КОМПОЗИЦИИ, НАБОРЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/70 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] В настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущество предварительной заявки на патент США №63/199,570, поданной 8 января 2021 г. и озаглавленной «COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №63/199,076, поданной 4 декабря 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №63/198,421, поданной 16 октября 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №63/198,134, поданной 30 сентября 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №62/706,081, поданной 30 июля 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №63/052,385, поданной 15 июля 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №63/044,160, поданной 25 июня 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; предварительной заявки на патент США №62/981,938, поданной 26 февраля 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES»; и предварительной заявки на патент США №62/978,274, поданной 18 февраля 2020 г. и озаглавленной COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRAL SEQUENCES». Каждая из предшествующих заявок полностью включена в настоящий документ посредством данной ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 15 января 2021 г., называется LT01529PCT_SL.txt и имеет размер 665718 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[3] Настоящие идеи относятся к композициям, способам, системам и наборам для специфического обнаружения, диагностики и дифференциации вирусов, вызывающих инфекционные заболевания. Дифференциальное обнаружение специфических вирусных агентов позволяет поставить точный диагноз, чтобы можно было своевременно принять соответствующие меры по лечению и инфекционному контролю.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[4] Инфекционные заболевания вызываются патогенными микробами или инфекционными агентами (например, вирусами). Ранняя и точная диагностика инфекционного заболевания важна по нескольким причинам. Например, правильная диагностика может привести к более раннему и более эффективному лечению, которое улучшит результаты для инфицированного индивидуума. С другой стороны, индивидуумы, которым не поставлен диагноз или поставлен неправильный диагноз, могут неосознанно передавать заболевания другим лицам. Точная диагностика также помогает обеспечить применение надлежащего лечения, особенно в отношении определенных категорий заболеваний с множественными патогенными причинами и аналогичными профилями симптомов, таких как респираторные заболевания.

[5] Одним из примеров проблемного вируса, связанного с инфекционными заболеваниями, являются коронавирусы. Коронавирусы представляют собой семейство вирусов, имеющих положительно-полярный одноцепочечный геном РНК длиной около 30 тысяч оснований. Коронавирусы человека были впервые идентифицированы в середине 1960-х годов как один из многих этиологических агентов простуды. Люди во всем мире обычно заражаются штаммами коронавируса человека 229Е (альфа-коронавирус), NL63 (альфа-коронавирус), ОС43 (бета-коронавирус) и HKU1 (бета-коронавирус). Эти инфекции проявляются слабо выраженными клиническими симптомами и связаны с чрезвычайно низким уровнем смертности.

[6] Некоторые коронавирусы заражают не являющихся человеком животных, причем они могут развиваться и подвергаться зоонозу, распространяя свой тропизм на людей. Такие события кроссовера имели губительные последствия в прошлые годы. Например, ближневосточный респираторный синдром (MERS) был вызван MERS-CoV, бета-коронавирусом, который передался от одногорбых верблюдов людям. MERS-CoV был связан с высоким уровнем смертности приблизительно в 35%, но его низкая скорость передачи помогла ограничить его распространение и потенциал губительного воздействия. В качестве другого примера, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), который был вызван SARS-CoV, другим бета-коронавирусом, как полагают, был передан от летучих мышей циветтам, которые затем передали вирус людям. Хотя SARS-CoV не так смертоносен, как MERS-CoV, он, тем по меньшей мере, был связан с умеренно высоким уровнем смертности, составляющим приблизительно 9,6%. Вероятно, по меньшей мере частично из-за жизненного цикла SARS-CoV внутри организма человека распространение этого вируса было ограничено в основном странами Юго-Восточной Азии. У людей, инфицированных SARS-CoV, симптомы часто проявляются до выделения инфекционных вирионов, что делает карантин особенно полезным инструментом для ограничения воздействия и распространения инфекции.

[7] Совсем недавно появился новый вариант бета-коронавируса, SARS-CoV-2 (также известный как 2019-nCoV), возможно, в результате события кроссовера между панголинами (ящерами) и людьми в Ухане, Китай. Хотя эпидемиологические данные являются неполными, отчеты на данный момент показывают, что более 85 миллионов человек во всем мире, как полагают, уже инфицированы SARS-CoV-2. Однако, в отличие от MERS-CoV и SARS-CoV до него, SARS-CoV-2, по-видимому, в среднем значительно менее смертоносен, имея уровень смертности около 2,3%. Из-за его повышенной передаваемости кажущийся небольшим процентный показатель смертности, связанной с SARS-CoV-2, противоречит его глобальному влиянию, которое на момент подачи данной заявки привело к примерно 1,9 миллионам смертей в рамках всемирной пандемии и в настоящее время продолжает расти. Общее количество людей, пораженных SARS-CoV-2, превосходит общее количество смертей, вызванных MERS-CoV и SARS-CoV, вместе взятых, - по сообщениям, около 1600 человек.

[8] Учитывая настоящее и продолжающееся появление новых штаммов коронавируса, существует настоятельная необходимость в разработке способов быстрого обнаружения и определения характеристик существующих и новых штаммов коронавируса, чтобы можно было своевременно принимать надлежащие меры по лечению и инфекционному контролю. Проблема заключается в том, что многие тесты для обнаружения SARS-CoV-2 неспецифичны в отношении обнаружения и дифференциации SARS-CoV-2 от других респираторных патогенов, в частности других коронавирусов, что привело к отсутствию уверенности пациентов в диагностическом потенциале текущих тестов для обнаружения SARS-CoV-2. Кроме того, поскольку индивидуумы, инфицированные SARS-CoV-2, часто испытывают симптомы, аналогичные симптомам, характерным для лиц, инфицированных гриппом типа А или В (грипп А или В) и/или респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), существует дополнительная необходимость в возможности одновременного выполнения тестов на каждый из этих респираторных вирусов для постановки точного диагноза перед поиском/предоставлением лечения и/или помещением индивидуума в карантинную зону из-за потенциально ошибочного предположения, что он инфицирован SARS-CoV-2. Каждый неправильно идентифицированный или неправильно диагностированный случай инфекции SARS-CoV-2 еще больше искажает эпидемиологические данные и препятствует принятию соответствующих обоснованных решений.

[9] Соответственно, существует ряд недостатков современных способов, систем, композиций и наборов для обнаружения существующих и новых штаммов коронавируса среди других распространенных вирусных патогенов дыхательных путей, которые можно устранить, и способов, систем, композиций и наборов по настоящему изобретению и преодоления по меньшей мере некоторые из вышеупомянутых проблем в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[10] Чтобы описать способ, которым могут быть получены приведенные выше и другие преимущества и признаки настоящего изобретения, более подробное описание изобретения, кратко изложенное выше, будет представлено со ссылкой на его конкретные варианты осуществления, которые проиллюстрированы в прилагаемых графических материалах. Следует понимать, что данные графические материалы изображают только типичные варианты осуществления настоящего изобретения и поэтому не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

[11] Настоящее изобретение будет описано и объяснено с дополнительной конкретизацией и детализацией посредством использования прилагаемых графических материалах, в которых:

[12] На Фиг. 1А проиллюстрирована идентичность последовательностей консенсусной последовательности SARS-CoV-2 и трех близкородственных коронавирусов, а именно Bat-SL-CoVZC45, Bat-SL-CoVZXC21 и SARS-CoVGZ02, по всему геному и по конкретным участкам генов в пределах генома коронавируса.

[13] На Фиг. 1В проиллюстрирована содержащаяся в таблицах информация, показанная на Фиг. 1А, в графической форме, причем ось х представляет собой положение пары оснований в вирусном геноме, а ось у представляет собой процентное сходство каждого родственного вируса с соответствующей консенсусной последовательностью SARS-CoV-2.

[14] На Фиг. 2А проиллюстрирован график амплификации одноплексного теста кПЦР ORF1ab, проведенного на типовом образце, содержащем нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2, причем реагенты для теста кПЦР являются частью набора для обнаружения SARS-CoV-2, описанного в настоящем документе.

[15] На Фиг. 2В проиллюстрирована стандартная кривая для одноплексного теста кПЦР, показанного на Фиг. 2А.

[16] На Фиг. 2С проиллюстрирован график амплификации одноплексного теста кПЦР с белком N, проведенного на типовом образце, содержащем нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2, причем реагенты для теста кПЦР являются частью набора для обнаружения SARS-CoV-2, описанного в настоящем документе.

[17] На Фиг. 2D проиллюстрирована стандартная кривая для одноплексного теста кПЦР, показанного на Фиг. 2С.

[18] На Фиг. 2Е проиллюстрирован график амплификации одноплексного теста кПЦР с белком S, проведенного на типовом образце, содержащем нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2, причем реагенты для теста кПЦР являются частью набора для обнаружения SARS-CoV-2, описанного в настоящем документе.

[19] На Фиг. 2F проиллюстрирована стандартная кривая для одноплексного теста кПЦР, показанного на Фиг. 2Е.

[20] На Фиг. 3А-3С проиллюстрированы сравнительные графики амплификации тестов кПЦР ORF1ab (Фиг. 3А), белка N (Фиг. 3В) и белка S (Фиг. 3С), проводимых на приборе 7500 Fast Dx (Thermo Fisher Scientific), использующем стандартный протокол 7500 или протокол 7500 Fast.

[21] На Фиг. 4А-4С проиллюстрированы сравнительные графики амплификации тестов кПЦР ORF1ab (Фиг. 4А), белка N (Фиг. 4В) и белка S (Фиг. 4С), получаемых при выполнении идентичных стандартных протоколов на приборе 7500 Fast Dx (Thermo Fisher Scientific) или системе ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific).

[22] На Фиг. 5А-5С проиллюстрированы сравнительные графики амплификации тестов кПЦР ORF1ab (Фиг. 5А), белка N (Фиг. 5В) и белка S (Фиг. 5С) с использованием 1-стадийного мастер-микса ОТ-кПЦР TaqPath (Thermo Fisher Scientific) или 1-стадийного мастер-микса TaqMan Fast Virus (Thermo Fisher Scientific) в системе ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[23] Прежде чем подробно описать варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что данное изобретение не ограничено параметрами конкретных примерных систем, способов, аппарата, продуктов, процессов и/или наборов, которые, конечно, могут меняться. Таким образом, хотя определенные варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны со ссылкой на конкретные конфигурации, параметры, компоненты, элементы и т.д., описания носят иллюстративный характер и не должны рассматриваться как ограничивающие объем заявленного изобретения. Кроме того, используемая в настоящем документе терминология предназначена для описания вариантов осуществления и не обязательно предназначена для ограничения объема заявленного изобретения.

[24] Кроме того, понятно, что для любого данного компонента или варианта осуществления, описанного в настоящем документе, любой из возможных кандидатов или альтернатив, перечисленных для этого компонента, обычно можно использовать по отдельности или в комбинации друг с другом, если неявно или явно не подразумевается или не указано иное. Кроме того, следует понимать, что любой перечень таких кандидатов или альтернатив является всего лишь иллюстративным, а не ограничивающим, если неявно или явно не подразумевается или не указано иное.

[25] Кроме того, если не указано иное, числа, выражающие количества, составляющие, расстояния или другие измерения, используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как видоизмененные термином «около», как этот термин определен в настоящем документе. Соответственно, если не указано противоположное, числовые параметры, изложенные в описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными и могут варьироваться в зависимости от требуемых свойств, которые должны быть достигнуты по объекту изобретения, представленному в настоящем документе. По меньшей мере и не в качестве попытки ограничить данную заявку доктрины эквивалентов объемом формулы изобретения, каждый числовой параметр должен по меньшей мере рассматриваться, исходя из количества приведенных значащих цифр с применением обычных методов округления. Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, определяющие широкий объем объекта изобретения, представленного в настоящем документе, являются приблизительными, числовые значения, указанные в конкретных примерах, представлены максимально точно. Однако любые числовые значения по своей природе содержат определенные ошибки, обязательно возникающие из-за среднеквадратичного отклонения, обнаруженного в соответствующих измерениях при испытаниях.

[26] Все публикации и патентные заявки, приводимые в настоящем документе, а также приложения, прилагаемые к настоящему документу, полностью включены посредством ссылки для всех целей в той же степени, в которой каждая из них была бы конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки. Хотя настоящее изобретение было описано довольно подробно посредством иллюстрации и примера в целях ясности и понимания, будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены на практике в пределах объема сущности и смысла настоящего описания и прилагаемой формулы изобретения.

[27] Любые заголовки и подзаголовки, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей и не предназначены для ограничения объема описания или формулы изобретения.

Обзор композиций, систем и наборов для обнаружения целевых последовательностей

[28] Как обсуждалось выше, новый вариант бета-коронавируса, SARS-CoV-2 (также известный как 2019-nCoV), недавно стал новейшим пандемическим вирусом. Текущие эпидемиологические данные потенциально неблагоприятны ввиду существующих неспецифических методов обнаружения, используемых для идентификации инфекций SARS-CoV-2. Отсутствие надежного теста для точной и специфической идентификации SARS-CoV-2 из образца (например, клинического образца, полученного из носоглоточного мазка, носоглоточного аспирата, бронхоальвеолярного лаважа, буккального мазка, слюны или мочи) и/или дифференциации этого вируса от других распространенных респираторных патогенов может препятствовать медицинским работникам предоставлять надлежащее лечение и консультирование пациентам. Кроме того, из-за невозможности точно и быстро идентифицировать индивидуумов, инфицированных SARS-CoV-2, может быть довольно сложно организовать кампанию по систематическому лечению или реализовать успешные профилактические меры.

[29] Учитывая настоящее и продолжающееся появление новых штаммов коронавируса, существует настоятельная необходимость в разработке способов быстрого обнаружения и определения характеристик существующих и новых штаммов коронавируса, чтобы можно было своевременно принимать надлежащие меры по лечению и инфекционному контролю. Проблема заключается в том, что многие из доступных тестов для обнаружения SARS-CoV-2 неспецифичны в отношении обнаружения и дифференциации SARS-CoV-2 от других респираторных патогенов, в частности других коронавирусов, что может привести к отсутствию уверенности пациентов в диагностическом потенциале текущих тестов для обнаружения SARS-CoV-2. Кроме того, поскольку индивидуумы, инфицированные SARS-CoV-2, часто испытывают симптомы, аналогичные тем, которые наблюдаются у лиц, инфицированных гриппом типа А или В и/или респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), и/или другими респираторными микробами, существует дополнительная необходимость в возможности одновременного выполнения тестов на каждый из этих респираторных инфекционных агентов для постановки точного диагноза перед поиском/предоставлением лечения и/или помещением индивидуума в карантинную зону из-за потенциально ошибочного предположения, что он инфицирован SARS-CoV-2. Каждый неправильно идентифицированный или неправильно диагностированный случай инфекции SARS-CoV-2 может еще больше исказить эпидемиологические данные и препятствовать принятию соответствующих обоснованных решений, которые могут помочь справиться с пандемией.

[30] Доступен ряд тестов для предположительного обнаружения наличия SARS-CoV-2, например тесты, предоставленные Центрами по контролю и профилактике заболеваний в США (US-CDC), которые содержат зонды, нацеленные на белок N, тест, разработанный китайскими CDC и нацеленный на кодирующие области белка N и белка ORF1ab, и набор ВОЗ, нацеленный на кодирующие области белка N, белка E и близкородственного коронавируса RdRp SARS/Ухань. Несмотря на то, что каждый из вышеперечисленных тестов имеет 100%-й охват всех опубликованных на сегодняшний день геномов SARS-CoV-2 - это означает, что каждый из этих тестов теоретически способен идентифицировать наличие SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты - дизайн этих тестов таков, что обнаружение является неспецифическим, что может закрепить проблемы, описанные выше, вместо того, чтобы уменьшить их.

[31] Например, зонды, используемые в наборе ВОЗ для белков E и N, идеально сопоставляются с сотнями штаммов коронавируса, отличного от SARS-CoV-2. Кроме того, подтверждающий зонд, идентифицирующий RdRp-SARS/Ухань, был разработан для обнаружения как SARS, так и SARS-CoV-2, что делает его неспецифическим по своему дизайну. В этих тестах также отсутствует эндогенный контроль. В целом данный тест неспецифичен для SARS-CoV-2 и может давать ложноположительные результаты. Аналогично, набор US-CDC для обнаружения SARS-CoV-2 также продемонстрировал некоторую неспецифичность. Он основан на трех отдельных зондах для кодирующей области белка N, и два из этих зондов могут генерировать ложноположительный сигнал при наличии коронавирусов, отличных от SARS-CoV-2, таких как многие штаммы SARS и даже штаммы SARS-CoV летучих мышей, в частности, когда они присутствуют в более высоких концентрациях. Соответственно, даже этот набор не может обеспечить тест, обладающий требуемой специфичностью в отношении SARS-CoV-2, и на рынке остается неудовлетворенная потребность в тесте для обнаружения SARS-CoV-2, который является точным и специфичным и который, предпочтительно, можно проводить быстро с коротким временем обработки между забором образца и получением результатов.

[32] В настоящем документе описаны композиции, наборы и способы специфичного обнаружения вирусных последовательностей, в частности SARS-CoV-2. Описаны дополнительные композиции, наборы и способы, которые позволяют обнаруживать и дифференцировать SARS-CoV-2 от других родственных коронавирусов, от микробиоты дыхательных путей и от распространенных респираторных патогенов, вызывающих аналогичные симптоматические инфекции у людей, включая грипп типа А (грипп А), грипп типа В (грипп В) и респираторно-синцитиальный вирус (например, RSV А и RSV В). Как показано в настоящем описании, многие зонды, описанные в настоящем документе, включают в себя участки, связывающие нуклеиновые кислоты, которые демонстрируют 100%-ю идентичность (т.е. отсутствие несоответствий) со всеми 52 геномными последовательностями SARS-CoV-2, описанными в литературе. Кроме того, наборы и способы, обеспеченные в настоящем документе, специфично нацелены на все 71 полный геном, доступные в настоящее время в GISAID, и не нацелены ни на один из 2116 полных геномов других коронавирусов, доступных в настоящее время в NCBI, что подчеркивает полезную специфичность описанных способов и наборов для обнаружения SARS-CoV-2. Действительно, описанные варианты осуществления удовлетворяют по меньшей мере некоторые из неудовлетворенных потребностей в области идентификации вирусов и обеспечивают значительные улучшения по сравнению с предшествующими композициями, наборами и способами обнаружения вирусов.

[33] В некоторых вариантах осуществления охват штаммов для композиций, наборов и способов, описанных в настоящем документе для обнаружения SARS-CoV-2, в том числе с использованием праймеров и зондов, выбранных из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533, составляет 99,9% на основе теста in silico 35 833 полных последовательностей высокого качества, доступных в GISAID по состоянию на 6 июля 2020 г. Кроме того, описанные в настоящем документе композиции, наборы и способы для обнаружения вирусных последовательностей, в частности мультиплексные тесты для идентификации специфического наличия SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В, RSV А и/или RSV В с использованием праймеров и зондов, выбранных из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533, сохраняют 99,9%-ю специфичность и точность для идентификации штаммов SARS-CoV-2, а охват штаммов составляет 98,2% (6730/6854) для гриппа А и 99,3% (3105/3127) для гриппа В на основе данных, доступных в NCBI по состоянию на 13 апреля 2020 г.

[34] SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 257 включают в себя перечень последовательностей, которые можно использовать в качестве прямых праймеров, нацеленных на кодирующие области ORF1ab, белка S или белка N генома SARS-CoV-2, области вирусного генома человеческого гриппа типа А или типа В, области вирусного генома респираторно-синцитиального вируса (RSV) типа А или типа В или контрольные последовательности, такие как фаг MS2 и РНКаза Р.

[35] SEQ ID NO: 267 - SEQ ID NO: 510 включают в себя перечень последовательностей, которые можно использовать в качестве обратных праймеров, нацеленных на кодирующие области ORF1ab, белка S или белка N генома SARS-CoV-2, области вирусного генома человеческого гриппа типа А или типа В, области вирусного генома респираторно-синцитиального вируса (RSV) типа А или типа В или контрольные последовательности, такие как фаг MS2 и РНКаза Р.

[36] SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO:2533 включают в себя перечень последовательностей, которые представляют собой части нуклеиновых кислот зондов, нацеленных на кодирующие области ORF1ab, белка S или белка N генома SARS-CoV-2, области вирусного генома человеческого гриппа типа А или типа В, области вирусного генома респираторно-синцитиального вируса (RSV) типа А или типа В или контрольные последовательности, такие как фаг MS2 и РНКаза Р.

[37] Кроме того, поскольку SARS-CoV-2 представляет собой РНК-вирус, он может мутировать с относительно высокой частотой, что затрудняет его постоянное обнаружение с течением времени. Специфическое обнаружение может быть обеспечено даже в случае будущих вариантов путем использования нескольких тестов, нацеленных на разные области одних и тех же целевых генов, для обеспечения избыточности и специфичности. В отличие от других опубликованных дизайнов тестов, которые требуют нескольких дизайнов тестов и отдельных реакций для каждого локуса для повышения специфичности, описанные праймеры и зонды могут дифференцировать штаммы SARS-CoV-2 с использованием одного и специфического теста, проводимого в одном, или самое большее двух, реакционных объемах.

[38] Варианты осуществления настоящего изобретения выгодно обеспечивают улучшенные композиции, наборы и способы обнаружения и дифференциации вирусных патогенов дыхательных путей, которые имеют схожие симптоматические выражения у людей. Таким образом, эти описанные варианты осуществления преимущественно улучшают эффективность и точность оценки образцов из дыхательных путей (например, в лабораторных условиях, в пункте продажи и/или в пункте оказания медицинской помощи) на наличие вирусных последовательностей и могут улучшить диагностику и лечение пострадавших индивидуумов.

[39] Описанные композиции, наборы и способы обнаружения вирусных последовательностей также могут повысить точность эпидемиологических исследований, связанных с инфекциями SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и/или RSV. Дополнительные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, включают в себя аналитические панели (например, в формате карты матрицы) для определения наличия последовательностей нуклеиновых кислот вирусов, бактерий и грибов, которые могут, помимо прочего, улучшить синдромные оценки и эпидемиологические исследования, будучи способными обнаруживать и дифференцировать SARS-CoV-2 от родственных коронавирусов, вирусов гриппа, риновирусов, аденовирусов и других вирусных, бактериальных и грибковых микробов.

Забор образцов

[40] Описанные композиции, наборы и способы выполнены с возможностью обнаружения нуклеиновой кислоты вируса в образце, предпочтительно специфического и дифференциального обнаружения SARS-CoV-2 в образце. Образец может представлять собой ветеринарный образец (например, от животных, не являющихся человеком, таких как норки), клинический образец (например, от человека с симптомами или без симптомов), образец пищи, образец для судебной экспертизы, образец из окружающей среды (например, почва, грязь, мусор, сточные воды, воздух или вода), включая поверхности для обработки и производства пищевых продуктов или любой другой биологический образец. В большинстве случаев SARS-CoV-2 или другие коронавирусы и патогены из дыхательных путей обнаруживают путем теста мазков или жидкости, полученной из мазков, таких как мазки из зева, мазки из носа, мазки из носоглотки, мазки из носа и средней носовой раковины, мазки из ротоглотки, щечные мазки, мазки слюны или другие мазки, хотя следует понимать, что SARS-CoV-2 или другие коронавирусы и/или патогены дыхательных путей также могут быть обнаружены путем анализа образцов мочи, образцов слюны или других клинических образцов.

[41] Образец может быть взят медицинским работником в медицинском учреждении, но в некоторых случаях образец также может быть взят самим испытуемым или индивидуумом, помогающим испытуемому в самостоятельном заборе образца. Например, мазок из носоглотки до сих пор служил золотым стандартом для получения образца для использования в клинической диагностике или скрининге. Такие мазки часто используются медицинским работником в медицинских учреждениях. Другие образцы, такие как образец слюны, можно аналогичным образом получить в медицинском учреждении с помощью или под контролем медицинского работника. Однако в некоторых случаях самостоятельный забор образца может быть более эффективным и может осуществляться вне медицинского учреждения.

[42] В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой необработанный образец слюны, отобранный - путем самостоятельного забора или забора с помощью / под контролем - в стерильную пробирку или специально разработанное устройство для забора слюны. Пробирка/устройство для забора слюны может быть компонентом набора для самостоятельного забора, для которого предусмотрены инструкции по применению, такие как инструкции по забору образцов, инструкции по подготовке или хранению образцов и/или инструкции по транспортировке. В некоторых вариантах осуществления необработанный образец слюны может быть отобран непосредственно в герметичный контейнер без какого-либо консервирующего раствора или другой жидкости или вещества в контейнере до размещения образца слюны внутри контейнера или в результате закрытия/герметизации контейнера. В некоторых других вариантах осуществления необработанный образец слюны отбирают в контейнер, который уже содержит некоторое количество консервирующего или лечебного раствора или другой жидкости или вещества.

[43] Традиционно фракцию нуклеиновой кислоты образца экстрагируют или очищают из образца, полученного с помощью мазка, необработанной слюны или другой биологической жидкости, до любого обнаружения в нем вирусных нуклеиновых кислот. Неожиданно, описанные варианты осуществления для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в образце могут быть адаптированы для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты непосредственно в необработанном образце слюны без специфической стадии очистки и/или экстрагирования нуклеиновой кислоты перед ее использованием в последующих тестах для обнаружения (например, ОТ-кПЦР). В некоторых вариантах осуществления образец слюны предварительно обрабатывают перед использованием (см., например, пример 8 в настоящем документе). Это может включать в себя, например, нагревание образца слюны, например, путем помещения необработанного образца слюны на нагревательный блок/водяную баню при температуре 95°С на 30 минут с последующим объединением термически обработанной слюны с буфером или раствором для лизиса. Буфер или раствор для лизиса может включать в себя, например, любой буфер, пригодный для нуклеиновых кислот, такой как ТВЕ, и может дополнительно включать в себя детергент и/или эмульгатор, такой как Triton-X-100, NP-40, или неионогенное поверхностно-активное вещество полисорбатного типа, Tween-20.

[44] Следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления описанные композиции могут включать в себя образец, смешанный с буфером и детергентом/эмульгатором. Образец можно добавить в смесь буфера/детенгента или наоборот. В качестве неограничивающего примера, набор образцов испытуемого может быть получен в виде композиций для последующего анализа и обнаружения вирусной последовательности путем добавления объема термически обработанного образца для каждого испытуемого в одну лунку (или совокупность лунок) в многолуночном планшете. Затем в каждую лунку, содержащую образец испытуемого, можно добавить объем смеси буфера/детергента (например, ТВЕ + Tween-20). Альтернативно, многолуночный планшет может быть загружен объемом смеси буфера/детергента, в которую добавлен объем термически обработанной слюны. После объединения этот испытательный матричный раствор можно использовать немедленно или сохранить для последующего анализа. Такие испытательные типовые растворы можно также объединять с реагентами для ПЦР (например, буферами, dNTP, мастер-миксами и т.д.) до или после хранения.

Композиции, наборы и способы обнаружения вирусных последовательностей SARS-CoV-2

[45] Праймеры и зонды, описанные в настоящем документе, применимы для обнаружения SARS-CoV-2 в образце, таком как биологический образец, полученный от человека или испытуемого, не являющегося человеком (например, норки). Такие праймеры и/или зонды можно использовать в наборе для проведения теста на основе нуклеиновых кислот для обнаружения и идентификации одной или более целевых нуклеиновых кислот в образце, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными любого размера. Например, праймеры и зонды, обеспеченные в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533, можно использовать для амплификации и/или анализа одной или более конкретных целевых последовательностей, присутствующих в вирусном геноме SARS-CoV-2 или в пределах одного или более из гриппа А, гриппа В, RSV A, RSV В, других целевых респираторных микробов и/или контролей (см., например, таблицы 3А и 3В), как описано в настоящем документе. Амплифицированные продукты («ампликоны») могут быть обнаружены и/или проанализированы с использованием любого подходящего способа и любой подходящей платформы.

[46] Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и родственные способы представляют

собой распространенные способы амплификации нуклеиновых кислот. ПЦР является одним, но не единственным, примером способа полимеразной реакции нуклеиновой кислоты для амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты, включающего в себя использование известной нуклеиновой кислоты в качестве праймера и полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации или получения специфичной целевой нуклеиновой кислоты. Как правило, в ПЦР используют пару праймеров, состоящую из прямого праймера и обратного праймера, выполненных с возможностью амплификации целевого сегмента матрицы нуклеиновой кислоты. Как правило, но не всегда, прямой праймер гибридизируется с 5'-концом целевой последовательности, а обратный праймер будет идентичен последовательности, присутствующей на 3'-конце целевой последовательности. Обратный праймер, как правило, гибридизируется с комплиментом целевой последовательности, например продуктом удлинения прямого праймера и/или наоборот. Способы ПЦР, как правило, выполняют при нескольких различных температурах, что вызывает повторяющиеся изменения температуры во время реакции ПЦР («термоциклирование»). Другие способы амплификации, такие как, например, петлевая изотермическая амплификация («LAMP») и другие изотермические способы, такие как перечисленные в таблице 1, могут требовать менее или менее интенсивного термоциклирования, чем ПЦР, или не требуют термоциклирования. Такие способы изотермической амплификации также предполагаются для использования с композициями для теста, реакционными смесями, наборами, описанными в настоящем документе.

[47] Способы проведения ПЦР, в том числе приведенные в таблице 1, хорошо известны в данной области; тем по меньшей мере, дальнейшее рассмотрение ПЦР и других способов можно найти, например, в публикации Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th Edition 2012, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[48] SARS-CoV-2 имеет одноцепочечный положительно-полярный геном РНК. Другие вирусы, такие как грипп А, грипп В, RSV А и RSV В, также имеют геномы на основе РНК. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления реакция амплификации (например, LAMP или ПЦР) может быть объединена с реакцией обратной транскрипции (ОТ), такой как ОТ-LAMP или ОТ-ПЦР, для преобразования генома РНК в матрицу кДНК. Затем матрицу кДНК используют для создания ампликонов целевых последовательностей в последующих реакциях амплификации.

[49] В некоторых вариантах осуществления стадия амплификации может включать в себя проведение кПЦР, как этот термин определен в настоящем документе. кПЦР представляет собой чувствительный и специфический способ обнаружения и, необязательно, количественного определения количеств исходной матрицы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты коронавируса) в образце. Способы кПЦР хорошо известны в данной области; один из ведущих способов включает в себя использование специфического гидролизного зонда в сочетании с парой праймеров. Зонд гидролиза может включать в себя обнаруживаемую метку (например, флуорофор) на одном конце и гаситель, который гасит обнаруживаемую метку на другом конце. В некоторых вариантах осуществления метка находится на 5'-конце зонда, и расщепление 5'-метки происходит посредством 5'-гидролиза зонда полимеразой нуклеиновой кислоты, поскольку она удлиняет прямой праймер к связывающему сайту зонда в целевой последовательности. Отделение метки зонда от гасителя зонда посредством расщепления (или развертывания) зонда приводит к увеличению сигнала, который может быть обнаружен и, необязательно, количественно определен. Обнаруживаемый сигнал можно отслеживать во времени и анализировать для определения относительного или абсолютного количества исходной матрицы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце. Подходящие метки описаны в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления используют комбинации краситель-гаситель, такие как описанные в примерах. Следует понимать, что способы кПЦР и ОТ-кПЦР известны специалистам в данной области. Тем по меньшей мере, конкретные варианты осуществления приведены в примерах и обеспечивают дополнительные подробности относительно кПЦР, а также родственных композиций и способов их использования.

[50] Реакционный сосуд или объем реакционной смеси может необязательно включать в себя трубку, канал, лунку, полость, участок или элемент на поверхности или, альтернативно, каплю (например, микрокаплю или нанокаплю), которая может быть нанесена на поверхность или в лунку на поверхности или полость, или суспендирована внутри потока (или частично ограничена потоком) жидкости. В некоторых вариантах осуществления объем реакционной смеси включает в себя одну или более капель, расположенных на поверхности или присутствующих в эмульсии. Объемы реакционной смеси необязательно могут быть образованы путем слияния множества объемов предреакционных смесей, содержащих различные компоненты реакции амплификации. Например, объемы предреакционных смесей, содержащие один или более праймеров, могут быть слиты с объемами предреакционных смесей, содержащими образцы нуклеиновых кислот человека и/или полимеразные ферменты, нуклеотиды и буфер. В некоторых вариантах осуществления, включающих проведение реакций кПЦР в формате матрицы, поверхность содержит множество канавок, каналов, лунок, полостей, участков или элементов, определяющих объем реакционной смеси, содержащий один или более реагентов для амплификации (например, праймеры, зонды, буфер, полимераза, нуклеотиды и т.п.). В некоторых одноплексных вариантах осуществления в формате матрицы объем реакционной смеси в выбранных пробирках, канавках, каналах, лунках, полостях, участках или элементах содержит только одну последовательность прямого праймера и одну последовательность обратного праймера. Необязательно, последовательность зонда также включена в одноплексный объем реакционной смеси.

[51] В некоторых мультиплексных вариантах осуществления в формате матрицы объем реакционной смеси в выбранных пробирках, канавках, каналах, лунках, полостях, участках или элементах содержит множество (например, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.) последовательностей прямых праймеров и множество последовательностей обратных праймеров. Необязательно, одна или более последовательностей зондов также включены в мультиплексный объем реакционной смеси.

