где блокатор является способным связываться с адаптером, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где область блокатора, способная связываться с индексной областью и/или UMI адаптера, содержит:

по меньшей мере три основания тимина, по меньшей мере четыре основания тимина, по меньшей мере пять оснований тимина, по меньшей мере шесть оснований тимина, по меньшей мере семь оснований тимина, по меньшей мере восемь оснований тимина, по меньшей мере девять оснований тимина или по меньшей мере десять оснований тимина; или

универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание.

[00146] 2. Блокатор из варианта осуществления блокатора 1, где область блокатора, способная связываться с индексной областью или UMI адаптера, содержит так много оснований тимина, как количество оснований в индексной области и/или UMI адаптера.

[00147] 3. Блокатор из варианта осуществления блокатора 1, где по меньшей мере одно неуниверсальное основание локализовано в области последовательности блокатора, соответствующей индексной области и/или UMI, и где неуниверсальное основание находится в третьем положении или в пятом положении, или в обоих из последовательности блокатора, относительно 5'-конца индексной области.

[00148] 4. Блокатор из варианта осуществления блокатора 1 или варианта осуществления блокатора 3, где по меньшей мере одно неуниверсальное основание содержит модифицированный гуанин.

[00149] 5. Блокатор из любого из вариантов осуществления блокатора 1, 3 или 4, где по меньшей мере одно неуниверсальное основание содержит случайный нуклеотид.

[00150] 6. Блокатор из любого из вариантов осуществления блокатора 1, 3, 4 или 5, где универсальное основание содержит 2'-дезоксиинозин, 2'-дезоксинебуларин, 3-нитропиррол-2'-дезоксинуклеозид или 5-нитроиндол-2'-дезоксинуклеозид.

[00151] 7. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора, где последовательность универсального праймера содержит по меньшей мере одно из P5, P7, P5', P7', V2.A14.METS, V2.B15.METS, последовательности, комплементарной V2.A14.METS, и последовательности, комплементарной V2.B15.METS.

[00152] 8. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора, где блокатор содержит модификацию, увеличивающую T_m блокатора, относительно такого же блокатора, который не включает модификацию.

[00153] 9. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора, где блокатор содержит по меньшей мере одно из ДНК- или РНК-олигонуклеотида, модифицированного для связывания областей с низким содержанием GC; перекрестно сшитого олигонуклеотида; модифицированного 5-метилдезоксицитидина (5-метил-dc); 2,6-диаминопурина; запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК); мостиковой нуклеиновой кислоты (БНК); трициклической нуклеиновой кислоты; пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК); C5-модифицированного пиримидинового основания; пропинилпиримидина; морфолино; фосфорамидита; и 5'-пиренового кэпа.

[00154] 10. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора, где блокатор содержит модифицированное основание в каждом основании, по меньшей мере через каждые 2 основания, по меньшей мере через каждые 3 основания, по меньшей мере через каждые 4 основания или по меньшей мере через каждые 5 оснований.

[00155] 11. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора, где блокатор содержит 3'-концевую группу, которая препятствует доступности блокатора, чтобы служить праймером для синтеза ДНК.

[00156] 12. Блокатор из варианта осуществления блокатора 11, где 3'-концевая группа содержит 3′-dC, 2′,3′-ddC, инвертированный dT или 3′-спейсер C3.

[00157] 13. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора, где блокатор содержит последовательность из таблицы 2A, таблицы 2B, таблицы 2C или таблицы 3.

[00158] 14. Набор, содержащий блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления блокатора.

Иллюстративные варианты осуществления разделенного блокатора

[00159] 1. Блокатор, содержащий два несвязанных олигонуклеотида;

где блокатор является способным связываться по меньшей мере с частью адаптера, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где несвязанные олигонуклеотиды содержат основания, которые не соответствуют индексной области и/или UMI адаптера.

[00160] 2. Блокатор из варианта осуществления разделенного блокатора 1, где несвязанные олигонуклеотиды не содержат основания, соответствующие индексной области и/или UMI адаптера.

[00161] 3. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где последовательность универсального праймера включает по меньшей мере одно из P5, P7, P5', P7', V2.A14.METS, V2.B15.METS, последовательности, комплементарной V2.A14.METS, и последовательности, комплементарной V2.B15.METS.

[00162] 4. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где блокатор содержит модификацию, увеличивающую T_m блокатора, относительно такого же блокатора, который не включает модификацию.

[00163] 5. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где блокатор содержит по меньшей мере одно из ДНК- или РНК-олигонуклеотида, модифицированного для связывания областей с низким содержанием GC; перекрестно сшитого олигонуклеотида; модифицированного 5-метилдезоксицитидина (5-метил-dc); 2,6-диаминопурина; запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК); мостиковой нуклеиновой кислоты (БНК); трициклической нуклеиновой кислоты; пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК); C5-модифицированного пиримидинового основания; пропинилпиримидина; морфолино; фосфорамидита; и 5'-пиренового кэпа.

[00164] 6. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где блокатор содержит модифицированное основание в каждом основании, по меньшей мере через каждые 2 основания, по меньшей мере через каждые 3 основания, по меньшей мере через каждые 4 основания или по меньшей мере через каждые 5 оснований.

[00165] 7. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где блокатор содержит 3'-концевую группу, которая препятствует доступности блокатора, чтобы служить праймером для синтеза ДНК.

[00166] 8. Блокатор из варианта осуществления разделенного блокатора 11, где 3'-концевая группа содержит 3′-dC, 2′,3′-ddC, инвертированный dT или 3′-спейсер C3.

[00167] 9. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где блокатор содержит последовательность из таблицы 2A, таблицы 2B, таблицы 2C или таблицы 3.

[00168] 10. Блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора, где блокатор содержит по меньшей мере один из BN023, BN024, BN027 и BN028 из таблицы 2A.

[00169] 11. Набор, содержащий блокатор из любого из предшествующих вариантов осуществления разделенного блокатора.

Иллюстративные варианты осуществления буфера для гибридизации

[00170] 1. Буфер для гибридизации, содержащий средство, оказывающее эффект скученности,.

[00171] 2. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 1, где средство, оказывающее эффект скученности, содержит по меньшей мере один из декстрана, декстрансульфата, полиэтиленгликоля (PEG), фиколла, глицерина и бетаина.

[00172] 3. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где средство, оказывающее эффект скученности, включено в буфер для гибридизации в количестве по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3% или по меньшей мере 4%.

[00173] 4. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где средство, оказывающее эффект скученности, включено в буфер для гибридизации в количестве самое большее 1%, самое большее 1,5%, самое большее 2%, самое большее 3%, самое большее 4%, самое большее 5%, самое большее 6%, самое большее 8% или самое большее 10%.

[00174] 5. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере одно из ДНК Cot-1 человека, дестабилизатора, соли и блокатора.

[00175] 6. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 5, где буфер для гибридизации содержит ДНК Cot-1 в количестве по меньшей мере 0,05 мг/мл, по меньшей мере 0,1 мг/мл, по меньшей мере 0,2 мг/мл или по меньшей мере 0,3 мг/мл.

[00176] 7. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 5 или 6, где буфер для гибридизации содержит ДНК Cot-1 в количестве самое большее 0,1 мг/мл, самое большее 0,2 мг/мл, самое большее 0,3 мг/мл или самое большее 0,5 мг/мл.

[00177] 8. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 5-7, где дестабилизатор составляет по меньшей мере 1% (об./об.), по меньшей мере 5% (об./об.) или по меньшей мере 10% (об./об.) буфера для гибридизации.

[00178] 9. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 5-8, где дестабилизатор составляет самое большее 5% (об./об.), самое большее 10% (об./об.) или самое большее 15% (об./об.) буфера для гибридизации.

[00179] 10. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 5-9, где дестабилизатор содержит формамид.

[00180] 11. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 5-10, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере 0,1 M, по меньшей мере 0,2 M, по меньшей мере 0,3 M, по меньшей мере 0,4 M, по меньшей мере 0,5 M, по меньшей мере 0,6 M, по меньшей мере 0,7 M, по меньшей мере 0,8 M, по меньшей мере 0,9 M или по меньшей мере 1 M соль.

[00181] 12. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 5-11, где буфер для гибридизации содержит самое большее 0,2 M, самое большее 0,3 M, самое большее 0,4 M, самое большее 0,5 M, самое большее 0,6 M, самое большее 0,7 M, самое большее 0,8 M, самое большее 0,9 M, самое большее 1 M, самое большее 2 M, самое большее 3 M, или самое большее 4 M соль.

[00182] 13. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 5-11, где соль содержит NaCl.

[00183] 14. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит фосфат.

[00184] 15. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 14, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере 40 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 55 мМ, по меньшей мере 60 мМ, по меньшей мере 65 мМ или по меньшей мере 70 мМ фосфат.

[00185] 16. Буфер для гибридизации из вариантов осуществления буфера для гибридизации 14 или 15, где буфер для гибридизации содержит самое большее 50 мМ, самое большее 55 мМ, самое большее 60 мМ, самое большее 65 мМ, самое большее 70 мМ, самое большее 75 мМ, или самое большее 80 мМ фосфат.

[00186] 17. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 14-16, где фосфат содержит KH₂PO₄ - K₂HPO₄.

[00187] 18. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит детергент.

[00188] 19. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 18, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере 0,001% (об./об.), по меньшей мере 0,01% (об./об.), по меньшей мере 0,05% (об./об.), по меньшей мере 0,1% (об./об.), по меньшей мере 1% (об./об.) или по меньшей мере 5% (об./об.) детергент.

[00189] 20. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 18 или 19, где буфер для гибридизации содержит самое большее 0,01% (об./об.), самое большее 0,05% (об./об.), самое большее 0,1% (об./об.), самое большее 1% (об./об.), самое большее 5% (об./об.) или самое большее 10% (об./об.) детергент.

[00190] 21. Буфер для гибридизации из любого из вариантов осуществления буфера для гибридизации 18-20, где детергент содержит TWEEN 20.

[00191] 22. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит

0,5% - 10% декстрансульфат,

0,05 мг/мл - 0,5 мг/мл ДНК Cot-1 человека,

1% - 15% (об./об.) формамид,

40 мМ - 80 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄,

0,1 M - 4 M NaCl, и

0,001% - 10% (об./об.) Tween 20.

[00192] 23. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит

1,5% декстрансульфат,

0,2 мг/мл ДНК Cot-1 человека,

10% (об./об.) формамид,

66,6 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄,

0,2 мМ усовершенствованные блокаторы адаптеров, (0,1 мМ для каждого адаптера)

0,8 M NaCl, и

0,04% (об./об.) Tween 20.

[00193] 24. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит блокатор.

[00194] 25. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 24, где блокатор содержит олигонуклеотид с увеличенной T_m.

[00195] 26. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 24 или 25, где блокатор содержит множество модификаций, увеличивающих T_m.

[00196] 27. Буфер для гибридизации из варианта осуществления буфера для гибридизации 26, где множество модификаций, увеличивающих T_m блокатора, содержат по меньшей мере одно из перекрестно сшитого олигонуклеотида; модифицированного 5-метилдезоксицитидина (5-метил-dc); 2,6-диаминопурина; запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК); мостиковой нуклеиновой кислоты (БНК); трициклической нуклеиновой кислоты; пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК); C5-модифицированного пиримидинового основания; пропинилпиримидина; морфолино; фосфорамидита; и 5'-пиренового кэпа.