[52] Например, типовые способы полимеризации и/или амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот, подходящие для использования, как описано в настоящем документе, имеются в продаже в виде тестов TaqMan (см., например, патенты США №№4,889,818; 5,079,352; 5,210,015; 5,436,134; 5,487,972; 5,658,751; 5,210,015; 5,487,972; 5,538,848; 5,618,711; 5,677,152; 5,723,591; 5,773,258; 5,789,224; 5,801,155; 5,804,375; 5,876,930; 5,994,056; 6,030,787; 6,084,102; 6,127,155; 6,171,785; 6,214,979; 6,258,569; 6,814,934; 6,821,727; 7,141,377; и/или 7,445,900, все из которых настоящим полностью включены в настоящий документ посредством ссылки). Тесты TaqMan, как правило, проводят путем осуществления амплификации нуклеиновой кислоты на целевом полинуклеотиде с использованием полимеразы нуклеиновой кислоты, обладающей 5'-3'-нуклеазной активностью, праймера, способного гибридизироваться с целевым полинуклеотидом, и олигонуклеотидного зонда, способного гибридизироваться с указанным целевым полинуклеотидом 3' относительно праймера. Олигонуклеотидный зонд, как правило, включает в себя обнаруживаемую метку (например, флуоресцентную репортерную молекулу) и молекулу-гаситель, способную гасить флуоресценцию репортерной молекулы. Как правило, обнаруживаемая метка и молекула-гаситель являются частью одного зонда. По мере амплификации полимераза расщепляет зонд, чтобы отделить обнаруживаемую метку от молекулы-гасителя. Обнаруживаемую метку отслеживают во время реакции, причем обнаружение метки соответствует возникновению амплификации нуклеиновой кислоты (например, чем выше сигнал, тем больше степень амплификации). Варианты тестов TaqMan известны в данной области и подходят для использования в способах, описанных в настоящем документе.

[53] Например, одноплексная или мультиплексная кПЦР может включать в себя один краситель TaqMan, связанный с локус-специфическим праймером, или множество красителей TaqMan, соответственно, связанных с совокупностью локусов в мультиплексном формате. В качестве неограничивающего примера, 4-плексная реакция может включать в себя красители FAM (пик эмиссии ~ 517 нм), VIC (пик эмиссии ~551 нм), ABY (пик эмиссии ~580 нм) и JUN (пик эмиссии ~617 нм), причем каждый краситель связан с другой целевой последовательностью и каждый краситель гасится с помощью QSY, и это может обеспечить амплификацию и отслеживание до 4 мишеней в режиме реального времени внутри одного реакционного сосуда. Эти вышеупомянутые репортерные красители оптимизированы для совместной работы с минимальным спектральным перекрытием для повышения эффективности. Эти красители можно дополнительно объединять с Mustang Purple (пик эмиссии ~654 нм) для отслеживания флуоресценции контроля или для использования в 5-плексном тесте без перекрытия спектра эмиссии. Кроме того, гаситель QSY полностью совместим с зондами, имеющими гасители связующего с малой канавкой.

[54] Зонды-детекторы могут быть связаны с альтернативными гасителями, включая, без ограничений, гаситель темной флуоресценции (DFQ), гасители черных дыр (BHQ), Iowa Black, гаситель QSY и сульфонатные/карбоксилатные гасители Dabsyl и Dabcel. Зонды-детекторы могут также включать в себя два зонда, причем, например, флуорофор связан с одним зондом, а гаситель связан с комплементарным зондом таким образом, что гибридизация двух зондов на мишени гасит флуоресцентный сигнал или гибридизация на мишени изменяет сигнатуру сигнала посредством изменения флуоресценции. Зонды-детекторы могут также включать в себя сульфонатные производные флуоресцеиновых красителей с SO₃ вместо карбоксилатной группы, фосфорамидитные формы флуоресцеина, фосфорамидитные формы Су5.

[55] Следует понимать, что при использовании более чем одной обнаруживаемой метки, в частности в мультиплексном формате, каждая обнаруживаемая метка должна отличаться по своим спектральным свойствам от других обнаруживаемых меток, используемых с ней, таким образом, чтобы метки можно было отличать друг от друга или чтобы совместно обнаруживаемые метки испускали сигнал, который не испускается ни одной из обнаруживаемых меток по отдельности. Типовые обнаруживаемые метки включают в себя, например, флуоресцентный краситель или флуорофор (например, химическую группу, которая может возбуждаться светом для испускания флуоресценции или фосфоресценции), «акцепторные красители», способные гасить флуоресцентный сигнал от флуоресцентного донорского красителя и т.п., как описано выше. Подходящие обнаруживаемые метки могут включать в себя, например, флуоресцеины (например, 5-карбокси-2,7-дихлорфлуоресцеин; 5-карбоксифлуоресцеин (5-FAM); 5-гидрокситриптамин (5-НАТ); 6-JOE; 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM); Mustang Purple, VIC, ABY, JUN; FITC; 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE)); 6-карбокси-1,4-дихлор-2',7'-дихлорфлуоресцеин (TET); 6-карбокси-1,4-дихлор-2',4',5',7'-тетрахлорфлуоресцеин (HEX); флуорофоры Alexa Fluor (например, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); флуорофоры BODIPY (например, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-Х, 650/665-Х, 665/676, FL, FL АТФ, FI-керамид, R6G SE, TMR, конъюгат TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), Cascade синий, Cascade желтый; красители Су™ (например, 3, 3,18, 3,5, 5, 5,18, 5,5, 7), голубой GFP, циклический флуоресцентный сенсор AMP (FiCRhR), флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок (например, GFP. EGFP), синий флуоресцентный белок (например, BFP, EBFP, EBFP2, азурит, mKalamal), голубой флуоресцентный белок (например, ECFP, лазурь, CyPet), желтый флуоресцентный белок (например, YFP, цитрин, Venus, YPet), пары донор/акцептор FRET (например, флуоресцеин/флуоресцеин, флуоресцеин/тетраметилродамин, IAEDANS/флуоресцеин, EDANS/дабцил, BODIPY FL/BODIPY FL, флуоресцеин/OSY7 и QSY9), LysoTracker и LysoSensor (например, LysoTracker синий DND-22, LysoTracker сине-белый DPX, LysoTracker желтый HCK-123, LysoTracker зеленый DND-26, LysoTracker красный DND-99, LysoSensor синий DND-167, LysoSensor зеленый DND-189, LysoSensor зеленый DND-153, LysoSensor желтый/синий DND-160, LysoSensor желтный/синий декстран с молекулярной массой 10000), орегонский зеленый (например, 488, 488-Х, 500, 514); родамины (например, 110, 123, В, В 200, ВВ, BG, В экстра, 5-карбокситетраметилродамин (5-TAMRA), 5 GLD, 6-карбоксиродамин 6G, лиссамин, лиссамин родамин В, фаллицидин, фаллоидин, красный, Rhod-2, ROX (6-карбокси-Х-родамин), 5-ROX (карбокси-Х-родамин), сульфородамин В can С, сульфродамин G Extra, TAMRA (6-карбокситетраметилродамин), тетраметилродамин (TRITC), WT), Texas красный, Texas красный-Х и другие, известные специалистам в данной области.

[56] Также могут быть использованы другие обнаруживаемые метки. Например, праймеры могут быть помечены и использованы как для получения ампликонов, так и для обнаружения наличия (или концентрации) ампликонов, полученных во время реакции, и их можно использовать в дополнение к меченым зондам, описанным в настоящем документе, или в качестве их альтернативы. В качестве дополнительного примера праймеры могут быть помечены и использованы, как описано в Nazarenko et al. (Nucleic Acids Res. 2002 May 1; 30(9): e37), Hayashi et al. (Nucleic Acids Res. 1989 May 11; 17(9): 3605), и/или Neilan et al. (Nucleic Acids Res. Vol. 25, Issue 14, 1 July 1997, pp.2938-39). Специалисты в данной области также понимают и способны использовать процессы ПЦР (и связанные с ними методы конструирования зондов и праймеров), описанные в Zhu et al. (Biotechniques. 2020 Jul: 10.2144/btn-2020-0057).

[57] В некоторых вариантах осуществления можно использовать интеркалирующие метки, такие как бромистый этидий, SYBR зеленый I, SYBR GreenER и PicoGreen (Life Technologies Corp., Карлсбад, Калифорния), таким образом обеспечивая визуализацию в режиме реального времени или в конечной точке продукта амплификации при отсутствии зонда-детектора. Однако следует понимать, что использование интеркалирующих меток может ограничивать возможности мультиплексирования, поскольку многие интеркалирующие метки неспецифичны для данной последовательности и просто сообщают об общем (или пропорциональном) содержании нуклеиновой кислоты в реакции. В некоторых вариантах осуществления визуализация в режиме реального времени может включать в себя как интеркалирующий зонд-детектор, так и зонд-детектор на основе последовательности. Зонд-детектор может быть по меньшей мере частично погашен, когда не гибридизируется с комплементарной последовательностью в реакции амплификации и по меньшей мере частично не погашен, когда гибридизируется с комплементарной последовательностью во время реакции амплификации. В некоторых вариантах осуществления зонды могут дополнительно включать различные модификации, такие как связующее с малой канавкой, для дополнительного обеспечения требуемых термодинамических характеристик.

[58] Генетическая последовательность SARS-CoV-2 доступна под номером доступа NCBI NC_045512.2 и номером доступа GenBank МН908947.3, описывающими положительно-полярный одноцепочечный геном РНК из 29844 пар оснований; иногда такая последовательность упоминается в настоящем документе как «нормальная», «дикого типа» или «эталонная» последовательность для SARS-CoV-2, в отличие от вариантных или мутантных последовательностей SARS-CoV-2. Первоначальные генетические характеристики SARS-CoV-2 идентифицировали три коронавируса, имеющих гомологию, близкую к SARS-CoV-2, а именно Bat-SL-CoVZC45, Bat-SL-CoVZXC21 и SARS-CoVGZ02. Идентичность последовательностей этих штаммов показана на Фиг. 1А и Фиг. 1В. В частности, на Фиг. 1А проиллюстрирована идентичность последовательности консенсусной последовательности SARS-CoV-2 по сравнению с каждой из Bat-SL-CoVZC45, Bat-SL-CoVZXC21 и SARS-CoVGZ02 по всему геному, а также по каждой конкретной области гена в пределах геном коронавируса. На Фиг. 1В проиллюстрирована содержащаяся в таблицах информация, показанная на Фиг. 1А, в графической форме, причем ось x представляет собой положение пары оснований в вирусном геноме, а ось у представляет собой процентное сходство каждого родственного вируса с соответствующей консенсусной последовательностью SARS-CoV-2.

[59] Анализ, проиллюстрированный на Фиг. 1А и Фиг. 1В, идентифицировал по меньшей мере три генетических области со значительной вариабельностью между SARS-CoV-2 и другими родственными вирусами, в частности в вирусных генах, кодирующих белок ORF1ab (SEQ ID NO:1; пара оснований 1 соответствует паре оснований 1000 MN908947.3), белок S (SEQ ID NO:2; пара оснований 1 соответствует паре оснований 21564 MN908947.3) и белок N (SEQ ID NO:3; пара оснований 1 соответствует паре оснований 28275 MN908947.3). Область, содержащая кодирующую последовательность для белка ORF1ab, находится между парами оснований 1000-3000 генома SARS-CoV-2; эта последовательность соответствует SEQ ID NO:1. Область генома SARS-CoV-2 из 2000 пар оснований, которая включает в себя кодирующую последовательность для белка S, находится между парами оснований 21564-23564; эта последовательность соответствует SEQ ID NO:2. Наконец, область генома SARS-CoV-2 из 1283 пар оснований, которая включает в себя кодирующую последовательность для белка N, находится между парами оснований 28275-29558; эта последовательность соответствует SEQ ID NO:3.

[60] В некоторых вариантах осуществления обнаружение амплификации целевых последовательностей включает в себя измерение одного или более сигналов, испускаемых обнаруживаемой меткой, прикрепленной к одному или более праймерам или зондам или связанной с ними. Необязательно, один или более сигналов измеряют несколько раз по мере прохождения реакции амплификации, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один раз за термический цикл (например, во время или сразу после фазы отжига или удлинения термического цикла), что обеспечивает обнаружение амплификации в режиме реального времени. В вариантах осуществления «мультиплексной» амплификации образование множества отдельных и различных продуктов амплификации можно отслеживать с течением времени путем измерения сигнала в одном или более каналах обнаружения. Сигнал может испускаться обнаруживаемой меткой, необязательно флуоресцентной меткой, прикрепленной к праймеру и/или зонду, который избирательно гибридизируется с продуктом амплификации. В некоторых вариантах осуществления каждый канал калибруют для предпочтительного или избирательного обнаружения соответствующего продукта амплификации, и сигнал в каждом канале используют в качестве измерения концентрации соответствующего продукта амплификации. Например, в некоторых вариантах осуществления продукт амплификации гена S из SARS-CoV-2 обнаруживают в первом канале обнаружения на основе первого сигнала, испускаемого первой меткой, прикрепленной к первому праймеру и/или первому зонду или связанной с ним, который избирательно гибридизируется с продуктом амплификации гена S, и продукт амплификации гена N обнаруживают во втором канале обнаружения на основе второго сигнала, испускаемого второй меткой, прикрепленной ко второму праймеру и/или второму зонду или связанной с ним, который избирательно гибридизируется с продуктом амплификации гена N. Необязательно, в «триплексных» вариантах осуществления, включающих амплификацию гена Orf1ab, продукт амплификации гена ORF1ab обнаруживают в третьем канале на основе третьего сигнала, испускаемого третьей меткой, прикрепленной к третьему праймеру и/или третьему зонду, который избирательно гибридизируется с продуктом амплификации ORF1ab или с целевой областью ORF1ab. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации контрольной или эталонной последовательности обнаруживают в четвертом канале на основе четвертого сигнала, испускаемого четвертой меткой, прикрепленной к четвертому праймеру и/или четвертому зонду, который избирательно гибридизируется с продуктом амплификации или с целевой последовательностью в контрольной или эталонной последовательности.

[61] В некоторых вариантах осуществления (например, в хорошо известной и широко используемой линии тестов кПЦР TaqMan™) обнаружение продукта амплификации включает в себя обнаружение сигнала, испускаемого флуоресцентной меткой, прикрепленной к 5'-концу расщепляемого зонда, который избирательно гибридизируется с продуктом амплификации во время амплификации. Расщепляемый зонд дополнительно включает в себя гаситель, который гасит флуоресцентную метку до «исходного» уровня флуоресценции. 5'-конец расщепляемого зонда расщепляется полимеразой на стадии удлинения, что приводит к отделению флуоресцентной метки от гасителя и соответствующему увеличению флуоресценции по сравнению с исходным уровнем. По мере прохождения реакции ПЦР в каждом цикле измеряют продолжающееся увеличение флуоресценции по сравнению с исходным уровнем. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации гена N SARS-CoV-2 обнаруживают в первом канале на основе первого сигнала, испускаемого красителем VIC, прикрепленным к зонду, который избирательно гибридизируется с соответствующим продуктом амплификации гена N. Необязательно, второй продукт амплификации гена S SARS-CoV-2 обнаруживают во втором канале на основе второго сигнала, испускаемого красителем ABY, прикрепленным к зонду, который избирательно гибридизируется с соответствующим продуктом амплификации гена S. Необязательно, третий продукт амплификации гена ORF1ab SARS-CoV-2 обнаруживают в третьем канале на основе третьего сигнала, испускаемого красителем FAM, прикрепленным к зонду, который избирательно гибридизируется с соответствующим продуктом амплификации гена ORF1ab. Необязательно, четвертый продукт амплификации из контрольной или эталонной последовательности обнаруживают в четвертом канале на основе четвертого сигнала, испускаемого красителем JUN, прикрепленным к зонду, который избирательно гибридизируется с соответствующим продуктом амплификации из контрольной или эталонной последовательности.

[62] В некоторых вариантах осуществления в реакционную смесь включают пассивный эталонный краситель, такой как ROX™. Показатель «Rn» необязательно используют для отслеживания хода реакции амплификации и для определения количества целевой последовательности, изначально присутствующей в реакционной смеси до амплификации. Rn можно рассчитать как флуоресценцию репортерного красителя, деленную на флуоресценцию пассивного эталонного красителя, присутствующего в реакционной смеси; т.е. Rn представляет собой репортерный сигнал, нормализованный по сигналу флуоресценции пассивного эталонного красителя. В некоторых вариантах осуществления Rn нанесен на график в зависимости от номера цикла ПЦР. В некоторых вариантах осуществления ΔRn (рассчитанный как Rn минус исходный уровень) может быть нанесен на график в зависимости от номера цикла ПЦР. В некоторых вариантах осуществления график амплификации показывает изменение log (ΔRn) в зависимости от номера цикла ПЦР. C_t (пороговый цикл) представляет собой пересечение между кривой амплификации и пороговой линией. Чем ниже значение Ct для данного продукта амплификации, тем раньше можно обнаружить амплификацию и тем выше абсолютное количество и относительная концентрация соответствующей целевой последовательности, изначально присутствующей в реакционной смеси. В некоторых вариантах осуществления предельные значения для Ct используют для определения того, присутствовала ли целевая последовательность изначально или отсутствовала в реакционной смеси до амплификации. Например, в некоторых вариантах осуществления определяют, что целевая последовательность присутствует, если значение Ct меньше или равно 37.

[63] В некоторых вариантах осуществления новые варианты SARS-CoV-2 обнаруживаются, даже если такие варианты включают в себя мутации в одной или более целевых областях, описанных выше (например, областях белка ORF1ab, белка S или белка N). При просмотре нескольких целевых областей в геноме SARS-CoV-2 точное обнаружение достижимо даже в тех ситуациях, когда мутации достаточно значительны, чтобы привести к отрицательному результату теста в одной (или даже двух) из целевых областей. Например, недавно появившийся вариант В. 1.1.7 (часто называемый «британским вариантом») имеет необычное количество мутаций, связанных с областью белка S. Эти мутации достаточно значительны, чтобы некоторые тестовые компоненты и протоколы, разработанные для более ранних вариантов SARS-CoV-2, давали отрицательный результат для области белка S. Однако встроенная избыточность просмотра нескольких областей гарантирует, что общий тест по-прежнему способен обнаруживать вариант В. 1.1.7 SARS-CoV-2 (на основе обнаружения положительного ORF1ab и/или области белка N) без значительного воздействия на общую точность теста. В другом примере было обнаружено, что вариант 501Y.V2 (обнаруженный в Южной Африке) не влияет на обнаружение области белка S или какой-либо другой тестируемой области, описанной в настоящем документе. Тем по меньшей мере, надежность и избыточность вариантов осуществления, нацеленных на несколько областей генома SARS-CoV-2, ограничивают риск того, что эти или другие варианты, которые появятся в будущем, существенно повлияют на общую точность обнаружения SARS-CoV-2.

[64] Чтобы максимально увеличить специфичность генетического теста на SARS-CoV-2, были разработаны праймеры и зонды, нацеленные на кодирующие области для ORF1ab, белка S и белка N. В частности, наборы, матрицы, тесты для обнаружения вирусов и т.д., описанные в настоящем документе, включают в себя праймеры и/или зонды, специфичные для генетической последовательности SARS-CoV-2, кодирующей белок S; ни один из наборов для обнаружения вируса SARS-CoV-2, доступных в настоящее время, не нацелен на ген S. Нацеливание на ген S (в дополнение к кодирующим областям, связанным с белком N и ORF1ab) дает несколько преимуществ с точки зрения специфичности и надежности. Например, было показано, что по меньшей мере некоторые из описанных тестов, нацеленных на кодирующую область для белка S, различают SARS-CoV и SARS-CoV-2 на уровне связывания с рецептором. Включение этих праймеров и/или зондов, нацеленных на последовательности гена S, обеспечивает более высокую специфичность при обнаружении штаммов SARS-CoV-2 по сравнению с другими аналогичными коронавирусами, особенно в географических регионах, в которых есть испытуемые, имеющие коинфекцию SARS-CoV и SARS-CoV-2.

[65] Специфичность праймеров и зондов, обеспеченных в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533, оценивали in silico с использованием стандартного алгоритма сопоставления zpcr3p. Было обнаружено, что эти праймеры и зонды обладают более высокой специфичностью в отношении SARS-CoV-2 in silico, чем праймеры и зонды других имеющихся в продаже тестов на основе кПЦР SARS-CoV-2. Соответственно, описанные композиции, наборы и способы обнаружения вирусных последовательностей включают в себя по меньшей мере один праймер и/или зонд, имеющий последовательность, определенную SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533, что позволяет проводить одноплексные и мультиплексные тесты, описанные в настоящем документе, для демонстрации высокого уровня чувствительности, специфичности и точности. В некоторых вариантах осуществления первый прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 160. В некоторых вариантах осуществления второй прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления третий прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 211. В некоторых вариантах осуществления первый обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 468. В некоторых вариантах осуществления второй обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 337. В некоторых вариантах осуществления третий обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 501 и/или 510. В некоторых вариантах осуществления зонды представляют собой SEQ ID NO: 1049, 864 и/или 833. В некоторых вариантах осуществления описанных композиций, наборов и способов первый прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 160, второй прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 100, третий прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 211, первый обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 468, второй обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 337, третий обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 501 и/или 510, а комплементарные зонды представляют собой SEQ ID NO: 1049, 864 и 833 соответственно.

[66] Например, чувствительность описанных в настоящем документе тестов может составлять по меньшей мере 30 GCE/rxn, 25 GCE/rxn, 20 GCE/rxn, 15 GCE/rxn или 10 GCE/rxn, включая все диапазоны и промежуточные числа, для одновременного обнаружение множества мишеней или патогенов, включая любые из описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления мультиплексные тесты, описанные в настоящем документе, демонстрируют линейный динамический диапазон (LDR) обнаружения от 10⁷ до 10 GCE/rxn при расчете на основе серийного разбавления. Используемый в настоящем документе термин «линейный динамический диапазон (LDR)» относится к диапазону вводимой матрицы (между самым высоким и самым низким значениями вводимой РНК или ДНК), для которого наблюдаются приемлема линейность (R2 составляет ≥0,980) и эффективность (предпочтительно от 90% до 110%).

[67] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе одноплексные тесты могут демонстрировать уровень чувствительности до 1-10 вводимых копий/мкл на реакцию. Например, чувствительность описанных в настоящем документе тестов может составлять всего лишь 20 копий/мкл, 15 копий/мкл, 10 копий/мкл, 5 копий/мкл, 4 копий/мкл, 3 копий/мкл, 2 копий/мкл или 1 копию/мкл на реакцию, включая все промежуточные числа и диапазоны. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе одноплексные тесты могут демонстрировать LDR в диапазоне по меньшей мере от 5 до 6 порядков величины, причем R2>0,99, а эффективность ПЦР близка к 100%, с использованием серийных разбавлений. Например, описанные в настоящем документе одноплексные тесты могут демонстрировать увеличение LDR, составляющее по меньшей мере 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶. В некоторых вариантах осуществления диапазон ввода образца от 10⁷ до 10¹ копий путем серийного разбавления является линейным с использованием тестов, описанных в настоящем документе.

[68] В некоторых вариантах осуществления амплификация вирусных геномов РНК достигается путем проведения обратной транскрипции с последующей амплификации по меньшей мере части полученной кДНК. Подходящие способы известны в данной области и включают в себя, например, способы ОТ-ПЦР или OT-LAMP, в которых целевая последовательность (например, геном вирусной РНК) подвергается обратной транскрипции с образованием первой цепи кДНК, которую затем копируют в зависимом от матрицы формате для образования двухцепочечной последовательности ДНК. Затем из этой двухцепочечной кДНК амплифицируют целевую последовательность.

[69] В некоторых вариантах осуществления ОТ-ПЦР проводят с использованием образцов, содержащих вирусные частицы или предположительно содержащих вирусные частицы, которые могут представлять собой инфекционные вирионы, неинфекционные или инактивированные вирусные капсиды, заключающие в оболочку вирусную нуклеиновую кислоту, или вирусную геномную РНК, полученную из инфицированной клетки. В таких вариантах осуществления композиции, реакционные смеси и наборы, описанные в настоящем документе, могут включать в себя по меньшей мере одну РНК-зависимую полимеразу ДНК, обычно называемую обратной транскриптазой (ОТ), и родственные компоненты для осуществления обратной транскрипции. ОТ-ПЦР можно проводить с использованием описанных в настоящем документе композиций, реакционных смесей и наборов, когда, например, исходным материалом для последующего анализа является РНК.

[70] В некоторых вариантах осуществления ОТ-ПЦР может представлять собой одностадийную процедуру с использованием одного или более праймеров и одного или более зондов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ОТ-ПЦР можно проводить в одной реакционной пробирке, реакционном сосуде (например, реакция в «одной пробирке» или «1 пробирке» или «одном сосуде»). В некоторых вариантах осуществления ОТ-ПЦР можно проводить в многоцелевом реакционном сосуде, таком как многолуночный планшет или матрица. В некоторых вариантах осуществления ОТ и ПЦР проводят в одном и том же реакционном сосуде или реакционном центре, например, в 1-стадийной ОТ-кПЦР или ОТ-кПЦР в 1 пробирке. Подходящие типовые ОТ могут включать в себя, например, обратную транскриптазу вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV), обратные транскриптазы Superscript (Thermo Fisher Scientific), обратные транскриптазы Superscript IV (Thermo Fisher Scientific), или обратные транскриптазы Maxima (Thermo Fisher Scientific), или модифицированные формы любых таких ОТ.

[71] В некоторых вариантах осуществления в реакционный сосуд или объем включен только один тест ОТ-кПЦР (состоящий из последовательности данного прямого праймера и данного обратного праймера), причем режим реакции называется в настоящем документе «одноплексным». Необязательно, одноплексный тест кПЦР может также включать в себя последовательность одного зонда в дополнение к последовательности прямого праймера и последовательности обратного праймера. Последовательность зонда может представлять собой последовательность зонда гидролиза. Необязательно, зонд включает в себя MGB (связывающий белок с малой канавкой), как и в зондах TaqMan.

[72] В некоторых вариантах осуществления описанные композиции и способы можно использовать в мультиплексном формате, причем два или более тестов кПЦР, каждый из которых способен амплифицировать и обнаруживать другую целевую последовательность, присутствуют в одном объеме реакционной смеси. В некоторых вариантах осуществления разные тесты в одном и том же объеме реакционной смеси будут вызывать образование соответствующего другого продукта амплификации, когда объем реакционной смеси подвергается соответствующим условиям амплификации, и в одном и том же объеме реакционной смеси может образовываться множество ампликонов. Разные продукты амплификации могут быть получены одновременно, когда объем реакционной смеси подвергается воздействию условий амплификации; альтернативно, разные продукты амплификации можно получать серийно или последовательно. Например, для появления некоторых продуктов реакции может потребоваться больше времени, чем для других, из-за начальной исходной концентрации матрицы, или для оптимального производства могут быть полезны другие условия реакции.

[73] В некоторых вариантах осуществления различные продукты теста могут быть обнаружены независимо друг от друга или по меньшей мере могут быть отличены друг от друга. Например, разные продукты теста можно различать оптически (например, при использовании оптически разных меток для каждого теста кПЦР, спектры испускания которых могут находиться, например, в оптическом спектре, включая инфракрасный, УФ и видимый свет) или можно различать с помощью какого-либо другого подходящего способа, включая то, что описано в публикации патента США №2019/0002963, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления используют специфичные комбинации меток для определения отличия разных патогенов, штаммов и/или типов патогенов. Например, различные респираторные патогены или вирусы можно отличать друг от друга, используя разные метки, специфичные для каждого патогена или вируса, таким образом, что метку можно обнаружить только при наличии, и амплификации, последовательности нуклеиновой кислоты, специфичной для патогена или вируса.

[74] В некоторых вариантах осуществления на основе матрицы два или более разных тестов кПЦР (каждый из которых содержит прямой праймер, обратный праймер и, необязательно, зонд) присутствуют в одной лунке, полости, участке или элементе матрицы, и продукты каждого теста могут быть обнаружены независимо. Например, различные продукты теста можно различать оптически (например, с использованием разных меток, присутствующих в качестве компонентов каждого теста) или с помощью какого-либо другого подходящего способа, в том числе описанного в публикации патента США №2019/0002963. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один праймер каждого теста содержит оптически обнаруживаемую метку, которую можно отличить от оптической метки по меньшей мере одного другого теста. Для целей настоящего изобретения тест ПЦР, который для ясности включает любую реакцию амплификации, управляемую полимеразой, описанную в настоящем документе (например, кПЦР и ОТ-кПЦР), считается отличным от другого теста ПЦР, если соответствующие ампликоны отличаются в последовательности нуклеиновой кислоты на по меньшей мере один нуклеотид.

[75] В предпочтительном мультиплексном формате по меньшей мере два разных теста объединяют в один объем реакционной смеси для определения по меньшей мере наличия SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты, полученном или происходящем из клинического или лабораторного источника.

[76] Следует понимать, что испытуемый и тип образца могут варьироваться. Например, мазок из носоглотки традиционно служил золотым стандартом во многих клинических диагностических ситуациях, особенно связанных с инфекциями верхних дыхательных путей. Фракция нуклеиновой кислоты образца, полученного с помощью мазка из носоглотки, может быть экстрагирована и использована для последующего теста, такого как ОТ-кПЦР. Мазок (или другие образцы, описанные в настоящем документе) могут быть получены или взяты у испытуемого-человека, но следует понимать, что описанные варианты осуществления могут дополнительно распространяться на обработку образцов у субъектов, не являющихся людьми, таких как животные, не являющиеся людьми. В некоторых вариантах осуществления испытуемый-животное, не являющееся человеком, может представлять собой норку или другое одомашненное (или не одомашненное) животное, и описанные композиции, наборы и способы могут быть использованы для обнаружения наличия SARS-CoV-2 у животного, не являющегося человеком (например, для целей диагностики или скрининга).

[77] В качестве дополнительного примера отобранный образец может представлять собой необработанный образец слюны. Как указано в настоящем документе, необработанный образец слюны может быть отобран самостоятельно (например, в устройстве для забора слюны или стерильной пробирке) или отобран у испытуемого любым другим индивидуумом, находящимся в непосредственной близости от испытуемого. В некоторых вариантах осуществления необработанный образец слюны отбирают непосредственно в герметизируемый контейнер без какого-либо консервирующего раствора или другой жидкости или вещества в контейнере до получения образца слюны или в результате закрытия/герметизации контейнера. Описанные варианты осуществления для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в образце могут быть адаптированы для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты непосредственно в образце слюны, или в альтернативных вариантах осуществления образец может подвергаться специфичной стадии очистки и/или экстрагирования РНК до его использования в тесте для обнаружения (например, ОТ-кПЦР). Таким образом, следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления образец испытуемого (например, слюна) может непосредственно служить в качестве исходного образца для следующих последующих анализов, таких как ПЦР, и это может быть выполнено в некоторых вариантах осуществления без стадии очистки и/или экстрагирования нуклеиновой кислоты перед ее использованием.

[78] В некоторых вариантах осуществления способ обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты, в частности SARS-CoV-2, непосредственно в необработанном образце слюны может включать в себя забор или получение образца слюны у испытуемого и термическую обработку образца, например, путем помещения необработанного образца слюны на нагревательный блок/водяную баню, установленную на температуру 95°С, на 30 минут. Стадия нагревания может дать много преимуществ, включая, например, денатурацию нуклеаз, таких как РНКаза, в слюне, что может помешать точной оценке наличия вируса. Нагревание необработанного образца слюны также может разрушить слизь, что делает образец более податливым для манипуляций с помощью лабораторного оборудования, такого как пипетки. Высокая температура также может вызывать термическое разрушение любых прокариотических и эукариотических клеток, присутствующих в образце, и может разрушить вирусы с оболочкой и/или вирусные капсиды, присутствующие в образце, и таким образом повышать доступность любой вирусной нуклеиновой кислоты.

[79] Способ может дополнительно включать в себя смешивание термически обработанного образца (например, посредством встряхивания образца в течение по меньшей мере 10 секунд) до и/или после уравновешивающего доведения термически обработанного образца до комнатной температуры. Затем можно получить раствор для лизиса и объединить (например, в пропорциях 1:1) с термически обработанным образцом для создания испытательного матричного раствора для обнаружения наличия вирусной нуклеиновой кислоты в образце посредством реакций амплификации нуклеиновых кислот (например, ПЦР, ОТ-ПЦР, кПЦР, ОТ-кПЦР и т.п.). Раствор для лизиса может включать в себя буфер, пригодный для нуклеиновых кислот, такой как ТВЕ, объединенный с детергентом и/или эмульгатором (например, Tween-20, Triton-X-100, NP-40 или т.п.), неионогенное поверхностно-активное вещество полисорбатного типа. Детергент и/или эмульгатор могут способствовать лучшему смешиванию реагентов, а также могут повышать доступность любой вирусной нуклеиновой кислоты в образце (например, путем удаления липидных оболочек вирионов).

[80] После того как образован испытательный матричный раствор, его можно объединить с реагентами ПЦР и подвергнуть воздействию условий, подходящих для получения вирусоспецифичных (например, SARS-CoV-2-специфичных, грипп А/В-специфичных и/или RSV-A/B-специфичных) ампликонов при наличии вирусной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления праймеры могут быть выбраны из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:510 и могут быть соединены с одним или несколькими зондами, полученными из последовательностей, описанных в SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO:2533, для специфичной идентификации амплифицированных кодирующих областей, связанных с белком N и белком S SARS-CoV-2 и/или областью ORF1ab, в дополнение к любой другой выбранной вирусной последовательности, подлежащей идентификации. В некоторых вариантах осуществления праймеры и/или зонды могут быть включены в набор, который может дополнительно включать в себя набор праймеров и зондов для внутреннего контроля для идентификации кодирующей последовательности положительного контроля (например, эндогенно присутствующей последовательности P RPP30 РНКазы человека). Вышеупомянутые и аналогичные способы успешно совместимы с некоторыми доступными в настоящее время тестами/наборами, такими как тест ПЦР Fast SARS-CoV-2 TaqCheck, контроль SARS-CoV-2 TaqCheck и контрольный буфер для разбавления SARS-CoV-2 TaqCheck, и, кроме того, могут быть совместимы с уже существующими мастер-миксами для термоциклирования, такими как 1-стадийный мастер-микс ОТ-кПЦР TaqPath, CG.

[81] Примечательно, что в некоторых вариантах осуществления протокол амплификации нуклеиновых кислот может быть выполнен с возможностью быстрой обработки (например, в течение менее чем около 45 минут) и высокой производительности, обеспечивая минимально инвазивный способ для быстрого скрининга больших количеств индивидуумов масштабируемым образом. Это может быть особенно полезно для проведения бессимптомного тестирования (например, частого/широко распространенного тестирования в школах, на рабочих местах, конгрессах, спортивных мероприятиях, крупных общественных мероприятиях и т.д.) или в эпидемиологических целях. Описанные варианты осуществления также могут выгодно обеспечить более дешевую систему и способ отбора образцов, которые обеспечивают самостоятельный забор (снижение потребностей в персонале медицинских работников (НСР)) с использованием недорогостоящего устройства для отбора. Это устраняет необходимость в мазках, буферах, средах для передачи вирусов (или других специализированных транспортных средах) и т.п. Описанные варианты осуществления также обеспечивают снижение требований и затрат на средства индивидуальной защиты (СИЗ). Поскольку реагенты и способы модернизированы (например, отсутствует стадия очистки и/или экстрагирования нуклеиновых кислот-предшественников), сокращается использование пластика для получения нуклеиновых кислот, что одновременно приводит к снижению затрат на реагенты и затрат на запасы. Также существует полезная сниженная зависимость от предметов ограниченных поставок, а совместимость этих способов и компонентов набора с существующим оборудованием повышает гибкость и простоту их реализации в массовом масштабе. В целом, такие варианты осуществления обеспечивают проведение менее дорогостоящего теста, который можно выполнить быстрее, начиная с отбора образца и заканчивая получением результатов.

[82] Описанные способы прямого обнаружения вирусных нуклеиновых кислот, в частности SARS-CoV-2, в необработанном образце слюны выгодно отличаются надежностью. Например, испытательная матрица, полученная из необработанного образца слюны, может быть использована и/или совместима со многими различными реагентами для ПЦР и/или имеющимися в продаже наборами. То есть в некоторых вариантах осуществления образец слюны, полученный непосредственно от испытуемого (путем самостоятельного или вспомогательного отбора), термически обработанный и объединенный со смесью буфера/детергента (например, раствором TBS/Tween-20) для использования в качестве исходного образца для существующих наборов PCR/LAMP и в других отношениях совместим со многими имеющимися в продаже буферами, полимеразами ПЦР/LAMP и другими реагентами ПЦР/LAMP. Действительно, в некоторых вариантах осуществления никаких дополнительных стадий или модификаций существующих протоколов ПЦР/LAMP не требуется при использовании термически обработанного образца слюны в TBS/Tween-20 (или другой смеси буфера/детергента) в качестве источника нуклеиновой кислоты для амплификации. Это обеспечивает быстрое принятие и внедрение при сохранении требуемой (и часто необходимой) специфичности и надежности диагностического теста. В некоторых вариантах осуществления описанные способы прямого обнаружения SARS-CoV-2 в необработанном образце слюны имеют чувствительность <10000 GCE/мл. В некоторых вариантах осуществления способы и наборы имеют чувствительность <5000 GCE/мл, <2500 GCE/мл, <1000 GCE/мл или любое промежуточное значение или диапазон. Например,

[83] Типовой способ обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты, в частности, SARS-CoV-2, непосредственно в необработанном образце слюны обеспечен в приведенном ниже разделе «Примеры».

[84] Как обеспечено в настоящем документе, следует понимать, что образец нуклеиновой кислоты может быть получен из других тканей или источников организма, включая, без ограничений, жидкости организма, отличные от слюны (например, кровь, моча, мокрота и т.п.). В некоторых вариантах осуществления SARS-CoV-2 или другие вирусы обнаруживают путем анализа мазков или жидкости, полученной из мазков, таких как мазки из зева, мазки из носа, мазки из носоглотки, мазки со щек, мазки из слюны или другие мазки. В некоторых вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты включает в себя общее содержание нуклеиновой кислоты, выделенное у испытуемого посредством мазка из носоглотки, аспирата из носоглотки и/или бронхоальвеолярного лаважа. Однако следует учитывать, что SARS-CoV-2 или другие коронавирусы и/или другие вирусы также могут быть обнаружены путем анализа образцов мочи, образцов слюны или других подходящих клинических образцов.

[85] В некоторых вариантах осуществления, в частности в тех случаях, когда образец не используют непосредственно для идентификации наличия вирусных последовательностей, начальная стадия обнаружения вирусных последовательностей может включать в себя проведение теста очистки нуклеиновой кислоты на каждом образце. Затем очищенную или иным образом экстрагированную фракцию нуклеиновой кислоты образца испытуемого добавляют к последующим тестам для обнаружения. Общее содержание нуклеиновых кислот может быть выделено любыми средствами, известными в данной области, включая, например, использование набора для выделения нуклеиновых кислот MagMAX Viral/Pathogen Ultra (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под кат. № А42356). Короче говоря, набор MagMAX обеспечивает гранулы, связывающие нуклеиновые кислоты, и другие реагенты для связывания, промывки и элюирования нуклеиновой кислоты в клиническом/лабораторном образце. Эти элюированные нуклеиновые кислоты предпочтительно включают в себя общее содержание нуклеиновых кислот, очищенное из образца.

[86] В некоторых вариантах осуществления общее содержание нуклеиновых кислот включает в себя любую геномную ДНК и транскрибированную РНК, полученные из клеток испытуемого, захваченных в образце, в дополнение к любым геномным/транскрибированным нуклеиновым кислотам, полученным из эукариотической и/или прокариотической микробиоты испытуемого, захваченной в процессе отбора образцов. Любая одноцепочечная (плюс или минус) РНК, двухцепочечная РНК, их производные кДНК, одноцепочечная (плюс или минус) ДНК или двухцепочечная ДНК, полученные из вирусов, захваченных в образце, также предпочтительно включаются в общее содержание нуклеиновых кислот, элюированных в клиническом/лабораторном образце. Затем это элюированное общее содержание нуклеиновой кислоты можно использовать в качестве источника матричной нуклеиновой кислоты в описанных тестах ОТ-кПЦР.

[87] Композиции, реакционные смеси и наборы могут также содержать любые другие компоненты, необходимые для проведения таких реакций ОТ-кПЦР, которые, например, можно найти в мастер-миксе Superscript IV VILO (Thermo Fisher Scientific), 1-стадийном мастер-миксе ОТ-кПЦР TaqPath (Thermo Fisher Scientific), 1-стадийном мастер-миксе Fast Virus TaqMan (Thermo Fisher Scientific) или любых других подходящих мастер-миксах для ОТ-ПЦР, которые могут иметься в продаже. Протоколы ОТ-ПЦР известны в данной области. Несмотря на это, типовой протокол ОТ-ПЦР для использования в мультиплексных протоколах обнаружения вирусов, описанных в настоящем документе, изложен в разделе «Примеры».

[88] В некоторых вариантах осуществления тесты обратной транскрипции и/или амплификации нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе, проводят с использованием прибора для количественной ПЦР (кПЦР) в режиме реального времени, включая, например, систему ПЦР в режиме реального времени QuantStudio, такую как система ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 5 (QS5) и система QuantStudio 12K Flex (QS12K) или система ПЦР в режиме реального времени 7500, такая как система 7500 Fast Dx, от Thermo Fisher Scientific.

[89] Описанные наборы для обнаружения вирусных последовательностей содержат в некоторых вариантах осуществления один или более прямых праймеров, обратных праймеров и/или зондов для обнаружения целевых последовательностей нуклеиновых кислот в геноме SARS-CoV-2, таких как раскрытые в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:251; SEQ ID NO:267 - SEQ ID NO:504 и SEQ ID NO:510; и SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO:1295 и SEQ ID NO:1466 - SEQ ID NO:2359 соответственно. В некоторых вариантах осуществления праймеры, описанные в настоящем документе, включены в наборы, карты матриц и т.п. в концентрации от около 100 нМ до 1 мМ (например, 300 нМ, 400 нМ, 500 нМ и т.д.), включая все промежуточные количества и диапазоны концентрации. В некоторых вариантах осуществления зонды, описанные в настоящем документе, используют в тесте нуклеиновых кислот в концентрации от около 50 нМ до 500 нМ (например, 75 нМ, 125 нМ, 250 нМ и т.д.), включая все промежуточные количества и диапазоны концентрации.

[90] Описанные в настоящем документе наборы, матрицы и т.д. могут включать в себя реагенты для осуществления способа амплификации нуклеиновых кислот, как обсуждается в настоящем документе, описанные в настоящем документе, как правило, включают в себя по меньшей мере одну пару праймеров (например, прямой праймер, выбранный из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:251, и обратный праймер, выбранный из SEQ ID NO:267 - SEQ ID NO:504 и SEQ ID NO:510), направленную на последовательность целевой нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, полимеразу нуклеиновой кислоты (например, термоустойчивые ДНК-зависимые ДНК-полимеразы, такие как Taq, или РНК-зависимые ДНК-полимеразы, также известные как обратная транскриптаза), и пул дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) для синтеза матриц и/или ампликонов кДНК. Каждый из вышеперечисленных элементов может быть включен отдельно в описанные наборы, по мере необходимости, в концентрациях, подходящих для различных термоциклических реакций, в которых их используют, как известно в данной области. В некоторых вариантах осуществления наборы могут дополнительно включать в себя буферы и/или соли в подходящей концентрации для получения реакционной смеси, которая, например, повышает уровни полимеразной активности в реакционной смеси, как известно в данной области или иным образом раскрыто в настоящем документе.

[91] В некоторых вариантах осуществления оптимальной амплификации и обнаруживаемости вирусных геномов достигают с помощью описанных наборов с использованием включенного в них мастер-микса, который можно добавить в объем реакционной смеси перед амплификацией. Мастер-микс может включать в себя, например, одну или более полимераз нуклеиновых кислот, dNTP, буферов и солей - все они включены в мастер-микс в соответствующей концентрации, при добавлении требуемого объема образца (с уравновешивающими объемами воды PCR-класса или без них). В некоторых вариантах осуществления (в частности, мультиплексных тестах) описанные наборы и/или реакционные объемы могут включать в себя 1-стадийный мастер-микс Fast Virus TaqMan (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу 44444432) или, альтернативно, 1-стадийный мастер-микс ОТ-кПЦР TaqPath, CG (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А15299). В других вариантах осуществления мастер-микс представляет собой 1-стадийный мультиплексный мастер-микс TaqPath (без ROX) (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под №№ по каталогу А48111 и А28521) или аналогичный мастер-микс, известный в данной области. В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя праймеры, зонды и мастер-микс в количестве, достаточном для создания реакционной смеси, поддерживающей мультиплексную амплификацию одной или более областей SARS-CoV-2, кодирующих белок N, белок S и/или белок ORF1ab, в одном объеме реакционной смеси.

[92] В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя по меньшей мере один тест кПЦР (включающий в себя прямой праймер, обратный праймер, зонд и, необязательно, мастер-микс или его компоненты), выполненный с возможностью амплификации области гена, кодирующего белок ORF1ab. В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя по меньшей мере один тест кПЦР (включающий в себя прямой праймер, обратный праймер, зонд и, необязательно, мастер-микс или его компоненты), выполненный с возможностью амплификации области гена, кодирующего белок N. В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя по меньшей мере один тест кПЦР (включающий в себя прямой праймер, обратный праймер, зонд и, необязательно, мастер-микс или его компоненты), выполненный с возможностью амплификации области гена, кодирующего белок S. В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя по меньшей мере один тест кПЦР (включающий в себя прямой праймер, обратный праймер и, необязательно, зонд), выполненный с возможностью амплификации области гена, кодирующего белок N, по меньшей мере один тест кПЦР (включающий в себя прямой праймер, обратный праймер, зонд и, необязательно, мастер-микс или его компоненты), выполненный с возможностью амплификации области гена, кодирующего белок S, и/или по меньшей мере один тест кПЦР (включающий в себя прямой праймер, обратный праймер, зонд и, необязательно, мастер-микс или его компоненты), выполненный с возможностью амплификации области гена, кодирующего белок ORF1ab.

[93] В некоторых вариантах осуществления праймеры и/или зонды, связанные с SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533 и/или таблицей 2, могут дополнительно включать флуоресцентную или другую обнаруживаемую метку и/или гаситель или связующее с малой канавкой, такие как описанные выше. В качестве неограничивающего примера указанные праймеры и/или зонды могут быть связаны с FAM, ABY, VIC или JUN в качестве обнаруживаемых меток и QSY в качестве гасителя. Таким образом, следует понимать, что праймеры и зонды SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533 и/или таблицы 2 могут быть включены в описанные наборы, матрицы и т.д. для использования в форматах одноплексного или мультиплексного теста.

[94] В некоторых вариантах осуществления форматов мультиплексных тестов, описанных в настоящем документе, обнаруживают одну или более различных геномных областей SARS-CoV-2, включая тесты для обнаружения кодирующих областей ORF1ab (например, меченых FAM), белка N (например, меченого VIC) и/или белка S (например, меченого ABY). Как описано выше, один или более меченых праймеров можно использовать в дополнение к меченым зондам или в качестве альтернативы им для обнаружения одной или более целевых нуклеиновых кислот. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления зонды не используют.

[95] В некоторых вариантах осуществления форматов мультиплексных тестов, описанных в настоящем документе, обнаруживают различные геномные области SARS-CoV-2, включая тесты для кодирующих областей белка N и белка S (например, в обоих случаях меченых FAM), необязательно, в комбинации с тестами для гриппа А (например, меченого VIC) и/или гриппа В (например, меченого ABY). В некоторых вариантах осуществления форматов мультиплексных тестов, описанных в настоящем документе, обнаруживают различные геномные области SARS-CoV-2, включая тесты для обнаружения кодирующих областей белка N и белка S (например, меченых VIC), необязательно, в комбинации с тестами для гриппа А и/или В (например, в обоих случаях меченых FAM) и/или для RSV типа А и/или типа В (например, в обоих случаях меченых ABY). Необязательно, в некоторых вариантах осуществления контроль (например, меченый JUN), такой как контроль бактериофага MS2 или РНКазы Р, включен в набор, матрицу и т.д., включающие мультиплексный тест. Следует понимать, что хотя выше приведены конкретные примеры, указывающие на то, что данный флуорофор связан с обнаружением данной вирусной последовательности, праймеры и/или зонды могут быть модифицированы для включения функционально аналогичного флуорофора, описанного в настоящем документе или иным образом известного в данной области. Кроме того, гасители, такие как QSY, могут быть включены в любой из приведенных выше примеров, а обнаруживаемая метка и/или гаситель могут быть выбраны на основе требований к одноплексному или мультиплексному формату данного теста кПЦР в соответствии с ограничениями и факторами, которые рассмотрены выше или иным образом понимаются специалистами в данной области.

[96] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из тестов кПЦР нацелен на последовательность в пределах гена SARS-CoV-2, выбранную из группы, состоящей из: белка N, белка ORF1ab и белка S. В некоторых вариантах осуществления объем реакционной смеси дополнительно включает в себя второй тест кПЦР, нацеленный на другой ген из вышеупомянутой группы. В некоторых вариантах осуществления объем реакционной смеси дополнительно включает в себя третий тест кПЦР, нацеленный на оставшийся третий ген из вышеупомянутой группы таким образом, что, когда объем реакционной смеси подвергается условиям амплификации и если образец включает в себя геномную РНК SARS-CoV-2, получают по меньшей мере один ампликон из генетической последовательности, кодирующей белок S, по меньшей мере один ампликон из генетической последовательности, кодирующей белок N, и по меньшей мере один ампликон из генетической последовательности, кодирующей белок ORF1ab.

[97] В дополнительном мультиплексном формате по меньшей мере два теста кПЦР объединяют в единый объем реакционной смеси, который включает в себя образец нуклеиновой кислоты, полученный или происходящий из ткани организма, как описано в настоящем документе, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты экзогенного положительного контроля. Последовательность экзогенного положительного контроля может включать последовательность/ген фага MS2 или другую последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательность РНК. Дополнительно или альтернативно, мультиплесные тесты кПЦР включают в себя эндогенный положительный контроль, такой как человеческая РНКаза Р. В некоторых вариантах осуществления можно использовать последовательности праймеров и/или зондов, описанные Центрами США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.htmll). Например, тесты, описанные в настоящем документе, могут включать в себя один или более праймеров и/или зондов, показанных в таблице 2.

[98] В некоторых вариантах осуществления обеспечены наборы, которые включают в себя реагенты для мультиплексного теста кПЦР, нацеленного на последовательность SARS-CoV-2, выбранную из кодирующих областей белка ORF1ab, белка N и/или белка S. В некоторых вариантах осуществления наборы дополнительно включают в себя реагенты для второго теста кПЦР, нацеленного на другую последовательность SARS-CoV-2, выбранную из кодирующих областей белка ORF1ab, белка N и белка S. В некоторых вариантах осуществления наборы дополнительно включают в себя реагенты для третьего теста кПЦР, нацеленного на третью последовательность SARS-CoV-2, выбранную из кодирующих областей, связанных с белком ORF1ab, белком N и белком S, таким образом, что, когда объем реакционной смеси, содержащий реагенты из первого, второго и третьего тестов кПЦР, подвергается условиям амплификации - и если тестируемый образец нуклеиновой кислоты включает в себя геномную РНК SARS-CoV-2 (или обратно транскрибированную из нее кДНК), - по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком ORF1ab, по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком S, и по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком N (например, с использованием первого прямого праймера, выбранного из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:34 и SEQ ID NO:160, второго прямого праймера, выбранного из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:100, и третьего прямого праймера, выбранного из SEQ ID NO:211 и SEQ ID NO:248; с использованием первого обратного праймера, выбранного из SEQ ID NO:320, SEQ ID NO:423 и SEQ ID NO:468, второго обратного праймера, выбранного из SEQ ID NO:337 и SEQ ID NO:441, и третьего обратного праймера, выбранного из SEQ ID NO:487 - SEQ ID NO:501 и 510; и с использованием комплементарных зондов, выбранных из SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO: 1295 и/или SEQ ID NO: 1466 - SEQ ID NO:2359; предпочтительно одного или более зондов, выбранных из SEQ ID NO: 821-1054, SEQ ID NO: 1853-2027, SEQ ID NO: 2028-2220 и/или SEQ ID NO: 2221-2359; и более предпочтительно одного или более зондов, выбранных из SEQ ID NO:565, SEQ ID NO:599, SEQ ID NO:833, SEQ ID NO:864, SEQ ID NO:930, SEQ ID NO:971, SEQ ID NO:1049, SEQ ID NO: 1106, SEQ ID NO:1160, SEQ ID NO:1203, SEQ ID NO:1866, SEQ IDNO:1891, SEQ IDNO:1962, SEQ ID NO:2031, SEQ ID NO:2188, SEQ ID NO:2203, SEQ ID NO:2216, SEQ ID NO:2248, SEQ ID NO:2291 и/или SEQ ID NO:2345). В некоторых вариантах осуществления первый прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 160. В некоторых вариантах осуществления второй прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления третий прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 211. В некоторых вариантах осуществления первый обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 468. В некоторых вариантах осуществления второй обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 337. В некоторых вариантах осуществления третий обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 501 и/или 510. В некоторых вариантах осуществления комплементарные зонды представляют собой SEQ ID NO: 1049, 864 и/или 833. В некоторых вариантах осуществления первый прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 160, второй прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 100, третий прямой праймер представляет собой SEQ ID NO: 211, первый обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 468, второй обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 337, третий обратный праймер представляет собой SEQ ID NO: 501 и/или 510, а комплементарные зонды представляют собой SEQ ID NO: 1049, 864 и 833 соответственно.

[99] Последовательности праймеров и зондов, описанные в настоящем документе, не обязательно должны иметь 100%-ную гомологию с их мишенями, чтобы быть эффективными, хотя в некоторых вариантах осуществления гомология составляет по существу 100%. В некоторых вариантах осуществления одна или более описанных последовательностей праймеров и/или зондов имеют гомологию с их соответствующей мишенью на около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 97%, около 98%, около 99% или по существу до 100%. Некоторые комбинации праймеров и/или зондов могут включать в себя праймеры и/или зонды, каждый из которых имеет разную гомологию со своими соответствующими мишенями, и эти гомологии могут находиться, например, в диапазоне с конечными точками, определяемыми любыми двумя из вышеуказанных значений.

[100] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе наборы кПЦР дополнительно включают в себя реагенты для четвертого теста кПЦР, нацеленного на последовательность экзогенного/эндогенного положительного контроля, так образом, что, когда объем мультиплексной реакционной смеси подвергается условиям амплификации - и если образец включает в себя геномную РНК SARS-CoV-2 и нуклеиновую кислоту, полученную от испытуемого, или экзогенно добавленную матричную нуклеиновую кислоту, - по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком ORF1ab, по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком S, по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком N, как указано выше, и по меньшей мере один ампликон получают из последовательности экзогенного/эндогенного положительного контроля. Если последовательность положительного контроля представляет собой контроль эндогенного происхождения, такой как РНКаза Р, наличие нуклеиновой кислоты, полученной от испытуемого (например, геномной ДНК, кодирующей РНКазу Р, РНК РНКазы Р и/или обратно транскрибированного транскрипта РНКазы Р), можно использовать в качестве матрицы для теста кПЦР РНКазы Р. Типовые праймеры и зонды для такого положительного контроля кПЦР РНКазы Р могут включать в себя SEQ ID NO: 2552 - SEQ ID NO: 2556, хотя специалистам в данной области должно быть понятно, что можно использовать другие праймеры и/или зонды, специфичные для РНКазы Р. Если последовательность положительного контроля представляет собой контроль экзогенного происхождения, такой как компонент бактериофага MS2, в объем реакционной смеси добавляют известную или заданную концентрацию матричной нуклеиновой кислоты, которая служит необходимой матрицей для теста кПЦР MS2. Типовые праймеры и зонды для экзогенного положительного контроля кПЦР MS2 могут включать в себя SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:509 и SEQ ID NO:1300, хотя специалистам в данной области должно быть понятно, что можно использовать другие MS2-специфические праймеры и/или зонды.

[101] В некоторых вариантах осуществления одноплексные и мультиплексные тесты могут включать в себя синтетические контроля ДНК и/или геномные контроля РНК для тестируемых патогенных мишеней, образцы клинических изолятов для исследований и/или образцы из организма. Композиции и наборы также могут включать в себя контрольную структуру ДНК, включающую плазмиду, несущую целевые последовательности белка N, белка S и белка ORF1ab. Контрольная плазмида может дополнительно включать в себя последовательность, кодирующую РНКазу Р, для использования в качестве положительного контроля и/или кассеты Xeno для контроля загрязнения образца. В некоторых вариантах осуществления структура синтетического контроля обеспечена в отдельном наборе с теми же праймерами и зондами, включенными в дополнительный набор, используемый для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 в биологическом образце. Эти два набора могут быть изготовлены в некоторых вариантах осуществления в разных местах, чтобы предотвратить любое возможное перекрестное загрязнение контрольной плазмиды в наборах для обнаружения (что может привести к ложноположительным результатам отбора образцов).

[102] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе мультиплексные наборы ОТ-кПЦР дополнительно включают в себя реагенты для пятого теста кПЦР, нацеленного на две отдельные последовательности (экзогенного/эндогенного) положительного контроля, таким образом, что, когда объем реакционной смеси подвергается условиям амплификации - и если образец включает в себя геномную РНК SARS-CoV-2 и нуклеиновую кислоту, полученную от испытуемого, или экзогенно добавленную матричную нуклеиновую кислоту, - по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком ORF1ab, по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком S, по меньшей мере один ампликон получают из кодирующей области, связанной с белком N, как указано выше, и по меньшей мере два ампликона получают из последовательности экзогенного и/или эндогенного положительного контроля (например, с использованием праймеров и зондов для РНКазы P и/или MS2, описанных выше, или других избирательных и специфических праймеров и зондов, которые могут служить в качестве положительного контроля в тестах кПЦР, описанных в настоящем документе).

[103] В некоторых вариантах осуществления описанные праймеры и зонды (в том числе перечисленные в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533) используют в формате мультиплексного теста, нацеленного по меньшей мере на два разных локуса в геноме SARS-CoV-2, а именно: ген, кодирующий ORF1ab, ген, кодирующий белок S, и/или ген, кодирующий белок N. В некоторых вариантах осуществления описанные праймеры и зонды используют в формате мультиплексного теста, нацеленного по меньшей мере на три локуса в геноме SARS-CoV-2, а именно: ген, кодирующий ORF1ab, ген, кодирующий белок S, и ген, кодирующий белок N. Один объем реакционной смеси кПЦР включает в себя несколько тестов для каждого из этих целевых генов, чтобы обеспечить избыточность и специфическую идентификацию целевого вируса.

[104] Например, мультиплексный тест по настоящему изобретению включает в себя 4-плексный тест, в котором каждый из трех из четырех каналов красителя предназначен для идентификации другой кодирующей области SARS-CoV-2, в частности, участков кодирующих областей, связанных с белком N, белком S или ORF1ab, которые обеспечивают специфическую и избирательную идентификацию SARS-CoV-2. Четвертый канал красителя можно использовать для идентификации положительного контроля (например, экзогенно добавленного контроля, такого как MS2, или эндогенно присутствующего контроля, такого как РНКаза Р). То есть мультиплексные тесты по настоящему изобретению могут включать в себя зонды, обладающие специфичностью последовательности к кодирующим областям белка N, белка S или ORF1ab, связанным с обнаруживаемой меткой и/или гасителем, как доказано в настоящем документе. В качестве неспецифического примера, мультиплексный тест может включать в себя первый зонд, нацеленный на последовательность, кодирующую специфичный для SARS-CoV-2 белок N, и имеющий связанный с ней краситель VIC. Второй зонд мультиплексного теста может быть нацелен на последовательность, кодирующую специфичный для SARS-CoV-2 белок S, и иметь связанный с ней краситель ABY. Третий зонд мультиплексного теста может быть нацелен на последовательность, кодирующую специфичное для SARS-CoV-2 ORF1ab, и иметь связанный с ней краситель FAM. Четвертый зонд мультиплексного теста может быть специфичным для последовательности положительного контроля и иметь связанный с ней краситель JUN. Специалисту в данной области будет понятно, что вышеуказанные красители могут быть взаимозаменяемы или заменены на другую обнаруживаемую метку, известную в данной области.

[105] В некоторых вариантах осуществления 4-плексный тест включает в себя по меньшей мере два специфичных для SARS-CoV-2 зонда, совместно использующих один и тот же канал красителя. Второй и третий каналы красителя 4-плексного теста могут быть связаны со специфичными для гриппа А и гриппа В зондами, соответственно, а четвертый канал красителя может быть связан со специфичными для RSV А и/или RSV В зондами или зондом положительного контроля. Альтернативно, второй канал красителя может совместно использоваться специфичными для гриппа А и гриппа В зондами, третий канал может быть связан со специфичными для RSV А и/или RSV В зондами, а четвертый канал красителя может быть связан с зондом положительного контроля. Альтернативно, третий канал красителя может быть связан со специфичным для гриппа А зондом, а четвертый канал может быть связан со специфичным для гриппа В зондом.

[106] В некоторых вариантах осуществления 4-плексный тест включает в себя по меньшей мере два специфичных для SARS-CoV-2 зонда, совместно использующих один и тот же канал красителя. Второй и третий каналы красителя 4-плексного теста могут быть связаны со специфичными для RSV А и специфичными для RSV В зондами, соответственно, а четвертый канал красителя может быть связан со специфичными для гриппа А и/или гриппа В зондами или зондом положительного контроля. Альтернативно, второй канал красителя может совместно использоваться специфичными для RSV А и RSV В зондами, третий канал может быть связан со специфичными для гриппа А и/или гриппа В зондами, а четвертый канал красителя может быть связан с зондом положительного контроля. Альтернативно, третий канал красителя может быть связан со специфичным для RSV А зондом, а четвертый канал может быть связан со специфичным для RSV В зондом.

[107] Описанные праймеры и зонды могут быть включены в дополнительные и/или альтернативные мультиплексные тесты. Например, 5-плексный тест может включать в себя по меньшей мере два специфичных для SARS-CoV-2 зонда (например, для ампликонов белка N, белка S и/или ORF1ab). Зонды могут быть связаны с разными каналами красителя или могут совместно использовать один и тот же канал красителя. В некоторых вариантах осуществления не различается обнаружение между геномными последовательностями белка N и белка S CoV-2. В некоторых вариантах осуществления различается обнаружение геномной последовательности белка N и геномной последовательности белка S CoV-2. Дополнительные, второй, третий и/или четвертый каналы красителя могут быть связаны, например, со специфичными для гриппа А и/или специфичными для гриппа В зондами, и/или специфичными для RSV А зондами, и/или специфичными для RSV В зондами. В некоторые варианты осуществления дополнительно может быть включен зонд положительного контроля. В качестве конкретного неограничивающего примера, области в генах, кодирующих белок N, белок S и/или ORF1ab SARS-CoV-2, могут быть обнаружены с использованием одного канала красителя (например, VIC), в то время как комбинированные тесты для гриппа типа А и/или В, и/или для RSV типа А и/или В одновременно обнаруживаются в одной и той же реакции с использованием одного или более различных каналов красителя (например, FAM, ABY и/или JUN). В одном варианте осуществления по меньшей мере два обнаруживаемых праймера и/или зонда, специфичных для SARS-CoV-2, могут быть связаны с одним каналом красителя, например, путем мечения красителем VIC и, необязательно, праймер и/или зонд, специфичные для гриппа А, могут быть связаны со вторым каналом красителя, например, путем мечения красителем ABY, и/или обнаруживаемые праймер и/или зонд, специфичные для гриппа В, могут быть связаны с третьим каналом красителя, например, путем мечения красителем FAM. В другом варианте осуществления тесты для SARS-CoV-2 и/или гриппа типа А и/или типа В можно дополнительно объединять с обнаруживаемыми праймерами и/или зондами RSV А и RSV В для включения обнаружения посредством еще одного канала красителя, например, посредством соответствующей связи с красителем JUN. Необязательно, пятый канал может быть зарезервирован для праймеров положительного контроля MS2 или РНКазы P и/или зондов, связанных с красителем ALEXA (AF).

Композиции, наборы и способы обнаружения множественных патогенов дыхательных путей

[108] Композиции, наборы и способы обнаружения SARS-CoV-2, описанные выше и в других местах в настоящем документе, могут стать основой теста для обнаружения множественных патогенов дыхательных путей. Например, тесты кПЦР, описанные выше (будь то одноплексные или мультиплексные), могут быть включены в качестве компонента панели тестов кПЦР или в качестве мультиплексного теста для обнаружения множества патогенов в образце испытуемого.

[109] В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя один или более тестов для обнаружения SARS-CoV-2 в дополнение к одному или более тестам для обнаружения вирусов гриппа А и/или гриппа В. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя один или более тестов на SARS-CoV-2 в дополнение к одному или более тестам на RSV А и/или RSV В. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя один или более тестов на SARS-CoV-2 в дополнение к одному или более тестам на вирусы гриппа А и/или гриппа В и одному или более тестам на RSV А и/или RSV В. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя по меньшей мере два теста на SARS-CoV-2 в дополнение по меньшей к двум тестам на вирусы гриппа А и/или гриппа В и по меньшей мере к двум тестам на RSV А и/или RSV В.

[110] Следует понимать, что панель тестов кПЦР может быть выполнена в одноплексном формате, что позволяет совместно использовать зонды для каждой мишени кПЦР для различных тестов. Альтернативно, тесты кПЦР можно выполнять в мультиплексном формате, причем каждый компонент панели связан с другим зондом, спектры испускания которого существенно не перекрываются (т.е. спектры испускания каждого зонда однозначно отличимы от спектров других зондов).

[111] В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя один или более тестов на SARS-CoV-2 в дополнение к одному или более тестам на последовательность контроля. В некоторых вариантах осуществления последовательность контроля представляет собой последовательность РНКазы P и/или последовательность фага MS2. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя один или более тестов, включающих любой из прямых праймеров, обратных праймеров и последовательностей зондов, перечисленных в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533. Следует понимать, что способы кПЦР и ОТ-кПЦР известны специалистам в данной области. Тем по меньшей мере, конкретные варианты осуществления предоставлены в примерах, иллюстрирующих использование тестов кПЦР для обнаружения мишеней SARS-CoV-2, гриппа А и/или гриппа В, и/или RSV А, и/или RSV В.

[112] В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя четыре или более тестов, включающих любые из прямых праймеров, обратных праймеров и последовательностей зондов, перечисленных в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя шесть или более тестов, включающих любую из последовательностей прямых праймеров, обратных праймеров и зондов, перечисленных в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533. Каждый тест КПЦР может включать в себя прямой праймер и обратный праймер. Необязательно, тест дополнительно включает в себя зонд, который может представлять собой гидролизный зонд. В некоторых вариантах осуществления каждый тест кПЦР включает в себя по меньшей мере один прямой праймер, по меньшей мере один обратный праймер и по меньшей мере один зонд, выбранный из любого из перечисленных в SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:267 - SEQ ID NO:510 и SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO:2533 соответственно.