[00197] 28. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит блокатор,

где блокатор содержит олигонуклеотид;

где блокатор является способным связываться с адаптером, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где область блокатора, способная связываться с индексной областью и/или UMI адаптера, содержит:

по меньшей мере три основания тимина, по меньшей мере четыре основания тимина, по меньшей мере пять оснований тимина, по меньшей мере шесть оснований тимина, по меньшей мере семь оснований тимина, по меньшей мере восемь оснований тимина, по меньшей мере девять оснований тимина или по меньшей мере десять оснований тимина; или

универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание.

[00198] 29. Буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит блокатор,

где блокатор содержит два несвязанных олигонуклеотида;

где блокатор является способным связываться по меньшей мере с частью адаптера, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где несвязанные олигонуклеотиды содержат основания, которые не соответствуют индексной области адаптера и/или UMI адаптера.

[00199] 30. Буфер для гибридизации из вариантов осуществления буфера для гибридизации 28 или 29, где блокатор содержит множество модификаций, увеличивающих T_m.

[00200] 31. Набор, содержащий буфер для гибридизации из любого из предшествующих вариантов осуществления буфера для гибридизации.

Иллюстративные способы использования буфера для гибридизации (варианты осуществления способов использования буфера)

[00201] 1. Способ, включающий использование буфера для гибридизации, содержащего средство, оказывающее эффект скученности, для гибридного связывания.

[00202] 2. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 1, где средство, оказывающее эффект скученности, содержит по меньшей мере один из декстрана, декстрансульфата, полиэтиленгликоля (PEG), фиколла, глицерина и бетаина.

[00203] 3. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где средство, оказывающее эффект скученности, включено в буфер для гибридизации в количестве по меньшей мере 0,5% (масс./об.), по меньшей мере 1% (масс./об.), по меньшей мере 1,5% (масс./об.), по меньшей мере 2% (масс./об.), по меньшей мере 3% (масс./об.) или по меньшей мере 4% (масс./об.).

[00204] 4. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где средство, оказывающее эффект скученности, включено в буфер для гибридизации в количестве самое большее 1% (масс./об.), самое большее 1,5% (масс./об.), самое большее 2% (масс./об.), самое большее 3% (масс./об.), самое большее 4% (масс./об.), самое большее 5% (масс./об.), самое большее 6% (масс./об.), самое большее 8% (масс./об.) или самое большее 10% (масс./об.).

[00205] 5. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере одно из ДНК Cot-1 человека, дестабилизатора и соли.

[00206] 6. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 5, где буфер для гибридизации содержит ДНК Cot-1 человека в количестве по меньшей мере 0,05 мг/мл, по меньшей мере 0,1 мг/мл, по меньшей мере 0,2 мг/мл или по меньшей мере 0,3 мг/мл.

[00207] 7. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 5 или 6, где буфер для гибридизации содержит ДНК Cot-1 человека в количестве самое большее 0,1 мг/мл, самое большее 0,2 мг/мл, самое большее 0,3 мг/мл или самое большее 0,5 мг/мл.

[00208] 8. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 5-7, где дестабилизатор составляет по меньшей мере 1% (об./об.), по меньшей мере 5% (об./об.) или по меньшей мере 10% (об./об.) буфера для гибридизации.

[00209] 9. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 5-8, где дестабилизатор составляет самое большее 5% (об./об.), самое большее 10% (об./об.) или самое большее 15% (об./об.) буфера для гибридизации.

[00210] 10. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 5-9, где дестабилизатор содержит формамид.

[00211] 11. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 5-10, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере 0,1 M, по меньшей мере 0,2 M, по меньшей мере 0,3 M, по меньшей мере 0,4 M, по меньшей мере 0,5 M, по меньшей мере 0,6 M, по меньшей мере 0,7 M, по меньшей мере 0,8 M, по меньшей мере 0,9 M или по меньшей мере 1 M соль.

[00212] 12. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 5-11, где буфер для гибридизации содержит самое большее 0,2 M, самое большее 0,3 M, самое большее 0,4 M, самое большее 0,5 M, самое большее 0,6 M, самое большее 0,7 M, самое большее 0,8 M, самое большее 0,9 M, самое большее 1 M, самое большее 2 M, самое большее 3 M или самое большее 4 M соль.

[00213] 13. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 5-12, где соль содержит NaCl.

[00214] 14. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где буфер для гибридизации содержит фосфат.

[00215] 15. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 14, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере 40 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 55 мМ, по меньшей мере 60 мМ, по меньшей мере 65 мМ или по меньшей мере 70 мМ фосфат.

[00216] 16. Способ из вариантов осуществления способов использования буфера 14 или 15, где буфер для гибридизации содержит самое большее 50 мМ, самое большее 55 мМ, самое большее 60 мМ, самое большее 65 мМ, самое большее 70 мМ, самое большее 75 мМ или самое большее 80 мМ фосфат.

[00217] 17. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 14-16, где фосфат содержит KH₂PO₄ - K₂HPO₄.

[00218] 18. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где буфер для гибридизации содержит детергент.

[00219] 19. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 17, где буфер для гибридизации содержит по меньшей мере 0,001% (об./об.), по меньшей мере 0,01% (об./об.), по меньшей мере 0,05% (об./об.), по меньшей мере 0,1% (об./об.), по меньшей мере 1% (об./об.) или по меньшей мере 5% (об./об.) детергент.

[00220] 20. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 18 или 19, где буфер для гибридизации содержит самое большее 0,01% (об./об.), самое большее 0,05% (об./об.), самое большее 0,1% (об./об.), самое большее 1% (об./об.), самое большее 5% (об./об.) или самое большее 10% (об./об.) детергент.

[00221] 21. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 18-20, где буфер для гибридизации содержит TWEEN 20.

[00222] 22. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где буфер для гибридизации содержит:

0,5% - 10% декстрансульфат,

0,05 мг/мл - 0,5 мг/мл Cot-1,

1% - 15% (об./об.) формамид,

40 мМ - 80 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄,

0,1 M - 4 M NaCl и

0,001% - 10% (об./об.) TWEEN 20.

[00223] 23. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где буфер для гибридизации содержит:

1,5% декстрансульфат,

0,2 мг/мл Cot-1,

10% (об./об.) формамид,

66,6 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄,

0,8 M NaCl и

0,04% (об./об.) TWEEN 20.

[00224] 24. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где буфер для гибридизации содержит блокатор.

[00225] 25. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 24, где блокатор присутствует в концентрации по меньшей мере 0,001 мМ, по меньшей мере 0,005 мМ, по меньшей мере 0,01 мМ, по меньшей мере 0,05 мМ или по меньшей мере 0,1 мМ.

[00226] 26. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 24 или 25, где блокатор присутствует в концентрации самое большее 0,01 мМ, самое большее 0,05 мМ, самое большее 0,1 мМ, самое большее 0,2 мМ, или самое большее 0,5 мМ.

[00227] 27. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где способ включает получение буфера для гибридизации из первой композиции, содержащей ДНК Cot-1 человека и блокатор, и второй композиции, содержащей формамид и декстрансульфат.

[00228] 28. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способов использования буфера, где способ включает приведение библиотеки в контакт с буфером для гибридизации, где буфер для гибридизации содержит блокатор.

[00229] 29. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 28, где способ включает объединение образцов по меньшей мере из двух препаратов библиотек до приведения библиотеки в контакт с блокатором в присутствии буфера для гибридизации.

[00230] 30. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 29, где объединяют по меньшей мере 1 мкл, по меньшей мере 2 мкл, по меньшей мере 3 мкл, по меньшей мере 5 мкл, по меньшей мере 10 мкл, по меньшей мере 15 мкл или по меньшей мере 20 мкл образца, полученного из каждого препарата библиотеки.

[00231] 31. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 29 или 30, где объединяют самое большее 2 мкл, самое большее 3 мкл, самое большее 5 мкл, самое большее 10 мкл, самое большее 15 мкл, самое большее 20 мкл, самое большее 25 мкл, самое большее 30 мкл, самое большее 40 мкл, или самое большее 50 мкл образца, полученного из каждого препарата библиотеки.

[00232] 32. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-31, где объединяют по меньшей мере 10 нг, по меньшей мере 15 нг, по меньшей мере 25 нг, по меньшей мере 50 нг, по меньшей мере 100 нг, по меньшей мере 200 нг, по меньшей мере 500 нг, по меньшей мере 1000 нг или по меньшей мере 5000 нг ДНК из каждого препарата библиотеки.

[00233] 33. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-32, где объединяют самое большее 15 нг, самое большее 25 нг, самое большее 50 нг, самое большее 100 нг, самое большее 200 нг, самое большее 500 нг, самое большее 1000 нг, самое большее 5000 нг, самое большее 10000 нг или самое большее 12000 нг ДНК из каждого препарата библиотеки.

[00234] 34. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-33, где концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, подвергаемого объединению, составляет по меньшей мере 0,1 нг/мкл, по меньшей мере 0,3 нг/мкл, по меньшей мере 0,4 нг/мкл, по меньшей мере 0,5 нг/мкл, по меньшей мере 1 нг/мкл, по меньшей мере 2 нг/мкл, по меньшей мере 4 нг/мкл, по меньшей мере 6 нг/мкл, по меньшей мере 8 нг/мкл, по меньшей мере 10 нг/мкл, по меньшей мере 12 нг/мкл, по меньшей мере 20 нг/мкл, по меньшей мере 50 нг/мкл, по меньшей мере 60 нг/мкл, по меньшей мере 100 нг/мкл или по меньшей мере 200 нг/мкл.

[00235] 35. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-34, где концентрация ДНК каждого образца, полученного из препарата библиотеки, подвергаемого объединению, составляет самое большее 0,4 нг/мкл, самое большее 0,5 нг/мкл, самое большее 1 нг/мкл, самое большее 2 нг/мкл, самое большее 4 нг/мкл, самое большее 6 нг/мкл, самое большее 8 нг/мкл, самое большее 10 нг/мкл, самое большее 12 нг/мкл, самое большее 15 нг/мкл, самое большее 20 нг/мкл, самое большее 50 нг/мкл, самое большее 100 нг/мкл, самое большее 120 нг/мкл, самое большее 200 нг/мкл, самое большее 300 нг/мкл или самое большее 400 нг/мкл.

[00236] 36. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-35, где концентрация ДНК после объединения препаратов библиотек лежит в диапазоне 0,3 нг/мкл - 400 нг/мкл.

[00237] 37. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-36, где способ дополнительно включает приведение членов библиотеки в контакт с зондом, где зонд гибридизуется с представляющей интерес областью в члене библиотеки, и где зонд содержит лиганд.

[00238] 38. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 37, где лиганд содержит группу биотина.

[00239] 39. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 29-38, где способ включает получение смеси для гибридизации, содержащей члены библиотеки, буфер для гибридизации (где буфер для гибридизации содержит блокатор) и зонд.

[00240] 40. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 39, где смесь для гибридизации дополнительно содержит ДНК Cot-1 человека.

[00241] 42. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 39 или 40, где способ включает использование объема смеси для гибридизации самое большее 150 мкл, самое большее 140 мкл, самое большее 130 мкл, самое большее 120 мкл, самое большее 110 мкл, самое большее 100 мкл, самое большее 90 мкл, самое большее 80 мкл, самое большее 70 мкл, самое большее 60 мкл или самое большее 50 мкл.