[113] В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя по меньшей мере один тест кПЦР для обнаружения SARS-CoV-2 плюс по меньшей мере один тест кПЦР для обнаружения по меньшей мере одного теста на респираторный микроорганизм, приведенный ниже в таблице 3А. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР включает в себя по меньшей мере один тест кПЦР для обнаружения SARS-CoV-2 плюс по меньшей мере один тест кПЦР для обнаружения каждого из микроорганизмов, перечисленных в таблице 3А. В некоторых вариантах осуществления тест обнаруживает две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.) мишеней из таблицы 3А. В некоторых вариантах осуществления тест обнаруживает по меньшей мере две мишени в геноме SARS-CoV-2, а также внутренний положительный контроль (см., например, таблицу 3В), такой как РНКаза P человека. В некоторых вариантах осуществления тест одновременно обнаруживает каждую мишень, приведенную в таблице 3А, в дополнение к одному или более положительным контролям, таким как РНКаза P и/или 18S рРНК, и/или экзогенному контролю, такому как бактериофаг MS2 (см., например, таблицу 3А). В некоторых вариантах осуществления панель тестов отформатирована в виде карты с открытой матрицей. В других вариантах осуществления панель тестов отформатирована в виде планшета с открытой матрицей. В некоторых вариантах осуществления панель тестов используют в совокупности одноплексных тестов. В некоторых других вариантах осуществления панель тестов используют в одном или более мультиплексных тестах. В некоторых вариантах осуществления панель тестов включает в себя объединенные тесты. В некоторых вариантах осуществления панель тестов включает в себя высушенные и/или лиофилизированные тесты.

[114] В некоторых вариантах осуществления можно использовать панель различных тестов кПЦР для тестирования нескольких штаммов или типов патогенов в дополнение к SARS-CoV-2, включая, помимо прочего, другие вирусные патогены, такие как грипп А и/или грипп В и RSV типа А и/или типа В, бактериальные патогены и/или грибковые патогены. В некоторых вариантах осуществления панель тестов кПЦР можно использовать одновременно для тестирования одного образца испытуемого или объединенного образца, включающего несколько образцов испытуемого, причем каждый тест выполняют параллельно в формате матрицы. Необязательно, различные тесты кПЦР, специфичные для каждой из целевых нуклеиновых кислот, могут быть высеяны в отдельные лунки одноматричного или многолуночного планшета, аналогично, например, карте с матрицей TaqMan (например, имеющиеся в продаже от Thermo Fisher Scientific под №№ по каталогу 4346800 и 4342265) или многолуночного реакционного планшета MicroAmp (например, имеющегося в продаже от Thermo Fisher Scientific под №№ по каталогу 4346906, 4366932, 4306737, 4326659 и N8010560). Необязательно, разные тесты кПЦР, присутствующие в разных лунках матрицы или планшета, могут быть высушены или лиофилизированы in situ, и матрица или планшет могут быть сохранены или отправлены до использования. В некоторых вариантах осуществления тесты в формате матрицы можно выполнять как одноплексный или как мультиплексный тест.

[115] Типовая карта с матрицей, описанная в настоящем документе, может включать в себя некоторые или все тесты, присутствующие в комплексной карте микробиоты дыхательных путей с матрицей TaqMan (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А41238), в частности те, которые направлены на идентификацию вирусных, бактериальных или грибковых микробов из образце, вместе с одним или более тестами для обнаружения SARS-CoV-2, как описано в настоящем документе, присутствует по меньшей мере в одной лунке матрицы. Тесты для обнаружения SARS-CoV-2 могут включать в себя по меньшей мере один праймер или зонд, выбранный из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:2533.

[116] В некоторых вариантах осуществления панель включает в себя тесты других распространенных штаммов коронавируса, включая, помимо прочего, коронавирусы 229Е, KHU1, NL63 и ОС43. Карта панели/матрицы может включать в себя любое количество отдельных тестов, а в некоторых вариантах осуществления карта панели/матрицы включает в себя 48 отдельных тестов, по меньшей мере один из которых представляет собой тест контроля (например, РНКаза Р, 18S рРНК или т.п.). В некоторых вариантах осуществления описанные способы включают в себя использование панели для определения профиля респираторных микроорганизмов, присутствующих в образце, взятом в организме (например, человека), и определения профиля респираторной микробиоты, присутствующей в образце организма. Необязательно, описанные способы могут включать в себя диагностику инфекции, присутствующей в организме (например, человека), из которого взят образец.

[117] Следует понимать, что в любом из предшествующих вариантов осуществления композиции, наборы и способы для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты могут быть реализованы или включены в систему «пункта оказания услуг» (POS). Дополнительно или альтернативно, образцы могут быть отобраны и/или проанализированы в месте «пункта оказания медицинской помощи» (РОС). В некоторых вариантах осуществления анализ в месте РОС, как правило, не требует специализированного оборудования и дает быстрые и легко считываемые визуальные результаты. В некоторых вариантах осуществления анализ может быть выполнен в полевых условиях, в домашних условиях и/или неспециалистом, не имеющим специальных навыков. В некоторых вариантах осуществления, например, анализ клинического образца небольшого объема может быть выполнен с использованием системы POS за короткий период времени (например, за считанные часы или минуты).

[118] Необязательно, «пункт оказания услуг» (POS) или «система пункта оказания услуг» реализуют по месту с использованием системы в этом месте расположения, которая способна предоставлять услугу (например, тестирование, мониторинг, лечение, диагностику, консультацию, забор образцов, проверку личности (подтверждение личности) и другие услуги) на месте или рядом с местом или местом расположения испытуемого. Услуга может представлять собой медицинскую услугу или может представлять собой немедицинскую услугу. В некоторых ситуациях система POS предоставляет услугу в заданном месте расположения, например в доме испытуемого, в школе или на работе, или в продуктовом магазине, аптеке, общественном центре, поликлинике, кабинете врача, больнице, установленной на улице медицинской палатке, временном госпитале, на пограничном контрольно-пропускном пункте и т.д. Система POS может включать в себя одно или более устройств пункта оказания услуг, таких как портативный детектор вирусов/патогенов. В некоторых вариантах осуществления система POS представляет собой систему пункта оказания медицинской помощи. В некоторых вариантах осуществления система POS является приемлемой для использования неспециализированными работниками или персоналом, например медсестрами, полицейскими, гражданскими добровольцами или самим испытуемым.

[119] В определенных вариантах осуществления тесты, описанные в настоящем документе, можно выполнять в «пункте оказания медицинской помощи» (РОС), например, в месте расположения, где предоставляется медицинская помощь (например, лечение, тестирование, мониторинг, диагностика, консультирование и т.д.). РОС может находиться, например, в доме испытуемого, на работе или в школе, или в продуктовом магазине, общественном центре, аптеке, кабинете врача, клинике, больнице, установленной на улице медицинской палатке, временном госпитале, на пограничной контрольно-пропускном пункте и т.д. Система РОС представляет собой систему, которая может помочь или может быть использована при оказании такой медицинской помощи, и может быть расположена в месте или рядом с местом или местоположением испытуемого или поставщика медицинских услуг испытуемого (например, в доме испытуемого, на работе или в школе, или в продуктовом магазине, общественном центре, аптеке, кабинете врача, поликлинике, больнице и т.д.).

[120] В вариантах осуществления такая система представляет собой систему пункта оказания услуг (система POS), при этом система POS расположена в месте расположения пункта оказания услуг. В вариантах осуществления система POS находится в месте расположения пункта оказания услуг и выполнена с возможностью приема клинического образца, полученного от испытуемого в месте расположения POS. В вариантах осуществления система POS находится в месте расположения пункта оказания услуг и выполнена с возможностью приема клинического образца, полученного от испытуемого в месте расположения POS, и дополнительно выполнена с возможностью анализа клинического образца в месте расположения POS. В вариантах осуществления клинический образец представляет собой клинический образец небольшого объема. В вариантах осуществления клинический образец анализируют за короткий период времени. В вариантах осуществления короткий период времени определяют относительно времени начала анализа образца. В вариантах осуществления короткий период времени определяют относительно времени, в которое образец был введен в устройство для анализа образца. В вариантах осуществления короткий период времени определяют относительно времени, когда образец был получен от испытуемого.

[121] В некоторых вариантах осуществления POS может включать в себя раскрытые в настоящем документе способы, композиции и наборы, основанные на амплификации, включая любой из описанных тестов и/или панелей тестов. Предполагается, что такие тесты можно использовать как с рабочими процессами и протоколами термоциклической амплификации, например в ПЦР, так и с рабочими процессами и протоколами изотермической амплификации, например в LAMP.

[122] В некоторых вариантах осуществления POS или РОС включает в себя самостоятельный забор биологического образца, такой как мазок из носа или образец слюны. В некоторых вариантах осуществления самостоятельный забор образца может включать в себя использование набора и/или устройства для самостоятельного забора образца, такого как мазок или пробирка. В некоторых вариантах осуществления набор для самостоятельного забора образца включает инструкции по использованию, включая инструкции по забору образца, инструкции по подготовке или хранению и/или инструкции по транспортировке. Например, набор и/или устройство для самостоятельного забора образца может использоваться индивидуумом, таким как неспециалист, не обладающий специальными навыками или медицинским опытом. В некоторых вариантах осуществления самостоятельный забор образца может осуществляться самим испытуемым или любым другим лицом, находящимся в непосредственной близости от испытуемого, таким как, помимо прочего, родитель, опекун, учитель, друг или другой член семьи.

[123] Реализации POS/POC могут выгодно обеспечить удобный способ мониторинга и/или обнаружения индивидуумов, которые могут быть инфицированы любым из вирусов, искомых посредством описанных наборов и способов. Это включает, например, скрининг бессимптомных индивидуумов (например, тех лиц, которые инфицированы SARS-CoV-2 и которые могут выделять инфекционные вирионы до появления характерных симптомов, связанных с инфекциями дыхательных путей (например, лихорадка, кашель, недомогание). После обнаружения инфицированные индивидуумы могут быть помещены в карантин для предотвращения дальнейшего распространения инфекции. Дополнительно или альтернативно, индивидууму может быть оказана соответствующая медицинская помощь, которая в некоторых вариантах осуществления может быть оказана непосредственно в учреждении РОС и/или после уведомления медицинского работника пункта системы POS/POC.

[124] Описанные наборы и способы для обнаружения вирусных последовательностей выгодно предоставляют компаниям и/или учреждениям, которые отделены от больниц и/или традиционных клинико-лабораторных служб, возможность быстрого скрининга образцов на месте и принятия мер, когда это необходимо, и только для тех индивидуумов, в отношении которых следует принять меры. Например, зрители спортивного мероприятия могут прибыть в соответствующее место до начала мероприятия, где их можно будет проверить на наличие SARS-CoV-2 (в дополнение к любому другому описанному вирусу). Затем те зрители, у которых результат теста отрицательный, могут зайти в место проведения мероприятия, и им может не потребоваться соблюдать социальное дистанцирование или носить средства индивидуальной защиты, такие как маски для лица. С другой стороны, зрителям с положительным результатом теста может быть отказано во входе и они будут направлены к медицинскому работнику, что таким образом ограничивает воздействие и/или распространение SARS-CoV-2 (или другого вируса, обнаруживаемого с помощью описанных в настоящем документе наборов и способов) в месте проведения мероприятия.

[125] Поскольку описанные наборы и способы обеспечивают проведение скрининга индивидуумов в местах расположения, удаленных от больниц и/или традиционных клинико-лабораторных служб, описанные наборы и/или способы можно дополнительно использовать для более эффективного и более быстрого сбора точных эпидемиологических данных у населения. Такие данные можно использовать для идентификации очагов в сообществе и/или типах поведения или когортах, которые увековечивают распространение таких вирусных патогенов, что может обеспечить целенаправленные или более эффективные решения.

[126] При проведении скрининга, как обсуждалось выше, образцы от индивидуумов, которые сообщают, что здоровы (т.е. у которых отсутствуют характерные симптомы SARS-CoV-2 или другой инфекции дыхательных путей), могут быть объединены в один объединенный образец. Поскольку ожидается, что большинство образцов дадут отрицательный результат, такие способы могут выгодно обеспечить быстрый и эффективный скрининг больших групп населения, хотя может потребоваться повторное тестирование меньших групп населения, чтобы определить, какой образец (образцы) в данном объединенном образце привел к тому, что объединенный образец дал положительный результат в отношении наличия целевой нуклеиновой кислоты (например, SARS-CoV-2). Для обработки каждого образца по отдельности потребуется меньше ресурсов и/или приборов для теста, и/или такое же количество ресурсов и/или приборов для теста может быть использовано для скрининга большего количества образцов.

[127] То есть в некоторых вариантах осуществления образец получают от множества организмов (например, совокупности испытуемых или пациентов), и множество образцов объединяют вместе для получения единого объединенного образца для тестирования. Образец может быть получен по меньшей мере от двух разных организмов или индивидуумов для объединения вместе для образования единого объединенного образца для тестирования. В некоторых вариантах осуществления образец может быть получен от 2-10 разных организмов или индивидуумов и объединен вместе для образования единого образца для тестирования. В некоторых вариантах осуществления образец может быть получен от 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 разных организмов или индивидуумов для объединения вместе для образования единого образца для тестирования. В некоторых вариантах осуществления образец может быть получен от 5 разных организмов или индивидуумов включительно для объединения вместе для образования единого образца для тестирования. Например, образец, используемый для тестирования в соответствии с описанными в настоящем документе способами и композициями, может включать множество образцов, полученных от разных организмов или индивидуумов (например, 2, 3, 4, 5 разных индивидуумов), которые объединены вместе для образования одного образца, используемого для последующего обнаружения патогена, такого как SARS-CoV-2.

[128] Независимо от того, объединяются ли образцы или оцениваются по отдельности, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что смешивание объемов реакционной смеси ОТ-кПЦР может играть решающую роль в предотвращении оптического смешивания и/или ложной классификации образцов. Соответственно, стадия смешивания (например, встряхивания) объема реакционной смеси перед ОТ-кПЦР включена в предпочтительные способы обнаружения вирусных последовательностей, описанные в настоящем документе. Это может включать в себя, например, встряхивание объема реакционной смеси (например, в одной пробирке, матрице и/или на основе планшета). В некоторых вариантах осуществления объем реакционной смеси встряхивают в течение по меньшей мере 5 секунд, предпочтительно по меньшей мере 10 секунд. В некоторых вариантах осуществления объем реакционной смеси встряхивают в течение около одной минуты или дольше, предпочтительно менее около одной минуты, или более предпочтительно менее около 30 секунд. В некоторых вариантах осуществления объем реакционной смеси встряхивают в течение периода времени от 5 секунд до около одной минуты, предпочтительно от 10 до 30 секунд.

Сокращенный перечень определенных терминов

[129] Чтобы помочь в понимании объема и содержания вышеприведенного и предстоящего письменного описания и прилагаемой формулы изобретения, несколько выбранных терминов определены непосредственно ниже.

[130] Вирус SARS-CoV-2, также известный как 2019-nCoV, связан с респираторным заболеванием человека COVID-19. Вирус, выделенный из ранних случаев COVID-19, был предварительно назван 2019-nCoV, а исследовательская группа по коронавирусу при Международном комитете по таксономии вирусов впоследствии обозначила 2019-nCoV как SARS-CoV-2. Для целей настоящего изобретения термины «SARS-CoV-2» и «2019-nCoV» считаются относящимися к одному и тому же вирусу и могут использоваться взаимозаменяемо для обозначения этиологического агента COVID-19. Используемые в настоящем документе термины также включают в себя отдельные варианты SARS-CoV-2, включая вариант В. 1.1.7, вариант 501Y.V2 и другие варианты, которые могут появиться в будущем.

[131] Используемый в настоящем документе термин «набор» относится к любой системе доставки для доставки материалов. В контексте реакционных тестов такие системы доставки включают в себя системы, которые обеспечивают хранение, транспортировку или доставку из одного места в другое реакционных реагентов (например, олигонуклеотидов, ферментов, набора(-ов) праймеров и т.п. в соответствующих контейнерах) и/или вспомогательных материалов (например, буферов, письменных инструкций по проведению теста и т.п.) Например, наборы могут включать в себя один или более корпусов (например, коробок), содержащих соответствующие реакционные реагенты и/или вспомогательные материалы. Используемый в настоящем документе термин «фрагментированный набор» относится к системе доставки, включающей два или более отдельных контейнеров, каждый из которых содержит подчасть всех компонентов набора. Контейнеры могут быть доставлены предполагаемому получателю вместе или по отдельности. Например, первый контейнер может содержать фермент для использования в тесте, а второй контейнер содержит олигонуклеоиды. Действительно, любая система доставки, включающая два или более отдельных контейнеров, каждый из которых содержит подчасть всех компонентов набора, включена в термин «фрагментированный набор». Напротив, «комбинированный набор» относится к системе доставки, содержащей все компоненты реакционного теста в одном контейнере (например, в одной коробке, содержащей каждый из требуемых компонентов). Термин «набор» включает в себя как фрагментированные, так и комбинированные наборы.

[132] Компоненты, описанные в настоящем документе, могут быть объединены друг с другом и обеспечены в виде такого комбинированного набора или фрагментированного набора, или, альтернативно, каждый компонент может быть обеспечен отдельно и использован пользователем по необходимости. Например, лечебный раствор, описанный в настоящем документе, может быть включен в набор или может быть обеспечен как «отдельный» элемент (в соответствующем контейнере) для использования пользователем по необходимости.

[133] Используемый в настоящем документе термин «пациент» по существу относится к любому животному, например млекопитающему, находящемуся под присмотром, наблюдением или лечением поставщика медицинских услуг, с особой ссылкой на людей, находящихся под наблюдением лечащего врача, специалиста по инфекционным заболеваниям или другого соответствующего медицинского работника, который может поставить диагноз или лечить вирусные инфекции. Для целей настоящей заявки термин «пациент» может быть взаимозаменяемым с «индивидуумом» или «испытуемым». Соответственно, в некоторых вариантах осуществления испытуемый представляет собой пациента-человека. Однако следует понимать, что «испытуемый» не обязательно должен представлять собой «пациента», как этот термин описан в настоящем документе. Например, испытуемый может представлять собой бессимптомного носителя или неинфицированное лицо (или животное), проходящее скрининг на наличие одного или более вирусов. «Испытуемый» также может представлять собой животное, не являющееся человеком, например норку.

[134] Используемые в настоящем документе термины «ПЦР в режиме реального времени» или «количественная ПЦР в режиме реального времени» или «кПЦР» относятся к измеримой амплификации нуклеиновых кислот с помощью ПЦР в режиме реального времени, как правило, путем мониторинга флуоресцентных зондов в объеме реакционной смеси и обеспечения необязательного количественного определения продукта ПЦР. Термины «в режиме реального времени» и «непрерывный в режиме реального времени» взаимозаменяемы и относятся к способу, при котором сбор данных происходит посредством периодического мониторинга в ходе реакции амплификации. Таким образом, способы в режиме реального времени объединяют амплификацию и обнаружение в одну стадию. Следует понимать, что сбор данных может происходить посредством периодического мониторинга в ходе ПЦР, тогда как анализ таких данных может происходить позднее.

[135] Термины «ПЦР с обратной транскрипцией» или просто «ОТ-ПЦР» предназначены для включения тех способов ПЦР, которые сначала транскрибируют матрицу РНК (такую как геномная матрица вирусной РНК) в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы, по существу называемой обратной транскриптазой. Затем кДНК используется любой из ДНК-зависимых ДНК-полимераз, обычно используемых в способах ПЦР, в качестве матрицы для амплификации ПЦР последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Для простоты использования в описании термины «ОТ-ПЦР» и «ОТ-кПЦР» могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку специалистам в данной области понятно, что способы и реагенты для мониторинга производства ампликона в конечной точке, как это происходит в традиционных способах ПЦР, можно регулировать таким образом, что можно контролировать производство ампликона во время термических циклов ПЦР и/или между ними, как это происходит в традиционных способах кПЦР.

[136] Кроме того, следует понимать, что, когда в настоящем документе используется термин «кПЦР», он не обязательно исключает способы и/или наборы, которые включают в себя начальную стадию обратной транскрипции. Таким образом, следует понимать, что любое указание в описании способа, набора, матрицы и/или теста для проведения кПЦР включает в себя тот же или аналогичный способ, набор, матрицу и/или тест, имеющие начальную стадию обратной транскрипции с любыми сопутствующими реагентами (например, обратной транскриптазой, буферами, dNTP, солями и т.д.).

[137] Если не указано иное, все использованные в настоящем документе технические и научные термины имеют такой же смысл, как в обычном толковании их специалистом средней квалификации в области, к которой относится настоящее изобретение.

[138] Различные аспекты настоящего изобретения, включая устройства, системы и способы, могут быть проиллюстрированы со ссылкой на один или более вариантов осуществления или реализации, которые являются типовыми по характеру. Используемый в настоящем документе термин «типовой» означает «служащий в качестве примера, экземпляра или иллюстрации» и не обязательно должен быть истолкован как предпочтительный или преимущественный вариант по сравнению с другими описанными в настоящем документе вариантами осуществления. Кроме того, ссылка на «реализацию» по настоящему описанию или изобретению включает в себя конкретную ссылку на один или более вариантов его осуществления и наоборот, и предназначена для предоставления иллюстративных примеров без ограничения объема изобретения, как указано в прилагаемой формуле изобретения, а не в последующем описании.

[139] При использовании в настоящей заявке термины «имеет возможность» и «может» используются в разрешающем смысле (т.е. подразумевая, что имеется потенциал), а не обязательном смысле (т.е. подразумевая долженствование). Кроме того, термины «включая в себя», «имеющий», «включающий в себя», «содержащий», «характеризующийся», а также их варианты (например, «включает в себя», «имеет» и «предполагает», «содержит» и т.д.), и аналогичные термины, используемые в настоящем документе, включая формулу изобретения, должны быть инклюзивными и/или неограниченными, должны иметь то же значение, что и слово «включающий» и его варианты (например, «включают» и «включает»), и не исключают дополнительные, не перечисленные элементы или стадии способа для иллюстрации.

[140] Следует заметить, что используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя формы множественного числа, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на объект в единственном числе (например, «предмет») включает в себя один, два или более объектов. Аналогично, ссылку на множество объектов следует истолковывать как включающую один объект и/или совокупность объектов, если содержание и/или контекст явно не предписывает иное. Например, ссылка на объекты в форме множественного числа (например, «предметы») не обязательно требует совокупности таких объектов. Вместо этого следует понимать, что независимо от предполагаемого количества объектов в настоящем документе рассматриваются один или более объектов, если не указано иное.

[141] Для облегчения понимания одинаковые ссылочные позиции (т.е. одинаковая нумерация компонентов и/или элементов) использовали, где это возможно, для обозначения одинаковых элементов, общих для фигур. В частности, в типовых вариантах осуществления, проиллюстрированных на фигурах, одинаковые конструкции или конструкции с одинаковыми функциями будут снабжены, где это возможно, аналогичными ссылочными обозначениями. Для описания типовых вариантов осуществления в настоящем документе будут использоваться специальные формулировки. Тем не менее, следует понимать, что при этом не предполагается ограничение объема настоящего изобретения. Скорее, следует понимать, что формулировки, используемые для описания типовых вариантов осуществления, являются только иллюстративным и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения (если только такие формулировки явно не описаны в настоящем документе как существенные).

[142] Любые используемые в настоящем документе заголовки предназначены только для организационных целей и не предназначены для ограничения объема данного описания или формулы изобретения.

[143] Различные аспекты настоящего изобретения могут быть проиллюстрированы описанием компонентов, которые связаны, соединены прикреплены, присоединены и/или состыкованы вместе. Используемые в настоящем документе термины «связанный», «соединенный» «прикрепленный», «присоединенный» и/или «состыкованный» используются для обозначения либо прямой связи между двумя компонентами либо, где это уместно, непрямой связи друг с другом через «посреднические» или промежуточные компоненты. И напротив, когда компонент упоминается как «связанный напрямую», «соединенный напрямую», «прикрепленный напрямую», «присоединенный напрямую» и/или «состыкованный напрямую» с другим компонентом, «промежуточные» элементы отсутствуют или не предполагаются. Кроме того, связывание, соединение, прикрепление, присоединение и/или состыкование может включать механическую и/или химическую связь.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Одноплексный текст для обнаружения SARS-CoV-2

[144] Был выполнен типовой протокол для обнаружения SARS-CoV-2 в биологическом образце посредством однопрексного теста, поскольку В тесте использовали праймеры и меченые FAM зонды для обнаружения ORF1ab, а также дополнительные праймеры и процесс для обнаружения белка S и кодирующих последовательностей белка N для SARS-CoV-2, выбранных из праймеров и зондов, описанных в настоящем документе. В тесте также использованы компоненты общего назначения (например, мастер-микс и другие неолигонуклеотидные компоненты) из набора для теста 2019-nCoV TaqMan (Thermo Fisher Scientific, № по каталогу A47532). Также был включен необязательный меченый VIC внутренний контроль, направленный на РНКазу Р. В отдельный набор были включены такие же праймеры/зонды, которые использовали в качестве положительных контролей для обнаружения целевых последовательностей из структуры синтетической ДНК, кодирующей целевые последовательности для ORF1ab, белка S, белка N и РНКазы Р.

[145] Общее содержание нуклеиновой кислоты выделяли из образцов, отобранных посредством мазка из носоглотки, аспирата из носоглотки или бронхоальвеолярного лаважа с использованием набора для выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот MagMAX (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А42356) в соответствии с приложенными к нему инструкциями.

[146] Для каждого теста компоненты, приведенные в таблице 4, были объединены для количества реакций плюс 10% избытка:

[147] Реакционные смеси встряхивали в течение около 10-30 секунд и недолго центрифугировали. В случае каждой реакции компоненты, указанные ниже в таблице 5, объединяли в 96-луночном оптическом реакционном планшете MicroAmp (0,2 мл/лунку):

[148] Планшет герметизировали с помощью оптической клейкой пленки MicroAmp и недолго встряхивали для смешивания содержимого. Планшет недолго центрифугировали для сбора содержимого на дне лунок. Планшет загружали в прибор для ПЦР в режиме реального времени 7500 и выполняли протокол, приведенный в таблице 6 или таблице 7, в зависимости от соответствующего мастер-микса ОТ-кПЦР, использованного для создания реакционной смеси.

[149] Полученные данные были проанализированы с использованием включенного программного обеспечения 7500 v2.3, поскольку данная программа имеет обновленные алгоритмы с улучшенной чувствительностью для обнаружения образцов с низким количеством копий. Анализ был выполнен с использованием настроек анализа Auto Baseline и Auto Threshold вышеупомянутого программного обеспечения. Для каждого планшета было подтверждено, что реакции контроля протекают так, как ожидалось (т.е. контроль без матрицы имел неопределенное значение C_t, и положительный контроль имел значение C_t меньше или равное 30).

[150] Значение C_t для каждого отдельного теста также анализировали в соответствии с таблицей 8.

[151] Результаты для каждого протестированного образца интерпретировали на наличие РНК SARS-CoV-2, если либо (i) любые два из трех тестов 2019-nCoV были положительными, либо (ii) любые из трех тестов 2019-nCoV были положительными в двух разных образцах, взятых у того же испытуемого. РНК SARS-CoV-2 не присутствовала в образце, если все три из тестов 2019-nCoV были отрицательными.

[152] Типовые результаты, иллюстрирующие графики амплификации и связанные с ними стандартные кривые для ORF1ab, представлены на Фиг. 2А и Фиг. 2В, соответственно. Аналогично, график амплификации и связанная с ним стандартная кривая для белка S представлены на Фиг. 2С и Фиг. 2D, соответственно, а график амплификации и связанная с ним стандартная кривая для белка N представлены на Фиг. 2Е и Фиг. 2F, соответственно.

Пример 2. Мультиплексный тест для обнаружения SARS-CoV-2

[153] Был выполнен типовой протокол для обнаружения SARS-CoV-2 в биологическом образце посредством мультиплексного теста. Набор для теста включал в себя праймеры и меченные FAM зонды для обнаружения ORF1ab (SEQ ID NO: 160, 468 и 1049, соответственно), праймеры и меченые ABY зонды для обнаружения белка S (SEQ ID NO: 100, 337 и 864, соответственно), и праймеры и меченые VIC зонды для обнаружения белка N (SEQ ID NO: 211, 501 и 833, соответственно), кодирующего последовательности для SARS-CoV-2. Также был включен меченый JUN внутренний положительный контроль, направленный либо на эндогенную РНКазу Р, либо на экзогенную РНК-матрицу MS2. В отдельный набор были включены такие же праймеры/зонды, которые использовали в качестве положительных контролей для обнаружения целевых последовательностей из структуры синтетической ДНК, кодирующей целевые последовательности для ORF1ab, белка S, белка N и РНК P/MS2 РНКазы. Остальные реагенты для амплификации были получены из комбинированного набора COVID-19 TaqPath™ (Thermo Fisher Scientific, № по каталогу A47814).

[154] Общее содержание нуклеиновой кислоты выделяли из образцов, отобранных посредством мазка из носоглотки, аспирата из носоглотки или бронхоальвеолярного лаважа с использованием набора для выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот MagMAX (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А42356) в соответствии с приложенными к нему инструкциями.

[155] Для каждого теста компоненты в таблице 9 были объединены для количества реакций плюс 10% избытка:

[156] Реакционные смеси встряхивали в течение около 10-30 секунд и недолго центрифугировали. В случае каждой реакции компоненты, указанные ниже в таблице 10, объединяли в 96-луночном оптическом реакционном планшете MicroAmp (0,2 мл/лунку):

[157] Планшет герметизировали с помощью оптической клейкой пленки MicroAmp и недолго встряхивали для смешивания содержимого. Планшет недолго центрифугировали для сбора содержимого на дне лунок. Реакционные смеси встряхивали в течение около 10-30 секунд) и недолго центрифугировали. Планшет загружали в систему ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 5 и выполняли протокол, приведенный в таблице 11.

[158] Полученные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения для проектирования и анализа v1.5.1 QuantStudio, включенного с системой ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 5, поскольку эта программа имеет обновленные алгоритмы с улучшенной чувствительностью для обнаружения образцов с низким количеством копий. Для каждого планшета было подтверждено, что реакции контроля протекают так, как ожидалось (т.е. контроль без матрицы имел неопределенное значение C_t, и положительный контроль имел значение Ct меньше или равное 30).

[159] Значение C_t для каждого отдельного теста также анализировали в соответствии с таблицей 8.

[160] Результаты для каждого протестированного образца интерпретировали на наличие РНК SARS-CoV-2, если либо (i) любые два из ORF1ab, белка S или белка N были положительными, либо (ii) любой один из ORF1ab, белка S или белка N был положительным в двух разных образцах, взятых у того же испытуемого. РНК SARS-CoV-2 отсутствовала в образце, если все три из ORF1ab, белка S и белка N были отрицательными.

Пример 3. Тестирование надежности тестов для обнаружения SARS-CoV-2

[161] Для обеспечения специфичности, наблюдаемой при выполнении одноплексных и мультиплексных тестов, описанных в примерах 1 и 2, надежность каждого теста была протестирована на основе использованного протокола ОТ-кПЦР, прибора кПЦР и мастер-микса ОТ-кПЦР. Типовые результаты, показанные на Фиг. 3А-3С, иллюстрируют надежные характеристики теста как по стандартному протоколу 7500, так и по протоколу 7500 Fast и показывают, что любой из протоколов можно эффективно использовать для идентификации образцов с РНК SARS-CoV-2.

[162] Также была подтверждена надежность характеристик теста между приборами кПЦР. Как показано на Фиг. 4А-4С, описанные тесты SARS-CoV-2, вероятно, будут эффективны для идентификации РНК SARS-CoV-2 в образце независимо от того, используется ли прибор 7500 или система QuantStudio 5.

[163] Хотя не прогнозировалось, что надежность теста будет варьироваться в зависимости от типа используемого мастер-микса, результаты, показанные на Фиг. 4А-4С, были специфичными для тестов с использованием 1-стадийного мастер-микса Fast Virus TaqMan. Таким образом, также была протестирована надежность теста по отношению к мастер-миксу. Как показано на Фиг. 5А-5С, как 1-стадийный мастер-микс TaqPath, так и 1-стадийный мастер-микс Fast Virus демонстрируют высокую эффективность теста на приборе Quant Studio 5, что делает любой мастер-микс эффективным для идентификации образцов, содержащих РНК SARS-CoV-2.

[164] Краткое изложение этих экспериментов показано ниже в таблице 13, что указывает на то, что описанные тесты достаточно надежны для идентификации образцов, включающих РНК SARS-CoV-2, независимо от используемого мастер-микса кПЦР, протокола кПЦР или прибора для кПЦР.

Пример 4. Тест на специфичность одноплексных и мультиплексных тестов на SARS-CoV-2

[165] Нуклеиновые кислоты 22 вирусов и бактерий (перечисленные ниже) экстрагировали с помощью набора для ультра-выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот MagMAX (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А42356) на KingFisher и использовали для этого теста. Экстрагированные РНК и ДНК были предварительно амплифицированы с помощью 1-стадийного мастер-микса ОТ-кПЦР TaqPath, CG и пула PreAmp, содержащего праймеры как для SARS-CoV-2, так и для MEGAPLEX PREAMP PRIMERS, RTM (имеются в продаже от Thermo Fisher Scientific, № по каталогу А41374). Предварительную амплификацию проводили с использованием протокола термоциклирования, приведенного ниже в таблице 14.

[166] Продукт реакции PreAMP разбавляли в соотношении 1:10 водой (предпочтительно водой, пригодной для OT-PCR), и 5 мкл разбавленной реакционной смеси PreAMP добавляли к объему реакционной смеси 25 мкл для одноплексных и мультиплексных реакций, содержащих ферменты и реагенты для теста ОТ-ПЦР. Состав для одноплексных реакций приведен в таблице 15, а состав для мультиплексных реакций приведен в таблице 16.

[167] 5 мкл разбавленной реакционной смеси PreAmp (т.е. образец) и 11 мкл воды (предпочтительно воды, пригодной для ОТ-ПЦР). Реакции проводили на приборе QS5 в соответствии с рекомендованными протоколами соответствующих мастер-миксов. Для каждого образца проводили три повторения.

[168]

[169] Каждую из реакционных смесей встряхивали в течение около 10-30 секунд и недолго центрифугировали. Предварительно амплифицированные и разбавленные образцы для каждого из 22 вирусов и бактерий использовали для тестирования специфичности. Все микроорганизмы были получены от ZeptoMetrix, за исключением штамма коронавируса HKU1, который представлял собой клинический изолят. Для каждой тестируемой реакционной смеси и геномного образца компоненты, указанные ниже в таблице 17, объединяли в 96-луночном оптическом реакционном планшете MicroAmp (0,2 мл/лунку) в трех экземплярах:

[170] Результаты: ни один из 22 протестированных микроорганизмов не проявляет перекрестной реактивности ни к одноплексным, ни к мультиплексным тестам для обнаружения SARS-CoV-2, как кратко показано ниже в таблице 18. Таким образом, тесты являются специфичными.

Пример 5. Смешивание реакционных планшетов для ОТ-ПЦР

[171] Чтобы обеспечить надлежащий анализ исследовательских образцов SARS-CoV-2, важно надлежащим образом смешать реакционную смесь для ОТ-кПЦР путем встряхивания планшета. Невыполнение этого требования может привести к оптическому смешиванию - явлению, которое может произойти, когда объем образца превышает 20% от объема реакционной смеси для ПЦР. Оптическое смешивание может привести к нестабильности основной линии ОТПЦР, что приведет к сбою QC целых планшетов и возможной неправильной классификации образцов.

[172] Протокол смешивания:

[173] После добавления мастер-микса, теста, воды, образцов и контролей в реакционный планшет для ОТ-ПЦР лунки планшета герметизировали с помощью оптической клейкой пленки MicroAmp. Для обеспечения полной герметизации всех лунок использовали аппликатор клейкой пленки MicroAmp. В оптическом клейком покрытии MicroAmp используют чувствительную к давлению клейкую подложку для приклеивания покрытия к оптическому 96- или 384-луночному планшету. Применение достаточной силы для активации чувствительного к давлению клея предотвратит испарение из лунок.

[174] Скорость вихревого смесителя, такого как Vortex-Genie 2 от Scientific Industries, была установлена на максимальное значение, а режим активации был установлен на «Touch» (касание). Вихревой смеситель также был снабжен платформой, а не трубчатым стаканом.

[175] Планшет был приведен в контакт с вихревым смесителем и удерживался в контакте с ним в течение 10-15 секунд, позволяя вихревой платформе энергично двигаться и приводя к свободному перемещению реакционной смеси в лунках. Слишком сильное или слишком слабое давление на вихревую платформу снижало эффективность перемешивания. Планшет перемещали вокруг во время встряхивания, чтобы обеспечить контакт с платформой во всех четырех квадрантах и в центре планшета в течение равных отрезков времени.

[176] Схема проведения экспериментов:

[177] В первой серии экспериментов были созданы два идентичных 96-луночных планшета. Первый планшет встряхивали в течение 30 секунд на максимальной скорости на Vortex-Genie 2, а другой планшет вообще не смешивали. Каждый планшет содержал три повторения реакций извлеченных искусственных положительных и отрицательных образцов. Искусственные положительные образцы состояли из объединенных носоглоточных образцов с добавлением вирусной РНК SARS-CoV-2 в 9, 3 или 1 раз больше от предела обнаружения (2250 GCE/мл, 750 GCE/мл и 250 GCE/мл соответственно). Образцы экстрагировали либо с помощью набора для выделения вирусных/патогеновых нуклеиновых кислот MagMAX с объемом образца 400 мкл, либо с помощью набора для выделения вирусных/патогеновых нуклеиновых кислот II MagMAX с объемом образца 200 мкл, причем оба рабочих процесса экстрагирования выполняли на том же планшете для ОТ-ПЦР.

[178] Во второй серии экспериментов были созданы два идентичных 384-луночных планшета; один планшет встряхивали в течение 10 секунд на максимальной скорости на Vortex-Genie 2, а другой планшет вообще не смешивали. Каждый планшет содержал 48 повторных реакций экстрагированной вирусной РНК SARS-CoV-2 при 10 GCE/реакцию плюс внутренний контроль MS2. Прогоны ОТ-ПЦР проводили на системе QuantStudio 7 Flex от Applied Biosystems с 384-луночным блоком.

[179] Результаты:

[180] 96-луночные и 384-луночные планшеты, которые не были смешаны, демонстрировали крутые нисходящие наклоны флуоресцентного сигнала во время первых циклов температурного протокола. И напротив, 96-луночные и 384-луночные планшеты, которые были смешаны, выявили, что надлежащее смешивание дает более ровные основные линии для тех же условий. Таким образом, по сравнению с отсутствием смешивания, встряхивание в течение 10-30 секунд дает более ровные основные линии независимо от протокола экстрагирования, типа планшета или типа образца. Поскольку падающие основные линии могут привести к сбою планшета или неточным результатам, вихревое смешивание представляется важным для получения надежных и конкретных результатов.

Пример 6. Мультиплексный тест на SARS-CoV-2, гриппа А/В, RSV

[181] Типовой протокол для обнаружения наличия геномной нуклеиновой кислоты, связанной с SARS-CoV-2, гриппом А/В или RSV, в биологическом образце с помощью мультиплексного теста был выполнен с использованием праймеров и меченого FAM зонда для обнаружения целевых последовательностей в геномах гриппа типов А и В (SEQ ID NO: 252, 253, 257, 505, 506, 1296 и 1297); праймеров и меченого VIC зонда для обнаружения целевых последовательностей SARS-CoV-2 в гене S в SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 100, 337 и 864) и белка N (SEQ ID NO: 211, 510 и 833), праймеров и меченых ABY зондов для обнаружения целевых последовательностей, специфичных для вирусного генома RSV (SEQ ID No: 254, 255, 507, 508, 1298 и 1299), и праймеров и меченых JUN зондов для внутреннего положительного контроля, направленного на экзогенную матрицу РНК MS2 (SEQ ID NO: 206, 509 и 1300). Праймер SEQ ID NO: 510, используемый для этого эксперимента, аналогичен праймеру SEQ ID NO: 501, а также включает в себя дополнительный нуклеотидный остаток «А» на 3'-конце. Было обнаружено, что добавление этого остатка способствует уменьшению артефактов, образующихся во время реакций ПЦР, содержащих определенные дополнительные праймеры и зонды.

[182] В отдельные лунки включали такие же праймеры/зонды и использовали их вместе с синтетической структурой положительного контроля, кодирующей целевые последовательности для идентификации SARS-CoV-2, гриппа (А и В) и RSV.

[183] Общее содержание нуклеиновой кислоты выделяли из образцов, отобранных посредством мазка из носоглотки, аспирата из носоглотки или бронхоальвеолярного лаважа с использованием набора для выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот MagMAX (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А42356) в соответствии с приложенными к нему инструкциями.

[184] Компоненты в одной из таблиц 19А-19С объединяли для получения реакционной смеси ОТ-ПЦР для общего количества реакций плюс 10% избытка:

[185] Реакционные смеси встряхивали в течение около 10-30 секунд) и недолго центрифугировали. Для каждой реакции компоненты, указанные ниже в таблицах 20А-20D, объединяли в 96-луночном оптическом реакционном планшете MicroAmp:

[186] Планшет герметизировали с помощью оптической клейкой пленки MicroAmp и недолго встряхивали для смешивания содержимого. Планшет недолго центрифугировали для сбора содержимого на дне лунок. Планшет загружали в прибор для ПЦР в режиме реального времени 7500 и выполняли протокол, приведенный в таблице 21.

[187] Результаты для каждого тестируемого образца, имеющего амплифицированный продукт в положительном контроле и отсутствие амплифицированного продукта в отрицательном контроле, интерпретировались как имеющие: (i) наличие РНК SARS-CoV-2, если сигнал VIC был положительным, (ii) гриппу А/В, если сигнал FAM был положительным, и/или (iii) RSV, если сигнал ABY был положительным.

Пример 7

[188] 4-плексный тест ОТ-кПЦР был разработан в 1 пробирке для обнаружения нуклеиновых кислот вирусов SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В вместе с контролем процесса. Эта часть SARS-CoV-2 4-плексного теста нацелена на области как белка S, так и белка N, обладающие более высокой специфичностью и имеющие более низкий риск мутации. Праймеры, нацеленные на область белка S, представляли собой SEQ ID NO: 100 и 337, с соответствующим зондом SEQ ID NO: 864. Праймеры, нацеленные на область белка N, представляли собой SEQ ID NO: 211 и 510 с соответствующим зондом SEQ ID NO: 833. Запатентованный конвейер биоинформатики использовали для разработки специфичных тестов для гриппа А и гриппа В с большим охватом. Получаемый охват штаммов для наборов праймеров и зондов составлял 99,9% для SARS-CoV-2 с 35833 полными последовательностями высокого качества. Получаемый охват штаммов для наборов праймеров и зондов для гриппа А и гриппа В представляет собой 6730/6854, или 98,2%, и 3105/3127, или 99,3%, соответственно. Тесты были протестированы с помощью приборов для кПЦР, таких как QS5 и 7500 Fast Dx, с использованием модифицированного протокола ОТ-ПЦР на основе комбинированного набора COVID-19 TaqPath (приложение 2) и с использованием того же мастер-микса, воды и dNTP, обеспеченных в нем.

[189] ДНК, РНК, транскрибируемая in vitro, геномная РНК и контроль вирусных организмов используют на разных стадиях тестирования осуществимости и разработки. ДНК и РНК, транскрибированные in vitro, включают в себя SARS-CoV-2, грипп А и грипп В. Вирусная РНК и контроли вирусных организмов включают в себя SARS-CoV-2, геномную РНК и инактивированный гамма-облучением вирус гриппа A: H1N1 (Брисбен/59/2007) и H3N2 (Перт/16/2009), и гриппа В: линия Victoria (Висконсин/01/2010) и линия Yamagata (Флорида/04/2006).

[190] Протокол термоциклирования ПЦР был выполнен в соответствии с предусмотренным по изобретению предыдущим комбинированным набором TaqPath COVID-19 с двумя модификациями: (1) стадия предварительной инкубации (85°С, 10 мин) была добавлена после ОТ (предварительная инкубация уменьшает аномальные кривые амплификации канала ABY); и (2) количество циклов было увеличено с 40 до 46 (увеличивает ΔRn истинной амплификации выше максимального уровня переходных влияний).

[191] Критерии проведения аналитических подтверждающих исследований:

[192] Предел обнаружения рабочего процесса (LoD) будет установлен как самая низкая концентрация GCE вируса, которая может быть обнаружена в течение ≥95% времени (например, ≥19/20 повторений).

[193] Реактивность/инклюзивность: 100% протестированных штаммов должны быть обнаружены с помощью теста; штаммы, не обнаруженные при 3Х LoD, будут повторно тестироваться при более высоких концентрациях до тех пор, пока не будет достигнута 100% вероятность совпадения; 100% повторов должны быть положительными.

[194] Воздействующее вещество: вещество будет считаться не воздействующим при тестируемой концентрации, если 100% повторений дают ожидаемые результаты для данного воздействующего вещества.

[195] Конкурентное влияние: по меньшей 95% положительных образцов при 4Х LoD или ниже дают положительный результат в наличии конкурентных веществ при 1000Х LoD или выше ΔC_t=средняя комбинация C_t - средняя одиночная мишень Ct≤1,5 цикла

[196] 4-плексные тесты ПЦР в режиме реального времени могут одновременно обнаруживать и дифференцировать вирусные нуклеиновые кислоты SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В. В протестированных примерах праймеры и наборы зондов гриппа А были связаны с каналом FAM, праймеры и наборы зондов белка N и белка S SARS-CoV-2 были связаны с каналом VIC, праймеры и наборы зондов гриппа В были связаны с каналом ABY, и праймеры и наборы зондов MS2 внутреннего контроля были связаны с каналом JUN.

[197] Один штамм SARS-CoV-2, два штамма гриппа А (один H1N1 и один H3N2) и два штамма гриппа В (одна линия Victoria и одна линия Yamagata) были исследованы в отношении LoD рабочего процесса. Экстрагирование вирусной РНК с использованием набора для выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот II MagMAX (MVP II) и глубокой лунки Flex 96 KingFisher. ОТ-кПЦР выполняли на системе ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast Dx и приборе для ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 5. Результаты пределов обнаружения рабочего процесса представлены ниже в Таблице 22.

[198] Праймеры и зонды, использованные в 4-плексном тесте, не имели перекрестных реакций ни с одним из 41 протестированного респираторного патогена, перечисленного ниже в таблице 23.

[199] Были протестированы возможные воздействующие вещества, чтобы продемонстрировать способность этого 4-плексного теста обнаруживать каждый целевой вирус в низкой концентрации в наличии потенциально воздействующих веществ и демонстрировать, что потенциальные воздействующие вещества сами по себе не дают ложно положительных результатов. Протестированная кровь, назальный спрей с кортикостероидами, назальный гель, гомеопатический назальный спрей для снятия аллергии, леденцы для горла, осельтамивир, мазь с антибиотиком и системные антибиотики не оказали никакого воздействия. Назальный спрей Afrin Original оказал воздействие при 10% об./об., поэтому его титровали до концентрации, при которой не наблюдалось ингибирование. Максимальная неингибирующая концентрация составляла 0,6% для обоих приборов и всех тестируемых вирусов. Результаты кратко приведены ниже в таблице 24.

[200] Также было проведено исследование конкурентного воздействия для оценки способности 4-плексного теста на SARS-CoV-2, грипп А и грипп В обнаруживать каждый целевой вирус в низкой концентрации в наличии другого целевого вируса в высокой концентрации. Тестирование конкурентного воздействия было проведено с использованием искусственных образцов NP с SARS-CoV-2, гриппом А и гриппом В с одним вирусом в концентрации, меньшей или равной его трехкратному LoD, и другим протестированным вирусом в концентрации, большей или равной 10⁵ TCID₅₀/мл. Результаты кратко приведены ниже в таблице 25.

Пример 8. Предел обнаружения

[201] Цель данного исследования состояла в том, чтобы установить пределы обнаружения (LoD) для SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В, RSV А и RSV В для использования на 96-луночной платформе ПЦР в режиме реального времени. В эксперименте используют праймеры, нацеленные на белок S и белок N SARS-CoV-2. Праймеры, нацеленные на область белка S, представляли собой SEQ ID NO: 100 и 337, с соответствующим зондом SEQ ID NO: 864. Праймеры, нацеленные на область белка N, представляли собой SEQ ID NO: 211 и 510 с соответствующим зондом SEQ ID NO: 833. LoD будет установлен как самое низкое количество (концентрация) эквивалентов геномной копии (GCE) каждого вируса, который может быть обнаружен по меньшей мере в 95% времени.

[202] Индивидуальный LoD для каждого из вирусов, обнаруженных с помощью теста COVID/гриппа/RSV, определяли с использованием искусственных образцов, включающих инактивированный вирус SARS-CoV-2 и живые респираторно-синцитиальные вирусы гриппа А и В, добавленные на различных уровнях в объединенные образцы мазков из носоглотки (NP). Инактивированный вирус SARS-CoV-2 был получен от BEI Resources (PN NR-52287, LN 70033322). Два штамма живого вируса гриппа А (обозначаемые как Перт и Брисбен соответственно) были получены от ZeptoMetrix: грипп A H3N2 (штамм А/Перт/16/2009; PN 0810251CF, LN 313219) и грипп A H1N1 (штамм А/Брисбен/59/2007; PN 0810244CF, LN 323919). Два штамма живого вируса гриппа В (обозначаемые как Флорида и Висконсин соответственно) были получены от ZeptoMetrix: линия гриппа В Yamagata (штамм В/Флорида/04/2006; PN 0810255CF, LN 312479) и линия гриппа В Victoria (штамм В/Висконсин/01/2010; PN 0810241CF, LN 324993). Один штамм вируса А RSV был получен от ZeptoMetrix (PN 0810040ACF, LN 324695). Один штамм вируса В RSV был получен от ZeptoMetrix (PN 0810480CF, LN 322742). Количественно определенные значения GCE/мл для исходных материалов были определены с помощью dPCR, и на основе этой информации были соответствующим образом составлены разбавления.

[203] Экстрагирование образцов проводили с использованием набора для выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот II MagMAX и системы KingFisher Flex. Образцы были протестированы с использованием теста на COVID/грипп/RSV с 1-стадийным мультиплексным мастер-миксом TaqPath (без ROX) на приборе для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast от Applied Biosystem. Исследование проводили в три фазы: предварительный LoD определяли в течение фазы I исследования, уточненный LoD определяли в течение фазы II, и LoD определяли в течение фазы III. Предварительный LoD определяли в течение фазы I путем тестирования искусственных образцов с известными GCE на шести уровнях, начиная с экстрагирования образца. Тестирование предварительного LoD выполняли с тремя повторными искусственными образцами на каждом уровне GCE. После определения предварительного LoD в течение фазы II был уточнен LoD с пятью повторными образцами на пяти уровнях на уровне, ниже и выше предварительного LoD, а в течение фазы III был подтвержден LoD с обнаружением по меньшей мере 95% в 20 повторных образцах.

[204] Тестирование проводили в условиях, рекомендованных производителем для приборов для ПЦР в режиме реального времени и KingFisher Flex. Стадии при комнатной температуре проводили в лабораториях при температуре от 15°С до 30°С.

[205] Все оставшиеся неолигонуклеотидные реагенты (например, мастер-микс, вода, dNTP и т.д.) были получены из комбинированного набора COVID-19 TaqPath™ (Thermo Fisher Scientific, № по каталогу A47814) и ОТ-ПЦР проводили в соответствии с прилагаемым протоколом.

[206] Процедура

[207] Пул из по меньшей мере 175 мл образцов NP был получен и разделен поровну для пяти вирусов; один и тот же пул каждого вируса использовали в течение всей фазы исследования.

[208] Инактивированный вирус SARS-CoV-2 получали и разбавляли раствором для разбавления нуклеиновых кислот (NADS) или VTM непосредственно перед экстрагированием в соответствии с таблицей 26; каждое разбавление осторожно, но тщательно перемешивали. Для предотвращения перекрестного загрязнения перчатки меняли после получения промежуточных разбавлений и перед началом разбавлений LoD. Расчеты в следующей таблице были основаны на исходной концентрации 1,75×10⁹ GCE/мл (2,8×10⁹ TCID₅₀/мл); если инактивированный вирус SARS-CoV-2 не был составлен с этой концентрацией, расчеты были изменены для получения следующих концентраций.

[209] Были получены живые вирусы RSV A, RSV В, гриппа А и гриппа В, а вирусная геномная РНК была количественно определена с помощью цифровой ПЦР. Живой RSV А, RSV В, вирус гриппа А и вирус гриппа В разбавляли до одинаковых концентраций на основе концентраций, определенных с помощью цифровой ПЦР. В качестве разбавителя вируса использовали либо NADS, либо VTM.

[210] LoD фаза I

[211] Каждый уровень теста включал в себя по меньшей мере три повторных экстракции. Предварительный LoD представлял собой самую низкую концентрацию, при которой все три повторения экстракции дают положительный результат.

[212] С помощью образцов, полученных на стадиях 12.2 и 12.3, искусственные образцы были экстрагированы в трех экземплярах из полученных образцов и протестированы с помощью ОТ-кПЦР на платформе 7500 Fast. Предварительный LoD был рассчитан как самая низкая концентрация (самый высокий идентификатор уровня теста), при которой все три повторения экстракции дали положительный результат.

[213] На приборе для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast предварительный LoD для SARS-CoV-2 был установлен в фазе I на 50 GCE/мл, предварительный LoD для гриппа А (Перт) был установлен в фазе I на 250 GCE/мл, предварительный LoD для гриппа А (Брисбен) был установлен в фазе I на 384 GCE/мл, предварительный LoD для гриппа В (Флорида) был установлен в фазе I как 500 GCE/мл, предварительный LoD для гриппа В (Висконсин) был установленный в фазе I на 250 GCE/мл, предварительный LoD для RSV А был установлен в фазе I на 50 GCE/мл, и предварительный LoD для RSV В был установлен в фазе I на 250 GCE/мл.

[214] LoD фаза II

[215] Каждый уровень теста включал в себя по меньшей мере пять повторных экстракций. Уточненный LoD представлял собой самую низкую концентрацию, при которой все пять повторений экстракции давали положительный результат.

[216] Искусственные образцы были получены на уровнях, указанных ниже в таблице 27, по меньшей мере в пяти повторах на каждый уровень тестов. Были составлены разбавления вируса, совместимые с тестируемыми концентрациями, и искусственные образцы были экстрагированы и протестированы с помощью ОТ-кПЦР на платформе 7500 Fast. Уточненный LoD был рассчитан для каждого вируса как самая низкая концентрация (самый высокий идентификатор уровня теста), при которой все пять повторов экстракции дали положительный результат.

[217] На приборе для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast уточненный LoD для SARS-CoV-2 был установлен в фазе II на 50 GCE/мл, уточненный LoD для гриппа А (Перт) был установлен в фазе II на 250 GCE/мл, уточненный LoD для гриппа А (Брисбен) был установлен в фазе II на 768 GCE/мл, уточненный LoD для гриппа В (Флорида) был установлен в фазе II на 1000 GCE/мл, уточненный LoD для гриппа В (Висконсин) был установленный в фазе II на 250 GCE/мл, уточненный LoD для RSV А был установлен в фазе II на 150 GCE/мл, и уточненный LoD для RSV В был установлен в фазе II на 200 GCE/мл.

[218] LoD фаза III

[219] Уточненный LoD, определенный в фазе II, был подтвержден по меньшей мере 20 повторными экстракциями. LoD считался подтвержденным, если по меньшей мере 19 из 20 повторов экстрагирования давали положительный результат.

[220] Искусственные образцы были получены на уровнях, указанных ниже в таблице 28, по меньшей мере в двадцати повторах для каждого уровня тестирования. Были составлены разбавления вируса, совместимые с тестируемыми концентрациями, и искусственные образцы были экстрагированы и протестированы с помощью ОТ-кПЦР на платформе 7500 Fast. LoD для каждого образца подтверждался, если по меньшей мере 95% повторов экстрагирования давали положительный результат. Если LoD не подтверждался ни для одного из пяти вирусов, фазу III повторяли для этого вируса с более высокой концентрацией.

[221] На приборе для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast подтвержденный LoD для SARS-CoV-2, установленный в фазе III, составлял 50 GCE/мл, подтвержденный LoD для гриппа А (Перт), установленный в фазе III, составлял 350 GCE/мл, подтвержденный LoD для гриппа А (Брисбен), установленный в фазе III, составлял 384 GCE/мл, подтвержденный LoD для гриппа В (Флорида), установленный в фазе III, составлял 1250 GCE/мл, подтвержденный LoD для гриппа В (Висконсин), установленный в фазе III, составлял 350 GCE/мл, подтвержденный LoD для RSV А, установленный в фазе III, составлял 200 GCE/мл, и подтвержденный LoD для RSV В, установленный в фазе III, составлял 200 GCE/мл.

[222] LoD для комбинированного набора COVID-19, гриппа А / гриппа В, RSV TaqPath (тест на COVID/грипп/RSV) были установлены с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast (например, 7500 Fast Dx для 96-луночных планшетов с использованием 17,5 мкл входного объема реакционной смеси и QS7 Flex для 384-луночных планшетов с использованием 14 мкл входного объема реакционной смеси); результаты кратко изложены ниже в таблице 29.

Пример 9. Быстрый ПЦР-тест SARS-CoV-2

[223] Необработанные образцы слюны нагревали на водяной бане при 95°С в течение 30 минут, а затем давали им уравновеситься до комнатной температуры. Каждый термически обработанный образец встряхивали на максимальной скорости в течение 10 секунд или до тех пор, пока образец не становился однородным. 100 мкл каждого нагретого образца обработанной слюны переносили в отдельные лунки 96-луночного планшета, включающего 100 мкл приготовленной в нем смеси ТВЕ-Т. Смесь ТВЕ-Т включала в себя 50 мкл буфера ТВЕ и 50 мкл детергента Tween-20. Каждую лунку осторожно перемешивали пипетированием. Любое хранение до проведения ОТ-ПЦР осуществляли при 4°С или на льду в течение до 2 часов.

[224] Компоненты, указанные в таблице 30, объединяли для получения реакционной смеси ОТ-ПЦР для общего количества реакций плюс 10% избытка (с мультиплексными реагентами и реагентами контроля, полученными из каталогов Thermo Fisher №№ А47701 и 956125, соответственно.

[225] Реакционные смеси встряхивали в течение около 10-30 секунд) и недолго центрифугировали. Для каждой реакции компоненты, указанные ниже в таблице 31, объединяли в 384-луночном оптическом реакционном планшете MicroAmp (0,2 мл/лунку):

[226] Планшет герметизировали с помощью оптической клейкой пленки MicroAmp и недолго встряхивали для смешивания содержимого. Планшет недолго центрифугировали для сбора содержимого на дне лунок. Планшет загружали в прибор для ПЦР в режиме реального времени 7500 и выполняли протокол, приведенный в таблице 32.

[227] Соответствующие параметры анализа были определены с использованием алгоритма основного порогового уровня с ручной настройкой порогового уровня на приборах кПЦР от Applied Biosystems для расчета значений Ct. При этом алгоритме на значение Ct влияли две основные настройки анализа - основная и пороговая. Основной уровень устанавливается отдельно для каждой кривой амплификации и определяет область обнаруженного основного значимого флуоресцентного сигнала, что может помочь нормализовать вариацию фонового шума от лунки к лунке во время ранних циклов. Автоматическое определение основного уровня с использованием начального цикла 5 первоначально использовали для быстрого ПЦР-теста SARS-CoV-2 TaqCheck.

[228] После того как параметры первичного теста были установлены, пороговые значения Ct были определены для каждой мишени как для образцов, так и для контролей. Пороговые значения оценивали с использованием данных, полученных без контролей матрицы и других отрицательных контролей, чтобы исключить ложную амплификацию, такую как загрязнение, внесенное из окружающей среды. Пороговые значения также оценивали в контексте данных, оценивающих динамический диапазон теста. Например, приемлемое пороговое значение Ct исключает фоновое загрязнение в NTC, при этом фиксируя истинную амплификацию в подтвержденном динамическом диапазоне.

[229] В первом эксперименте определяли максимальный уровень сигнала фоновой флуоресценции и, следовательно, самое низкое из возможных порогововых значений ΔRn. Данный эксперимент состоял из задействования лунок для однократной амплификации транскрибированной in vitro РНК SARS-CoV-2 (1×10⁷ копий/лунку) и универсальной эталонной РНК человека (1 мг) в 4 угловых лунках и 4 лунках в центре 384-луночного планшета на 8 различных приборах QuantStudio 5.

[230] Во втором эксперименте оценивали изменчивость значений Ct РНКазы Ρ и реальные эффекты ингибирования на общую силу амплификации кПЦР и, следовательно, то, насколько высокие пороговые значения ΔRn можно было установить. Данный эксперимент был выполнен с использованием замороженных отрицательных образцов слюны (в трех экземплярах) и добавления разбавлений инактивированного вируса в концентрации 10000 GCE/мл.

[231] В последнем эксперименте были установлены пороговые значения ΔRn и Ct для целей теста. Это было достигнуто путем запуска в общей сложности 8 384-луночных планшетов с NTC в 3 разных лабораториях, чтобы определить изменчивость фонового сигнала РНКазы P в разных лабораториях и установить параметры предела Ct для теста. Между лабораториями существует свойственная изменчивость, поскольку человеческие клетки, хотя и распространены повсеместно, существуют на разных уровнях в разных лабораториях.

[232] Результаты: после того, как данные были собраны, ΔRn репрезентативных присутствующих и отсутствующих образцов для РНКазы P наносили на график в различных циклах, чтобы определить предварительное предельные значения Ct и пороговый уровень, который отделяет образцы с присутствующей РНКазой P от образцов с отсутствующей РНКазой Р. Предварительные эксперименты показали, что предельные значения Ct 32 для РНКазы P для образцов обеспечивал аналитическую чувствительность и защищал от ложных распознаваний из-за неадекватности образца. На основе этих экспериментов было выбрано предельное значение Ct, равное 35, для РНКазы P в контроле без матрицы (NTC) и положительном контроле (PC) для контроля загрязнения РНКазой Р, поскольку эти контроли не должны содержать геномный материал человека. Предварительные эксперименты также показали, что предельное значение Ct, равное 37, для SARS-CoV-2 обеспечивает аналитическую чувствительность при низких уровнях загрязнения SARS-CoV-2. Важно отметить, что высокие уровни загрязнения (например, в результате перекрестного загрязнения) сложно устранить с помощью пороговых значений и предельного значения Ct - передовые методы должны быть реализованы в лаборатории SOP для предотвращения загрязнения.

[233] Сводка идентифицированных пороговых значений и предельных значений Ct представлена ниже в таблице 33.

[234] На основе вышеизложенного для образцов (как описано ниже в таблице 34) и для NTC и PC (как описано ниже в таблице 35) были применены предельные значения Ct вторичного анализа.

[235] Для определения аналитической чувствительности был проведен эксперимент по определению эквивалентов количества копий генома на мл (GCE/мл), где было обнаружено более 95% ожидаемых присутствующих образцов. Гамма-облученный вирус был добавлен в отрицательные образцы слюны в отношении SARS-CoV-2. Затем образцы были получены, как описано в кратком справочном руководстве по быстрого ПЦР-теста SARS-CoV-2 TaqCheck™, и проанализированы с помощью ОТ-ПЦР. Данные репрезентативного эксперимента, проанализированные на основе определенных пороговых значений и предельных значений Ct, содержащихся в нем, представлены в таблице 36. По результатам эксперимента аналитическая чувствительность была установлена на уровне 6000 GCE/мл.

Пример 10. Различение вариантов SARS-CoV-2 в биологических образцах

[236] В некоторых вариантах осуществления одним неотъемлемым преимуществом описанных праймеров и зондов является способность различать образцы пациентов, которые содержат «нормальную» или «эталонную» версию SARS-nCoV-2, как показано на примере в доступе к GenBank № MN908947.3, и образцы пациентов, инфицированные определенными вариантами вируса, в частности вариантами, включающими делецию аминокислотного остатка 69 и/или 70 шиповидного белка, кодируемого геном S. Соответственно, описанные праймеры и зонды можно использовать для быстрого и недорогостоящего определения того, присутствуют ли потенциально определенные варианты SARS-CoV-2 в клинических образцах во время приема или установления очередности медицинской помощи для пациентов. Образцы, дающие положительный результат теста для двух из трех целевых последовательностей вируса (N, S и ORF1ab), первоначально классифицируются как положительные и отбираются для дальнейшей оценки с использованием более обширных и дорогостоящих подтверждающих способов, таких как секвенирование вирусного генома. Как сообщалось в публикациях, такие праймеры и зонды широко используются медицинскими учреждениями в Соединенном Королевстве для получения начального показания того, присутствует ли вариант В. 1.1.7 у пациентов.

[237] См., например, Public Health England, Technical Briefing 1, Investigation of Novel SARS-COV-2 Variant, Variant of Concern 202012/01, доступно по адресу https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attchment_data/fil e/959438/Technical_Briefing_VOC_SH_NJL2_SH2.pdf.

[238] Например, образцы, взятые у людей посредством мазка из носоглотки, аспирата из носоглотки или бронхоальвеолярного лаважа, тестируют для определения потенциального наличия определенных вариантов SARS-CoV-2. Вирусную ДНК из образцов пациентов выделяют с помощью набора для выделения вирусных/патогенных нуклеиновых кислот MagMAX (имеется в продаже от Thermo Fisher Scientific под № по каталогу А42356) в соответствии с приложенными к нему инструкциями.

[239] Затем образцы подвергают мультиплексной амплификации с использованием типовых праймеров и зондов, указанных ниже, а также с использованием мастер-микса и других общих компонентов из комбинированного набора для COVID-19 TaqPath (Thermo Fisher Scientific, № по каталогу A47814) в соответствии с прилагаемым к нему протоколом. Амплификацию проводят на QuantStudio 7500 (Thermo Fisher Scientific), и амплификацию целевых последовательностей N, S и ORF1ab отслеживают с использованием меток зондов VIC, ABY и FAM соответственно, в то время как положительный контроль (MS2) отслеживают с помощью метки зонда JUN.

[240] Полученные данные анализируют с использованием программного обеспечения для интерпретации COVID, выпущенного Thermo Fisher Scientific. Для каждого планшета подтверждено, что контрольные реакции проходят, как ожидалось (т.е. контроль без матрицы имеет неопределенное значение Ct, а положительный контроль имеет значение Ct, которое меньше или равно 30).

[241] Заданное предельное значение Ct для вирусных образцов составляет 37. Если определено значение C_t для каждой из целевых последовательностей N, S и ORF1ab, образец считается положительным для целевой последовательности, причем значение Ct для этой целевой последовательности равно или меньше 37. В нескольких образцах результаты были положительными для целевых последовательностей генов N и ORF1ab, но отрицательными для целевой последовательности гена S.