[00242] 42. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-41, где способ включает использование объема смеси для гибридизации по меньшей мере 10 мкл, по меньшей мере 20 мкл, по меньшей мере 30 мкл, по меньшей мере 40 мкл, по меньшей мере 50 мкл, по меньшей мере 60 мкл или по меньшей мере 70 мкл.

[00243] 43. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-42, где концентрация ДНК в смеси для гибридизации составляет по меньшей мере 0,1 нг/мкл, по меньшей мере 0,3 нг/мкл, по меньшей мере 0,4 нг/мкл, по меньшей мере 0,5 нг/мкл, по меньшей мере 1 нг/мкл, по меньшей мере 2 нг/мкл, по меньшей мере 4 нг/мкл, по меньшей мере 6 нг/мкл, по меньшей мере 8 нг/мкл, по меньшей мере 10 нг/мкл, по меньшей мере 12 нг/мкл, по меньшей мере 15 нг/мкл, по меньшей мере 20 нг/мкл, по меньшей мере 50 нг/мкл, по меньшей мере 75 нг/мкл, по меньшей мере 100 нг/мкл, по меньшей мере 120 нг/мкл, по меньшей мере 150 нг/мкл, по меньшей мере 200 нг/мкл.

[00244] 44. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-43, где концентрация ДНК в смеси для гибридизации составляет самое большее 0,3 нг/мкл, самое большее 0,4 нг/мкл, самое большее 0,5 нг/мкл, самое большее 1 нг/мкл, самое большее 2 нг/мкл, самое большее 4 нг/мкл, самое большее 6 нг/мкл, самое большее 8 нг/мкл, самое большее 10 нг/мкл, самое большее 12 нг/мкл, самое большее 15 нг/мкл, самое большее 20 нг/мкл, самое большее 50 нг/мкл, самое большее 75 нг/мкл, самое большее 100 нг/мкл, самое большее 120 нг/мкл, самое большее 150 нг/мкл, самое большее 200 нг/мкл или самое большее 500 нг/мкл.

[00245] 45. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 37-44, где библиотека находится в контакте с зондом в течение самое большее 3 суток, самое большее 2 суток, самое большее 24 часов, самое большее 20 часов, самое большее 16 часов, самое большее 12 часов, самое большее 6 часов, самое большее 3 часов, самое большее 2 часов, самое большее 90 минут, самое большее 1 часа или самое большее 30 минут.

[00246] 46. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 37-45, где библиотека находится в контакте с зондом в течение по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 45 минут, по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 90 минут, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 3 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 20 часов или по меньшей мере 24 часов.

[00247] 47. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-46, где способ включает поддержание смеси для гибридизации при температуре гибридизации, и где температура гибридизации составляет по меньшей мере 50°C, по меньшей мере 55°C, по меньшей мере 56°C, по меньшей мере 57°C, по меньшей мере 58°C, по меньшей мере 59°C, по меньшей мере 60°C, по меньшей мере 61°C, по меньшей мере 62°C, по меньшей мере 63°C, по меньшей мере 64°C, по меньшей мере 65°C или по меньшей мере 70°C.

[00248] 48. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-47, где способ включает поддержание смеси для гибридизации при температуре гибридизации, и где температура гибридизации составляет самое большее 56°C, самое большее 58°C, самое большее 60°C, самое большее 61°C, самое большее 62°C, самое большее 63°C, самое большее 64°C, самое большее 65°C или самое большее 70°C.

[00249] 49. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-48, где способ включает поддержание смеси для гибридизации при температуре гибридизации в течение самое большее 3 суток, самое большее 2 суток, самое большее 24 часов, самое большее 20 часов, самое большее 16 часов, самое большее 12 часов, самое большее 6 часов, самое большее 3 часов, самое большее 2 часов, самое большее 90 минут, самое большее 1 часа или самое большее 30 минут.

[00250] 50. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 39-49, где способ включает поддержание смеси для гибридизации при температуре гибридизации в течение по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 45 минут, по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 90 минут, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 3 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 20 часов или по меньшей мере 24 часов.

[00251] 51. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 37-50, где способ дополнительно включает связывание зонда после его гибридизации со средством для связывания.

[00252] 52. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 51, где связывание зонда включает использование стрептавидиновой бусины.

[00253] 53. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 37-52, где способ включает получение смеси для связывания, включающей зонд и средство для связывания.

[00254] 54. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 53, где способ включает поддержание смеси для связывания при температуре связывания по меньшей мере 50°C, по меньшей мере 55°C, по меньшей мере 56°C, по меньшей мере 57°C, по меньшей мере 58°C, по меньшей мере 59°C, по меньшей мере 60°C, по меньшей мере 61°C, по меньшей мере 62°C, по меньшей мере 63°C, по меньшей мере 64°C, по меньшей мере 65°C или по меньшей мере 70°C.

[00255] 55. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 53 или 54, где способ включает поддержание смеси для связывания при температуре связывания самое большее 56°C, самое большее 58°C, самое большее 60°C, самое большее 61°C, самое большее 62°C, самое большее 63°C, самое большее 64°C, самое большее 65°C или самое большее 70°C.

[00256] 56. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 53-55, где способ включает поддержание смеси для связывания при температуре связывания в течение по меньшей мере 2 минут, по меньшей мере 5 минут, по меньшей мере 10 минут или по меньшей мере 15 минут.

[00257] 57. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 53-56, где способ включает поддержание смеси для связывания при температуре связывания в течение самое большее 5 минут, самое большее 10 минут, самое большее 15 минут, самое большее 20 минут, самое большее 30 минут или самое большее 45 минут.

[00258] 58. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 53-57, где способ включает промывку связанного зонда.

[00259] 59. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 53-58, где способ дополнительно включает элюцию связанных членов библиотеки со средств для связывания в элюант.

[00260] 60. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 53-59, где способ дополнительно включает элюцию связанных членов библиотеки с зонда в элюант.

[00261] 61. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 60, где элюируют по меньшей мере 60 фемтомоль, по меньшей мере 80 фемтомоль, по меньшей мере 90 фемтомоль, по меньшей мере 100 фемтомоль или по меньшей мере 150 фемтомоль ДНК.

[00262] 62. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 60 или 61, где элюируют самое большее 150 фемтомоль, самое большее 500 фемтомоль, самое большее 1 пикомоль, самое большее 2 пикомоль или самое большее 3 пикомоль ДНК.

[00263] 63. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 60-62, где концентрация ДНК в элюанте составляет по меньшей мере 1,1 пМ, по меньшей мере 1,2 пМ, по меньшей мере 1,3 пМ, по меньшей мере 10 пМ или по меньшей мере 100 пМ.

[00264] 64. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 60-63, где концентрация ДНК в элюанте составляет самое большее 100 пМ, самое большее 200 пМ, самое большее 250 пМ, или самое большее 300 пМ.

[00265] 65. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 60-64, где концентрация ДНК в элюанте лежит в диапазоне 1,3 пМ-250 пМ.

[00266] 66. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 37-65, где способ дополнительно включает секвенирование членов библиотеки.

[00267] 67. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 66, где способ включает амплификацию членов библиотеки перед секвенированием членов библиотеки.

[00268] 68. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 66, где способ не включает амплификацию членов библиотеки перед секвенированием членов библиотеки.

[00269] 69. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 24-68, где блокатор содержит олигонуклеотид с увеличенной T_m.

[00270] 70. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 24-69, где блокатор содержит множество модификаций, увеличивающих T_m.

[00271] 71. Способ из варианта осуществления способов использования буфера 70, где множество модификаций, увеличивающих T_m блокатора, содержит по меньшей мере одно из перекрестно сшитого олигонуклеотида; модифицированного 5-метилдезоксицитидина (5-метил-dc); 2,6-диаминопурина; запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК); мостиковой нуклеиновой кислоты (БНК); трициклической нуклеиновой кислоты; пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК); C5-модифицированного пиримидинового основания; пропинилпиримидина; морфолино; фосфорамидита; и 5'-пиренового кэпа.

[00272] 72. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 24-71, где блокатор содержит олигонуклеотид;

где блокатор является способным связываться с адаптером, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где область блокатора, способная связываться с индексной областью и/или UMI адаптера, содержит:

по меньшей мере три основания тимина, по меньшей мере четыре основания тимина, по меньшей мере пять оснований тимина, по меньшей мере шесть оснований тимина, по меньшей мере семь оснований тимина, по меньшей мере восемь оснований тимина, по меньшей мере девять оснований тимина или по меньшей мере десять оснований тимина; или

универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание.

[00273] 73. Способ из любого из вариантов осуществления способов использования буфера 24-72, где блокатор содержит два несвязанных олигонуклеотида;

где блокатор является способным связываться по меньшей мере с частью адаптера, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где несвязанные олигонуклеотиды содержат основания, которые не соответствуют индексной области адаптера и/или UMI адаптера.

Иллюстративные способы не включающего ПЦР гибридного связывания (варианты осуществления способа связывания)

[00274] 1. Способ, включающий

приведение библиотеки в контакт с блокатором в присутствии буфера для гибридизации;

и приведение библиотеки в контакт с зондом, где зонд гибридизуется с представляющей интерес областью в члене библиотеки;

где способ не включает амплификацию членов библиотеки с использованием ПЦР перед секвенированием членов библиотеки.

[00275] 2. Способ из варианта осуществления способа связывания 1, где зонд дополнительно содержит лиганд, и где члены библиотеки элюируют с лиганда перед секвенированием членов библиотеки.

[00276] 3. Способ из варианта осуществления способа связывания 2, где лиганд содержит биотин.

[00277] 4. Способ из любого из вариантов осуществления способа связывания 2 или 3, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку после элюции с лиганда.

[00278] 5. Способ из любого из вариантов осуществления способа связывания 1-4, где способ дополнительно включает связывание зонда после его гибридизации со средством для связывания.

[00279] 6. Способ из варианта осуществления способа связывания 5, где средство для связывания содержит стрептавидин.

[00280] 7. Способ из любого из вариантов осуществления способа связывания 5 или 6, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку после элюции со средств для связывания.

[00281] 8. Способ из варианта осуществления способа связывания 4 или 7, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку в объеме менее чем 100 мкл, в объеме менее чем 90 мкл, в объеме менее чем 80 мкл, в объеме менее чем 70 мкл или в объеме менее чем 60 мкл.

[00282] 9. Способ из варианта осуществления способа связывания 4 или 7, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку в концентрации по меньшей мере 1,1 пМ, по меньшей мере 1,2 пМ, по меньшей мере 1,3 пМ, по меньшей мере 10 пМ или по меньшей мере на 100 пМ.

[00283] 10. Способ из варианта осуществления способа связывания 4, 7 или 9, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку в концентрации самое большее 100 пМ, самое большее 200 пМ, самое большее 250 пМ или самое большее 300 пМ.

[00284] 11. Способ из любого из вариантов осуществления способа связывания 4, или 7-10, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку с использованием устройства для прямой загрузки проточной ячейки.

[00285] 12. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способа связывания, где буфер для гибридизации содержит средство, оказывающее эффект скученности.