[242] Образцы, дающие положительный результат теста для двух или более целевых последовательностей SARS-CoV-2, классифицируются как имеющие действительный результат; образцы, которые дают положительный результат только для двух из трех целевых последовательностей SARS-CoV-2, рекомендуются для дальнейшего тестирования органами здравоохранения. Обычно, но не обязательно, они могут включать в себя образцы, дающие положительный результат теста для целевых последовательности как гена N, так и ORF1ab, но отрицательный результат теста для целевой последовательности гена S.

Заключение

[243] Настоящее изобретение может быть реализовано в других конкретных формах без отступления от его сущности или существенных характеристик. Описанные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях только в качестве иллюстративных и не ограничивающих. Поэтому объем изобретения определяется не предшествующим описанием, а приведенной далее формулой изобретения. Хотя некоторые варианты осуществления и детали были включены в настоящий документ и в прилагаемое описание в целях иллюстрации вариантов осуществления настоящего описания, специалистам в данной области будет очевидно, что различные изменения в способах, продуктах, устройствах и аппаратах, раскрытых в настоящем документе, могут быть выполнены без отступления от объема данного описания или изобретения. Таким образом, несмотря на то, что в настоящем документе были описаны различные аспекты и варианты осуществления, предполагаются другие аспекты и варианты осуществления. Все изменения, возникающие в пределах значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, следует считать входящими в объем, определяемый данной формулой изобретения.

[244] Последующие пункты представляют собой перечень предпочтительных вариантов осуществления:

1. Способ обнаружения SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты, включающий:

(а) создание реакционной смеси, содержащей образец нуклеиновой кислоты, прямой праймер и обратный праймер; и

(b) подвергание реакционной смеси реакционным условиям, подходящим для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Способ по пункту 1, дополнительно включающий генерирование одного или более ампликонов посредством ПЦР.

3. Способ по пункту 1 или пункту 2, отличающийся тем, что реакционная смесь дополнительно включает зонд, содержащий флуоресцентный репортер и соответствующий гаситель.

4. Способ по любому одному из пунктов 1-3, дополнительно включающий контроль флуоресценции, получаемой во время ПЦР.

5. Способ по любому предшествующему пункту, дополнительно включающий определение количества нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце.

6. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что прямой праймер и обратный праймер связываются с областью генома коронавируса, при этом гомология области между SARS-CoV-2 и bat-SL-CoVZC45 составляет менее 50%, 20%, 10% или 5%.

7. Способ по пункту 6, отличающийся тем, что указанная область находится в пределах гена ORF1ab, гена белка S или гена белка N генома SARS-CoV-2.

8. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что прямые праймеры выбраны из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:251.

9. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что обратные праймеры выбраны из SEQ ID NO:267 - SEQ ID NO:504.

10. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что последовательность зонда выбрана из SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO: 1295.

11. Способ по любому одному из пунктов 3-10, отличающийся тем, что зонд метят на 5'-конце красителем, выбранным из 6FAM, ABY, VIC, JUN и FAM.

12. Способ по пункту 11, отличающийся тем, что зонд метят на 3'-конце гасителем, выбранным из QSY, BHQ (гаситель черной дыры) и DFQ (гаситель темной флуоресценции).

13. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что положительный контроль и отрицательный контроль анализируют вместе с образцом.

14. Способ по пункту 13, отличающийся тем, что матрица нуклеиновой кислоты для положительного контроля представляет собой синтетическую плазмиду, содержащую последовательности гена ORF1ab SARS-CoV-2, гена белка S SARS-CoV-2, гена белка N SARS-CoV-2 и/или гена РНКазы P человека.

15. Композиция для обнаружения наличия SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты, содержащая праймер и/или зонд нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты целевой области, причем праймер и/или зонд нуклеиновой кислоты содержит праймер и/или зонд в пределах SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:251. SEQ ID NO:267 - SEQ ID NO:504 и SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO:1295.

16. Композиция по пункту 15, отличающаяся тем, что праймер нуклеиновой кислоты представляет собой первый прямой праймер, выполненный с возможностью гибридизации с одним концом первой целевой последовательности в пределах первой целевой области в геноме вирусной РНК SARS-CoV-2 или с комплементом первой целевой последовательности.

17. Композиция по пункту 15 или 16, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты целевой области представляет собой SEQ ID NO:1.

18. Композиция по пункту 15 или 16, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты целевой области представляет собой SEQ ID NO:2.

19. Композиция по пункту 15 или 16, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты целевой области представляет собой SEQ ID NO:3.

20. Композиция по любому одному из пунктов 15-19, дополнительно содержащая первый обратный праймер, выполненный с возможностью гибридизации с другим концом первой целевой последовательности или ее комплемента.

21. Композиция по любому одному из пунктов 15-20, дополнительно содержащая образец нуклеиновой кислоты, полимеразу, буфер и dNTP.

22. Композиция по любому одному из пунктов 15-21, дополнительно содержащая первый зонд, содержащий обнаруживаемую метку.

23. Композиция по пункту 22, отличающаяся тем, что обнаруживаемая метка представляет собой флуоресцентную метку, а первый зонд дополнительно содержит гаситель, который гасит флуоресцентную метку.

24. Композиция по пункту 22 или пункту 23, отличающаяся тем, что первый зонд выполнен с возможностью гибридизации с первой целевой подпоследовательностью, которая комплементарна или идентична по меньшей мере 10 смежным нуклеотидам в пределах первой целевой последовательности, ее копии ДНК или комплементу первой целевой последовательности или ее копии ДНК.

25. Композиция для амплификации одной или более целевых последовательностей в геноме SARS-CoV-2, содержащая: первый прямой праймер и первый обратный праймер, выполненные с возможностью амплификации первой целевой последовательности, присутствующей в первой целевой области генома SARS-CoV-2, при этом первая целевая последовательность содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов первой целевой области, причем первая целевая область имеет менее чем 50%, 40%, 30%, 20% или 10% идентичность с аналогичной областью в bat-SL-CoVZC45.

26. Композиция по пункту 25, отличающаяся тем, что первый прямой праймер и первый обратный праймер выполнены с возможностью гибридизации с разными концами первой целевой последовательности, ее копии ДНК или их соответствующих комплементов и образования между ними ампликона.

27. Композиция по пункту 25 или пункту 26, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты первой целевой области представляет собой SEQ ID NO:1.

28. Композиция по пункту 25 или пункту 26, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты первой целевой области представляет собой SEQ ID NO:2.

29. Композиция по пункту 25 или пункту 26, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты первой целевой области представляет собой SEQ ID NO:3.

30. Композиция по любому одному из пунктов 25-29, дополнительно содержащая образец нуклеиновой кислоты, полимеразу, буфер и dNTP.

31. Композиция по любому одному из пунктов 25-30, дополнительно содержащая первый зонд, содержащий обнаруживаемую метку.

32. Композиция по пункту 31, отличающаяся тем, что обнаруживаемая метка представляет собой флуоресцентную метку, а первый зонд дополнительно содержит гаситель, который гасит флуоресцентную метку.

33. Композиция по пункту 31 или 32, отличающаяся тем, что первый зонд выполнен с возможностью гибридизации с первой целевой подпоследовательностью, комплементарной или идентичной по меньшей мере 10 сопряженным нуклеотидам первой целевой последовательности, ее копии ДНК или их соответствующим комплементам.

34. Композиция по пункту 33, дополнительно содержащая второй прямой праймер и второй обратный праймер, выполненные с возможностью амплификации второй целевой последовательности в пределах второй целевой области генома SARS-CoV-2.

35. Композиция по пункту 34, отличающаяся тем, что второй прямой праймер и второй обратный праймер выполнены с возможностью связывания с разными концами второй целевой последовательности или с ее комплементом кДНК.

36. Композиция по пункту 34 или 35, отличающаяся тем, что последовательности нуклеиновой кислоты первой целевой области и второй целевой области являются разными и выбраны из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3.

37. Композиция по пункту 36, дополнительно содержащая третий прямой праймер и третий обратный праймер, выполненные с возможностью амплификации третьей целевой последовательности в пределах третьей целевой области генома SARS-CoV-2.

38. Композиция по пункту 37, отличающаяся тем, что третий прямой праймер и третий обратный праймер выполнены с возможностью связывания с разными концами третьей целевой последовательности или с ее копией ДНК или комплементом ДНК.

39. Композиция по пункту 38, отличающаяся тем, что последовательности нуклеиновой кислоты первой целевой области, второй целевой области и третьей целевой области являются разными и выбраны из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3.

40. Композиция по любому одному из пунктов 26-39, отличающаяся тем, что последовательности праймеров, специфичные для первой целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 4, 320, 34, 423, 160 и 468.

41. Композиция по любому одному из пунктов 34-40, отличающаяся тем, что последовательности праймеров, специфичные для второй целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 5, 441, 100 и 337.

42. Композиция по любому одному из пунктов 37-41, отличающаяся тем, что последовательности праймеров, специфичные для третьей целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 248, 487, 211 и 501.

43. Композиция, применяемая в качестве контроля амплификации в реакции для обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, нуклеиновой кислоты гриппа типа А и/или гриппа типа В и/или нуклеиновой кислоты респираторно-синцитиального вируса (RSV) в образце, содержащая линейную или кольцевую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую в любом порядке по меньшей мере одну целевую последовательность, полученную из гена N вируса SARS-CoV-2, по меньшей мере одну дополнительную целевую последовательность, полученную из гена S SARS-CoV-2, и, необязательно, по меньшей мере одну целевую последовательность, полученную из гена ORF1ab SARS-CoV-2.

44. Набор для обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, нуклеиновой кислоты гриппа типа А и/или гриппа типа В и/или нуклеиновой кислоты респираторно-синцитиального вируса (RSV) в образце, содержащий композицию по любому одному из пунктов 15-43 или любые их комбинации.

45. Набор по пункту 44, дополнительно содержащий мастер-микс для ПЦР.

46. Набор по пункту 45, отличающийся тем, что мастер-микс представляет собой 1-стадийный вирусный мастер-микс Fast TaqPath или 1-стадийный мастер-микс ОТ-кПЦР TaqPath, CG.

47. Набор по любому одному из пунктов 44-46, отличающийся тем, что по меньшей мере один из компонентов подвергается сушке или лиофилизации.

48. Набор по любому одному из пунктов 44-47, дополнительно содержащий матрицу тестов кПЦР, причем каждый тест кПЦР расположен в другом локусе матрицы.

49. Набор по пункту 48, отличающийся тем, что другой локус содержит лунку, канал, канавку, полость, участок или элемент, образованный на поверхности матрицы.

50. Способ обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, присутствующей в образце, включающий:

(a) обеспечение композиции по любому одному из пунктов 15-43;

(b) образование объема реакционной смеси путем приведения в контакт композиции в любом порядке или комбинации с полимеразой, dNTP и образцом нуклеиновой кислоты, полученными из ткани организма, взятой из организма; и

(c) образование одного или более продуктов амплификации, содержащих амплифицированные последовательности SARS-CoV-2 в объеме реакционной смеси, при этом образование включает подвергание объема реакционной смеси условиям амплификации, подходящим для амплификации целевых последовательностей SARS-CoV-2 из нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, присутствующей в образце нуклеиновой кислоты, до амплификации.

51. Способ по пункту 50, дополнительно включающий обнаружение по меньшей мере одного из продуктов амплификации во время или после стадии образования.

52. Способ по пункту 50 или 51, дополнительно включающий диагностику инфекции SARS-CoV-2 в организме.

53. Способ по любому одному из пунктов 50-52, отличающийся тем, что организм представляет собой испытуемого-человека, и образец нуклеиновой кислоты получают из SARS-CoV-2.

54. Способ по любому одному из пунктов 50-53, отличающийся тем, что образование включает амплификацию по меньшей мере трех разных и специфичных целевых последовательностей SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты.

55. Способ по пункту 54, отличающийся тем, что по меньшей мере три разных целевых последовательности SARS-CoV-2 включают одну целевую последовательность, полученную из гена N, одну целевую последовательность, полученную из гена S, и одну целевую последовательность, полученную из гена ORF1ab.

56. Способ по пункту 13 или любому одному из пунктов 50-54, отличающийся тем, что положительный контроль представляет собой экзогенную последовательность РНК или эндогенную последовательность ДНК или РНК.

57. Способ по пункту 56, отличающийся тем, что экзогенная последовательность РНК представляет собой последовательность бактериофага MS2, а эндогенная последовательность ДНК или РНК представляет собой последовательность РНКазы P человека.

58. Способ по пункту 56 или 57, дополнительно включающий второй положительный контроль, выбранный из экзогенной последовательности РНК и эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты.

59. Способ по любому одному из пунктов 1-14 или 50-58, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обнаружение целевой последовательности, полученной из вируса гриппа типа А (гриппа А) и/или гриппа типа В (гриппа В), в образце нуклеиновой кислоты.

60. Способ по пункту 59, отличающийся тем, что обнаружение включает применение прямого праймера, выбранного из SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253 или SEQ ID NO:257; обратного праймера, выбранного из SEQ ID NO:505 и SEQ ID NO:506; и/или зонда, выбранного из SEQ ID NO:1296 и SEQ ID NO: 1297.

61. Способ по любому одному из пунктов 1-14 или 50-60, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2, и/или гриппа А, и/или гриппа В в образце нуклеиновой кислоты выполняют по меньшей мере до эквивалента 10 геномных копий на реакцию (GCE/rxn).

62. Способ по любому одному из пунктов 1-14 или 50-60, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2, и/или гриппа А, и/или гриппа В в образце нуклеиновой кислоты выполняют в линейном динамическом диапазоне (LDR) обнаружения от 10⁷ до 10 GCE/rxn.

63. Способ по любому одному из пунктов 1-14 или 50-60, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты выполняют до 1-10 копий/мкл на реакцию.

64. Способ по любому одному из пунктов 1-14 или 50-60, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты выполняют в линейном динамическом диапазоне (LDR) по меньшей мере 5 логарифмов.

65. Композиция для обнаружения наличия SARS-CoV-2 и гриппа типа А и/или гриппа типа В в образце нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере две пары праймеров нуклеиновых кислот, причем каждая пара праймеров нуклеиновых кислот включает прямой праймер и обратный праймер, выбранные соответственно из SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:257 и SEQ ID NO:267 - SEQ ID NO:510, и, необязательно, по меньшей мере два зонда нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из любого из SEQ ID NO:520 - SEQ ID NO:2533.

66. Способ, набор или композиция по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой меченый FAM зонд, направленный на ген ORF1ab SARS-CoV-2.

67. Способ, набор или композиция по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой меченый VIC зонд, направленный на ген белка N SARS-CoV-2.

68. Способ, набор или композиция по любому одному из предшествующих пунктов 1, отличающиеся тем, что зонд представляет собой меченый ABY зонд, направленный на ген белка S SARS-CoV-2.

69. Способ, набор или композиция по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что положительный контроль представляет собой тест кПЦР MS2, содержащий меченый JUN зонд, направленный на часть нуклеиновой кислоты MS2, присутствующую в тесте кПЦР MS2.

70. Способ обнаружения SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты, включающий:

(a) создание реакционной смеси, содержащей образец нуклеиновой кислоты, прямой праймер и обратный праймер; и

(b) подвергание реакционной смеси реакционным условиям, подходящим для осуществления петлевой изотермической амплификации (LAMP).

71. Способ по любому одному из пунктов 1-14, 50-64 и 66-70, отличающийся тем, что способ включает систему пункта оказания услуг (POS).

72. Способ по любому одному из пунктов 1-14, 50-64 и 66-70, отличающийся тем, что образец нуклеиновой кислоты отбирают в пункте оказания медицинской помощи (РОС) и/или анализируют в устройстве в месте нахождения РОС.

73. Способ по пункту 71, отличающийся тем, что устройство в месте нахождения РОС выполнено с возможностью анализа клинического образца небольшого объема за короткий период времени, например менее 12 часов.

74. Способ по пункту 71 или пункту 72, в котором способ выполняют в системе POS в месте нахождения РОС.

75. Способ по пункту 71 или пункту 72, отличающийся тем, что образец нуклеиновой кислоты получают в месте нахождения РОС.

76. Способ по пункту 71 или пункту 72, отличающийся тем, что способ применяют для анализа клинического образца в месте нахождения РОС.

77. Способ по пункту 71 или пункту 72, отличающийся тем, что способ POS включает выполнение совокупности тестов на одном клиническом образце небольшого объема или на его аликвотах.

78. Способ по пункту 71, отличающийся тем, что систему POS реализуют в месте нахождения POS, и при этом способ выполняют за короткий период времени.

79. Способ по пункту 71, отличающийся тем, что способы реализуют в системе POS в месте нахождения POS, при этом способы предназначены для проведения совокупности тестов на одном клиническом образце небольшого объема или на его аликвотах и могут выполняться за короткий период времени.

80. Способ по пункту 78 или пункту 79, отличающийся тем, что короткий период времени составляет менее 24 часов.

81. Способ, набор или композиция по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что ПЦР представляет собой ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

82. Способ, набор или композиция по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что прямой праймер для РНКазы P содержит SEQ ID NO: 2552, обратный праймер для РНКазы P содержит SEQ ID NO: 2553, и/или зонд РНКазы P выбран из SEQ ID NO:2554 - SEQ ID NO:2556.

83. Способ по любому одному из пунктов 1-14, или 50-64, или 66-82, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обнаружение специфичной мишени респираторно-синцитиального вируса (RSV) в пределах образца нуклеиновой кислоты.

84. Способ по пункту 83, отличающийся тем, что обнаружение RSV включает обнаружение RSV типа А и/или RSV типа В с применением прямого праймера, выбранного из SEQ ID NO:254 и SEQ ID NO:255, обратного праймера, выбранного из SEQ ID NO:507 и SEQ ID NO:508, и/или зонда, выбранного из SEQ ID NO:1298 и SEQ ID NO:1299.

85. Способ по любому одному из пунктов 1-14, или 50-64, или 66-84, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2, гриппа А, и/или гриппа В, и/или RSV А, и/или RSV В в образце нуклеиновой кислоты выполняют по меньшей мере до эквивалента 10 геномных копий на реакцию (GCE/rxn).

86. Способ по любому одному из пунктов 1-14, или 50-64, или 66-84, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2, гриппа А, и/или гриппа В, и/или RSV А, и/или RSV В в нуклеиновой кислоте образец выполняют в линейном динамическом диапазоне обнаружения от 10⁷ до 10 GCE/rxn.

87. Способ по любому одному из пунктов 1-14, или 50-64, или 66-84, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обнаружение вируса гриппа типа А (гриппа А), вируса гриппа типа В (гриппа В), респираторно-синцитиального вируса типа A (RSV А) и/или респираторно-синцитиального вируса типа В (RSV В) в образце нуклеиновой кислоты.

88. Способ по пункту 87, отличающийся тем, что зонды для SARS-CoV-2 содержат краситель VIC и гаситель QSY, зонды для гриппа А/В содержат краситель FAM и гаситель QSY, а зонды для RSV А/В содержат краситель ABY и гаситель QSY.

89. Способ обнаружения SARS-CoV-2, описанный в настоящем документе.

90. Способ по любому одному из пунктов 1-14, 50-64 или 66-89, отличающийся тем, что образец содержит образец слюны.

91. Способ по пункту 89 или пункту 90, отличающийся тем, что способ не включает стадию очистки или выделения части, содержащей нуклеиновую кислоту, из образца.

92. Способ по любому одному из пунктов 89-91, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2 внутри образца осуществляют посредством реакции амплификации нуклеиновой кислоты с применением неочищенного образца в качестве испытательной матрицы.

93. Способ по пункту 92, дополнительно включающий нагрев образца в течение периода времени, достаточного для инактивации нуклеаз внутри образца и/или для разрыва эукариотических клеток, денатурации вирусных капсидов и/или разрушения мембранной части взятых в оболочку вирионов в них.

94. Способ по любому одному из пунктов 89-93, дополнительно включающий нагрев неочищенного образца до температуры на уровне или выше около 80°С, предпочтительно на уровне или выше около 90°С, более предпочтительно на уровне или выше около 95°С.

95. Способ по пункту 94, отличающийся тем, что неочищенный образец нагревают в течение по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 минут или в течение любого интервала времени, образованного верхней и нижней границей, выбранной из них.

96. Способ по любому одному из пунктов 90-95, дополнительно включающий объединение образца с буфером для лизиса.

97. Способ по любому одному из пунктов 93-96, дополнительно включающий смешивание термически обработанного образца до и/или после объединения термически обработанного образца с буфером для лизиса.

98. Способ по пункту 96 или 97, отличающийся тем, что буфер для лизиса содержит буфер, поддающийся обработке нуклеиновыми кислотами, и детергент и/или эмульгатор.

99. Способ по любому одному из пунктов 96-98, отличающийся тем, что буфер для лизиса содержит комбинацию буфера ТВЕ и неионогенного поверхностно-активного вещества полисорбатного типа, такого как Tween-20.

100. Способ по любому одному из пунктов 89-99, отличающийся тем, что образец содержит объединенный образец испытуемого.

101. Способ по любому одному из пунктов 89-100, отличающийся тем, что обнаружение SARS-CoV-2 внутри образца происходит спустя менее чем около 3 часов с момента получения образца, предпочтительно менее чем около 2 часов.

102. Способ обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты, включающий:

(a) нагрев образца в течение 15-45 минут, предпочтительно около 30 минут, при 95°С;

(b) смешивание термически обработанного образца с раствором для лизиса с образованием объема испытательной матрицы;

(c) создание реакционной смеси для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере часть объема испытательной матрицы, один или более праймеров, специфичных и/или диагностических для SARS-CoV-2, и полимеразу нуклеиновой кислоты; и

(d) подвергание реакционной смеси для амплификации нуклеиновой кислоты условиям, подходящим для генерирования ампликонов, специфичных для SARS-CoV-2, если в образце присутствует нуклеиновая кислота SARS-CoV-2.

103. Способ по пункту 102, дополнительно включающий получение образца.

104. Способ по пункту 103, отличающийся тем, что получение образца включает получение устройства для отбора образцов или другого контейнера, содержащего образец.

105. Способ по пункту 104, отличающийся тем, что устройство для отбора образцов представляет собой герметизируемую пробирку.

106. Способ по любому одному из пунктов 103-105, отличающийся тем, что образец получают после самостоятельного отбора образца испытуемым.

107. Способ по любому одному из пунктов 103-106, отличающийся тем, что получение образца включает получение необработанного образца слюны.

108. Способ по любому одному из пунктов 102-107, дополнительно включающий встряхивание термически обработанного образца.

109. Способ по любому одному из пунктов 102-108, дополнительно включающий обнаружение ампликонов или одной или более обнаруживаемых меток, связанных с генерированием ампликонов, при подвергании реакционной смеси для амплификации нуклеиновых кислот условиям, подходящим для генерирования ампликонов.

110. Способ по любому одному из пунктов 102-108, дополнительно включающий обнаружение ампликонов или одной или более обнаруживаемых меток, связанных с генерированием ампликонов, после подвергания реакционной смеси для амплификации нуклеиновых кислот условиям, подходящим для генерирования ампликонов.

111. Способ по любому одному из пунктов 102-110, дополнительно включающий уравновешивание термически обработанного образца до комнатной температуры перед смешиванием термически обработанного образца с раствором для лизиса.

112. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец получают после самостоятельного отбора поставщиком образца.

113. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец получают после отбора индивидуумом, не являющимся поставщиком образца.

114. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что одну или более стадий способа выполняют с применением устройства для отбора образцов.

115. Способ по пункту 114, отличающийся тем, что по меньшей мере стадии получения и нагрева выполняют с применением устройства для отбора образцов.

116. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ применяют для бессимптомного тестирования и/или высокочастотного или широко распространенного скрининга.

117. Композиция для применения в способах обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты, причем композиция содержит термически обработанный образец.

118. Композиция по пункту 117, отличающаяся тем, что термически обработанный образец содержит термически обработанную необработанную слюну.

119. Композиция по пункту 117 или пункту 118, дополнительно содержащая буфер.

120. Композиция по пункту 119, отличающаяся тем, что буфер содержит ТВЕ.

121. Композиция по любому одному из пунктов 117-120, дополнительно содержащая детергент и/или эмульгатор.

122. Композиция по пункту 121, отличающаяся тем, что детергент и/или эмульгатор содержит неионогенное поверхностно-активное вещество полисорбатного типа.

123. Композиция по любому одному из пунктов 117-122, дополнительно содержащая один или более реагентов для ПЦР.

124. Композиция по пункту 123, отличающаяся тем, что один или более реагентов для ПЦР содержат один или более праймеров или зондов для амплификации специфичных последовательностей вирусных нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе.

125. Композиция по пункту 123 или пункту 124, отличающаяся тем, что один или более реагентов для ПЦР содержат мастер-микс для ПЦР или его компоненты.

126. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что образец нуклеиновой кислоты получен от животного, не являющегося человеком.

127. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что образец нуклеиновой кислоты получают от млекопитающего.

128. Способ, композиция или набор по любому одному из пункта 127, отличающиеся тем, что образец нуклеиновой кислоты получают от норки, кошки, собаки, хорька, хомяка, летучей мыши, примата, такого как макаки-резус, яванские макаки, гриветы и обыкновенные мартышки, животного из зоопарка, лабораторного животного или сельскохозяйственного животного.

129. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что последовательности обратного и прямого праймеров, специфичные для первой целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 248 и 487 или 211 и 501.

130. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что последовательности обратного и прямого праймеров, специфичные для второй целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 5 и 441 или 100 и 337.

131. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что последовательности обратного и прямого праймеров, специфичные для третьей целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 4 и 320, или 34 и 423, или 160 и 468.

132. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что последовательности обратного и прямого праймеров, специфичные для первой, второй и/или третьей целевых последовательностей, представляют собой:

SEQ ID NO: 4 и 320, SEQ ID NO: 5 и 441 и/или SEQ ID NO: 248 и 487;

SEQ ID NO: 34 и 423, SEQ ID NO: 5 и 441 и/или SEQ ID NO: 248 и 487;

SEQ ID NO: 160 и 468, SEQ ID NO: 5 и 441 и/или SEQ ID NO: 248 и 487;

SEQ ID NO: 4 и 320, SEQ ID NO: 100 и 337 и/или SEQ ID NO: 248 и 487;

SEQ ID NO: 34 и 423, SEQ ID NO: 100 и 337 и/или SEQ ID NO: 248 и 487;

SEQ ID NO: 160 и 468, SEQ ID NO: 100 и 337 и SEQ ID NO: 248 и 487;

SEQ ID NO: 4 и 320, SEQ ID NO: 5 и 441 и SEQ ID NO: 211 и 501;

SEQ ID NO: 34 и 423, SEQ ID NO: 5 и 441 и SEQ ID NO: 211 и 501;

SEQ ID NO: 160 и 468, SEQ ID NO: 5 и 441 и SEQ ID NO: 211 и 501;

SEQ ID NO: 4 и 320, SEQ ID NO: 100 и 337 и SEQ ID NO: 211 и 501;

SEQ ID NO: 34 и 423, SEQ ID NO: 100 и 337 и SEQ ID NO: 211 и 501; или

SEQ ID NO: 160 и 468, SEQ ID NO: 100 и 337 и SEQ ID NO: 211 и 501.

133. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 565, 599, 971, 930, 1160, 1106, 1203, 1049, 864 и/или 833.

134. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 248.

135. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 487.

136. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 211.

137. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 501.

138. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 5.

139. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 441.

140. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого или обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 100.

141. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 337.

142. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 160.

143. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого или обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 468.

144. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 4.

145. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 565.

146. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 599.

147. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 971.

148. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 930.

149. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 1160.

150. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 1106.

151. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 1203.

152. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 1049.

153. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 864.

154. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что зонд представляет собой SEQ ID NO: 833.

155. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 320.

156. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 34.

157. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любая одна из последовательностей прямого и обратного праймеров, специфичных для первой, второй или третьей целевых последовательностей, представляет собой SEQ ID NO: 423.

158. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, содержащие первый прямой праймер SEQ ID NO: 160 и первый обратный праймер SEQ ID NO: 468.

159. Способ, композиция или набор по пункту 134, дополнительно содержащие зонд SEQ ID NO: 1049.

160. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, содержащие второй прямой праймер SEQ ID NO: 100 и второй обратный праймер SEQ ID NO: 337.

161. Способ, композиция или набор по пункту 136, дополнительно содержащие зонд SEQ ID NO: 864.

162. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, содержащие третий прямой праймер SEQ ID NO: 211 и третий обратный праймер SEQ ID NO: 501 и/или 510.

163. Способ, композиция или набор по пункту 138, дополнительно содержащие зонд SEQ ID NO: 833.

164. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для амплификации и/или обнаружения области гена ORF1ab SARS-CoV-2, содержащие: прямой праймер SEQ ID NO: 160, обратный праймер SEQ ID NO: 468 и зонд SEQ ID NO: 1049.

165. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для амплификации и/или обнаружения области гена S SARS-CoV-2, содержащие: прямой праймер SEQ ID NO: 100, обратный праймер SEQ ID NO: 337 и зонд SEQ ID NO: 864.

166. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для амплификации и/или обнаружения области гена N SARS-CoV-2, содержащие: прямой праймер SEQ ID NO: 211, обратный праймер SEQ ID NO: 501 и зонд SEQ ID NO: 833.

167. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для амплификации и/или обнаружения области гена N SARS-CoV-2, содержащие: прямой праймер SEQ ID NO: 211, обратный праймер SEQ ID NO: 510 и зонд SEQ ID NO: 833.

168. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для мультиплексного обнаружения целевых последовательностей, полученных из гена S и гена N SARS-CoV-2, содержащие:

(i) первый прямой праймер SEQ ID NO: 211, первый обратный праймер SEQ ID NO: 501 и первый зонд SEQ ID NO: 833; и

(ii) второй прямой праймер SEQ ID NO: 100, второй обратный праймер SEQ ID NO: 337 и второй зонд SEQ ID NO: 864.

169. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для мультиплексного обнаружения целевых последовательностей, полученных из гена S и гена N SARS-CoV-2, содержащие:

(i) первый прямой праймер SEQ ID NO: 211, первый обратный праймер SEQ ID NO: 510 и первый зонд SEQ ID NO: 833; и

(ii) второй прямой праймер SEQ ID NO: 100, второй обратный праймер SEQ ID NO: 337 и второй зонд SEQ ID NO: 864.

170. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для мультиплексного обнаружения целевых последовательностей, полученных из гена S, гена N и генов ORF1ab SARS-CoV-2, содержащие:

(i) первый прямой праймер SEQ ID NO: 160, первый обратный праймер SEQ ID NO: 468 и первый зонд SEQ ID NO: 1049;

(ii) второй прямой праймер SEQ ID NO: 100, второй обратный праймер SEQ ID NO: 337 и второй зонд SEQ ID NO: 864; и

(iii) третий прямой праймер SEQ ID NO: 211, третий обратный праймер SEQ ID NO: 501 и третий зонд SEQ ID NO: 833.

171. Способ, композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, применимые для мультиплексного обнаружения целевых последовательностей, полученных из гена S, гена N и генов ORF1ab SARS-CoV-2, содержащие:

(i) первый прямой праймер SEQ ID NO: 160, первый обратный праймер SEQ ID NO: 468 и первый зонд SEQ ID NO: 1049;

(ii) второй прямой праймер SEQ ID NO: 100, второй обратный праймер SEQ ID NO: 337 и второй зонд SEQ ID NO: 864; и

(iii) третий прямой праймер SEQ ID NO: 211, третий обратный праймер SEQ ID NO: 510 и третий зонд SEQ ID NO: 833.

172. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие праймер, выбранный из SEQ ID NO: 252, 253 или 257.

173. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие праймер, выбранный из SEQ ID NO: 505 и 506.

174. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие зонд, выбранный из SEQ ID NO: 1296 и 1297.

175. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие праймер, выбранный из SEQ ID NO: 254 и 255.

176. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие праймер, выбранный из SEQ ID NO: 507 и 508.

177. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие олигонуклеотид, выбранный из SEQ ID NO: 1298 и 1299.

178. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие олигонуклеотид, выбранный из SEQ ID NO: 2552 и 2553.

179. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие олигонуклеотид, выбранный из SEQ ID NO: 2554, 2555 и 2556.

180. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно содержащие один или более олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 256, 509 и 1300.

181. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что любой один или более праймеров и зондов содержат метку флуоресцентного красителя.

182. Композиция или набор по любому одному из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что любой один или более из праймеров и зондов содержат метку флуоресцентного красителя, выбранную из группы, состоящей из: VIC, ABY, FAM и JUN.

183. Способ применения композиции или набора по любому одному из предшествующих пунктов, включающий амплификацию целевой последовательности с применением композиции или набора; и обнаружение целевой последовательности.

184. Способ по пункту 183, дополнительно включающий определение того, включает ли биологический образец ДНК или РНК вируса.

185. Способ по пункту 184, дополнительно включающий диагностику вирусной инфекции у испытуемого, от которого был получен биологический образец.

186. Способ по пункту 185, дополнительно включающий диагностику специфичной вирусной инфекции у испытуемого, от которого был получен биологический образец.

187. Способ по любому из пунктов 183-186, дополнительно включающий исключение специфичной вирусной инфекции у испытуемого, от которого был получен биологический образец.

188. Способ обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 в образце нуклеиновой кислоты, включающий:

(a) создание реакционной смеси, содержащей образец, прямой праймер и обратный праймер; и

(b) подвергание реакционной смеси реакционным условиям, подходящим для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

189. Способ по пункту 188, дополнительно включающий генерирование одного или более ампликонов посредством ПЦР.