[00286] 13. Способ из варианта осуществления способа связывания 12, где буфер для гибридизации содержит

0,5% - 10% декстрансульфат,

0,05 мг/мл - 0,5 мг/мл ДНК Cot-1 человека,

1% - 15% (об./об.) формамид,

40 мМ - 80 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄,

0,1 M - 4 M NaCl, и

0,001% - 10% (об./об.) Tween 20.

[00287] 14. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способа связывания, где блокатор содержит олигонуклеотид с увеличенной T_m.

[00288] 15. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способа связывания, где блокатор содержит множество модификаций, увеличивающих T_m.

[00289] 16. Способ из варианта осуществления способа связывания 15, где множество модификаций, увеличивающих T_m блокатора, включают по меньшей мере одно из перекрестно сшитого олигонуклеотида; модифицированного 5-метилдезоксицитидина (5-метил-dc); 2,6-диаминопурина; запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК); мостиковой нуклеиновой кислоты (БНК); трициклической нуклеиновой кислоты; пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК); C5-модифицированного пиримидинового основания; пропинилпиримидина; морфолино; фосфорамидита; и 5'-пиренового кэпа.

[00290] 17. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способа связывания, где блокатор содержит олигонуклеотид;

где блокатор является способным связываться с адаптером, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где область блокатора, способная связываться с индексной областью и/или UMI адаптера, содержит:

по меньшей мере три основания тимина, по меньшей мере четыре основания тимина, по меньшей мере пять оснований тимина, по меньшей мере шесть оснований тимина, по меньшей мере семь оснований тимина, по меньшей мере восемь оснований тимина, по меньшей мере девять оснований тимина или по меньшей мере десять оснований тимина; или

универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание.

[00291] 18. Способ из любого из предшествующих вариантов осуществления способа связывания, где блокатор содержит два несвязанных олигонуклеотида;

где блокатор является способным связываться по меньшей мере с частью адаптера, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI);

и где несвязанные олигонуклеотиды содержат основания, которые не соответствуют индексной области адаптера и/или UMI адаптера.

[00292] Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими ниже примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и способы следует интерпретировать в широком смысле, в соответствии с объемом и содержанием изобретения, как указано в настоящем описании.

Варианты осуществления

[00293] Следующие пронумерованные пункты представляют варианты осуществления, как описано в настоящем описании, хотя варианты осуществления, перечисленные в настоящем описании, не являются ограничивающими.

[00294] Пункт 1. Буфер для гибридизации, содержащий средство, оказывающее эффект скученности, и по меньшей мере одно из ДНК Cot-1 человека, дестабилизатора, соли и блокатора.

[00295] Пункт 2. Буфер для гибридизации по пункту 1, где средство, оказывающее эффект скученности, содержит по меньшей мере один из декстрана, декстрансульфата, полиэтиленгликоля (PEG), фиколла, глицерина и бетаина.

[00296] Пункт 3. Буфер для гибридизации по любому из предшествующих пунктов, где буфер для гибридизации содержит: 0,5% - 10% декстрансульфат, 0,05 мг/мл - 0,5 мг/мл Cot-1, 1% - 15% (об./об.) формамид, 40 мМ - 80 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄, 0,1 M - 4 M NaCl и 0,001% - 10% (об./об.) TWEEN 20.

[00297] Пункт 4. Буфер для гибридизации по любому из предшествующих пунктов, где блокатор содержит множество модификаций, увеличивающих T_m.

[00298] Пункт 5. Способ, включающий использование буфера для гибридизации по любому из предшествующих пунктов.

[00299] Пункт 6. Способ по пункту 5, включающий получение смеси для гибридизации, содержащей члены библиотеки, буфер для гибридизации, ДНК Cot-1 человека, блокатор и зонд.

[00300] Пункт 7. Способ по пункту 6, где смесь для гибридизации содержит образцы по меньшей мере из двух препаратов библиотек, где объединяют по меньшей мере 10 нг, по меньшей мере 25 нг, по меньшей мере 50 нг, по меньшей мере 100 нг, по меньшей мере 200 нг или по меньшей мере 500 нг ДНК из каждого препарата библиотеки.

[00301] Пункт 8. Способ по пункту 6 или пункту 7, где концентрация ДНК в смеси для гибридизации лежит в диапазоне 0,1 нг/мкл - 120 нг/мкл.

[00302] Пункт 9. Способ по любому из пунктов 6-8, где способ включает: приведение членов библиотеки в контакт с зондом, где зонд гибридизуется с представляющей интерес областью в члене библиотеки, и где зонд содержит лиганд, связывание зонда после его гибридизации со средством для связывания, и элюцию связанных членов библиотеки со средств для связывания в элюант, где концентрация ДНК элюанта лежит в диапазоне 1,3 пМ - 250 пМ.

[00303] Пункт 10. Способ по любому из пунктов 6-9, где способ дополнительно включает секвенирование членов библиотеки, и где способ не включает амплификацию членов библиотеки перед секвенированием членов библиотеки.

[00304] Пункт 11. Способ по пункту 10, где способ включает внесение членов библиотеки в проточную ячейку с использованием устройства для прямой загрузки проточной ячейки.

[00305] Пункт 12. Блокатор, содержащий олигонуклеотид; где блокатор является способным связываться с адаптером, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI); и где область блокатора, способная связываться с индексной областью и/или UMI адаптера, содержит: по меньшей мере три основания тимина, по меньшей мере четыре основания тимина, по меньшей мере пять оснований тимина, по меньшей мере шесть оснований тимина, по меньшей мере семь оснований тимина, по меньшей мере восемь оснований тимина, по меньшей мере девять оснований тимина или по меньшей мере десять оснований тимина; или универсальные основания и по меньшей мере одно неуниверсальное основание.

[00306] Пункт 13. Блокатор, содержащий два несвязанных олигонуклеотида; где блокатор является способным связываться по меньшей мере с частью адаптера, где адаптер содержит последовательность универсального праймера и по меньшей мере одно из индексной области или уникального молекулярного идентификатора (UMI); и где несвязанные олигонуклеотиды содержат основания, которые не соответствуют индексной области и/или UMI адаптера.

[00307] Пункт 14. Блокатор по пункту 12 или 13, где последовательность универсального праймера содержит по меньшей мере один из P5, P7, P5', P7', V2.A14.METS, V2.B15.METS, последовательности, комплементарной V2.A14.METS, и последовательности, комплементарной V2.B15.METS.

[00308] Пункт 15. Блокатор по любому из пунктов 12-14, где блокатор содержит модификацию, увеличивающую T_m блокатора, относительно такого же блокатора, который не включает модификацию.

[00309] Пункт 16. Блокатор по любому из пунктов 12-15, где блокатор содержит по меньшей мере одно из ДНК- или РНК-олигонуклеотида, модифицированного для связывания областей с низким содержанием GC; перекрестно сшитого олигонуклеотида; модифицированного 5-метилдезоксицитидина (5-метил-dc); 2,6-диаминопурина; запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК); мостиковой нуклеиновой кислоты (БНК); трициклической нуклеиновой кислоты; пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК); C5-модифицированного пиримидинового основание; пропинилпиримидина; морфолино; фосфорамидита; и 5'-пиренового кэпа.

[00310] Пункт 17. Способ, включающий приведение библиотеки в контакт с блокатором в присутствии буфера для гибридизации; и приведение библиотеки в контакт с зондом, где зонд гибридизуется с представляющей интерес областью в члене библиотеки; где способ не включает амплификацию членов библиотеки с использованием ПЦР перед секвенированием членов библиотеки.

[00311] Пункт 18. Способ по пункту 17, где способ включает внесение членов библиотеки в проточную ячейку в концентрации по меньшей мере 1,1 пМ, по меньшей мере 1,2 пМ, по меньшей мере 1,3 пМ, по меньшей мере 10 пМ, или по меньшей мере 100 пМ и в концентрации самое большее 100 пМ, самое большее 200 пМ, самое большее 250 пМ или самое большее 300 пМ.

[00312] Пункт 19. Способ по пункту 17 или 18, где блокатор содержит множество модификаций, увеличивающих T_m.

[00313] Пункт 20. Способ по любому из пунктов 17-19, где буфер для гибридизации содержит средство, оказывающее эффект скученности.

[00314] Пункт 21. Способ по любому из пунктов 17-20, где буфер для гибридизации содержит 0,5%-10% декстрансульфат, 0,05 мг/мл - 0,5 мг/мл ДНК Cot-1 человека, 1% - 15% (об./об.) формамид, 40 мМ - 80 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄, 0,1 M - 4 M NaCl и 0,001% - 10% (об./об.) Tween 20.

[00315] Пункт 22. Способ по любому из пунктов 17-21, включающий внесение членов библиотеки в проточную ячейку с использованием устройства для прямой загрузки проточной ячейки.

[00316] Пункт 23. Набор, содержащий буфер для гибридизации по любому из пунктов 1-4.

[00317] Пункт 24. Набор, содержащий блокатор по любому из пунктов 12-16.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Гибридизация и связывание

Гибридизация

[00318] Неусовершенствованный буфер для гибридизации включает следующие компоненты/конечные концентрации в реакции гибридизации в 100 мкл: Cot-1 человека 0,2 мг/мл, формамид 10% (об./об.), KH₂PO₄ - K₂HPO₄ 66,6 мМ, NaCl 0,8 M, TWEEN 20 0,04% (об./об.).

[00319] Усовершенствованный буфер для гибридизации включает следующие компоненты/конечные концентрации в реакции гибридизации в 100 мкл: декстрансульфат 1,5% (масс./об.), Cot-1 человека 0,2 мг/мл, формамид 10% (об./об.), KH₂PO₄ - K₂HPO₄ 66,6 мМ, NaCl 0,8 M, TWEEN 20 0,04% (об./об.).

[00320] В каждом случае, 100 мкл конечной реакционной смеси также содержит: зонды (при по меньшей мере 500 зондов и самое большее 500000 зондов) в концентрации 125 пМ на зонд (при общей концентрации зонда по меньшей мере 30 нМ), и образцы ДНК самое большее в 30 мкл (50 нг - 6 мкг). Если они включены, блокаторы присутствуют при 0,2 мМ.

[00321] Реакцию гибридизации проводят в термоциклере или в системе HYBEX с точным контролем температуры. После денатурации при 95°C в течение 5 минут, реакцию гибридизации инкубируют при 58°C или 62°C в течение 90 минут (общее время гибридизации приблизительно (~) 100 минут) или самое большее 24 часов. За линейным изменением при 2°C в минуту, начиная от 95°C до 58°C или 62°C (дополнительные 20 минут), может следовать инкубация при 58°C или 62°C, в зависимости от дизайна зонда. (Для экспериментов, описанных в настоящем описании, образцы инкубируют при 62°C.).

Связывание

[00322] Целевую ДНК связывают с использованием 250 мкл стрептавидиновых бусин SMB (стрептавидиновые магнитные бусины, Illumina, Inc., San Diego, CA) для каждой реакции гибридизации в 100 мкл при температуре инкубации для гибридизации (например, 62°C, если реакцию гибридизации инкубируют при 62°C в течение 90 минут) в течение 15 минут. Затем целевую ДНК промывают при такой же температуре (например, 62°C) в течение 5 минут всего 4 раза с использованием буфера для промывки EEW (усовершенствованный буфер для промывки при обогащении, Illumina, Inc., San Diego, CA (Трис-HCL, мезилат дефероксамина (DFO), бетаин и TWEEN 20)). Целевую ДНК элюируют с использованием свежего раствора для денатурации (0,1% (об./об.) TWEEN 20 (EE1) и 2 Н NaOH (HP3)), нейтрализуют с использованием ET2 (буфер для элюции мишени 2, Illumina, Inc., San Diego, CA (Трис-основание, Трис-ацетат)), и далее амплифицируют с использованием смеси праймеров (PPC; набор праймеров с адаптерами для секвенирования, включающий 5 мкМ праймеры P5 и P7, Illumina, Inc.) и усовершенствованной смеси для ПЦР (EPM) (Illumina, Inc., San Diego, CA), и очищают с использованием 0,9x бусин для твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI).

Пример 2 - Блокаторы, включающие тимин

[00323] В этом примере описаны блокаторы, которые включают тимин в области блокатора, которая соответствует индексу и/или UMI (см. ФИГ. 3D).

[00324] С использованием блокаторов из таблицы 3, проводят гибридизацию и связывание, как описано в примере 1, с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации и 0,2 мМ блокатора. Полученные связанные ДНК секвенируют, и обогащение с дополненным считыванием рассчитывают с использованием приложения Enrichment v3.0 BASESPACE App (Illumina, Inc., San Diego, CA).

[00325] Блокаторы, которые включают отрезок из T в положениях индексной последовательности, требуют по меньшей мере 8 или 10 модифицированных нуклеотидов в области блокатора, которая не соответствует индексу, для достижения высокого связывания целевой ДНК (как измерено посредством обогащения с дополненным считыванием).

[00326] Для олигонуклеотидов с последовательностью, комплементарной индексной области, необходимо меньше модифицированных нуклеотидов (тестировали 8 нуклеотидов и 10 нуклеотидов) и показано более высокое обогащение с дополненным считыванием. Результаты показаны на ФИГ. 4. При одинаковом количестве модификаций (8 или 10 нуклеотидов) в блокаторах, для блокаторов с последовательностью, комплементарной индексной области (последний столбец), показано более высокое обогащение с дополненным считыванием, чем для блокаторов с отрезком из T в индексной области (отмеченным как «10 мод. с (T)8» на ФИГ. 4).

Таблица 3

SEQ ID NO Наименование Описание Последовательности Модификация 104 NEXTERA Блокатор 1 (15016424) i5 Illumina NEXTERA блокатор i5 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTTTTTTTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG/ 3ddC/ без мод. 105 NEXTERA Блокатор 2 (15016425) i7 Illumina NEXTERA блокатор i7 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG/3ddC/ без мод. 106 TiБНК1 NEXTERA блокатор 1_3XCG 5' - AATGATACGGCGACCACCGAGAT+CTACACTTTTTTTTT+CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGA+C AG/3ddC/ 3 мод. 107 TiБНК2 NEXTERA блокатор 2_3XCG 5' - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTTTTTTGT+CTCGTGGGCT+CGGAGATGTGTATAAGAGA+CAG/ 3ddC/ 3 мод. 108 TiБНК3 NEXTERA блокатор 1_6XCG 5' - AATGATACGGCGACCACCGAGA+TCTACACTTTTTTTTTCG+TCGG+CAGCG+TCAGATG+TGTATAA+G AGACAG/3ddC/-3' 6 мод. 109 TiБНК4 NEXTERA блокатор 2_6XCG 5' - CAAGCAGAAGACGGCA+TACGAGATTTTTTTTTG+TCT+CGTGGGC+TCGGAGATG+TGTATAA+G AGACAG/3ddC/-3' 6 мод. 110 TiБНК5 NEXTERA блокатор 1_10XCG 5' - AATGATA+CGGCGA+CCAC+CGAGA+TCTA+CACTTTTTTTTTCG+TCGG+CAGCG+TCAGATG+TGTATA A+GAGACAG-спейсер C3-3' 10 мод. 111 TiБНК6 NEXTERA блокатор 2_10XCG 5' - CAAG+CAGAAGA+CGGCA+TACGA+GATTTTTTTTTG+TCT+CGTGGGC+TCGG+AGATG+TGTATAA+G AGACAG-спейсер C3-3' 10 мод. 112 TiS517 С-специфический блокатор 517 5' - AATGATACGGCGACCAC+CGAGA+TCTA+CACG+CGTA+AGATCG+TCGG+CAGCG+TCAGATG+T GTATAA+GAGACAG-спейсер C3-3' 10 мод. 113 TiS701 С-специфический блокатор701 5' - CAAGCAGAAGA+CGGCA+TACGAGATT+CGCCTTAG+TCT+CGTGGGC+TCGGAGA+TGTGTATAA+G AGACAG-спейсер C3-3' 8 мод.

Таблица 4

SEQ ID NO Наименование Описание Последовательности Модификация 114 BL007 TSHTЗНК15G 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/ iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ G мод. в индексе 115 BL008 TSHTЗНК16G 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+G/iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ G мод. в индексе 116 BL009 TSHTЗНК15N 5'- AATGATACGGCGACCAC+CGA+GAT+CTA+CAC/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/ACAC+TCT+TTC+CCT+ACA+CGA+CGC+TCT+TCC+GAT+C/3ddC/ N в индексе 117 BL010 TSHTЗНК16N 5'- CAAGCAGAAGACGG+CAT+ACG+AGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/N/iдезоксиI//iдезоксиI// iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/+GTG+ACT+GGA+GTT+CAG+ACG+TGTGCT+CTT+CCG+ATC/3ddC/ N в индексе

Таблица 5

SEQ ID NO Наименование Описание Последовательности Модификация 118 BN023 P5ЗНК 5'- AATGA+TAC+GGC+GAC+CAC+CGA+GAT+CTA+CAC/3SpC3/ 8 мод. 119 BN024 P7ЗНК 5'- CAAGC+AGA+AGA+CGG+CAT+ACG+A+GA+T/3SpC3/ 8 мод. 120 BN025 TiЗНКS1 5'- TCGTC+GGC+AGC+GTC+AGA+TGT+GTA+TAA+GAG+ACA+G/3SpC3/ 10 мод. 121 BN026 TiЗНКS2 5'- GTCT+CGT+GGGC+TCG+GAG+ATG+TGT+ATAA+GAG+ACA+G/3SpC3/ 10 мод. 122 BN027 TiЗНК17 5' - GGCGAC+CAC+CGAGA+TCT+ACA+C/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+TCG+TCG+GCA+GCG+TCA+GATG+TG/3SpC3/ 123 BN028 TiЗНК18 5' - GGCA+TAC+GAGA+T/iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI//iдезоксиI/
+GTC+TCG+TGG+GC+TCGG+AGA+TGTG+TATAA+GAG/3SpC3/

Пример 3 - Блокаторы, включающие универсальные основания и модифицированные основания

[00327] С использованием 0,2 мМ блокаторов из таблицы 4 в усовершенствованном буфере для гибридизации, гибридизацию и связывание проводят, как описано в примере 1. Как показано в таблице 4, область блокатора, соответствующая индексной области, включает универсальные основания (дезоксиинозин) и ЗНК-модифицированный гуанин или случайный нуклеотид.

[00328] Без намерения быть связанными с теорией, считают, что включение модифицированного G или случайного нуклеотида в каждое третье основание последовательности блокатора, соответствующей индексной области (например, в третьих и/или в пятых положениях (от 5'-конца) последовательности блокатора соответствующий индексной области, как показано в одном варианте осуществления на ФИГ. 5, или во вторых и/или в четвертых положениях последовательности блокатора, соответствующей индексной области), улучшает аффинность блокатора для члена библиотеки.

Пример 4 - Разделенные блокаторы

[00329] В этом примере показано, что разделенные ЗНК-блокаторы хорошо функционируют с библиотекой, включающей 8-нуклеотидный индекс.

[00330] С использованием блокаторов из таблицы 5, гибридизацию и связывание проводят, как описано в примере 1, с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации. Как показано в таблице 5, блокаторы TiЗНКS1 (BN025), TiЗНКS2 (BN026), P5ЗНК (BN023) и P7ЗНК (BN024) не включают область, соответствующую индексной области. Каждый из P5ЗНК (BN023) и P7ЗНК (BN024) включает 8 ЗНК-модифицированных оснований. Каждый из TiЗНКS1 (BN025) и TiЗНКS2 (BN026) включает 10 ЗНК-модифицированных оснований. Каждый из TiЗНК17 (BN027) и TiЗНК18 (BN028) включает универсальные основания (дезоксиинозин) в области блокатора, соответствующей индексной области, но включает укороченные области блокатора, соответствующие другим областям адаптера.

[00331] Полученные связанные ДНК секвенируют, и обогащение с дополненным считыванием рассчитывают с использованием приложения Enrichment v3.0 BASESPACE App (Illumina, Inc., San Diego, CA). Схема блокаторов показана на ФИГ. 6A и ФИГ. 3E - ФИГ. 3I; результаты показаны на ФИГ. 6B. Образец «разделенный на 4 фрагм.» содержит TiЗНКS1 (BN025), TiЗНКS2 (BN026), P5ЗНК (BN023) и P7ЗНК (BN024) из таблицы 5; образец «внутренний» содержит TiЗНКS1 (BN025) и TiЗНКS2 (BN026) в таблице 5; образец «внешний» содержит P5ЗНК (BN023 и P7ЗНК (BN024) в таблице 5; образец короткий из 8 н. включает TiЗНК17 (BN027) и TiЗНК18 (BN028) в таблице 5. Блокаторы из двух фрагментов («разделенные блокаторы»), включающие BN023, BN024, BN025 и BN026, функционируют так же хорошо, как блокирующие олигонуклеотиды XGEN (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), как измерено посредством обогащения с дополненным считыванием; эксперименты с использованием блокатора, блокирующего только часть адаптера, не функционируют так хорошо.

Пример 5 - Буфер для гибридизации

[00332] В этом примере показаны сравнения целевого связывания с использованием неусовершенствованного буфера для гибридизации и усовершенствованного буфера для гибридизации.

[00333] Гибридизацию и связывание проводят, как описано в примере 1, с использованием блокирующих олигонуклеотидов XGEN (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) и усовершенствованного буфера для гибридизации, включающего концентрации декстрансульфата, указанные на ФИГ. 7A. Полученные связанные ДНК секвенируют, и обогащение с дополненным считыванием рассчитывают с использованием приложения Enrichment v3.0 BASESPACE App (Illumina, Inc., San Diego, CA). Результаты показаны на ФИГ. 7A. Включение декстрансульфата позволяет быструю гибридизацию (60 минут - 90 минут) в большом объеме (100 мкл) буфера для гибридизации.

[00334] Обогащение с использованием объема 100 мкл буфера для гибридизации оценивают с использованием четырех различных панелей зондов: кодирующих экзом олигонуклеотидов Coding Exome Oligos (CEX) (Illumina, Inc., San Diego, CA), панели для исследования экзома IDT Exome Research Panel (экзом IDT) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), панели для исследования злокачественных опухолей TRUSIGHT Cancer Panel (Злокачественная опухоль) (Illumina, Inc., San Diego, CA) и панели для секвенирования TRUSIGHT One Sequencing Panel (TSO) (Illumina, Inc., San Diego, CA). Тестируют гибридизацию в трех буферах для гибридизации: буфере IDT из набора XGEN LOCKDOWN (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) и буфере для гибридизации в присутствии и в отсутствие декстрансульфата, как описано в примере 1. Результаты показаны на ФИГ. 7B. Усовершенствованный буфер для гибридизации обеспечивает сходные или более высокие целевые результаты, по сравнению с буфером IDT, для всех четырех панелей зондов (лежащих в диапазоне от 4000 до 450000 зондов).

[00335] Два ключевых показателя обогащения (обогащение с дополненным считыванием и равномерность покрытия) для четырех панелей (CEX, экзом IDT, злокачественная опухоль и TSO) получают при различных периодах времени инкубации при гибридизации, и в присутствии и в отсутствие дополнительной стадии линейного изменения температуры с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации Illumina с блокаторами IDT xGen. Результаты показаны на ФИГ. 7C. Пунктирная черная линия на левой панели обозначает результат гибридизации в буфере без декстрансульфата.

[00336] В трех экспериментах вводы 12-плексной библиотеки пулируют по объему до суммарных 30 мкл и обогащают с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации Illumina с блокаторами IDT XGEN. Образцы исследуют в различных секвенаторах от Illumina, Inc. (NOVASEQ, NEXTSEQ и ISEQ). Стадия концентрирования образца не требуется. Результаты показаны на ФИГ. 7D-7F. Результаты показывают, что при использовании усовершенствованного буфера для гибридизации, включающего декстрансульфат, самое большее 30 мкл образцов можно предоставлять для реакции гибридизации (например, один образец 15 мкл или 12-плексная реакция по 2,5 мкл каждого). Использование усовершенствованного буфера для гибридизации позволяет обогащение самое большее 12 образцов в одной реакции без использования вакуумной центрифуги speed vacuum, колонки для центрифугирования или бусин SPRI для дополнительного уменьшения объема пула.

Пример 6 - Улучшенные адаптеры+усовершенствованный буфер для гибридизации

[00337] Эффективность обогащения панели экзома IDT (кат. # 1056114, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) тестируют с использованием: (1) буфера IDT (17 мкл) из набора XGEN LOCKDOWN (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA); (2) неусовершенствованного буфера для гибридизации с неусовершенствованными блокаторами адаптеров (NEXTERA блокатор 1 i5 (BN001) и NEXTERA блокатор 2 i7 (BN002) в таблице 2) в малом (11 мкл) реакционном объеме (TiE0); (3) неусовершенствованного буфера для гибридизации с усовершенствованными блокаторами адаптеров (XGEN блокаторы) в малом (11 мкл) реакционном объеме (TiE3); (4) неусовершенствованного буфера для гибридизации с усовершенствованными блокаторами адаптеров (XGEN блокаторы) в большом (100 мкл) реакционном объеме (TiE4); и (5) усовершенствованного буфера для гибридизации с усовершенствованными блокаторами адаптеров (XGEN блокаторы) в большом (100 мкл) реакционном объеме (TiE9). Результаты показаны на ФИГ. 8A и показывают, что эффективность обогащения улучшают при использовании модифицированных блокаторов, увеличения температуры промывки и/или средства, оказывающего эффект скученности (декстрансульфата), в буфере для гибридизации.

[00338] Эффективность обогащения (как измерено с использованием обогащения с дополненным считыванием) оценивают для девяти панелей зондов с использованием анализа обогащения IDT (каталожный No. 1080584, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), и анализа обогащения Illumina с усовершенствованным буфером для гибридизации. Высокого обогащения с дополненным считыванием достигают в реакционном объеме 100 мкл с различными панелями зондов (от 5004 до 50000 зондов). Панели зондов включают: (1) панель для исследования экзома XGEN Exome Research Panel (экзом IDT) (каталожный No. 1056114, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA); (2) панель для исследования экзома человека Twist Human Core Exome (Twist Bioscience, Inc., каталожный No. 100254); (3) панель кодирующих экзом олигонуклеотидов Coding Exome Oligos (CEX) (каталожный No. 15034575, Illumina, Inc., San Diego, CA); (4) панель TruSight One (Illumina Inc, San Diego, CA, каталожный No. FC-141-1007; зонд - каталожный No. 15046658); (5) расширенную панель TruSight One Expanded (Illumina, Inc San Diego, каталожный No. FC-141-2007; зонд - каталожный No. 20015656); (6) панель для исследования злокачественных опухолей TruSight Cancer (Illumina, Inc., San Diego, CA, каталожный No. FC-121-0202; зонд - каталожный No. 15035642); (7) кардиологическую панель TruSight Cardio (Illumina, Inc., San Diego, CA, каталожный No. FC-141-1010; зонд - каталожный No. 15069654); (8) панель слитых РНК TruSight RNA Fusion Panel (Illumina Inc, San Diego, CA, каталожный No. 20000906); (9) готовый пул ДНК-зондов для исследования онкологических заболеваний Oncology DNA Probes Master Pool (OPD1) (Illumina, Inc., каталожный No. OP-101-1004; зонд - каталожный No. 20001565). Результаты показаны на ФИГ. 8B. Белый столбец (столбец 1) показывает производительность панели экзома IDT в технологическом процессе обогащения IDT lockdown с получением библиотеки NEXTERA Rapid Capture (Illumina, Inc., San Diego, CA). Серые столбцы показывают производительность панелей с использованием анализа обогащения Illumina с усовершенствованным буфером для гибридизации и блокаторами адаптеров IDT xGEN. Черные горизонтальные линии показывают сравнительные результаты, полученные с использованием соответствующих панелей, с использованием анализа обогащения Twist (Twist Bioscience, Inc.) (столбец 3), получения библиотеки Nextera Rapid Capture (столбцы 4-8) или технологического процесса TruSight Tumor 170 с использованием панели OPD1 (столбец 10). Производительность каждой панели в анализе обогащения Illumina с усовершенствованным буфером для гибридизации оценивают по меньшей мере в трех независимых экспериментах; планки погрешностей показывают стандартное отклонение.

[00339] Соматические варианты детектируют посредством способа обогащения с одной гибридизацией с использованием усовершенствованного буфера для гибридизации и блокаторов XGEN для панели из 12 генов, 535 зондов для обогащения библиотек, полученных из количественного мультиплексного (QM) стандарта ДНК Horizon Discover HD701. Данные, представленные на ФИГ. 8C, показывают ожидаемую частоту вариантов (x-ось) против выявленной частоты вариантов (y-ось). Каждая панель на ФИГ. 8C представляет различные концентрации высокоаффинных блокаторов адаптеров (блокаторы адаптеров IDT XGEN, 0,1x (0,02 мМ) и 0,5x (0,1 мМ), и отрицательный контроль (без высокоаффинных блокаторов адаптеров). Каждая точка представляет собой выявление соматического варианта, окрашенное по глубине считывания. Пунктирная красная линия представляет прогнозируемую точную корреляцию между известными частотами вариантов и выявленными частотами вариантов. Синяя и серая штриховка представляет линию наилучшего соответствия и 95% доверительный интервал, соответственно, для частот выявленных вариантов, по сравнению с частотами известных вариантов. Ожидаемая частота вариантов (x-ось) коррелирует с известной (выявленной) частотой вариантов (y-ось) для блокаторов адаптеров IDT XGEN (0,1X (0,02 мМ), 0,5X (0,1 мМ)), но не коррелирует с отрицательным контролем (без высокоаффинных блокаторов адаптеров)).

Пример 7A - Не включающее ПЦР гибридное связывание с использованием библиотек TRUSEQ с лигированными адаптерами

[00340] В этом примере показано не включающее ПЦР гибридное связывание.

[00341] Гибридизацию проводят с использованием реагентов XGEN LOCKDOWN (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), в соответствии с инструкциями в упаковке, со следующими модификациями. Целевую ДНК получают с использованием способа лигирования адаптеров TRUSEQ и связывают с использованием 100 мкл бусин Dynabeads M-270 со стрептавидином (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Гибридизацию инкубируют только в течение 30 минут вместо рекомендованных 4 часов. Затем следуют следующему протоколу:

1. Инкубация с 10 мкл 0,1 Н NaOH, денатурация связанной библиотеки с зондов и ее высвобождение в раствор.

2. Удаление раствора связанной библиотеки от бусин (с использованием магнита) и нейтрализация с использованием 10 мкл 200 мМ Трис.HCl pH 7,0.

3. (Необязательно) Добавление денатурированного контроля PhiX Control v3 (Illumina, Inc., San Diego, CA) к образцу, самое большее 7,5 мкл буфера для ресуспендирования (RSB) (Illumina, Inc., San Diego, CA).

4. Добавление 27,5 мкл 2x HT1 (буфера для гибридизации, Illumina, Inc., San Diego, CA)

[00342] Полученный образец (в 55 мкл 1x буфера HT1) вносят непосредственно в проточную ячейку с использованием пипетки или с использованием устройства для загрузки проточной ячейки, как описано, например, в Предварительной патентной заявке США No. 62/564466, поданной 28 сентября 2017 г. Результаты показаны в таблице 6A. Контроль (столбец 1) анализируют с использованием таких же условий, как в не включающих ПЦР способах, за исключением того, что ПЦР проводят после связывания. Первоначальные попытки проведения не включающего ПЦР обогащения показаны в столбце 2, и показано, что слишком малое количество прочтений привело к неудаче в отношении достижения приемлемого уровня покрытия экзома. Достигнуто только ~18x среднее покрытие мишени, в то время как целью является превышение ~50x. Для второй попытки (столбец 3), использовали устройство для прямой загрузки проточной ячейки, и показано, что увеличенный ввод ДНК в гибридизацию улучшал выход секвенирования для способа не включающего ПЦР обогащения до ~140x, намного больше, чем цель ~40x. Снижение частоты выборки данных для не включающего ПЦР способа до 70 миллионов прочтений (столбец 4) приводит к показателям, сходным (или даже превосходящим), по отношению к контролю.

Пример 7B - Не включающее ПЦР гибридное связывание с использованием библиотек NEXTERA на основе бусин улучшает качество экзома для коротких периодов времени гибридизации

[00343] Контролируемый эксперимент проводят с использованием условий, сходных с примером 7A, но с использованием библиотек, полученных с использованием способа получения библиотеки с тагментацией на основе бусин, и с использованием соответствующих блокирующих олигонуклеотидов. В этом эксперименте, как длительность гибридизации, так и амплификация ПЦР представляют собой переменные. Рекомендованный 4-часовой способ реакции гибридизации с ПЦР после связывания (всего ~7,5 часов, см. протокол IDT XGEN) с секвенированием с использованием устройства NextSeq без прямой загрузки проточной ячейки используют в качестве контроля (схема этого технологического процесса показана на ФИГ. 9B), и сравнивают с двумя условиями с использованием только 30-минутных гибридизаций (в присутствии и в отсутствие ПЦР после связывания) и с прямой загрузкой проточной ячейки (ФИГ. 9C). Укорочение длительности гибридизации и исключение ПЦР позволяют осуществление способа обогащения только за ~2 час. Схема этого технологического процесса с укороченным временем гибридизации и без ПЦР показана на ФИГ. 9D.

[00344] Результаты показаны в таблице 6B. Для всех данных снижают частоту выборки до ~23 миллионов кластеров. В первом столбце (контроль), данные показывают хорошее качество экзома, но с длительным технологическим процессом ~7,5 час. Когда гибридизацию укорачивают на 30 минут, длительность протокола уменьшается суммарно до ~4 час (столбец 2); однако, количество дупликатов при ПЦР увеличивается, по сравнению с контролем. Увеличение количества дупликатов при ПЦР также уменьшает разнообразие библиотеки и соответствующее покрытие ~20x. Когда ПЦР исключают из 30-минутного технологического процесса (столбец 3), количество дупликатов при ПЦР значительно уменьшается, и разнообразие увеличивается до уровня выше уровня контроля, с намного укороченным технологическим процессом (2 часа против 7,5 часов). Этот пример подчеркивает, что исключение ПЦР может улучшать качество реакций связывания при гибридизации посредством минимизации дупликации матриц во время ПЦР.

Таблица 6A

Контроль Без ПЦР Без ПЦР+прямая загрузка Без ПЦР+прямая загрузка Общее время обработки 4 час 2 час 17 мин 2 час 17 мин 2 час 17 мин Прочтения 70000000 17090392 132402247 70026594 Снижение частоты выборки данных да нет нет да Обогащение с дополненным считыванием 88% 85% 86% 86% Равномерность покрытия (Pct > 0,2*среднее) 99% 98% 99% 99% Среднее покрытие мишени 76,6 17,9 140,3 81,7 Среднее покрытие мишени (после дедупликации) 60,9 15,8 98,3 64,1 SNV в мишени 26585 21354 26758 26629 Инделы в мишени 2082 1078 2638 2348

Таблица 6B

Гибридизация 4 час Гибридизация 30 мин Гибридизация 30 мин (без ПЦР) Длительность гибридизации 4 час 30 мин 30 мин ПЦР после обогащения ДА ДА Нет Общее обогащение TAT 7,5 час 4 час 2 час Обогащение с дополненным считыванием 92,42±1% 87,03±0,35% 84,72±0,76% Равномерность 98,76± 0,14% 98,67±0,04% 98,44±0,13% % дупликатов 9,015±0,69% 16,04±0,52% 6,02±0,42% Размер библиотеки HS 102789918±11527768 50909151±1527235 141515722±7601326 Средняя глубина покрытия области 45,4±1,13 39±0,14 42,2±0 Покрытие мишени при 20x 89,98± 0,91% 85,04±0,22% 87,40±0,77% Выявление SNV 95,91±2,74% 97,26±0,0% 97,59±0,24% Точность SNV 99,63±0,05% 99,4±0,05% 99,38±0,01% Выявление инделов 80,87 ±5,82% 82,91±0,68% 85,68±0,08% Точность инделов 91,92%±0,94% 91,01±0,83% 94,49± 0,01%

Пример 8 - Сравнения блокаторов

[00345] С использованием 0,2 мМ блокаторов BN001 и BN002; BX003 и BX007; BN007 и BN008; BN005 и BN006; или BN023, BN024, BN025 и BN026 (как описано в таблице 2A) в усовершенствованном буфере для гибридизации, гибридизацию и связывание проводят, как описано в примере 1. «Немодифицированные» блокаторы BN001 и BN002 включают основания тимина в областях блокатора, соответствующих индексной области адаптера, и основания, комплементарные адаптеру, в областях блокатора, соответствующих неиндексной области адаптера; блокаторы BN001 и BN002 включают немодифицированные основания и включают 3'-ddC концевую группу. Блокаторы BX003 и BX007 представляют собой модифицированные варианты BN001 и BN002, каждый из которых имеет две замены AP-dC-CE-фосфорамидита (G-фиксатор) в областях блокатора, соответствующих неиндексной области адаптера. Блокаторы BN007 и BN008 представляют собой модифицированные варианты BN001 и BN002 с универсальными основаниями (дезоксиинозина) в области блокатора, соответствующей индексной области адаптера, и БНК-модифицированными основаниями в областях блокатора, соответствующих неиндексной области адаптера. Блокаторы BN023 и BN025 представляют собой модифицированные варианты областей BN001, которые соответствуют неиндексной области адаптера и включают ЗНК-модифицированные основания; блокаторы также включают 3'-спейсер C3 вместо 3'-ddC. Блокаторы BN024 и BN026 представляют собой модифицированные варианты областей BN002, которые соответствуют неиндексной области адаптера и включают ЗНК-модифицированные основания; блокаторы также включают 3'-спейсер C3 вместо 3'-ddC.

[00346] Полученные связанные ДНК секвенируют, и рассчитывают обогащение с дополненным считыванием, показатель количества связанной целевой ДНК. Результаты показаны на ФИГ. 10 и показывают, что различные модификации «немодифицированных» блокаторов улучшают обогащение с дополненным считыванием в анализах гибридизации.

Пример 9 - Сравнения разделенных блокаторов

[00347] С использованием 0,2 мМ BN001 и BN002; или BN023, BN024, BN025, и BN026 (как описано в таблице 2A) в усовершенствованном буфере для гибридизации, гибридизацию и связывание проводят, как описано в примере 1. Соответствующий адаптер включает 8-нуклеотидный индекс или 10-нуклеотидный индекс. Полученные связанные ДНК секвенируют, и рассчитывают обогащение с дополненным считыванием. Результаты показаны на ФИГ. 11 и показывают, что использование «разделенных блокаторов» (то есть, блокаторов, не включающих основания, соответствующие индексной области адаптера) позволяет использование одних и тех же блокаторов с адаптерами, имеющими различные индексные последовательности и длину индексов. Эти результаты показывают, что разделенные блокаторы можно использовать в ситуациях, где может являться неблагоприятным накопление изменений в дизайне индексов.

[00348] Полное содержание всех патентов, патентных заявок и публикаций, и доступного в электронной форме материала (включающего, например, нуклеотидные последовательности, поданные, например, в GenBank и RefSeq, и аминокислотные последовательности, поданные, например, в SwissProt, PIR, PRF, PDB, и трансляции аннотированных кодирующих областей в GenBank и RefSeq), процитированных в настоящем описании, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. В случае, когда существует какое-либо несоответствие между описанием настоящей заявки и описанием(описаниями) любого документа, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки, настоящее описание имеет преимущество. Предшествующее подробное описание и примеры приведены только для ясности понимания. Из этого не следует понимать никаких необязательных ограничений. Изобретение не является ограниченным точными деталями, показанными и описанными, вместо этого, изменения, очевидные для специалиста в данной области, могут быть включены в изобретение, определенное посредством формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ILLUMINA, INC.

ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED

SLATTER, Andrew F., et al.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ОБОГАЩЕНИЯ БИБЛИОТЕК

<130> 01243-0009-00PCT

<150> US 62/764753

<151> 2018-08-15

<160> 123

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN001, Nextera 8 н. адаптер - i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(37)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 2

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN002, Nextera 8 н. адаптер - i7

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (25)..(32)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 3

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN003, Nextera 10 н. адаптер - i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(39)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnnnt cgtcggcagc gtcagatgtg 60

tataagagac ag 72

<210> 4

<211> 68

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN004, Nextera 10 н. адаптер - i7

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (25)..(34)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnnngtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60

agagacag 68

<210> 5

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN005, Nextera короткий адаптер - i5

<400> 5

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagt 34

<210> 6

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN006, Nextera короткий адаптер - i7

<400> 6

ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34

<210> 7

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN007, Nextera nrUMI адаптер - i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (35)..(40)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 7

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtnnnnnn t 41

<210> 8

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TN008, Nextera nrUMI адаптер - i7

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (1)..(6)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 8

nnnnnnctgt ctcttataca catctccgag cccacgagac 40

<210> 9

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL001, TruSeq универсальный адаптер - i5

<400> 9

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 10

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL002, TruSeq 6 н. адаптер - i7

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (34)..(39)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 10

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacnnnnnna tctcgtatgc cgtcttctgc 60

ttg 63

<210> 11

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL003, TruSeq 8 н. адаптер - i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(37)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 11

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnaca ctctttccct acacgacgct 60

cttccgatct 70

<210> 12

<211> 65

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL004, TruSeq 8 н. адаптер - i7

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (34)..(41)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 12

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacnnnnnnn natctcgtat gccgtcttct 60

gcttg 65

<210> 13

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL005, TruSeq 10 н. адаптер - i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(39)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 13

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnnna cactctttcc ctacacgacg 60

ctcttccgat ct 72

<210> 14

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL006, TruSeq 10 н. адаптер - i7

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (34)..(43)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 14

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacnnnnnnn nnnatctcgt atgccgtctt 60

ctgcttg 67

<210> 15

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL007, TruSeq короткий адаптер - i5

<400> 15

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 16

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL008, TruSeq короткий адаптер - i7

<400> 16

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33

<210> 17

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL009, TruSeq nrUMI адаптер - i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (34)..(39)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 17

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt 40

<210> 18

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TL010, TruSeq nrUMI адаптер -i5

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (1)..(6)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 18

nnnnnnagat cggaagagca cacgtctgaa ctccagtcac 40

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: последовательность p5

<400> 19

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 20

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: последовательность p7

<400> 20

tcgtatgccg tcttctgctt g 21

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: последовательность, обратно комплементарная P7 (P7')

<400> 21

caagcagaag acggcatacg a 21

<210> 22

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TruSeq адаптерная область i7

<400> 22

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33

<210> 23

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TruSeq адаптерная область i5

<400> 23

acactctttc cctacacgac gctcttccga tc 32

<210> 24

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: последовательность V2.A14.METS

<400> 24

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 25

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: последовательность V2.B15.METS

<400> 25

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 26

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: N-членный домен (например, UMI)

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (1)..(6)

<223> n представляет собой смесь из 25 процентов каждого из A, T, C или G

<400> 26

nnnnnn 6

<210> 27

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN001, Nextera Блокатор 1 i5

<400> 27

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 28

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN002, Nextera Блокатор 2 i7

<400> 28

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 29

<211> 71

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN003, Праймер C NRCBLK1

<400> 29

gctgtctctt atacacatct gacgctgccg acgatttttt ttgtgtagat ctcggtggtc 60

gccgtatcat t 71

<210> 30

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN004, Праймер C NRCBLK2

<400> 30

gctgtctctt atacacatct ccgagcccac gagacttttt tttatctcgt atgccgtctt 60

ctgcttg 67

<210> 31

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN005, TiS517 с примером спаривания оснований индексной последовательности

<400> 31

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cgtaagatcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 32

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN006, TiS701 с примером спаривания оснований индексной последовательности

<400> 32

caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 33

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN007, TiБНК7

<400> 33

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag 62

<210> 34

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN008, TiБНК8

<400> 34

caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacag 58

<210> 35

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN009, TiЗНК7

<400> 35

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag 62

<210> 36

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN010, TiЗНК8

<400> 36

caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacag 58

<210> 37

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN011, TiБНК11

<400> 37

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag 62

<210> 38

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN012, TiБНК12

<400> 38

caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacag 58

<210> 39

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN013, TiБНК15G

<400> 39

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga 60

cag 63

<210> 40

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN014, TiБНК16G

<400> 40

caagcagaag acggcatacg agatggtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 59

<210> 41

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN015, TiБНК15N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(30)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 41

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga 60

cag 63

<210> 42

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN016, TiБНК16N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (25)..(25)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 42

caagcagaag acggcatacg agatngtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 59

<210> 43

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN017, TiЗНК11

<400> 43

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag 62

<210> 44

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN018, TiЗНК12

<400> 44

caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacag 58

<210> 45

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN019, TiЗНК15G

<400> 45

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga 60

cag 63

<210> 46

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN020, TiЗНК16G

<400> 46

caagcagaag acggcatacg agatggtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 59

<210> 47

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN021, TiЗНК15N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(30)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 47

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga 60

cag 63

<210> 48

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN022, TiЗНК16N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (25)..(25)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 48

caagcagaag acggcatacg agatngtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 59

<210> 49

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN023, P5ЗНК

<400> 49

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 50

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN024, P7ЗНК

<400> 50

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 51

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN025, TiЗНКS1

<400> 51

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 52

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN026, TiЗНКS2

<400> 52

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 53

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN027, TiЗНК17

<400> 53

ggcgaccacc gagatctaca ctcgtcggca gcgtcagatg tg 42

<210> 54

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN028, TiЗНК18

<400> 54

ggcatacgag atgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag ag 42

<210> 55

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN029, P5БНК-полностью

<400> 55

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 56

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN030, P7БНК-полностью

<400> 56

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 57

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN031, TiБНКS1-полностью

<400> 57

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 58

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN032, TiБНКS2-полностью

<400> 58

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 59

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN033, P5БНК-половина

<400> 59

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 60

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN034, P7БНК-половина

<400> 60

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 61

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN035, TiБНКS1-половина

<400> 61

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 62

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN036, TiБНКS2-половина

<400> 62

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 63

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN037, P5БНК-Alt

<400> 63

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 64

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN038, P7БНК-Alt

<400> 64

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 65

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN039, TiБНКS1-Alt

<400> 65

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 66

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN040, TiБНКS2-Alt

<400> 66

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 67

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN041, TiБНК3

<400> 67

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 68

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN042, TiБНК4

<400> 68

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 69

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN043, TiБНК1

<400> 69

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 70

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN044, TiБНК2

<400> 70

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 71

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL001, CT3 Блокатор 1 i7

<400> 71

caagcagaag acggcatacg agattttttt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atc 63

<210> 72

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL002, CT3 Блокатор 2 i5

<400> 72

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatc 57

<210> 73

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL003, TSLTЗНК13

<400> 73

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatc 57

<210> 74

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL004, TSLTЗНК14

<400> 74

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatc 57

<210> 75

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL005, TSHTЗНК13

<400> 75

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60

c 61

<210> 76

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL006, TSHTЗНК14

<400> 76

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatc 57

<210> 77

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL007, TSHTЗНК15

<400> 77

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60

c 61

<210> 78

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL008, TSHTЗНК16

<400> 78

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatc 57

<210> 79

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL009, TSHTЗНК15G

<400> 79

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg acactctttc cctacacgac gctcttccga 60

tc 62

<210> 80

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL010, TSHTЗНК16G

<400> 80

caagcagaag acggcatacg agatggtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatc 58

<210> 81

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL011, TSHTЗНК15N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(30)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 81

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn acactctttc cctacacgac gctcttccga 60

tc 62

<210> 82

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL012, TSHTЗНК16N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (25)..(25)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 82

caagcagaag acggcatacg agatngtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatc 58

<210> 83

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL013, TSLTБНК13

<400> 83

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatc 57

<210> 84

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL014, TSLTБНК14

<400> 84

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatc 57

<210> 85

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL015, TSHTБНК13

<400> 85

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60

c 61

<210> 86

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL016, TSHTБНК14

<400> 86

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatc 57

<210> 87

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL017, TSHTБНК15

<400> 87

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60

c 61

<210> 88

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL018, TSHTБНК16

<400> 88

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatc 57

<210> 89

<211> 68

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX001, Nextera Блокатор 1_2X

<400> 89

aatgataggc gaccaccgag atctacactt tttttttcgt cggcagcgtc agatgtgtat 60

aagagaag 68

<210> 90

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX002, Nextera Блокатор 1_3X

<400> 90

aatgataggc gaccaccgag attacacttt ttttttcgtc ggcagcgtca gatgtgtata 60

agagaag 67

<210> 91

<211> 68

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX003, Nextera Блокатор 1_2Xalt

<400> 91

aatgatacgg cgaccaccga gattacactt tttttttcgt cggcagcgtc agatgtgtat 60

aagagaag 68

<210> 92

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX004, Nextera Блокатор 1_3Xalt

<400> 92

aatgatacgg cgaccaccga gattacactt tttttttgtc ggcagcgtca gatgtgtata 60

agagaag 67

<210> 93

<211> 64

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX005, Nextera Блокатор 2_2X

<400> 93

caagagaaga cggcatacga gatttttttt tgtctcgtgg gctcggagat gtgtataaga 60

gaag 64

<210> 94

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX006, Nextera Блокатор 2_3X

<400> 94

caagagaaga cggcatagag attttttttt gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag 60

aag 63

<210> 95

<211> 64

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX007, Nextera Блокатор 2_2Xalt

<400> 95

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgttcgtgg gctcggagat gtgtataaga 60

gaag 64

<210> 96

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX008, Nextera Блокатор 2_3Xalt

<400> 96

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgttcgtgg gctggagatg tgtataagag 60

aag 63

<210> 97

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX009, Nextera Блокатор 1_5X4Y

<400> 97

aatgataggc gacaccgaga ttacactttt tttttcgtcg gagcgtcaga ggaaagagaa 60

g 61

<210> 98

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX010, Nextera Блокатор 2_5X4Y

<400> 98

caagagaaga ggcatagaga tttttttttg tctcgtgggt cggagaggaa agagaag 57

<210> 99

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX011, Nextera Блокатор 1_5X4Y-внешний

<400> 99

aatgataggc gacaccgaga ttacac 26

<210> 100

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX012, Nextera Блокатор 1_5X4Y-внутренний

<400> 100

tcgtcggagc gtcagaggaa agagaag 27

<210> 101

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX013, Nextera Блокатор 2_5X4Y-внешний

<400> 101

caagagaaga ggcatagaga t 21

<210> 102

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BX014, Nextera Блокатор 2_5X4Y-внутренний

<400> 102

gtctcgtggg tcggagagga aagagaag 28

<210> 103

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: Основания тимина в индексном положении в олигонуклеотидах

<400> 103

tttttttt 8

<210> 104

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: Nextera Блокатор 1 (15016424) i5, Illumina Nextera Блокатор i5

<400> 104

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 105

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: Nextera Блокатор 2 (15016425) i7, Illumina Nextera Блокатор i7

<400> 105

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 106

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiБНК1, Nextera Блокатор 1_3XCG

<400> 106

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 107

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiБНК2, Nextera Блокатор 2_3XCG

<400> 107

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 108

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiБНК3, Nextera Блокатор 1_6XCG

<400> 108

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 109

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiБНК4, Nextera Блокатор 2_6XCG

<400> 109

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 110

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiБНК5, Nextera Блокатор 1_10XCG

<400> 110

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ttttttttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 111

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiБНК6, Nextera Блокатор 2_10XCG

<400> 111

caagcagaag acggcatacg agattttttt ttgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 112

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiS517, С-специфический блокатор 517

<400> 112

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cgtaagatcg tcggcagcgt cagatgtgta 60

taagagacag 70

<210> 113

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: TiS701, С-специфический блокатор 701

<400> 113

caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60

agacag 66

<210> 114

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL007, TSHTЗНК15G

<400> 114

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg acactctttc cctacacgac gctcttccga 60

tc 62

<210> 115

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL008, TSHTЗНК16G

<400> 115

caagcagaag acggcatacg agatggtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatc 58

<210> 116

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL009, TSHTЗНК15N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (30)..(30)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 116

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn acactctttc cctacacgac gctcttccga 60

tc 62

<210> 117

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BL010, TSHTЗНК16N

<220>

<221> неопределенный признак

<222> (25)..(25)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 117

caagcagaag acggcatacg agatngtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatc 58

<210> 118

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN023, P5ЗНК

<400> 118

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 119

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN024, P7ЗНК

<400> 119

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 120

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN025, TiЗНКS1

<400> 120

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 121

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN026, TiЗНКS2

<400> 121

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 122

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN027, TiЗНК17

<400> 122

ggcgaccacc gagatctaca ctcgtcggca gcgtcagatg tg 42

<210> 123

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: BN028, TiЗНК18

<400> 123

ggcatacgag atgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag ag 42

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен буфер для гибридизации, включающий декстрансульфат, ДНК Cot-1 человека, формамид, KH₂PO₄ - K₂HPO₄, NaCl, TWEEN 20, и усовершенствованные блокаторы адаптеров. Также изобретение относится к способу и набору для получения обогащенной библиотеки, содержащей коллекцию членов нуклеиновых кислот. Изобретение обеспечивает улучшенную эффективность отбора нуклеиновой кислоты перед секвенированием. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 31 ил., 11 табл., 9 пр.

1. Буфер для гибридизации, содержащий:

1,5% (масс./об.) декстрансульфат,

0,2 мг/мл ДНК Cot-1 человека,

10% (об./об.) формамид,

66,6 мМ KH₂PO₄ - K₂HPO₄,

0,8 M NaCl,

0,04% (об./об.) TWEEN 20, и

усовершенствованные блокаторы адаптеров.

2. Способ получения обогащенной библиотеки, содержащей коллекцию членов нуклеиновых кислот, включающий получение смеси для гибридизации, содержащей члены библиотеки, буфер для гибридизации по п. 1 и зонд, для получения смеси для гибридизации, в условиях, подходящих для гибридизации зонда с представляющей интерес областью в члене библиотеки, где зонд содержит лиганд.

3. Способ по п. 2, включающий:

связывание зонда после его гибридизации с использованием средства для связывания, и

элюцию связанных членов библиотеки со средств для связывания в элюант, содержащий обогащенные члены библиотеки, где концентрация ДНК в элюанте лежит в диапазоне 1,3-250 пМ.

4. Способ по п. 2 или 3, где смесь для гибридизации содержит образцы по меньшей мере из двух препаратов библиотек, где объединяют по меньшей мере 10 нг, по меньшей мере 25 нг, по меньшей мере 50 нг, по меньшей мере 100 нг, по меньшей мере 200 нг или по меньшей мере 500 нг ДНК из каждого препарата библиотеки.

5. Способ по любому из пп. 2-4, где концентрация ДНК в смеси для гибридизации находится в диапазоне 0,1-120 нг/мкл.

6. Способ по любому из пп. 2-5, включающий секвенирование обогащенных членов библиотеки, и причем способ не включает амплификацию членов библиотеки перед связыванием членов библиотеки.

7. Способ по п. 6, где секвенирование проводят в проточной ячейке, и способ включает внесение обогащенных членов библиотеки в проточную ячейку в концентрации по меньшей мере 1,1 пМ, по меньшей мере 1,2 пМ, по меньшей мере 1,3 пМ, по меньшей мере 10 пМ или по меньшей мере 100 пМ, и в концентрации самое большее 100 пМ, самое большее 200 пМ, самое большее 250 пМ или самое большее 300 пМ.

8. Способ по п. 7, включающий внесение обогащенных членов библиотеки в проточную ячейку с использованием устройства для прямой загрузки проточной ячейки.

9. Набор для получения обогащенной библиотеки, содержащей коллекцию членов нуклеиновых кислот, который содержит буфер для гибридизации по п. 1 и инструкции по применению.