190. Способ по пункту 188 или 189, отличающийся тем, что реакционная смесь дополнительно содержит зонд, содержащий флуоресцентный репортер и соответствующий гаситель.

191. Способ по любому из пунктов 188-190, дополнительно включающий контроль и/или обнаружение флуоресценции, получаемой во время ПЦР.

192. Способ по пункту 191, дополнительно включающий определение количества нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце.

193. Способ по пункту 188, отличающийся тем, что прямой праймер и обратный праймер связываются с областью генома коронавируса, при этом гомология между коронавирусом SARS-CoV-2 и коронавирусом bat-SL-CoVZC45 составляет менее 50%, 20%, 10% или 5%.

194. Способ по пункту 193, отличающийся тем, что область коронавируса, имеющая менее 50% гомологии между коронавирусом SARS-CoV-2 и коронавирусом bat-SL-CoVZC45, находится в пределах гена orf1ab, гена белка S или гена белка N генома коронавируса.

195. Способ по пункту 193 или 194, отличающийся тем, что прямые праймеры выбраны из SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 251.

196. Способ по пункту 193 или 194, отличающийся тем, что обратные праймеры выбраны из SEQ ID NO. 267-SEQ ID NO. 504.

197. Способ по пункту 193 или 194, отличающийся тем, что последовательность зонда выбрана из SEQ ID NO. 520-SEQ ID NO. 1295.

198. Способ по пункту 197, отличающийся тем, что зонд метят на 5'-конце красителем, выбранным из 6FAM, ABY, VIC, JUN и FAM.

199. Способ по пункту 198, отличающийся тем, что зонд метят на 3'-конце гасителем, выбранным из QSY, BHQ (гаситель черной дыры) и DFQ (гаситель темной флуоресценции).

200. Способ по пункту 193 или 194, отличающийся тем, что положительный контроль и отрицательный контроль анализируют вместе с образцом.

201. Способ по пункту 200, отличающийся тем, что положительный контроль представляет собой синтетическую плазмиду, содержащую мишени из гена orf1ab коронавируса, гена белка S, гена белка N и РНКазы Р.

202. Композиция для обнаружения наличия SARS-CoV-2 в образце ДНК, содержащая праймер нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, содержащей любой из праймеров, описанных в настоящем документе.

203. Композиция по пункту 202, отличающаяся тем, что праймер нуклеиновой кислоты представляет собой первый прямой праймер, выбранный с возможностью гибридизации с одним концом первой целевой последовательности в пределах первой целевой области в геноме вирусной РНК SARS-CoV-2 или с комплементом первой целевой последовательности.

204. Композиция по пункту 202, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты целевой области представляет собой SEQ ID NO: 1.

205. Композиция по пункту 202, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты целевой области представляет собой SEQ ID NO: 2.

206. Композиция по пункту 202, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты целевой области представляет собой SEQ ID NO: 3.

207. Композиция по пунктам 202-206, дополнительно содержащая первый обратный праймер, выполненный с возможностью гибридизации с другим концом первой целевой последовательности или ее комплемента.

208. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая образец нуклеиновой кислоты, полимеразу, буфер и нуклеотиды.

209. Композиция по любому из пунктов 202-208, дополнительно содержащая первый зонд, содержащий флуоресцентную или другую обнаруживаемую метку.

210. Композиция по пункту 209, отличающаяся тем, что метка первого зонда представляет собой флуоресцентную метку, а олигонуклеотидный зонд дополнительно содержит гаситель, который гасит флуоресцентную метку.

211. Композиция по пункту 209 или 210, отличающаяся тем, что первый зонд выполнен с возможностью гибридизации с первой целевой подпоследовательностью, которая комплементарна или идентична по меньшей мере 10 смежным нуклеотидам в пределах первой целевой последовательности, ее копии ДНК или комплементу первой целевой последовательности или ее копии ДНК.

212. Композиция для амплификации одной или более целевых последовательностей в геноме SARS-CoV-2, содержащая: первый прямой праймер и первый обратный праймер, выполненные с возможностью амплификации первой целевой последовательности, присутствующей в первой целевой области генома SARS-CoV-2, при этом первая целевая последовательность содержит по меньшей мере 10 сопряженных нуклеотидов первой целевой области, причем первая целевая область имеет менее чем 50%, 40%, 30%, 20% или 10% идентичность с коронавирусом bat-SL-CoVZC45 и с SARS-КоВ-2.

213. Композиция по пункту 212, отличающаяся тем, что первый прямой праймер и первый обратный праймер выполнены с возможностью гибридизации с разными концами первой целевой последовательности, ее копии ДНК или их соответствующих комплементов.

214. Композиция по пункту 212 или 213, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты первой целевой области представляет собой SEQ ID NO: 1.

215. Композиция по пункту 212 или 213, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты первой целевой области представляет собой SEQ ID NO: 2.

216. Композиция по пункту 212 или 213, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты первой целевой области представляет собой SEQ ID NO: 3.

217. Композиция по любому из пунктов 212-217, дополнительно содержащая образец нуклеиновой кислоты, полимеразу, буфер и нуклеотиды.

218. Композиция по любому из пунктов 212-217, дополнительно содержащая первый зонд, содержащий флуоресцентную или другую обнаруживаемую метку.

219. Композиция по пункту 218, отличающаяся тем, что метка первого зонда представляет собой флуоресцентную метку, а зонд дополнительно содержит гаситель, который гасит флуоресцентную метку.

220. Композиция по пункту 218 или 219, отличающаяся тем, что первый зонд выполнен с возможностью гибридизации с первой целевой подпоследовательностью, комплементарной или идентичной по меньшей мере 10 смежным нуклеотидам первой целевой последовательности, ее копии ДНК или их соответствующим комплементам.

221. Композиция по любому из пунктов 212-220, дополнительно содержащая второй прямой праймер и второй обратный праймер, выполненные с возможностью амплификации второй целевой последовательности в пределах второй целевой области генома SARS-CoV-2.

222. Композиция по пункту 221, отличающаяся тем, что второй прямой праймер и второй обратный праймер выполнены с возможностью связывания с разными концами второй целевой последовательности или с ее комплементом кДНК.

223. Композиция по пунктам 221 или 222, отличающаяся тем, что последовательности нуклеиновой кислоты первой целевой области и второй целевой области являются разными и выбраны из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

224. Композиция по пунктам 221-223, дополнительно содержащая третий прямой праймер и третий обратный праймер, выполненные с возможностью амплификации третьей целевой последовательности в пределах третьей целевой области генома SARS-CoV-2.

225. Композиция по пункту 224, отличающаяся тем, что третий прямой праймер и третий обратный праймер выполнены с возможностью связывания с разными концами третьей целевой последовательности или с ее копией ДНК или комплементом ДНК.

226. Композиция по пунктам 224 и 225, отличающаяся тем, что последовательности нуклеиновой кислоты первой целевой области, второй целевой области и третьей целевой области являются разными и выбраны из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

227. Композиция по пункту 226, отличающаяся тем, что последовательности праймеров, специфичные для первой целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 248 и 487 или 211 и 501.

228. Композиция по пункту 226 или 227, отличающаяся тем, что последовательности праймеров, специфичные для второй целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 5 и 441 или 100 и 337.

229. Композиция по любому из пунктов 226-228, отличающаяся тем, что последовательности праймеров, специфичные для третьей целевой последовательности, выбраны из SEQ ID NO: 4 и 320, или 34 и 423, или 160 и 468.

230. Композиция, применяемая в качестве контроля амплификации в реакции для обнаружения нуклеиновых кислот вируса SARS-CoV-2 в образце, содержащая линейную или кольцевую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую в любом порядке по меньшей мере одну целевую последовательность, полученную из гена N вируса SARS-CoV-2, по меньшей мере одну дополнительную целевую последовательность, полученную из гена S вируса SARS-CoV-2, и по меньшей мере одну целевую последовательность, полученную из гена orf1ab вируса SARS-CoV-2.

231. Набор для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 в образце, содержащий композицию по любому из пунктов 202-230 или любые ее комбинации.

232. Набор по пункту 231, дополнительно содержащий мастер-микс.

233. Набор по пункту 232, отличающийся тем, что мастер-микс представляет собой 1-стадийный вирусный мастер-микс Fast TaqPath или 1-стадийный мастер-микс ОТ-кПЦР TaqPath, CG.

234. Набор по любому из пунктов 231-233, отличающийся тем, что по меньшей мере один из компонентов подвергается сушке или лиофилизации.

235. Набор по любому из пунктов 231-234, дополнительно содержащий матрицу тестов кПЦР, причем каждый тест кПЦР расположен в другом локусе матрицы.

236. Набор по пункту 235, отличающийся тем, что другой локус содержит лунку, канал, канавку, полость, участок или элемент на поверхности матрицы.

237. Способ обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, присутствующей в образце, включающий:

(c) обеспечение композиции по любому из пунктов 202-230;

(d) образование объема реакционной смеси путем приведения в контакт композиции в любом порядке или комбинации с полимеразой, нуклеотидами и образцом, полученным из ткани организма, взятой из организма; и

(e) образование одного или более продуктов амплификации, содержащих амплифицированные последовательности коронавируса в объеме реакционной смеси, при этом образование включает подвергание объема реакционной смеси условиям амплификации, подходящим для амплификации целевых последовательностей коронавируса из нуклеиновой кислоты коронавируса, при этом нуклеиновая кислота коронавируса присутствует в образце до амплификации.

238. Способ по пункту 237, дополнительно включающий обнаружение по меньшей мере одного из продуктов амплификации во время или после стадии образования.

239. Способ по пункту 238, дополнительно включающий диагностику коронавирусной инфекции в организме.

240. Способ по пунктам 237-239, отличающийся тем, что организм представляет собой пациента-человека, а нуклеиновая кислота коронавируса получена из SARS-CoV-2.

241. Способ по пунктам 237-240, отличающийся тем, что образование включает амплификацию по меньшей мере трех разных целевых последовательностей коронавируса из нуклеиновой кислоты коронавируса.

242. Способ по пункту 241, отличающийся тем, что по меньшей мере три разные целевые последовательности коронавируса включают одну целевую последовательность, полученную из гена N, одну целевую последовательность, полученную из гена S, и одну целевую последовательность, полученную из гена orf1ab.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION

< 120> КОМПОЗИЦИИ, НАБОРЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<130> LT01529PCT

<140>

<141>

<150> 63/199,570

<151> 2021-01-08

<150> 63/199,076

<151> 2020-12-04

<150> 63/198,421

<151> 2020-10-16

<150> 63/198,134

<151> 2020-09-30

<150> 62/706,081

<151> 2020-07-30

<150> 63/052,385

<151> 2020-07-15

<150> 63/044,160

<151> 2020-06-25

<150> 62/981,938

<151> 2020-02-26

<150> 62/978,274

<151> 2020-02-18

<160> 2556

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 2001

<212> ДНК

<213> Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2

<400> 1

tgaaaagagc tatgaattgc agacaccttt tgaaattaaa ttggcaaaga aatttgacac 60

cttcaatggg gaatgtccaa attttgtatt tcccttaaat tccataatca agactattca 120

accaagggtt gaaaagaaaa agcttgatgg ctttatgggt agaattcgat ctgtctatcc 180

agttgcgtca ccaaatgaat gcaaccaaat gtgcctttca actctcatga agtgtgatca 240

ttgtggtgaa acttcatggc agacgggcga ttttgttaaa gccacttgcg aattttgtgg 300

cactgagaat ttgactaaag aaggtgccac tacttgtggt tacttacccc aaaatgctgt 360

tgttaaaatt tattgtccag catgtcacaa ttcagaagta ggacctgagc atagtcttgc 420

cgaataccat aatgaatctg gcttgaaaac cattcttcgt aagggtggtc gcactattgc 480

ctttggaggc tgtgtgttct cttatgttgg ttgccataac aagtgtgcct attgggttcc 540

acgtgctagc gctaacatag gttgtaacca tacaggtgtt gttggagaag gttccgaagg 600

tcttaatgac aaccttcttg aaatactcca aaaagagaaa gtcaacatca atattgttgg 660

tgactttaaa cttaatgaag agatcgccat tattttggca tctttttctg cttccacaag 720

tgcttttgtg gaaactgtga aaggtttgga ttataaagca ttcaaacaaa ttgttgaatc 780

ctgtggtaat tttaaagtta caaaaggaaa agctaaaaaa ggtgcctgga atattggtga 840

acagaaatca atactgagtc ctctttatgc atttgcatca gaggctgctc gtgttgtacg 900

atcaattttc tcccgcactc ttgaaactgc tcaaaattct gtgcgtgttt tacagaaggc 960

cgctataaca atactagatg gaatttcaca gtattcactg agactcattg atgctatgat 1020

gttcacatct gatttggcta ctaacaatct agttgtaatg gcctacatta caggtggtgt 1080

tgttcagttg acttcgcagt ggctaactaa catctttggc actgtttatg aaaaactcaa 1140

acccgtcctt gattggcttg aagagaagtt taaggaaggt gtagagtttc ttagagacgg 1200

ttgggaaatt gttaaattta tctcaacctg tgcttgtgaa attgtcggtg gacaaattgt 1260

cacctgtgca aaggaaatta aggagagtgt tcagacattc tttaagcttg taaataaatt 1320

tttggctttg tgtgctgact ctatcattat tggtggagct aaacttaaag ccttgaattt 1380

aggtgaaaca tttgtcacgc actcaaaggg attgtacaga aagtgtgtta aatccagaga 1440

agaaactggc ctactcatgc ctctaaaagc cccaaaagaa attatcttct tagagggaga 1500

aacacttccc acagaagtgt taacagagga agttgtcttg aaaactggtg atttacaacc 1560

attagaacaa cctactagtg aagctgttga agctccattg gttggtacac cagtttgtat 1620

taacgggctt atgttgctcg aaatcaaaga cacagaaaag tactgtgccc ttgcacctaa 1680

tatgatggta acaaacaata ccttcacact caaaggcggt gcaccaacaa aggttacttt 1740

tggtgatgac actgtgatag aagtgcaagg ttacaagagt gtgaatatca cttttgaact 1800

tgatgaaagg attgataaag tacttaatga gaagtgctct gcctatacag ttgaactcgg 1860

tacagaagta aatgagttcg cctgtgttgt ggcagatgct gtcataaaaa ctttgcaacc 1920

agtatctgaa ttacttacac cactgggcat tgatttagat gagtggagta tggctacata 1980

ctacttattt gatgagtctg g 2001

<210> 2

<211> 2001

<212> ДНК

<213> Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2

<400> 2

tgtttgtttt tcttgtttta ttgccactag tctctagtca gtgtgttaat cttacaacca 60

gaactcaatt accccctgca tacactaatt ctttcacacg tggtgtttat taccctgaca 120

aagttttcag atcctcagtt ttacattcaa ctcaggactt gttcttacct ttcttttcca 180

atgttacttg gttccatgct atacatgtct ctgggaccaa tggtactaag aggtttgata 240

accctgtcct accatttaat gatggtgttt attttgcttc cactgagaag tctaacataa 300

taagaggctg gatttttggt actactttag attcgaagac ccagtcccta cttattgtta 360

ataacgctac taatgttgtt attaaagtct gtgaatttca attttgtaat gatccatttt 420

tgggtgttta ttaccacaaa aacaacaaaa gttggatgga aagtgagttc agagtttatt 480

ctagtgcgaa taattgcact tttgaatatg tctctcagcc ttttcttatg gaccttgaag 540

gaaaacaggg taatttcaaa aatcttaggg aatttgtgtt taagaatatt gatggttatt 600

ttaaaatata ttctaagcac acgcctatta atttagtgcg tgatctccct cagggttttt 660

cggctttaga accattggta gatttgccaa taggtattaa catcactagg tttcaaactt 720

tacttgcttt acatagaagt tatttgactc ctggtgattc ttcttcaggt tggacagctg 780

gtgctgcagc ttattatgtg ggttatcttc aacctaggac ttttctatta aaatataatg 840

aaaatggaac cattacagat gctgtagact gtgcacttga ccctctctca gaaacaaagt 900

gtacgttgaa atccttcact gtagaaaaag gaatctatca aacttctaac tttagagtcc 960

aaccaacaga atctattgtt agatttccta atattacaaa cttgtgccct tttggtgaag 1020

tttttaacgc caccagattt gcatctgttt atgcttggaa caggaagaga atcagcaact 1080

gtgttgctga ttattctgtc ctatataatt ccgcatcatt ttccactttt aagtgttatg 1140

gagtgtctcc tactaaatta aatgatctct gctttactaa tgtctatgca gattcatttg 1200

taattagagg tgatgaagtc agacaaatcg ctccagggca aactggaaag attgctgatt 1260

ataattataa attaccagat gattttacag gctgcgttat agcttggaat tctaacaatc 1320

ttgattctaa ggttggtggt aattataatt acctgtatag attgtttagg aagtctaatc 1380

tcaaaccttt tgagagagat atttcaactg aaatctatca ggccggtagc acaccttgta 1440

atggtgttga aggttttaat tgttactttc ctttacaatc atatggtttc caacccacta 1500

atggtgttgg ttaccaacca tacagagtag tagtactttc ttttgaactt ctacatgcac 1560

cagcaactgt ttgtggacct aaaaagtcta ctaatttggt taaaaacaaa tgtgtcaatt 1620

tcaacttcaa tggtttaaca ggcacaggtg ttcttactga gtctaacaaa aagtttctgc 1680

ctttccaaca atttggcaga gacattgctg acactactga tgctgtccgt gatccacaga 1740

cacttgagat tcttgacatt acaccatgtt cttttggtgg tgtcagtgtt ataacaccag 1800

gaacaaatac ttctaaccag gttgctgttc tttatcagga tgttaactgc acagaagtcc 1860

ctgttgctat tcatgcagat caacttactc ctacttggcg tgtttattct acaggttcta 1920

atgtttttca aacacgtgca ggctgtttaa taggggctga acatgtcaac aactcatatg 1980

agtgtgacat acccattggt g 2001

<210> 3

<211> 1284

<212> ДНК

<213> Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2

<400> 3

tgtctgataa tggaccccaa aatcagcgaa atgcaccccg cattacgttt ggtggaccct 60

cagattcaac tggcagtaac cagaatggag aacgcagtgg ggcgcgatca aaacaacgtc 120

ggccccaagg tttacccaat aatactgcgt cttggttcac cgctctcact caacatggca 180

aggaagacct taaattccct cgaggacaag gcgttccaat taacaccaat agcagtccag 240

atgaccaaat tggctactac cgaagagcta ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa 300

tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct actacctagg aactgggcca gaagctggac 360

ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aactgaggga gccttgaata 420

caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac 480

ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc 540

aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc gcaacagttc aagaaattca actccaggca 600

gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt 660

tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac 720

aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa 780

aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac 840

aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat tacaaacatt 900

ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg 960

gcatggaagt cacaccttcg ggaacgtggt tgacctacac aggtgccatc aaattggatg 1020

acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca 1080

aaacattccc accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag 1140

ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg 1200

atgatttctc caaacaattg caacaatcca tgagcagtgc tgactcaact caggcctaaa 1260

ctcatgcaga ccacacaagg caga 1284

<210> 4

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 4

tccagcatgt cacaattcag aagta 25

<210> 5

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 5

gttggatgga aagtgagttc agagt 25

<210> 6

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 6

cgtagtcgca acagttcaag aaatt 25

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 7

tgctgcagct tattatgtgg gttat 25

<210> 8

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 8

tgtctctggg accaatggta ctaa 24

<210> 9

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 9

gggaacgtgg ttgacctaca c 21

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 10

ctgtgcactt gaccctctct 20

<210> 11

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 11

gcagagacag aagaaacagc aaac 24

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 12

tccaatgtta cttggttcca tgct 24

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 13

gccaacaaca acaaggccaa a 21

<210> 14

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 14

gtgctagcgc taacataggt tgt 23

<210> 15

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 15

caagcctctt ctcgttcctc atc 23

<210> 16

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 16

aaattcaact ccaggcagca gta 23

<210> 17

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 17

ccctcagatt caactggcag taa 23

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 18

cttggttcac cgctctcact 20

<210> 19

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 19

cgcaatcctg ctaacaatgc t 21

<210> 20

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 20

cttcagcgtt cttcggaatg tc 22

<210> 21

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 21

gttgcgtcac caaatgaatg ca 22

<210> 22

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 22

gagcatagtc ttgccgaata cca 23

<210> 23

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 23

gctgcagctt attatgtggg ttatc 25

<210> 24

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 24

cgaagaccca gtccctactt attgt 25

<210> 25

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 25

gcagtcaagc ctcttctcgt t 21

<210> 26

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 26

caagtgtgcc tattgggttc ca 22

<210> 27

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 27

cgtactgcca ctaaagcata caatg 25

<210> 28

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 28

acgcctatta atttagtgcg tgatct 26

<210> 29

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 29

tgaaggaaaa cagggtaatt tcaa 24

<210> 30

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 30

cgtcaccaaa tgaatgcaac caaat 25

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 31

ggttcaccgc tctcactcaa 20

<210> 32

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 32

tgttaacaac taaacgaaca atgtt 25

<210> 33

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 33

ttcgtggtgg tgacggtaaa a 21

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 34

agaggctgct cgtgttgtac 20

<210> 35

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 35

ccctcagatt caactggcag taac 24

<210> 36

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 36

gcagaggcgg cagtcaa 17

<210> 37

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 37

gtccagaaca aacccaagga aatt 24

<210> 38

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 38

caagcctctt ctcgttcctc at 22

<210> 39

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 39

ttgacagatt gaaccagctt gaga 24

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 40

ggttcaccgc tctcactcaa 20

<210> 41

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 41

gggcgatttt gttaaagcca ctt 23

<210> 42

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 42

ctgctgctga ggcttctaag aa 22

<210> 43

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 43

gccccaaggt ttacccaata atact 25

<210> 44

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 44

gtctatccag ttgcgtcacc aa 22

<210> 45

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 45

gcagacgggc gattttgtta aa 22

<210> 46

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 46

aactgaggga gccttgaata cac 23

<210> 47

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 47

ttcgaagacc cagtccctac tt 22

<210> 48

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 48

tgctgtagac tgtgcacttg ac 22

<210> 49

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 49

tgcaatcgtg ctacaacttc ct 22

<210> 50

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 50

gttgccataa caagtgtgcc tattg 25

<210> 51

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 51

gcagacgggc gattttgtta 20

<210> 52

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 52

tgctgcaatc gtgctacaac t 21

<210> 53

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 53

ggctactacc gaagagctac ca 22

<210> 54

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 54

ggacaaggcg ttccaattaa cac 23

<210> 55

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 55

gatccatttt tgggtgttta ttaccacaa 29

<210> 56

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 56

cgtcggcccc aaggtttac 19

<210> 57

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 57

cttctcgttc ctcatcacgt agtc 24

<210> 58

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 58

caacaacaag gccaaactgt ca 22

<210> 59

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 59

agcttgagag caaaatgtct ggtaa 25

<210> 60

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 60

gcagagacag aagaaacagc aaa 23

<210> 61

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 61

gtccagatga ccaaattggc tacta 25

<210> 62

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 62

tcacgtagtc gcaacagttc aa 22

<210> 63

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 63

gagggagcct tgaatacacc aa 22

<210> 64

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 64

cagcaaactg tgactcttct tcct 24

<210> 65

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 65

acaaggccaa actgtcacta agaaa 25

<210> 66

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 66

ctcaattacc ccctgcatac actaa 25

<210> 67

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 67

ccacgtgcta gcgctaacat 20

<210> 68

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 68

ggagccttga atacaccaaa agatc 25

<210> 69

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 69

gcagacgtgg tccagaaca 19

<210> 70

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 70

aaaatgtctg gtaaaggcca acaac 25

<210> 71

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 71

ggcgcgatca aaacaacgt 19

<210> 72

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 72

ggaccaatgg tactaagagg tttga 25

<210> 73

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 73

ggtcgcacta ttgcctttgg a 21

<210> 74

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 74

ctggtgattc ttcttcaggt tgga 24

<210> 75

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 75

atcacgtagt cgcaacagtt ca 22

<210> 76

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 76

caacaaggcc aaactgtcac taag 24

<210> 77

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 77

cctctctcag aaacaaagtg tacgt 25

<210> 78

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 78

cagcgcttca gcgttcttc 19

<210> 79

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 79

gtttggtgga ccctcagatt caa 23

<210> 80

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 80

ttggaggctg tgtgttctct tatg 24

<210> 81

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 81

ccccaaaatc agcgaaatgc a 21

<210> 82

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 82

cgtgatctcc ctcagggttt t 21

<210> 83

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 83

gactaaagaa ggtgccacta cttgt 25

<210> 84

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 84

ctacacaggt gccatcaaat tgg 23

<210> 85

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 85

ggcatcatat gggttgcaac tga 23

<210> 86

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 86

agacgtggtc cagaacaaac c 21

<210> 87

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 87

tggccgcaaa ttgcacaat 19

<210> 88

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 88

aaatctgctg ctgaggcttc t 21

<210> 89

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 89

ggctttagaa ccattggtag atttgc 26

<210> 90

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 90

caaaatgtct ggtaaaggcc aaca 24

<210> 91

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 91

caaaatgtct ggtaaaggcc aacaa 25

<210> 92

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 92

ctcttgcttt gctgctgctt 20

<210> 93

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 93

cgggaacgtg gttgaccta 19

<210> 94

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 94

gttacttacc ccaaaatgct gttgt 25

<210> 95

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 95

aacaccaata gcagtccaga tgac 24

<210> 96

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 96

ggctgtgtgt tctcttatgt tggtt 25

<210> 97

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 97

agattgaacc agcttgagag caa 23

<210> 98

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 98

caacaaaagt tggatggaaa gtgagt 26

<210> 99

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 99

tcatcacgta gtcgcaacag tt 22

<210> 100

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 100

aggacttgtt cttacctttc ttttcca 27

<210> 101

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 101

agagctatga attgcagaca ccttt 25

<210> 102

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 102

ggtgatgctg ctcttgcttt g 21

<210> 103

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 103

ggtggaccct cagattcaac tg 22

<210> 104

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 104

gcggcagtca agcctctt 18

<210> 105

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 105

aacaaggcca aactgtcact aaga 24

<210> 106

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 106

tgagaagtct aacataataa gaggctggat 30

<210> 107

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 107

cgtcaccaaa tgaatgcaac ca 22

<210> 108

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 108

gaagtaggac ctgagcatag tcttg 25

<210> 109

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 109

accccgcatt acgtttggt 19

<210> 110

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 110

ggtggtgacg gtaaaatgaa agatc 25

<210> 111

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 111

gcaaagaaat ttgacacctt caatgg 26

<210> 112

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 112

gcgaattttg tggcactgag aat 23

<210> 113

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 113

ggcttgaaaa ccattcttcg taagg 25

<210> 114

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 114

aatctgctgc tgaggcttct aag 23

<210> 115

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 115

gggagccttg aatacaccaa aaga 24

<210> 116

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 116

caatcgtgct acaacttcct caag 24

<210> 117

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 117

accaaatgtg cctttcaact ctcat 25

<210> 118

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 118

tggcagacgg gcgatttt 18

<210> 119

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 119

ggttcaccgc tctcactcaa c 21

<210> 120

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 120

ttcgtggtgg tgacggtaaa at 22

<210> 121

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 121

aacagagttg ttatttctag tgatgt 26

<210> 122

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 122

cattcccacc aacagagcct aaa 23

<210> 123

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 123

caatcctgct aacaatgctg caa 23

<210> 124

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 124

agacgggcga ttttgttaaa gc 22

<210> 125

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 125

gcacttgacc ctctctcaga aa 22

<210> 126

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 126

caaggcgttc caattaacac caata 25

<210> 127

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 127

ggcagacgtg gtccagaac 19

<210> 128

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 128

ggaccttgaa ggaaaacagg gtaat 25

<210> 129

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 129

agggtggtcg cactattgc 19

<210> 130

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 130

ctgctgcaga tttggatgat ttctc 25

<210> 131

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 131

acaaaagttg gatggaaagt gagttca 27

<210> 132

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 132

acatgtctct gggaccaatg gta 23

<210> 133

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 133

ctcagccttt tcttatggac cttga 25

<210> 134

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 134

ccagcgcttc agcgttct 18

<210> 135

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 135

tcaaggaaca acattgccaa aagg 24

<210> 136

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 136

ccaaatgtgc ctttcaactc tcatg 25

<210> 137

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 137

gcagagacag aagaaacagc aaa 23

<210> 138

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 138

agcttgagag caaaatgtct ggta 24

<210> 139

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 139

ccgaagagct accagacgaa tt 22

<210> 140

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 140

gttgccataa caagtgtgcc tatt 24

<210> 141

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 141

ggttcaccgc tctcactca 19

<210> 142

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 142

gatgctgctc ttgctttgct 20

<210> 143

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 143

ggtggtcgca ctattgcctt t 21

<210> 144

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 144

tgctgcttga cagattgaac ca 22

<210> 145

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 145

gcgttccaat taacaccaat agca 24

<210> 146

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 146

gggaacgtgg ttgacctaca 20

<210> 147

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 147

cttgcgaatt ttgtggcact ga 22

<210> 148

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 148

tggcagtaac cagaatggag aac 23

<210> 149

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 149

tcactcaaca tggcaaggaa gac 23

<210> 150

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 150

ggccccaagg tttacccaat aata 24

<210> 151

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 151

cacgtggtgt ttattaccct gaca 24

<210> 152

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 152

ggctttatgg gtagaattcg atctgt 26

<210> 153

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 153

cctattgggt tccacgtgct a 21

<210> 154

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 154

catacaaaac attcccacca acaga 25

<210> 155

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 155

tgcaccccgc attacgt 17

<210> 156

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 156

gcaaccaaat gtgcctttca act 23

<210> 157

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 157

ggaactgggc cagaagct 18

<210> 158

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 158

ggtgatgctg ctcttgcttt g 21

<210> 159

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 159

ttggccgcaa attgcacaa 19

<210> 160

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 160

tgcctggaat attggtgaac agaaa 25

<210> 161

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 161

aactcaatta ccccctgcat acac 24

<210> 162

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 162

gctgcaatcg tgctacaact t 21

<210> 163

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 163

caaaatgtct ggtaaaggcc aacaa 25

<210> 164

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 164

ccaatagcag tccagatgac caaa 24

<210> 165

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 165

cccctgcata cactaattct ttcaca 26

<210> 166

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 166

ccttcgggaa cgtggttga 19

<210> 167

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 167

attcaactcc aggcagcagt ag 22

<210> 168

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 168

gggcgcgatc aaaacaac 18

<210> 169

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 169

cgcattggca tggaagtca 19

<210> 170

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 170

cattcccacc aacagagcct aa 22

<210> 171

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 171

gaaatctgct gctgaggctt cta 23

<210> 172

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 172

ggtccagaac aaacccaagg a 21

<210> 173

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 173

ttggcatgga agtcacacct t 21

<210> 174

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 174

cgtcaccaaa tgaatgcaac caa 23

<210> 175

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 175

ctcaattacc ccctgcatac act 23

<210> 176

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 176

cgtggtggtg acggtaaaat g 21

<210> 177

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 177

ctggacttcc ctatggtgct aa 22

<210> 178

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 178

accgcagaga cagaagaaac ag 22

<210> 179

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 179

gcacttgacc ctctctcaga aac 23

<210> 180

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 180

cacttgaccc tctctcagaa aca 23

<210> 181

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 181

cttcagcgtt cttcggaatg t 21

<210> 182

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 182

tggcagacgg gcgattt 17

<210> 183

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 183

tgattacaaa cattggccgc aaat 24

<210> 184

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 184

tctggcttga aaaccattct tcgt 24

<210> 185

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 185

ccccctgcat acactaattc tttca 25

<210> 186

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 186

cggctttaga accattggta gatttg 26

<210> 187

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 187

ctcaagcctt accgcagaga 20

<210> 188

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 188

gcagtccaga tgaccaaatt gg 22

<210> 189

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 189

gaagttattt gactcctggt gattcttct 29

<210> 190

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 190

tgattacaaa cattggccgc aaa 23

<210> 191

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 191

gaccttaaat tccctcgagg acaag 25

<210> 192

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 192

tggtggaccc tcagattcaa ct 22

<210> 193

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 193

gggagccttg aatacaccaa aagat 25

<210> 194

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 194

gcacccgcaa tcctgcta 18

<210> 195

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 195

aaatctgctg ctgaggcttc t 21

<210> 196

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 196

ccaggaacta atcagacaag gaact 25

<210> 197

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 197

ttggcacccg caatcct 17

<210> 198

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 198

ggtccagaac aaacccaagg aaat 24

<210> 199

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 199

gtcaagcctc ttctcgttcc t 21

<210> 200

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 200

gcagacgtgg tccagaacaa 20

<210> 201

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 201

tgggaccaat ggtactaaga ggtt 24

<210> 202

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 202

aacaacattg ccaaaaggct tctac 25

<210> 203

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 203

ccgaagagct accagacgaa t 21

<210> 204

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 204

cgtcaccaaa tgaatgcaac caa 23

<210> 205

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 205

ctggtgctgc agcttattat gtg 23

<210> 206

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 206

cttgctttgc tgctgcttga 20

<210> 207

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 207

acacaggtgc catcaaattg gat 23

<210> 208

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 208

catgtctctg ggaccaatgg t 21

<210> 209

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 209

ccctcagatt caactggcag ta 22

<210> 210

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 210

gaaccagctt gagagcaaaa tgt 23

<210> 211

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 211

gcaatggcgg tgatgct 17

<210> 212

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 212

ttcttcctgc tgcagatttg gat 23

<210> 213

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 213

gaacaacatt gccaaaaggc ttcta 25

<210> 214

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 214

caactcagga cttgttctta cctttct 27

<210> 215

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 215

gggaatgtcc aaattttgta tttc 24

<210> 216

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 216

gctgctgctt gacagattga ac 22

<210> 217

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 217

ttgaccctct ctcagaaaca aagtg 25

<210> 218

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 218

gctgatgaaa ctcaagcctt acc 23

<210> 219

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 219

ctctcagcct tttcttatgg acctt 25

<210> 220

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 220

gaggctggat ttttggtact actttaga 28

<210> 221

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 221

agatgctgta gactgtgcac ttg 23

<210> 222

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 222

gctttgctgc tgcttgaca 19

<210> 223

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 223

cacttttgaa tatgtctctc agcctttt 28

<210> 224

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 224

tgcaaccaaa tgtgcctttc aac 23

<210> 225

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 225

gctagaatgg ctggcaatgg 20

<210> 226

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 226

acgtggtgtt tattaccctg acaa 24

<210> 227

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 227

attcccacca acagagccta aaa 23

<210> 228

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 228

cttgatggct ttatgggtag aattcg 26

<210> 229

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 229

cgtggtgttt attaccctga caaag 25

<210> 230

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 230

ctgctgcaga tttggatgat ttct 24

<210> 231

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 231

cccgcaatcc tgctaacaat g 21

<210> 232

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 232

gctaacaaag acggcatcat atgg 24

<210> 233

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 233

acggcatcat atgggttgca 20

<210> 234

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 234

tcaccgctct cactcaacat g 21

<210> 235

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 235

actcttcttc ctgctgcaga ttt 23

<210> 236

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 236

ctggtaaagg ccaacaacaa caa 23

<210> 237

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 237

cagagacaga agaaacagca aactg 25

<210> 238

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 238

ttccacgtgc tagcgctaa 19

<210> 239

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 239

ggcagacgtg gtccagaa 18

<210> 240

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 240

gcacccgcaa tcctgctaa 19

<210> 241

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 241

acttccctat ggtgctaaca aagac 25

<210> 242

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 242

ccttaccgca gagacagaag aaa 23

<210> 243

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 243

gttaaagcca cttgcgaatt ttgtg 25

<210> 244

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 244

acaacaaggc caaactgtca ct 22

<210> 245

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 245

tgaaaagagc tatgaattgc agaca 25

<210> 246

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 246

ccgcaatcct gctaacaatg c 21

<210> 247

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 247

aatgcaacca aatgtgcctt tca 23

<210> 248

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 248

ctcagattca actggcagta acca 24

<210> 249

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 249

tgctgcagct tattatgtgg gtta 24

<210> 250

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 250

accaaatgtg cctttcaact ctca 24

<210> 251

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 251

cgtaagggtg gtcgcactat 20

<210> 252

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 252

aaaatgtgtg agctttcatg aagcat 26

<210> 253

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 253

ggaatggcta aagacaagac caat 24

<210> 254

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 254

caagcttaac aactgaaatt caaatcaaca 30

<210> 255

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 255

gggcaaatat ggaaacatac gtga 24

<210> 256

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 256

tgtcgcccca agcaactt 18

<210> 257

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 257

aaaatgtgtg agctttcatg aagcatt 27

<210> 258

<400> 258

000

<210> 259

<400> 259

000

<210> 260

<400> 260

000

<210> 261

<400> 261

000

<210> 262

<400> 262

000

<210> 263

<400> 263

000

<210> 264

<400> 264

000

<210> 265

<400> 265

000

<210> 266

<400> 266

000

<210> 267

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 267

gcgaccaccc ttacgaaga 19

<210> 268

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 268

ccaatttgat ggcacctgtg tag 23

<210> 269

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 269

aataaccatc aatattctta aacacaaatt 30

<210> 270

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 270

aattctaccc ataaagccat caagct 26

<210> 271

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 271

cgtctggtag ctcttcggta gt 22

<210> 272

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 272

aagcagcagc aaagcaagag 20

<210> 273

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 273

attgtatgct ttagtggcag tacgt 25

<210> 274

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 274

gggccgacgt tgttttg 17

<210> 275

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 275

taaagttaga agtttgatag attcctt 27

<210> 276

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 276

gcttgagttt catcagcctt cttct 25

<210> 277

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 277

acccaatagg cacacttgtt atgg 24

<210> 278

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 278

acgtctgccg aaagcttgt 19

<210> 279

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 279

ggctctgttg gtgggaatgt 20

<210> 280

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 280

agggactggg tcttcgaatc t 21

<210> 281

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 281

gcacacttgt tatggcaacc aa 22

<210> 282

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 282

caagtagtgg caccttcttt agtca 25

<210> 283

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 283

ggtaataaac accacgtgtg aaagaa 26

<210> 284

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 284

tgccgtcttt gttagcacca tag 23

<210> 285

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 285

taaagttaga agtttgatag attcct 26

<210> 286

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 286

ggctctgttg gtgggaatgt t 21

<210> 287

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 287

ttagcgctag cacgtggaa 19

<210> 288

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 288

atttggacat tccccattga aggt 24

<210> 289

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 289

cgtctggtag ctcttcggta gtag 24

<210> 290

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 290

catgagagtt gaaaggcaca tttgg 25

<210> 291

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 291

ggtcatctgg actgctattg gt 22

<210> 292

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 292

acccacataa taagctgcag ca 22

<210> 293

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 293

gatttcaacg tacactttgt ttctgaga 28

<210> 294

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 294

catgccaatg cgcgacat 18

<210> 295

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 295

ttgttggcct ttaccagaca ttttg 25

<210> 296

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 296

gccttttggc aatgttgttc ct 22

<210> 297

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 297

tgcgttctcc attctggtta ctg 23

<210> 298

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 298

cgggtgccaa tgtgatcttt tg 22

<210> 299

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 299

agctgtccaa cctgaagaag aatc 24

<210> 300

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 300

ctgagggaga tcacgcacta aatt 24

<210> 301

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 301

tctcaagctg gttcaatctg tcaag 25

<210> 302

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 302

tctgccgaaa gcttgtgtta ca 22

<210> 303

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 303

agcaggaaga agagtcacag tttg 24

<210> 304

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 304

tctgcggtaa ggcttgagtt t 21

<210> 305

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 305

gccttttggc aatgttgttc ctt 23

<210> 306

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 306

cccgtctgcc atgaagtttc a 21

<210> 307

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 307

cgcactagaa taaactctga actcact 27

<210> 308

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 308

gccttgtcct cgagggaatt t 21

<210> 309

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 309

tcatccaaat ctgcagcagg aa 22

<210> 310

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 310

gggccgacgt tgttttgatc 20

<210> 311

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 311

gattgcagca ttgttagcag gatt 24

<210> 312

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 312

gccgaaagct tgtgttacat tgta 24

<210> 313

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 313

aacccatatg atgccgtctt tgt 23

<210> 314

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 314

ctgagggaga tcacgcacta aatta 25

<210> 315

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 315

catgttgagt gagagcggtg aa 22

<210> 316

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 316

agctggttca atctgtcaag ca 22

<210> 317

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 317

gtgcgaccac ccttacgaa 19

<210> 318

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 318

gcactaaatt aataggcgtg tgctt 25

<210> 319

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 319

gcaaccaaca taagagaaca caca 24

<210> 320

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 320

acgaagaatg gttttcaagc cagat 25

<210> 321

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 321

cgcaactgga tagacagatc gaat 24

<210> 322

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 322

gcaagactat gctcaggtcc tact 24

<210> 323

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 323

acaagtagtg gcaccttctt tagtc 25

<210> 324

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 324

aggtcttcct tgccatgttg ag 22

<210> 325

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 325

agagggtcaa gtgcacagtc ta 22

<210> 326

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 326

tgcgcgacat tccgaagaa 19

<210> 327

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 327

tcgcaagtgg ctttaacaaa atcg 24

<210> 328

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 328

tcagcactgc tcatggattg tt 22

<210> 329

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 329

tgctgcctgg agttgaattt ctt 23

<210> 330

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 330

ctctgcggta aggcttgagt t 21

<210> 331

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 331

gggtaagtaa ccacaagtag tg 22

<210> 332

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 332

gcgaccaccc ttacgaagaa tg 22

<210> 333

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 333

tctttgttag caccataggg aagtc 25

<210> 334

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 334

ccaatttggt catctggact gctat 25

<210> 335

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 335

tgttgagtga gagcggtgaa c 21

<210> 336

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 336

gtcatctgga ctgctattgg tgtta 25

<210> 337

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 337

gtaggacagg gttatcaaac ctctt 25

<210> 338

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 338

aagcagcagc aaagcaagag 20

<210> 339

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 339

tttaccgtca ccaccacgaa tt 22

<210> 340

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 340

ttcttgaact gttgcgacta cgt 23

<210> 341

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 341

cctttaccag acattttgct ctcaa 25

<210> 342

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 342

tgtatgcttt agtggcagta cgttt 25

<210> 343

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 343

ttcctggtcc ccaaaatttc ctt 23

<210> 344

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 344

cctgtgtagg tcaaccacgt t 21

<210> 345

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 345

cacgttcccg aaggtgtga 19

<210> 346

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 346

ctacgtgatg aggaacgaga agag 24

<210> 347

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 347

caggaagaag agtcacagtt tgct 24

<210> 348

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 348

tctaccaatg gttctaaagc cgaaaa 26

<210> 349

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 349

ggaacccaat aggcacactt gtt 23

<210> 350

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 350

ccacataata agctgcagca cca 23

<210> 351

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 351

gccttgtcct cgagggaatt ta 22

<210> 352

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 352

tggcccagtt cctaggtagt 20

<210> 353

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 353

gagggtcaag tgcacagtct ac 22

<210> 354

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 354

caccataggg aagtccagct t 21

<210> 355

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 355

tttgtcaggg taataaacac cacgt 25

<210> 356

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 356

caagactatg ctcaggtcct actt 24

<210> 357

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 357

ttttaccgtc accaccacga at 22

<210> 358

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 358

gcaaagcaag agcagcatca c 21

<210> 359

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 359

ccctgttttc cttcaaggtc cata 24

<210> 360

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 360

caagactatg ctcaggtcct acttc 25

<210> 361

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 361

caaggtccat aagaaaaggc tgaga 25

<210> 362

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 362

ctgattagtt cctggtcccc aaaat 25

<210> 363

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 363

ttgtatgctt tagtggcagt acgtt 25

<210> 364

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 364

gtgggaatgt tttgtatgcg tcaat 25

<210> 365

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 365

cgttcccgaa ggtgtgactt 20

<210> 366

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 366

gtctgccgaa agcttgtgtt ac 22

<210> 367

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 367

cgccccactg cgttct 16

<210> 368

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 368

agctcttcgg tagtagccaa tttg 24

<210> 369

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 369

gtcctcgagg gaatttaagg tcttc 25

<210> 370

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 370

ccttgaggaa gttgtagcac gatt 24

<210> 371

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 371

gttgcgacta cgtgatgagg aa 22

<210> 372

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 372

gcggccaatg tttgtaatca gttc 24

<210> 373

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 373

ccgtctgcca tgaagtttca c 21

<210> 374

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 374

aatctgtcaa gcagcagcaa ag 22

<210> 375

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 375

gcacatttgg ttgcattcat ttggt 25

<210> 376

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 376

ccatatgatg ccgtctttgt tagca 25

<210> 377

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 377

tggcctttac cagacatttt gct 23

<210> 378

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 378

gccgaaagct tgtgttacat tgtat 25

<210> 379

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 379

ttttaccgtc accaccacga a 21

<210> 380

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 380

ggcaaatcta ccaatggttc taaagc 26

<210> 381

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 381

ctttgtttct gagagagggt caagt 25

<210> 382

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 382

gccttgtcct cgagggaatt taa 23

<210> 383

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 383

tgaaattacc ctgttttcct tcaa 24

<210> 384

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 384

tttgtttctg agagagggtc aagtg 25

<210> 385

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 385

cgtagaagcc ttttggcaat gtt 23

<210> 386

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 386

actgcgttct ccattctggt t 21

<210> 387

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 387

gtggtaataa acacccaaaa atggatca 28

<210> 388

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 388

ttctggccca gttcctaggt a 21

<210> 389

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 389

caaccacgtt cccgaaggt 19

<210> 390

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 390

cacgattgca gcattgttag ca 22

<210> 391

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 391

agcagcagat ttcttagtga cagtt 25

<210> 392

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 392

caaggctccc tcagttgca 19

<210> 393

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 393

ttaggcctga gttgagtca 19

<210> 394

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 394

cggtagtagc caatttggtc atctg 25

<210> 395

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 395

agcctcagca gcagatttct tag 23

<210> 396

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 396

cgaagaatgg ttttcaagcc agatt 25

<210> 397

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 397

ctgagggaga tcacgcacta a 21

<210> 398

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 398

aggctctgtt ggtgggaatg 20

<210> 399

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 399

ggtgacgcaa ctggatagac a 21

<210> 400

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 400

agtcctaggt tgaagataac ccacat 26

<210> 401

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 401

cttccttgcc atgttgagtg aga 23

<210> 402

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 402

tgaactgttg cgactacgtg at 22

<210> 403

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 403

cccttggttg aatagtcttg attatgga 28

<210> 404

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 404

ctctgttggt gggaatgttt tgt 23

<210> 405

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 405

caatttgcgg ccaatgtttg taat 24

<210> 406

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 406

gggtaataaa caccacgtgt gaaag 25

<210> 407

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 407

ccttgaggaa gttgtagcac gat 23

<210> 408

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 408

tggtcccaga gacatgtata gcat 24

<210> 409

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 409

agactatgct caggtcctac ttctg 25

<210> 410

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 410

aagactatgc tcaggtccta cttct 25

<210> 411

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 411

ctgaagaaga atcaccagga gtcaa 25

<210> 412

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 412

ccttttggca atgttgttcc ttgag 25

<210> 413

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 413

gcgggtgcca atgtgatctt 20

<210> 414

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 414

ttcggaacct tctccaacaa ca 22

<210> 415

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 415

acagtttggc cttgttgttg ttg 23

<210> 416

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 416

agtgccacaa aattcgcaag tg 22

<210> 417

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 417

cagtggaagc aaaataaaca ccatca 26

<210> 418

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 418

cactgcgttc tccattctgg tta 23

<210> 419

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 419

ccctgttttc cttcaaggtc cataa 25

<210> 420

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 420

gctctcaagc tggttcaatc tgt 23

<210> 421

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 421

aaaggcacat ttggttgcat tcat 24

<210> 422

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 422

cccactgcgt tctccattct g 21

<210> 423

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 423

acgcacagaa ttttgagcag ttt 23

<210> 424

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 424

agaacacaca gcctccaaag g 21

<210> 425

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 425

aatttgcggc caatgtttgt aatca 25

<210> 426

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 426

tttcttctgt ctctgcggta agg 23

<210> 427

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 427

cctcagcagc agatttctta gtg 23

<210> 428

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 428

gctgtccaac ctgaagaaga atca 24

<210> 429

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 429

cggtaaggct tgagtttcat cag 23

<210> 430

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 430

gcgaccaccc ttacgaagaa 20

<210> 431

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 431

ctggcccagt tcctaggtag ta 22

<210> 432

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 432

ggcccagttc ctaggtagta gaaat 25

<210> 433

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 433

cactgctcat ggattgttgc a 21

<210> 434

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 434

cccgtctgcc atgaagtttc 20

<210> 435

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 435

tttggtcatc tggactgcta ttgg 24

<210> 436

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 436

tgcggtaagg cttgagtttc a 21

<210> 437

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 437

gtagaagcct tttggcaatg ttgt 24

<210> 438

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 438

ggactgggtc ttcgaatcta aagt 24

<210> 439

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 439

gtagggactg ggtcttcgaa tcta 24

<210> 440

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 440

ggtgaaccaa gacgcagtat tattg 25

<210> 441

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 441

aggtccataa gaaaaggctg agaga 25

<210> 442

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 442

cgactacgtg atgaggaacg a 21

<210> 443

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 443

agggtaataa acaccacgtg tgaa 24

<210> 444

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 444

cacgtgtgaa agaattagtg tatgca 26

<210> 445

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 445

ctgcctggag ttgaatttct tgaac 25

<210> 446

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 446

gtgacgcaac tggatagaca ga 22

<210> 447

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 447

ctgcctggag ttgaatttct tgaa 24

<210> 448

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 448

gcctcagcag cagatttctt agt 23

<210> 449

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 449

tcaagtgcac agtctacagc at 22

<210> 450

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 450

cgccattgcc agccattc 18

<210> 451

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 451

agggtaataa acaccacgtg tgaaa 25

<210> 452

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 452

ccttcggaac cttctccaac aa 22

<210> 453

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 453

tgcggtaagg cttgagtttc at 22

<210> 454

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 454

accagctgtc caacctgaag 20

<210> 455

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 455

gccgtctttg ttagcaccat agg 23

<210> 456

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 456

cctcagcagc agatttctta gtga 24

<210> 457

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 457

gactgggtct tcgaatctaa agtag 25

<210> 458

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 458

agtgcacagt ctacagcatc tg 22

<210> 459

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 459

accttcggaa ccttct 16

<210> 460

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 460

ctccctcagt tgcaacccat at 22

<210> 461

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 461

cttgtcctcg agggaattta aggt 24

<210> 462

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 462

tggtgttaat tggaacgcct tgt 23

<210> 463

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 463

ccttttggca atgttgttcc ttga 24

<210> 464

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 464

aagcagcagc aaagcaagag 20

<210> 465

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 465

cttgaggaag ttgtagcacg attg 24

<210> 466

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 466

tcatccaaat ctgcagcagg aa 22

<210> 467

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 467

tctccaacaa cacctgtatg gttac 25

<210> 468

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 468

agtgcgggag aaaattgatc gta 23

<210> 469

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 469

aaaggcacat ttggttgcat tca 23

<210> 470

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 470

ggaacgagaa gaggcttgac t 21

<210> 471

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 471

gactgggtct tcgaatctaa agtagtac 28

<210> 472

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 472

ctgcagcagg aagaagagtc a 21

<210> 473

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 473

ttcaacgtac actttgtttc tgagaga 27

<210> 474

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 474

gcgaccaccc ttacgaagaa t 21

<210> 475

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 475

tctgctccct tctgcgtaga 20

<210> 476

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 476

gggtaattga gttctggttg taa 23

<210> 477

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 477

cttgttgttg ttggccttta cca 23

<210> 478

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 478

acagtgaagg atttcaacgt acactt 26

<210> 479

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 479

cacaaaattc gcaagtggct ttaac 25

<210> 480

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 480

cagggtaata aacaccacgt gtga 24

<210> 481

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 481

ccctcagttg caacccatat gat 23

<210> 482

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 482

ggtgttaatt ggaacgcctt gtc 23

<210> 483

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 483

gggtaattga gttctggttg taaga 25

<210> 484

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 484

gaactgttgc gactacgtga tg 22

<210> 485

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 485

acaaaattcg caagtggctt taaca 25

<210> 486

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 486

cacataataa gctgcagcac cag 23

<210> 487

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 487

gggccgacgt tgttttga 18

<210> 488

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 488

cctactgctg cctggagtt 19

<210> 489

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 489

gcgcgacatt ccgaagaac 19

<210> 490

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 490

cagcatcacc gccattgc 18

<210> 491

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 491

cgcctctgct cccttctg 18

<210> 492

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 492

ctctgaactc actttccatc caact 25

<210> 493

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 493

gtgtgacttc catgccaatg c 21

<210> 494

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 494

gtgacagttt ggccttgttg tt 22

<210> 495

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 495

agtgccacaa aattcgcaag tg 22

<210> 496

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 496

gtctgccgaa agcttgtgtt a 21

<210> 497

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 497

agcacgtgga acccaatagg 20

<210> 498

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 498

tcggaacctt ctccaacaac ac 22

<210> 499

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 499

ggccaatgtt tgtaatcagt tcctt 25

<210> 500

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 500

gccatgaagt ttcaccacaa tgatc 25

<210> 501

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 501

gcctttacca gacattttgc tctca 25

<210> 502

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 502

tggcaaccaa cataagagaa caca 24

<210> 503

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 503

gcagcattgt tagcaggatt gc 22

<210> 504

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 504

ccattgccag ccattctagc a 21

<210> 505

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 505

caggattcag gtacatgacc atgag 25

<210> 506

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 506

acgctgcagt cctcg 15

<210> 507

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 507

caatcaggag agtcatgcct gtat 24

<210> 508

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 508

gcgggatcat catctttttc tagaaca 27

<210> 509

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 509

gcctgtgaac gcgagttaga 20

<210> 510

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 510

gcctttacca gacattttgc tctcaa 26

<210> 511

<400> 511

000

<210> 512

<400> 512

000

<210> 513

<400> 513

000

<210> 514

<400> 514

000

<210> 515

<400> 515

000

<210> 516

<400> 516

000

<210> 517

<400> 517

000

<210> 518

<400> 518

000

<210> 519

<400> 519

000

<210> 520

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 520

tagactgtgc acttgaccc 19

<210> 521

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 521

acgtttggtg gaccctc 17

<210> 522

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 522

atcattacaa aattgaaatt cac 23

<210> 523

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 523

caagacgcag tattattg 18

<210> 524

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 524

cttctggccc agttcct 17

<210> 525

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 525

actgccgcct ctgctc 16

<210> 526

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 526

ctggatagac agatcgaatt c 21

<210> 527

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 527

accaggagtc aaataacttc ta 22

<210> 528

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 528

acccttggtt gaatagtct 19

<210> 529

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 529

tcgcactaga ataaactct 19

<210> 530

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 530

tcccaccaac agagcct 17

<210> 531

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 531

ctgcttgaca gattgaacc 19

<210> 532

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 532

cagccttctt ctttttgtcc tt 22

<210> 533

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 533

attgtggtga aacttca 17

<210> 534

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 534

ccgtctgcca tgaagttt 18

<210> 535

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 535

cagcatgtca caattcaga 19

<210> 536

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 536

ccactgagaa gtctaacata at 22

<210> 537

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 537

actcctggtg attctt 16

<210> 538

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 538

ccccctgcat acactaa 17

<210> 539

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 539

atggttacaa cctatgttag cgc 23

<210> 540

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 540

ccagaagctg gacttcc 17

<210> 541

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 541

ctgccagttg aatctga 17

<210> 542

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 542

atggtgctaa caaagacg 18

<210> 543

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 543

acatggcaag gaagacc 17

<210> 544

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 544

taagaggctg gatttttg 18

<210> 545

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 545

tcctcaagga acaacattg 19

<210> 546

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 546

ttttgaaatt accctgtttt cc 22

<210> 547

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 547

aaggctccct cagttgca 18

<210> 548

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 548

ttcctggtcc ccaaaatt 18

<210> 549

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 549

cttcaaggtc cataagaaaa g 21

<210> 550

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 550

tcctggtccc caaaatt 17

<210> 551

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 551

tctcagtgga agcaaaata 19

<210> 552

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 552

caacagttca agaaattc 18

<210> 553

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 553

cccaataggc acacttgtt 19

<210> 554

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 554

cctgtgtagg tcaaccac 18

<210> 555

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 555

accacaatga tcacacttc 19

<210> 556

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 556

acgtggtcca gaacaa 16

<210> 557

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 557

aagcacacgc ctattaat 18

<210> 558

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 558

ccttgaggaa gttgtagcac g 21

<210> 559

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 559

cacctgtatg gttacaacct 20

<210> 560

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 560

aagttcccct actgctgcct 20

<210> 561

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 561

caaattggat gacaaagatc 20

<210> 562

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 562

aacccaatag gcacacttg 19

<210> 563

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 563

tttgccccca gcgctt 16

<210> 564

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 564

ccttgaatac accaaaagat 20

<210> 565

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 565

cttgccgaat accataatga 20

<210> 566

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 566

acgcatacaa aacattccc 19

<210> 567

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 567

cacacgccta ttaattta 18

<210> 568

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 568

aattggatga caaagatcc 19

<210> 569

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 569

cagcctccaa aggca 15

<210> 570

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 570

aaggcgttcc aattaaca 18

<210> 571

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 571

atctggcttg aaaaccat 18

<210> 572

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 572

tctgccgaaa gcttg 15

<210> 573

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 573

acgtggaacc caatagg 17

<210> 574

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 574

ccattggtcc cagagacat 19

<210> 575

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 575

tcttcaacct aggacttttc 20

<210> 576

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 576

ttgacgcata caaaacat 18

<210> 577

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 577

cagcaccagc tgtcc 15

<210> 578

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 578

cagtggaagc aaaataaaca 20

<210> 579

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 579

ccgaatacca taatgaatct g 21

<210> 580

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 580

cccagtccct acttattgtt a 21

<210> 581

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 581

ttgcaaccca tatgatgcc 19

<210> 582

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 582

acaatgctgc aatcgtg 17

<210> 583

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 583

aaactctgaa ctcactttcc 20

<210> 584

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 584

accattggta gatttgc 17

<210> 585

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 585

ttctccattc tggttactgc c 21

<210> 586

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 586

tagcaccata gggaagtcc 19

<210> 587

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 587

accttcttta gtcaaattc 19

<210> 588

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 588

atgctggaca ataaattt 18

<210> 589

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 589

ccctgaggga gatcac 16

<210> 590

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 590

aagtagtacc aaaaatcc 18

<210> 591

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 591

caatcctgct aacaatgc 18

<210> 592

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 592

aagcctcttc tcgttcctca 20

<210> 593

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 593

aatgtaacac aagctttcg 19

<210> 594

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 594

acgtggtcca gaacaaac 18

<210> 595

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 595

ccgaagagct accagacgaa 20

<210> 596

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 596

caccaaatga atgcaaccaa 20

<210> 597

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 597

actgagaagt ctaacataat aag 23

<210> 598

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 598

caaggaactg attacaaaca t 21

<210> 599

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 599

ttctcccgca ctcttg 16

<210> 600

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 600

caagctggtt caatctg 17

<210> 601

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 601

ctcatgaagt gtgatcattg 20

<210> 602

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 602

ccaggagtca aataacttct atg 23

<210> 603

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 603

atgcttattc agcaaaatg 19

<210> 604

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 604

tcacgtagtc gcaacagt 18

<210> 605

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 605

tagtcttgat tatggaattt aag 23

<210> 606

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 606

cactttccat ccaacttttg t 21

<210> 607

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 607

tcattgtggt gaaactt 17

<210> 608

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 608

ttggtcccag agacatgta 19

<210> 609

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 609

caatagcagt ccagatgac 19

<210> 610

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 610

ttggtggacc ctcagattc 19

<210> 611

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 611

caaacattgt tcgtttagtt gtt 23

<210> 612

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 612

tcatcagcct tcttcttttt 20

<210> 613

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 613

ccaaacaatt gcaacaatc 19

<210> 614

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 614

ccatttttgg gtgtttatta c 21

<210> 615

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 615

ccagttccta ggtagtagaa at 22

<210> 616

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 616

attcgtctgg tagctcttc 19

<210> 617

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 617

caaagatcaa gtcattttgc 20

<210> 618

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 618

ctggtaaagg ccaacaac 18

<210> 619

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 619

accccctgca tacactaa 18

<210> 620

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 620

ccttctttag tcaaattct 19

<210> 621

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 621

ctggagttga atttct 16

<210> 622

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 622

caaaatcgcc cgtctgcc 18

<210> 623

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 623

caacaaggcc aaactgt 17

<210> 624

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 624

ttggatgaca aagatcc 17

<210> 625

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 625

aatgaatgca accaaatgt 19

<210> 626

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 626

caaaatttgg acattccc 18

<210> 627

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 627

ctgtaatggt tccattttc 19

<210> 628

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 628

aagcctcttc tcgttcctc 19

<210> 629

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 629

ccagcatgtc acaattc 17

<210> 630

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 630

cagttccttg tctgattagt t 21

<210> 631

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 631

ccgtcaccac cacgaatt 18

<210> 632

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 632

ccctgacaaa gttttca 17

<210> 633

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 633

aaagtgtacg ttgaaatcc 19

<210> 634

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 634

ctgagggtcc accaaac 17

<210> 635

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 635

tcaaaagtgc aattattcg 19

<210> 636

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 636

ctctagtcag tgtgttaatc 20

<210> 637

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 637

ctgccgaaag cttg 14

<210> 638

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 638

atcgcccgtc tgccatg 17

<210> 639

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 639

aagaggcttg actgccgc 18

<210> 640

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 640

cctctgctcc cttctgc 17

<210> 641

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 641

atggcaacca acataagag 19

<210> 642

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 642

atggttccat tttcattata tttta 25

<210> 643

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 643

ctgcgttctc cattctg 17

<210> 644

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 644

ccaggagtca aataacttct 20

<210> 645

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 645

caaaatttgg acattcccc 19

<210> 646

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 646

tactgctgcc tggagttg 18

<210> 647

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 647

ccatcaatat tcttaaacac aaatt 25

<210> 648

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 648

aagagctacc agacgaattc 20

<210> 649

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 649

cctgtcctac catttaatg 19

<210> 650

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 650

ccctgcatac actaattc 18

<210> 651

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 651

ctgccgaaag cttgtg 16

<210> 652

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 652

tcatgagagt tgaaaggcac 20

<210> 653

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 653

ctgtgactct tcttcctgct gc 22

<210> 654

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 654

catggcaagg aagacc 16

<210> 655

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 655

cctgagcata gtcttgcc 18

<210> 656

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 656

tcaccaccac gaattc 16

<210> 657

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 657

aagaaggctg atgaaactc 19

<210> 658

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 658

ttccatgcca atgcgc 16

<210> 659

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 659

aagtggcttt aacaaaatc 19

<210> 660

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 660

ttcggtagta gccaatttg 19

<210> 661

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 661

aagccatcaa gctttttc 18

<210> 662

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 662

ctgcgttctc cattctgg 18

<210> 663

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 663

ttggaacgcc ttgtcctcg 19

<210> 664

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 664

ttggacattc cccattgaag 20

<210> 665

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 665

ctcgttcctc atcacgtagt c 21

<210> 666

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 666

ctgggtcttc gaatcta 17

<210> 667

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 667

tctacgcaga agggagcag 19

<210> 668

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 668

attggcatgg aagtcac 17

<210> 669

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 669

tcagcaaaat gacttgatct t 21

<210> 670

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 670

cttcaaccta ggacttttc 19

<210> 671

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 671

ctcctggtga ttcttc 16

<210> 672

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 672

ttctagtgcg aataattg 18

<210> 673

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 673

ccgacgttgt tttgatcg 18

<210> 674

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 674

cttgagagca aaatgtc 17

<210> 675

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 675

ctctgggacc aatggtac 18

<210> 676

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 676

tctcatgaag tgtgatcatt g 21

<210> 677

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 677

aaggcgttcc aattaac 17

<210> 678

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 678

cagcagcaga tttctta 17

<210> 679

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 679

caggtgccat caaattg 17

<210> 680

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 680

aagggtggtc gcactatt 18

<210> 681

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 681

atcaccgcca ttgcca 16

<210> 682

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 682

cagcagcaaa gcaag 15

<210> 683

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 683

cctattggca aatctac 17

<210> 684

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 684

accagaactc aattacccc 19

<210> 685

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 685

catcactagg tttcaaactt 20

<210> 686

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 686

ccaacagagc ctaaaaag 18

<210> 687

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 687

cattgtggtg aaacttcatg 20

<210> 688

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 688

aatattctta aacacaaatt cc 22

<210> 689

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 689

ccaatggtac taagaggttt g 21

<210> 690

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 690

actgccacta aagcatacaa 20

<210> 691

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 691

catagtcttg ccgaatacc 19

<210> 692

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 692

acacaggtgc catcaaat 18

<210> 693

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 693

ctgggtcttc gaatctaaa 19

<210> 694

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 694

cattcaactc aggacttgtt 20

<210> 695

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 695

ccacgttccc gaaggtg 17

<210> 696

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 696

ccaatgcgcg acattc 16

<210> 697

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 697

acagatgctg tagactgtgc 20

<210> 698

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 698

aataagaggc tggattttt 19

<210> 699

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 699

atggatcatt acaaaattg 19

<210> 700

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 700

ccttacgaag aatggttttc 20

<210> 701

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 701

actcaggact tgttcttacc 20

<210> 702

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 702

aagcagcagc aaagcaa 17

<210> 703

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 703

acaaacccaa ggaaattt 18

<210> 704

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 704

ccaatggttc taaagccg 18

<210> 705

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 705

acaatgtaac acaagctttc 20

<210> 706

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 706

caccgctctc actcaac 17

<210> 707

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 707

cccagtccct acttattg 18

<210> 708

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 708

ttgcggccaa tgtt 14

<210> 709

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 709

ttgcggccaa tgtttgt 17

<210> 710

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 710

tcagtggaag caaaataa 18

<210> 711

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 711

cccttggttg aatagtcttg a 21

<210> 712

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 712

cccaccaaca gagccta 17

<210> 713

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 713

cacccttacg aagaatg 17

<210> 714

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 714

tcgtgctaca acttcctc 18

<210> 715

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 715

ctgcagcacc agctgtc 17

<210> 716

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 716

ctagcacgtg gaaccc 16

<210> 717

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 717

cacacgtggt gtttatta 18

<210> 718

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 718

ctgagggagc cttgaatac 19

<210> 719

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 719

ttcttaaaca caaattccc 19

<210> 720

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 720

cagcatgtca caattc 16

<210> 721

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 721

cagggttttt cggctttag 19

<210> 722

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 722

accaggagtc aaataac 17

<210> 723

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 723

ccatatgatg ccgtctttg 19

<210> 724

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 724

ccccagcgct tcagc 15

<210> 725

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 725

aatgtgcctt tcaactct 18

<210> 726

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник