РАСТЕНИЯ ТОМАТОВ С УЛУЧШЕННЫМИ ПРИЗНАКАМИ Российский патент 2024 года по МПК A01H5/08 C12Q1/68 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США сер. № 62/613617, поданной 4 января 2018 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Включение перечня последовательностей

[0002] Перечень последовательностей, содержащий файл с именем “SEMB033WO_ST25.txt”, который составляет 36 килобайт (как измерено в MS-Windows®) и создан 2 января 2019 года, содержит 65 последовательностей и включен в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Данное изобретение относится к области селекции растений и, более конкретно, к способам и композициям для получения растений томатов с улучшенным качество плодов без сцепленных вредных признаков.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Качество и вкус плодов являются важными характеристиками при селекции томатов, в частности, для разработки коммерческих сортов. Хотя аллели качества плодов были идентифицированы в томатах, попытки по внедрению этих аллелей в культивируемые линии были затруднены из-за отсутствия специфических маркеров, сцепленных с аллелями, а также наличием вредных аллелей, генетически сцепленных с аллелями качества плодов, которые приводят к неприемлемым характеристикам растения, таких как некроз листьев. Применение селекции с помощью маркеров (MAS) для методов селекции растений предоставило возможность селекции растений на основе генетических маркеров, которые сцеплены с признаками, представляющими интерес. Тем не менее, точные маркеры для идентификации или отслеживания желательных признаков у растений часто недоступны, даже если ген, который связан с признаком, является охарактеризованным. Эти трудности дополнительно осложняются такими факторами, как полигенное или количественное наследование, эпистаз и часто неполное понимание генетического фона, лежащего в основе экспрессии желаемого фенотипа. В отсутствие точных и проверенных маркеров для применения в MAS может оказаться невозможным продуцировать новые линии растений, обладающие определенным качеством плодов, без неприемлемого некроза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СущностИ изобретения

[0005] В первом аспекте предлагается растение Solanum lycopersicum, содержащее рекомбинантный хромосомный сегмент на хромосоме 1, при этом указанный хромосомный сегмент содержит интрогрессированный аллель BRIX из S. pennellii, что обеспечивает повышенное количество BRIX у плода указанного растения по сравнению с плодом растения, не содержащего указанного аллеля, и в котором указанный хромосомный сегмент не имеет вредного аллеля, генетически сцепленного с указанным аллелем BRIX, который обуславливает некроз указанного растения, когда этот вредный аллель присутствует. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный аллель BRIX находится в пределах хромосомного сегмента, фланкированного маркерным локусом M3 (SEQ ID NO: 11) и маркерным локусом M11 (SEQ ID NO: 51) на хромосоме 1 указанного растения, например, в пределах хромосомного сегмента, фланкированного маркерным локусом M3 (SEQ ID NO: 11) и маркерным локусом M9 (SEQ ID NO: 41) на хромосоме 1 указанного растения или в пределах хромосомного сегмента, фланкированный маркерным локусом M4 (SEQ ID NO: 16) и маркерным локусом M5 (SEQ ID NO: 21) на хромосоме 1 указанного растения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный рекомбинантный хромосомный сегмент содержит локус маркера, выбранный из группы, состоящей из M1 (SEQ ID NO: 1), M2 (SEQ ID NO: 6), M3 (SEQ ID NO: 11), M4 (SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), M7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M9 (SEQ ID NO: 41), M10 (SEQ ID NO: 46), M11 (SEQ ID NO: 51), M12 (SEQ ID NO: 56) и M13 (SEQ ID NO: 61) на хромосоме 1. В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения указанное растение содержит аллель S. lycopersicum в локусе маркера M2 (SEQ ID NO: 6) и аллель S. pennellii в локусе маркера M3 (SEQ ID NO: 11). В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения указанное растение содержит аллель S. pennellii в локусе маркера M9 (SEQ ID NO: 41) и аллель S. lycopersicum в локусе маркера M10 (SEQ ID NO: 46). Кроме того, предлагаются растения, содержащие аллель S. lycopersicum в M2 (SEQ ID NO: 6) и M10 (SEQ ID NO: 46) и аллель S. pennellii в локусе маркера, выбранном из группы, состоящей из M3 (SEQ ID NO: 11), M4 (SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), M7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M9 (SEQ ID NO : 41) и M12 (SEQ ID NO: 56). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный аллель BRIX расположен в пределах хромосомного сегмента в геноме указанного растения, фланкированном 96 871 421 п.н. и 98 155 761 п.н. на карте Tomato SL3.0. Кроме того, предлагаются части растения, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный интрогрессированный аллель BRIX получают из линии LA0716 растения S. pennellii.

[0006] В другом аспекте предлагается сегмент рекомбинантной ДНК, включающий аллель BRIX, что обеспечивает повышенное количество BRIX у плода указанного растения, и не содержащий вредного аллеля, генетически связанного с указанным аллелем BRIX, который обуславливает некроз указанного растения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный сегмент рекомбинантной ДНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из M1 (SEQ ID NO: 1), M2 (SEQ ID NO: 6), M3 (SEQ ID NO: 11), M4 (SEQ ID NO: 16), M5 ( SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), M7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M9 (SEQ ID NO: 41), M10 (SEQ ID NO: 46), M11 (SEQ ID NO: 51), M12 (SEQ ID NO: 56) и M13 (SEQ ID NO: 61) В других вариантах осуществления данного изобретения сегменты рекомбинантной ДНК, описанные в данном документе, содержатся в растении, части растения, клетке растения или семени, и при этом указанный сегмент ДНК может обеспечивать повышенное количество BRIX для плода указанного растения.

[0007] В еще одном аспекте предлагаются способы получения растения томата, имеющего плод с повышенным количеством BRIX, при этом указанные способы включают: а) скрещивание растения томата, описанного в данном документе, с самим собой или со вторым растением томата другого генотипа для получения одного или большего количества растений потомства; и b) отбор растения потомства, содержащего указанный аллель BRIX и лишенного указанного вредного аллеля. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения отбор указанного растения потомства включает в себя обнаружение аллеля S. Lycopersicum в M2 (SEQ ID NO: 6) и обнаружение аллеля S. pennellii в M3 (SEQ ID NO: 11). В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения отбор указанного растения потомства дополнительно включает в себя обнаружение аллеля S. pennellii в локусе маркера M9 (SEQ ID NO: 41) и обнаружение аллеля S. lycopersicum в локусе маркера M10 (SEQ ID NO: 46). В других вариантах осуществления данного изобретения указанное растение потомства представляет собой растение потомства F₂-F₆. В других вариантах осуществления данного изобретения продуцирование указанного растения потомства включает обратное скрещивание.

[0008] В дополнительном аспекте предлагаются способы получения растения томата, имеющего плод с повышенным количеством BRIX, включающие интрогрессирование в растение аллеля BRIX в пределах рекомбинантного хромосомного сегмента, фланкированного в геноме указанного растения маркерным локусом M3 (SEQ ID NO: 11) и маркерным локусом M11 (SEQ ID NO: 51) на хромосоме 1, при этом указанный аллель BRIX обеспечивает повышенное количество BRIX для указанного плода указанного растения по сравнению с растением, не содержащим указанный аллель, и в котором указанный рекомбинантный хромосомный сегмент не имеет вредного аллеля, генетически сцепленного с указанным аллелем BRIX, который обуславливает усиленный некроз указанного растения при наличии такого вредного аллеля. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный рекомбинантный хромосомный сегмент расположен в пределах хромосомного сегмента, фланкированного маркерным локусом M3 (SEQ ID NO: 11) и маркерным локусом M9 (SEQ ID NO: 41) на хромосоме 1 указанного растения, например, в пределах хромосомного сегмента, фланкированного маркерным локусом M4 (SEQ ID NO: 16) и маркерным локусом M5 (SEQ ID NO: 21) на хромосоме 1 указанного растения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный рекомбинантный хромосомный сегмент содержит локус маркера, выбранный из группы, состоящей из M1 (SEQ ID NO: 1), M2 (SEQ ID NO: 6), M3 (SEQ ID NO: 11), M4 (SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), M7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M9 (SEQ ID NO: 41), M10 (SEQ ID NO: 46), M11 (SEQ ID NO: 51), M12 (SEQ ID NO: 56) и M13 (SEQ ID NO: 61) В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения указанное растение содержит аллель S. lycopersicum в локусе маркера M2 (SEQ ID NO: 6) и аллель S. pennellii в локусе маркера M3 (SEQ ID NO: 11). В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения указанное растение содержит аллель S. pennellii в локусе маркера M9 (SEQ ID NO: 41) и аллель S. lycopersicum в локусе маркера M10 (SEQ ID NO: 46). В способах, представленных в данном документе, интрогрессирование может включать возвратное скрещивание, селекцию с помощью маркеров или анализ указанного плода указанного растения на предмет повышенного количества BRIX. Кроме того, предлагаются растения томата, которые можно получить с помощью способов, представленных в данном документе.

[0009] В еще одном аспекте предлагаются способы отбора растения томата, имеющего плод с повышенным количеством BRIX, при этом указанные способы включают: а) скрещивание растения томата, описанного в данном документе, с самим собой или со вторым растением томата другого генотипа для получения одного или большего количества растений потомства; и b) отбор растения потомства, содержащего указанный аллель BRIX и лишенного указанного вредного аллеля. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения отбор указанного растения потомства включает в себя обнаружение аллеля S. Lycopersicum в M2 (SEQ ID NO: 6) и обнаружение аллеля S. pennellii в M3 (SEQ ID NO: 11). В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения отбор указанного потомства растения дополнительно включает в себя обнаружение аллеля S. pennellii в локусе маркера M9 (SEQ ID NO: 41) и обнаружение аллеля S. lycopersicum в локусе маркера M10 (SEQ ID NO: 46). В определенных вариантах осуществления данного изобретения указанное растение потомства представляет собой растение потомства F₂-F₆. В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения продуцирование указанного растения потомства включает возвратное скрещивание.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0010] Фиг. 1 демонстрирует измерение зоны некроза для растения томата. Некроз измеряется в области 40 см выше и 40 см ниже от последнего (самого младшего) кластера с полностью созревшими плодами томатов.

Подробное описание сущности изобретения

[0011] Качество и вкус плодов становятся все более важными характеристиками в выращивании продовольственных культур. Потребители томатов особенно заинтересованы в сортах с лучшими вкусовыми качествами. Вкус спелых томатов определяют многие факторы, но одним из них, преимущественно применяемых в промышленности, является содержание растворимых сухих веществ, или BRIX. Уровни BRIX в плодах определяются факторами окружающей среды и генетикой. Некоторые аллели, которые повышают уровни BRIX, были определены в некультивируемых линиях растений, однако усилия по внедрению этих аллелей в культивируемые линии затруднены недостатками в растениеводстве. Когда селекционер интрогрессирует признак от дикого родственника, наблюдаемые плодоводческие недостатки могут быть результатом плейотропии или перемещения сцепления. Плейотропия, как правило, может быть преодолена путем нескольких циклов обратного скрещивания с культивируемым плодоводческим родительским растением высшего качества. Тем не менее, преодоление перемещения сцепления осуществляется значительно сложнее, и при этом успех не гарантирован.

[0012] Перемещение сцепления является результатом нежелательных аллелей, жестко связанных с аллелем, представляющим интерес. В некоторых случаях возможно, что нежелательные плодоводческие признаки даже обусловлены геном, представляющим интерес. Кроме того, рекомбинация часто подавляется в тех регионах, которые интрогрессированы у диких родственников, особенно если эти родственники дополнительно удалены генетически. В случае жестко сцепленного перемещения сцепления, изучение маркеров может помочь селекционеру преодолеть нежелательные плодоводческие признаки. Кроме того, могут быть разработаны акты рекомбинации, чтобы предоставить селекционерам наименьшую интрогрессию ДНК диких видов, которую можно применять в селекционных программах.

[0013] Были предприняты усилия для интрогрессии аллелей, которые повышают уровни BRIX томатов, из некультивируемых линий в культивируемые линии томатов. Например, локус, который повышает уровни BRIX плодов томата расположен на хромосоме 1 генома Solanum pennellii. Локус был обнаружен в исследовании линии интрогрессии S. pennellii LA0716 x S. lycopersicum cv. M82 Эти линии и производные сублинии можно получить по запросу в Еврейском университете в Иерусалиме или в Институте молекулярной физиологии растений им. Макса Планка (Alseekh, et al. 2013). Кроме того, LA0716 можно получить из Центра генетических ресурсов томатов в Дэвисе, штат Калифорния, США. Однако эти интрогрессии локуса BRIX на хромосоме 1 также несут жестко сцепленный вредный аллель, который вызывает некроз листьев. Этот некроз листьев наиболее заметен в условиях слабого освещения и, таким образом, наиболее легко обнаруживается у растений томатов, выращиваемых в зимние месяцы. Некроз листьев часто встречается у растений томатов во время цикла роста, как правило, у более старых нижних листьев. Как правило, это допускается производителями. Однако некроз листьев, вызванный аллелем, жестко сцепленным с аллелем, повышающим уровень BRIX, из S. pennellii на хромосоме 1, происходит на листьях вокруг созревшей кисти. Это является неприемлемым признаком для производителей томатов, и любой сорт с таким типом некроза сразу же считается непригодным для продажи. Поэтому получение плодов с повышенным содержанием BRIX без неприемлемого некроза остается серьезной проблемой.

[0014] Авторы данного изобретения впервые картировали как аллели, повышающие уровень BRIX, так и сцепленные вредные аллели некроза на хромосоме 1, и разработали набор маркеров, которые могут отслеживать присутствие или отсутствие аллелей BRIX и аллелей некроза во время селекции растений. Авторы данного изобретения также создали уменьшенную интрогрессию, включающую локус количественных признаков (QTL), ответственного за повышение уровня BRIX, на хромосоме 1 с отсутствующим перемещением сцепления, ассоциированным с некрозом листьев, из S. pennellii. QTL BRIX был картирован в область 6,6 сМ между маркером M3 (SEQ ID NO: 11; изменение SNP [A/G] с 96 871 421 п.н.) и маркером M10 (SEQ ID NO: 46; изменение SNP [C/T] с 98 155 761 п.н.), в то время как QTL некроза листьев находится на расстоянии около 1,2 сМ от локуса BRIX возле маркера M1 (SEQ ID NO: 1; изменение SNP [G/C] с 96 680 481 п.н.), проксимальный конец QTL BRIX. Чтобы расцепить два локуса, авторы данного изобретения дополнительно разработали новый молекулярный маркер, M2 (SEQ ID NO: 6; изменение SNP [T/G] с 96 761 293 п.н.), который можно применять для выбора QTL, повышающего уровень BRIX, из S. pennellii и против QTL, ответственного за некроз листьев, из S. pennellii.

[0015] Авторы данного изобретения впервые обнаружили, что вредные аллели некроза можно удалить из растения, содержащего интрогрессию для повышения уровня BRIX на хромосоме 1, путем отбора растений с актом рекомбинации между маркерными локусами M2 (SEQ ID NO: 6) и M3 (SEQ ID NO: 11), при этом локус маркера M2 (SEQ ID NO: 6) обеспечивает аллель S. lycopersicum , а локус маркера M3 (SEQ ID NO: 11) - аллель S. pennellii. В этих растениях локус некроза и локус повышения уровня BRIX расцеплены. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения размер интрогрессии S. pennellii может варьироваться на дистальном конце QTL, ответственного за повышение уровня BRIX, и может включать остальную часть дистального плеча хромосомы 1.

[0016] В других вариантах осуществления данного изобретения, в дополнение к акту рекомбинации между маркерными локусами M2 (SEQ ID NO: 6) и M3 (SEQ ID NO: 11), обнаружен еще один акт рекомбинации между маркерным локусом M9 (SEQ ID NO: 41; изменение SNP [A/G] в 97 237 436 п.н.), и маркерным локусом M10 (SEQ ID NO: 46). В этом варианте осуществления данного изобретения аллель S. pennellii присутствует в локусе маркера M9, а аллель S. lycopersicum присутствует в M10. Эта версия устраняет нежелательные или ненужные ДНК S. pennellii, как на проксимальной, так и на дистальной стороне QTL, что приводит к интрогрессии минимального количества ДНК S. pennellii, необходимого для получения фенотипа с повышенным уровнем BRIX без перемещения сцепления, ассоциированного с некрозом листьев.

[0017] В других вариантах осуществления данного изобретения, в дополнение к акту рекомбинации между маркерными локусами M2 (SEQ ID NO: 6) и M4 (SEQ ID NO: 16), обнаружен еще один акт рекомбинации между маркерным локусом M12 (SEQ ID NO: 56; изменение SNP [ G/A] в 97 062 157 п.н.) и маркерным локусом M13 (SEQ ID NO: 61; изменение SNP [T/G] в 97 261 644 п.н.). В этом варианте осуществления данного изобретения аллель S. pennellii присутствует в локусе маркера M12, а аллель S. lycopersicum присутствует в M13. Эта версия устраняет нежелательные или ненужные ДНК S. pennellii, как на проксимальных и дистальных сторонах QTL, что приводит к интрогрессии минимального количества ДНК S. pennellii, необходимого для получения фенотипа с повышенным уровнем BRIX без перемещения сцепления, ассоциированного с некрозом листьев.

[0018] Кроме того, в данном изобретении предлагаются маркеры для отслеживания и идентификации новых рекомбинантных интрогрессий в растениях в процессе селекции. Краткое изложение пригодных маркеров приведено в Таблице 1. Например, маркерные локусы М2 (SEQ ID NO: 6), М3 (SEQ ID NO: 11), М4 (SEQ ID NO: 16; изменение SNP [C/G] в 96 902 157 п.н.), М5 (SEQ ID NO: 21; изменение SNP [G/A] в 96 934 226 п.н.), M6 (SEQ ID NO: 26; изменение SNP [G/A] в 97 023 393 п.н.), М7 (SEQ ID NO: 31; изменение SNP [G/A] в 96 985 002 п.н.), M8 (SEQ ID NO: 36; изменение SNP [T/A] в 96 998 916 п.н.), M12 (SEQ ID NO:56), М9 (SEQ ID NO:41), М13 (SEQ ID NO: 61), и М10 (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения локус BRIX может быть выбран путем обнаружения растений с аллелем S. pennellii в одном из следующих локусов: M3 (SEQ ID NO:11), М4 (SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), М7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M12 (SEQ ID NO: 56), и/или М9 (SEQ ID NO: 41). Растения без некроза затем могут быть обнаружены путем отбора среди ранее отобранных растений для этих растений с аллелем S. Lycopersicum в М2 (SEQ ID NO: 6).

[0019] Кроме того, в данном изобретении предлагается акт селекции с пониженной рекомбинантной интрогрессией из S. pennellii между маркерными локусами М2 (SEQ ID NO:6) и М10 (SEQ ID NO: 46), что обеспечивает повышение уровня BRIX без некроза. Этот акт селекции может быть применен для интрогрессии аллелей BRIX из S. pennellii в любой желаемый генотип томата без вредного перемещения сцепления.

[0020] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются растения томатов, содержащие интрогрессированный аллель на хромосоме 1, при этом указанный интрогрессированный аллель обеспечивает плоду указанного растения повышенный уровень BRIX по сравнению с растением, не содержащим указанный аллель, и при этом у указанного растения отсутствует дополнительный аллель, генетически сцепленный с указанным интрогрессированным аллелем, который обеспечивает некроз, когда присутствует.

[0021] В других вариантах осуществления данного изобретения предлагаются растения, содержащие один или большее количество новых рекомбинантных интрогрессий, представленных в данном документе. В результате этих новых интрогрессии получают плоды с повышенным уровнем BRIX, избегая при этом некроза, ранее ассоциированного с аллелями, повышающими уровни BRIX. Дополнительно предлагаются способы получения растений, описанных в данном документе.

[0022] Поскольку генетически разнообразные линии растений может быть трудно скрещивать, интрогрессия аллелей, повышающих уровень BRIX, в культивируемые линии с помощью традиционных способов селекции может потребовать непомерно больших сегрегационных популяций для скрининга потомства с неопределенным результатом. Следовательно, селекция с помощью маркеров (MAS - marker-assisted selection) является необходимой для эффективной интрогрессии аллелей BRIX в элитные сорта без неприемлемого некроза. Однако с помощью ранее известных маркеров для повышения уровня BRIX не было возможности определить различия между донорной ДНК, обеспечивающей повышение уровня BRIX, и донорной ДНК, обеспечивающей вредные признаки. Это еще более осложнялось ранее известной неспособностью устранять определенные области, ассоциированные с повышением уровня BRIX. Впервые, в данном изобретении предлагается эффективная MAS, обеспечивающая улучшенные и валидированные маркеры для выявления генотипов, ассоциированных с повышением уровня BRIX и вредным некрозом, без необходимости выращивать большие популяции растений до стадии зрелости с целью наблюдения фенотипа.

[0023] Следовательно, в данном изобретении дополнительно предлагаются новые маркеры, сцепленные с признаками, которые можно использовать для получения растений, содержащих новые рекомбинантные интрогрессии на хромосоме 1, обеспечивающие повышенные уровни BRIX, как описано в данном документе. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения предлагаются маркеры, продемонстрированные в Таблице 1. В других вариантах осуществления данного изобретения предлагаются маркеры M1 (SEQ ID NO: 1), М2 (SEQ ID NO: 6), М3 (SEQ ID NO: 11), М4 (SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), М7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), М9 (SEQ ID NO: 41), М10 (SEQ ID NO: 46), М11 (SEQ ID NO: 51), M12 (SEQ ID NO: 56), и М13 (SEQ ID NO: 61) на хромосоме 1, которые могут применяться для отслеживания аллелей BRIX и некроза в растениях томатов в процессе селекции.

[0024] Дополнительно предлагаются способы получения растений, включающие уменьшенные рекомбинантные интрогрессии, описанные в данном документе. В некоторых примерах, донорную ДНК от донора-родителя с высоким уровнем BRIX интрогрессируют в культивируемую линию растения (рекуррентная родительская линия). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения растения могут быть отобраны на основе обнаружения рекуррентной родительской ДНК в маркерных локусах M2 (SEQ ID NO: 6) и M13 (SEQ ID NO: 61) или M10 (SEQ ID NO: 46) и донорной ДНК в маркерном локусу, выбранном из группы, состоящей из M3 (SEQ ID NO: 11), M4 (SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), M7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M12 (SEQ ID NO: 56) и M9 (SEQ ID NO: 41).

[0025] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются способы получения или отбора растения томата, имеющего плод с повышенным количеством BRIX, без некроза, при этом указанные способы включают: а) скрещивание растения томата, описанного в данном документе, с самим собой или со вторым растением томата другого генотипа для получения одного или большего количества растений потомства; и b) отбор растения потомства, содержащего указанный аллель BRIX и лишенного аллеля некроза. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения описанные способы включают отбор потомства растения путем обнаружения по меньшей мере одного полиморфизма в локусе, выбранном из группы, состоящей из локуса маркера M2 (SEQ ID NO: 6), M3 (SEQ ID NO: 11), M4 ( SEQ ID NO: 16), M5 (SEQ ID NO: 21), M6 (SEQ ID NO: 26), M7 (SEQ ID NO: 31), M8 (SEQ ID NO: 36), M9 (SEQ ID NO: 41), M10 (SEQ ID NO: 46), M12 (SEQ ID NO: 56) и M13 (SEQ ID NO: 61)

Геномные области, аллели и полиморфизмы, ассоциированные с BRIX и некрозом, у растений томатов

[0026] В данном изобретении предлагаются новые интрогрессии одного или большего количества аллелей, ассоциированных с повышенным уровнем BRIX и некрозом у растений томатов, наряду с полиморфными нуклеиновыми кислотами и сцепленными маркерами для отслеживания интрогрессий во время селекции растений.

[0027] Линии томатов, проявляющие BRIX, известны в данной области техники и могут применяться вместе с новыми сцепленными с признаками маркерами, представленными в данном документе, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения. Например, образец дикого томата Solanum pennellii LA0716 (доступный в Центре генетических ресурсов томатов в Дэвисе, штат Калифорния, США) может применяться в качестве источника аллелей, повышающих уровень BRIX. Применяя улучшенные генетические маркеры и анализы по данному изобретению, заявители смогли успешно идентифицировать новую уменьшенную интрогрессию S. pennellii, которая обеспечивает повышенный уровень BRIX для плода растения с меньшим количеством вредных признаков при интрогрессии в культивируемую линию. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к растениям томатов, содержащих ДНК донора между маркером локус M3 (SEQ ID NO:11) и М10 (SEQ ID NO: 46) на хромосоме 1.

[0028] Новые интрогрессии, представленные в данном документе, обеспечивают значительное повышение уровня BRIX, избегая некроза, наблюдаемого при применении обычных интрогрессий. Таким образом, данное изобретение представляет собой значительное достижение в данной области техники.

Интрогрессия геномных областей, ассоциированных с повышением уровня BRIX

[0029] Интрогрессия с помощью маркеров включает перенос хромосомной области, которая определена одним или большем количеством маркеров, из первого набора генетических признаков во второе. Потомство от скрещивания, которое содержит интрогрессированную геномную область, может быть идентифицировано с помощью комбинации маркеров, характерных для желаемой интрогрессированной геномной области из первого набора генетических признаков, и как сцепленными, так и несцепленными маркерами, характерными для второго набора генетических признаков.

[0030] В данном изобретении предлагаются новые точные маркеры для идентификации и отслеживания интрогрессии одной или большего количества геномных областей, описанных в данном документе, из донорного растения, содержащего аллели, повышающие уровень BRIX, в культивируемую линию. Дополнительно, в данное изобретении предлагаются маркеры для идентификации и отслеживания новых интрогрессий, описанных в данном документе, в ходе селекции растений, в том числе маркеры, которые приведены в Таблице 1.

[0031] Маркеры, в пределах геномных интервалов или сцепленные с любым из геномных интервалов по данному изобретению, могут быть пригодны для различных селекционных действий, которые включают интрогрессию геномных областей, которые ассоциированы с повышенным уровнем BRIX, в желаемое генетическое окружение. Например, маркер в пределах 40 сМ, 20 сМ, 15 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 2 сМ или 1 сМ от маркера, ассоциированного с повышенными уровнями BRIX, описанный в данном документе, можно применять для интрогрессии с помощью маркеров геномных областей, ассоциированных с фенотипом, устойчивым к болезням.

[0032] Также предлагаются растения томатов, которые содержат одну или большее количество интрогрессированных областей, которые ассоциированы с желаемым фенотипом, при этом по меньшей мере 10%, 25%, 50%, 75%, 90% или 99% оставшихся геномных последовательностей несут маркеры, характерные для рекуррентной родительской зародышевой плазмы. Также предлагаются растения томатов, которые содержат интрогрессированную область, которая содержит области, тесно сцепленные или смежные с геномными областями, и маркеры, описанные в данном документе и ассоциированные с фенотипом, характеризующимся повышенным уровнем BRIX.

Разработка сортов томатов с повышенным уровнем BRIX

[0033] Для большинства селекционных целей коммерческие селекционеры работают в зародышевой плазме, которая представляет собой «культивируемую плазму», «культивируемый тип» или «элиту». Эти культивируемые линии могут применяться в качестве рекуррентных родителей или в качестве источника рекуррентных родительских аллелей в ходе селекции. Культивируемую или элитную зародышевую плазму легче размножать, потому что она, как правило, хорошо себя зарекомендовала, если оценивать плодоовощную продуктивность. Многие культивируемые типы томатов были разработаны и известны в данной области техники как агрономически элитные и пригодные для коммерческого выращивания. Однако преимущество в продуктивности, которое обеспечивает культивируемая зародышевая плазма, может быть нейтрализовано отсутствием аллельного разнообразия. Селекционеры обычно принимают этот компромисс, поскольку прогресс идет быстрее при работе с культивируемым материалом, чем при селекции с генетически разнообразными источниками.

[0034] В отличие от этого, когда культивируемую зародышевую плазму скрещивают с некультивируемой зародышевой плазмой, селекционер может получить доступ к новым аллелям из некультивируемого типа. Некультивируемая зародышевая плазма может применяться в качестве источника донорных аллелей в ходе селекции. Тем не менее, этот подход обычно представляет значительные трудности из-за проблем фертильности, ассоциированных со скрещиваниями между различными линиями, и отрицательного перемещения сцепления от некультивируемого родителя. Например, некультивируемые типы томатов могут обеспечить аллели, ассоциированные с повышенным качеством плодов. Однако, эти некультивируемые типы могут иметь плохие плодоовощные качества, такие как повышенная восприимчивость к некрозу.

[0035] Процесс интрогрессии желательных генов из некультивируемых линий в элитные культивируемые линии с избежанием при этом проблем с перемещением сцепления или низкой наследуемостью, представляет собой длительный и часто трудный процесс. При развертывании аллелей, полученных от диких родственников, часто желательно ввести минимальную или усеченную интрогрессию, которая обеспечивает желательный признак, но не имеет вредных эффектов. Для облегчения интрогрессии надежные маркерные анализы предпочтительнее фенотипических скринингов. Успеху способствует упрощение генетики для ключевых характеристик, что позволяет сосредоточиться на генетическом эффекте количественных признаков, таких как повышение качества плодов. Более того, процесс интрогрессии геномных областей из некультивируемых линий может быть значительно облегчен благодаря наличию точных маркеров для MAS.

[0036] Таким образом, специалисту в данной области техники будет очевидно, что аллели, полиморфизмы и маркеры, предложенные в данном изобретении, позволяют отслеживать и интродуцировать любую из геномных областей, которые определены в данном документе, в любое генетическое окружение. Кроме того, описанные в данном документе геномные области, которые ассоциируются с повышенным уровнем BRIX, могут быть интрогрессированы из одного генотипа в другой и прослежены с помощью MAS. Таким образом, обнаружение авторами изобретения точных маркеров, которые ассоциируются с повышенным уровнем BRIX, будет способствовать созданию растений томатов с предпочтительными фенотипами. Например, с применением маркеров по данному изобретению могут быть генотипированы семена с целью отбора растений, которые содержат желаемые геномные области, которые ассоциируются с повышенным уровнем BRIX. Кроме того, MAS позволяет идентифицировать растения гомозиготные или гетерозиготные по желаемой интрогрессии.

[0037] Межвидовые скрещивания также могут приводить к супрессии рекомбинации и получению растений с низкой фертильностью или плодовитостью. Например, супрессия рекомбинации наблюдалась для гена устойчивости к томатной нематоде Mi, генов ячменя Mla и Mlg, генов пшеницы Yr17 и Lr20, гена виноградной лозы Run1, а также гена арахиса Rma . Мейотическая рекомбинация имеет важное значение для классической селекции, поскольку она позволяет переносить благоприятные аллели в другие генетические окружения, удалять вредные геномные фрагменты и пирамидировать признаки, которые являются генетически жестко сцепленными. Поэтому при отсутствии точных маркеров, супрессированная рекомбинация вынуждает селекционеров увеличивать сегрегацию популяций при скрининге потомства для того, чтобы прийти к желаемой генетической комбинации.

[0038] Фенотипическая оценка больших популяций требует много времени, ресурсов и не воспроизводится в любой среде. Селекция с помощью маркеров предлагает приемлемую альтернативу. Молекулярные анализы, которые разработаны для обнаружения уникальных полиморфизмов, таких как SNP, являются универсальными. Однако, они могут не различать аллели внутри и среди видов томатов в одном анализе. Структурные перестройки хромосом, такие как делеции, ухудшают гибридизацию и расширение синтетически меченых олигонуклеотидов. В случае актов дубликации многочисленные копии амплифицируются в одной реакции без разграничения. Поэтому разработка и проверка точных и высокопрогнозируемых маркеров представляются важными для успешных селекционных программ MAS.

Методы селекции с помощью маркеров

[0039] Генетические маркеры, которые могут применяться в практике данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (RFLP - restriction fragment length polymorphisms), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (AFLP - amplified fragment length polymorphisms), простые повторяющиеся последовательности (SSR - simple sequence repeats), полиморфизмы длин простой последовательности (SSLP - simple sequence length polymorphisms), одиночные нуклеотидные полиморфизмы (SNP - single nucleotide polymorphisms), полиморфизмы вставки/делеции (Indel - insertion/deletion polymorphisms), тандемные повторы с вариабельным числом (VNTR - variable number tandem repeats) и случайно амплифицированную полиморфную ДНК (RAPD - random amplified polymorphic DNA), изозимы и другие маркеры, известные специалистам в данной области техники. Обнаружение и разработка маркеров в сельскохозяйственных растениях обеспечивает первичный каркас для применения в селекции с помощью маркеров (патентные публикации США №: 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305 и 2006/00504538). Полученная «генетическая карта» является представлением положения характеризуемых локусов (полиморфных маркеров нуклеиновой кислоты или любого другого локуса, для которого могут быть идентифицированы аллели) относительно друг к другу.

[0040] Полиморфизмы, которые содержат всего лишь одну нуклеотидную замену, можно анализировать несколькими способами. Например, обнаружение может быть осуществлено с помощью электрофоретических методов, включая конформационный полиморфизм одиночной цепи (Orita, et al. (1989) Genomics, 8(2), 271-278), электрофорез в градиенте денатурирующего геля (Myers (1985) EPO 0273085), или полиморфизм длины расщепленных фрагментов (Life Technologies, Inc., Gathersberg, MD), но широко распространенная доступность сиквенирования ДНК часто упрощает прямое сиквенирование амплифицированных продуктов. После получения данных о различии полиморфных последовательностей, могут быть разработаны быстрые анализы для тестирования потомства, как правило, с помощью какой-либо версии ПЦР-амплификации специфических аллелей (PASA; Sommer, et al. (1992) Biotechniques 12(1), 82-87), или ПЦР-амплификации множества специфических аллелей (PAMSA; Dutton and Sommer (1991) Biotechniques, 11(6), 700-7002).

[0041] Полиморфные маркеры служат пригодным инструментом для анализа растений с целью определения степени идентичности линий или сортов (патент США № 6207367). Эти маркеры являются основой для определения ассоциаций с фенотипами и могут применяться для стимулирования генетического эффекта. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению полиморфные нуклеиновые кислоты могут применяться для обнаружения в растении томата генотипа, ассоциированного с повышенными уровнями BRIX, идентификации растения томата с генотипом, ассоциированным с повышенными уровнями BRIX, и отбора растения томата с генотипом, ассоциированным с повышенными уровнями BRIX. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению полиморфные нуклеиновые кислоты могут применяться для получения растения томата, которое содержит в своем геноме интрогрессированный локус, ассоциированный с повышенными уровнями BRIX. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения полиморфные нуклеиновые кислоты могут применяться для селекции растений потомства томата, которые содержат локус, ассоциированный с повышенными уровнями BRIX.

[0042] Генетические маркеры могут включать «доминантные» или «кодоминантные» маркеры. «Кодоминантные» маркеры выявляют наличие двух или большего количества аллелей (два на диплоидный индивидуум). «Доминантные» маркеры выявляют наличие только одного аллеля. Маркеры предпочтительно наследуются кодоминантным способом, так что присутствие обоих аллелей в диплоидном локусе, или множественных аллелей в триплоидных или тетраплоидных локусах, легко обнаруживаются, и они не ограничены изменением окружающей среды, то есть их наследуемость равна 1. Генотип маркера обычно содержит два маркерных аллеля в каждом локусе диплоидного организма. Маркерная аллельная композиция каждого локуса может быть либо гомозиготной, либо гетерозиготной. Гомозиготность является условием, при котором оба аллеля в локусе характеризуются одной и той же нуклеотидной последовательностью. Гетерозиготность относится к различным состояниям аллеля в локусе.

[0043] Анализы на основе нуклеиновых кислот, для определения наличия или отсутствия генетического полиморфизма (то есть генотипирования), могут применяться в селекционных программах для идентификации, отбора, интрогрессии и т. п. Широкое разнообразие генетических маркеров для анализа генетических полиморфизмов доступно и известно специалистам в данной области техники. Указанный анализ можно применять для отбора генов, частей генов, QTL, аллелей или геномных областей, которые включают или сцеплены с генетическим маркером, который ассоциирован с повышенными уровнями BRIX в растениях томата.

[0044] Применяемые в данном документе методы анализа нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, методы детектирования на основе ПЦР (например, анализы TaqMan), методы микрочипов, методы на основе масс-спектрометрии и/ или методы сиквенирования нуклеиновых кислот, включая полное сиквенирование генома. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения обнаружение полиморфных сайтов в образце ДНК, РНК или кДНК может быть облегчено с помощью способов амплификации нуклеиновых кислот. Такие способы специально увеличивают концентрацию полинуклеотидов, которые охватывают полиморфный сайт или включают этот сайт и последовательности, которые расположены либо дистально, либо проксимально по отношению к нему. Такие амплифицированные молекулы могут быть легко обнаружены с помощью гель-электрофореза, методами флуоресцентного детектирования или другими способами.

[0045] Один из способов достижения такой амплификации использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (Mullis et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273; Европейский патент 50 424; Европейский патент 84 796; Европейский патент 258 017; Европейский патент 237 362; Европейский патент 201 184; патент США 4 683 202; патент США 4 582 788; и патент США 4 683 194), в которой используются пары праймеров, способные гибридизоваться с проксимальными последовательностями, которые определяют полиморфизм в его двухцепочечной форме. Могут также применяться способы типирования ДНК на основе масс-спектрометрии. Такие способы описаны в патентах США 6 613 509 и 6 503 710 и в содержащихся в них ссылках.

[0046] Полиморфизмы в последовательностях ДНК могут быть обнаружены или типизированы с помощью различных эффективных способов, хорошо известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, способы, описанные в патентах США №№ 5 468 613, 5 217 863; 5 210 015; 5 876 930; 6 030 787; 6 004 744; 6 013 431; 5 595 890; 5 762 876; 5 945 283; 5 468 613; 6 090 558; 5 800 944; 5 616 464; 7 312 039; 7 238 476; 7 297 485; 7 282 355; 7 270 981 и 7 250 252, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Однако, композиции и способы по данному изобретению могут применяться в сочетании с любым способом типирования полиморфизма для типирования полиморфизмов в образцах геномной ДНК. Эти использованные образцы геномной ДНК включают, но не ограничиваются ими, геномную ДНК, выделенную непосредственно из растения, клонированную геномную ДНК или амплифицированную геномную ДНК.

[0047] Например, полиморфизмы в последовательностях ДНК могут быть обнаружены путем гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными (ASO) зондами, как описано в патентах США №№ 5 468 613 и 5 217 863. Патент США № 5 468 613 описывает аллель-специфические олигонуклеотидные гибридизации, в которых единичные или множественные нуклеотидные вариации в последовательности нуклеиновой кислоты могут быть обнаружены в нуклеиновых кислотах с помощью процесса, при котором последовательность, которая содержит нуклеотидную вариацию, амплифицируют, наносят на мембрану и обрабатывают меченым олигонуклеотидным зондом, специфическим для данной последовательности.

[0048] Целевую последовательность нуклеиновой кислоты также можно обнаружить с помощью способов лигирования зонда, например, как описано в патенте США № 5800944, когда интересующую последовательность, представляющую интерес, амплифицируют и гибридизуют с зондами с последующим лигированием для обнаружения меченой части зонда.

[0049] Также для обнаружения полиморфизма могут применяться микрочипы, в которых наборы олигонуклеотидных зондов собраны перекрывающимся способом для того, чтобы представить одну последовательность таким образом, что различие в целевой последовательности в одной точке приведет к частичной гибридизации зонда (Borevitz et al., Genome Res. 13:513-523 (2003); Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005). Ожидается, что на любом одном микрочипе будет множество целевых последовательностей, которые могут представлять гены и/или некодирующие области, при этом каждая целевая последовательность представлена серией перекрывающихся олигонуклеотидов, а не одним зондом. Эта платформа обеспечивает высокопроизводительный скрининг множества полиморфизмов. Типирование целевых последовательностей с помощью способов на основе микрочипов описано в патентах США 6 799 122, 6 913 879 и 6 996 476.

[0050] Другие способы для обнаружения SNP и Indel включают способы достройки по одному основанию (single base extension, SBE). Примеры способов SBE включают, но не ограничиваются ими, примеры, которые описаны в патентах США №№ 6004744; 6013431; 5595890; 5762876; и 5945283.

[0051] В другом способе обнаружения полиморфизмов, SNP и Indel могут быть обнаружены с помощью способов, описанных в патентах США №№ 5 210 015, 5 876 930 и 6 030 787, в которых олигонуклеотидный зонд имеет 5'- флуоресцентный репортерный краситель и 3'- гасящий краситель, ковалентно сцепленные с 5'- и 3'- концами зонда. Когда зонд остается интактным, близость репортерного красителя к гасящему красителю приводит к супрессии флуоресценции репортерного красителя, например, путем переноса энергии по Ферстеровскому типу. Во время ПЦР, прямой и обратный праймеры гибридизуются со специфической последовательностью целевой ДНК, фланкирующей полиморфизм, тогда как гибридизационный зонд гибридизуется с полиморфизмосодержащей последовательностью в амплифицированном продукте ПЦР. В последующем цикле ПЦР ДНК-полимераза с 5’ → 3’- экзонуклеазной активностью гидролизирует зонд и отделяет репортерный краситель от гасящего красителя, что в результате приводит к повышенной флуоресценции репортера.

[0052] В другом варианте осуществления данного изобретения целевой локус или локусы могут быть непосредственно сиквенированы с помощью технологий сиквенирования нуклеиновых кислот. Способы сиквенирования нуклеиновой кислоты, известные в данной области техники, включают технологии, предоставляемые компаниями 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Beverly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Biosciences (Lincoln, NE) , NimbleGen Systems (Madison, WI), Illumina (San Diego, CA) и VisiGen Biotechnologies (Houston, TX). Такие технологии сиквенирования нуклеиновых кислот включают такие форматы, как параллельные массивы бусин (parallel bead arrays), сиквенирование путем лигирования, капиллярный электрофорез, электронные микрочипы, «биочипы», микрочипы, параллельные микрочипы и одномолекулярные массивы (single-molecule arrays).

Определения

[0053] Нижеследующие определения приведены для лучшего понимания данного изобретения и в качестве руководства для специалистов в данной области техники в практике данного изобретения. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с обычным применением специалистами в данной области техники.

[0054] Применяемый в данном документе термин «растение» включает растительные клетки, протопласты растений, растительные клетки культуры ткани, из которых могут быть регенерированы растения томата, каллусы растений, группы растений и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растений, таких как пыльца, цветки, семена, листья, стебли и тому подобное.

[0055] Применяемый в данном документе термин «популяция» означает генетически гетерогенную совокупность растений, которая имеет общее родительское происхождение.

[0056] Применяемые в данном документе термины «сорт» и «культивар» означают группу сходных растений, которые по своим генетическим источникам происхождения и характеристикам могут быть отличены от других сортов внутри одного и того же вида.

[0057] Применяемый в данном документе термин «аллель» относится к одной из двух или большему количеству альтернативных форм геномной последовательности в данном локусе на хромосоме.

[0058] «Локус количественных признаков (QTL)» представляет собой хромосомное расположение, которое кодирует по меньшей мере первую аллель, которая влияет на экспрессивность фенотипа

[0059] Применяемый в данном документе термин «маркер» означает детектируемую характеристику, которая может использоваться для различения организмов. Примеры таких характеристик включают, но не ограничиваются ими, генетические маркеры, биохимические маркеры, метаболиты, морфологические характеристики и агрономические характеристики.

[0060] Применяемый в данном документе термин «фенотип» означает детектируемые характеристики клетки или организма, на которые может повлиять экспрессия гена.

[0061] Применяемый в данном документе термин «генотип» означает специфические аллельные составляющие растения.

[0062] Применяемый в данном документе термин «элитный» или «культивируемый» сорт означает любой сорт, который получили в результате селекции и отбора по улучшенным агрономическим характеристикам. Термин «элитное растение» относится к растению, принадлежащему к элитной разновидности. Многочисленные элитные сорта доступны и известны специалистам в области селекции томатов. «Элитная популяция» представляет собой множество элитных особей или сортов, которые могут быть использованы для представления состояния в области техники с точки зрения агрономически улучшенных генотипов данного вида сельскохозяйственной культуры, такой как томат. Аналогичным образом «элитная зародышевая плазма» или элитный штамм зародышевой плазмы представляет собой агрономически улучшенную зародышевую плазму.

[0063] Применяемый в данном документе термин «интрогрессированный» в контексте генетического локуса, относится к генетическому локусу, который был введен в новое генетическое окружение, например, путем возвратного скрещивания. Интрогрессия генетического локуса может быть достигнута посредством методов селекции растений и/или молекулярно-генетических методов. Такие молекулярно-генетические спо включают, но не ограничиваются ими, различные способы трансформации растений и/или способы, которые обеспечивают гомологичную рекомбинацию, негомологичную рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию и/ или геномные модификации, которые обеспечивают замену локуса или преобразование локуса.

[0064] Применяемые в данном документе термины «рекомбинантный» или «рекомбинированный» в контексте хромосомного сегмента относятся к рекомбинантным последовательностям ДНК, содержащим один или большее количество генетических локусов в конфигурации, в которой они не обнаруживаются в природе, например, в результате акта рекомбинации между гомологичными хромосомами во время мейоза.

[0065] Применяемый в данном документе термин «сцепленный» в контексте маркеров нуклеиновой кислоты и/или областей генома означает, что маркеры и/или области генома расположены в одной группе сцепления или хромосоме, так что они имеют тенденцию к совместной сегрегации при мейозе.

[0066] Термин «около» применяется для указания того, что значение включает стандартное отклонение ошибки для устройства или способа, который используется для определения значения. Термин «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если только явно не указано другое, или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя описание поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или». При применении в сочетании со словом «содержащий» или другим открытым словом в формуле изобретения слова с признаками единственного числа обозначают «один или большее количество», если не указано иное. Термины «содержать», «иметь» и «включать» являются открытыми связующими глаголами. Любые формы или времена одного или большего количества из этих глаголов, таких как «содержит», «содержащий», «имеет», «имеющий», «включает» и «включающий» также являются открытыми. Например, любой способ, который «содержит», «имеет» или «включает» один или большее количество этапов, не ограничен тем, что обладает только этими одним или большим количеством этапов, а также охватывает другие, не включенные в перечень, этапы. Аналогичным образом, любое растение, которое «содержит», «имеет» или «включает» один или большее количество признаков, не ограничено тем, что обладает только этими одним или большим количеством признаков, а охватывает другие, не включенные в перечень, признаки.

Примеры

Пример 1. Измерение BRIX и определение уровней некроза

[0067] BRIX, или содержание растворимых сухих веществ, обычно измеряется в промышленности томатов и часто применяется в качестве вкусового показателя. Для измерения BRIX применяют BRIX-метр, который представляет собой цифровой рефрактометр, откалиброванный с применением серий растворов сахарозы. В то время как способ измерения BRIX в образце является стандартным для всей отрасли, способ сбора для получения образца таким не является. Все способы сбора будут эффективными, если образцы собирают и обрабатывают одновременно, а образцы плодов последовательно срывают со всех растений. Это очень важно, потому что уровень BRIX в значительной степени зависит от условий окружающей среды и спелости плодов. Например, плоды, собранные в разное время года с одного и того же растения, могут иметь существенно разные уровни BRIX. Следовательно, BRIX часто выражается как относительная величина по сравнению с контролем. Указанный контроль зависит от эксперимента, но может иметь место, например, рекуррентный родитель, сестринская линия без интрогрессии, представляющей интерес, или стандартный сорт. В описанных в данном документе примерах применяли следующий способ сбора. Все плоды растений собирали два раза (H1 и H2). Сбор H1 осуществляли, когда вторая кисть последнего элемента достигала 80% зрелости. Это означает, что 80% плодов из кисти полностью окрашивались в цвет зрелых плодов. У каждого растения собирали самую последнюю кисть, которая имела 80% или более спелых плодов. Как правило, срывали 2 плода у основания кисти (ближе к стеблю). Для более мелких видов плодов это может быть 4 или 6 плодов, ближайших к стеблю растения. Сбор H2 осуществляли в конце эксперимента, при этом применяли тот же протокол сбора, что и для сбора H1. Плоды одного растения собирали и гомогенизировали. Затем определяли содержание BRIX для гомогенизированного образца.

[0068] Некроз определяли у взрослых растений с нормальной плодовой нагрузкой. Некроз листьев лучше всего наблюдать в условиях отсутствия искусственного освещения, так как искусственное освещение может вызвать собственную форму некроза листьев, и, как правило, в условиях более низкой освещенности, что обычно характерно для зимних месяцев. Растения следует сеять так, чтобы взрослые растения находились в экспериментальных условиях слабого освещения с ранней осени (середина сентября или октябрь) до апреля. Растения выращивают с помощью способов, обычно применяемых производителями томатов. Оценку некроза листьев следует начинать, когда растения положительного контроля демонстрируют некроз листьев промежуточного уровня, который соответствует четкие и/или интенсивным пятнам некроза на <10% поверхности листа. Другие категории для оценки могут включать (с возрастающей тяжестью): отсутствие признаков, незначительные признаки некроза на краю листа, четкие признаки некроза на краю листа, незначительные пятна некроза на < 10% поверхности листа, четкие пятна некроза на < 10% поверхности листа, интенсивные пятна некроза на < 10% поверхности листа, некроз на < 20% поверхности листа, некроз на < 50% поверхности листа и некроз на > 50% поверхности листа. Оценка не должна осущесвляться, пока растение не произвело два кластера полностью спелых плодов. Уровень некроза оценивают на листьях в зоне, простирающейся на около 40 см выше и на около 40 см ниже кисти, которая созревает в это время (Фиг. 1). Эта зона является относительным местоположением, при этом точное расстояние от почвы может варьироваться между анализируемыми растениями в зависимости от расмещения плодов и скорости роста. Важно, чтобы в эксперименте был адекватный положительный и отрицательный контроль растений. Растениями положительного контроля являются, например, инбредная линия IL1-4, которую можно получить от Zamir или Fernie (Alsheekh, et al. 2013), или растения с аллелями S. pennellii возле маркера M1 (SEQ ID NO: 1) и M2 (SEQ ID NO: 6). Адекватным отрицательным контролем является родительская линия с интрогрессией S. pennellii на хромосоме 1. Хотя интенсивность некроза варьируется в зависимости от генетического фона, некроз может наблюдаться во всех случаях.

Пример 2. Удаление вредных признаков на хромосоме 1

[0069] В предыдущих исследованиях идентифицировали несколько локусов, в том числе pen1(получен из линии LA0716 S. pennellii), с потенциалом улучшения вкуса за счет повышения уровня BRIX (содержание растворимых твердых веществ в водном растворе (г/100 мл)). Было обнаружено, что первоначальные интрогрессии этого локуса BRIX продемонстрировали значительное повышение уровня BRIX, но также продемонстрировали нежелательный признак некроза листьев. Чтобы гарантировать минимальную (или отсутствие таковой) интрогрессию ассоциированных вредных признаков, были проведены эксперименты по созданию рекомбинантов вокруг локуса pen1 и оценке этих рекомбинантов как относительно уровней BRIX, так и тяжести некроза. Был разработан ряд маркеров для картирования аллелей некроза листьев и BRIX (Таблица 1). Исходный интервал составлял 18,1 сМ и был сужен до области 4 сМ путем оценки набора рекомбинантов из скрещивания BC1F4 между детерминантным источником LEASE, несущим сегмент S. pennellii, и недетерминантной селекционной линией FIR-150-2044. После оценки выяснилось, что этот исходный уменьшенный сегмент все еще содержит некроз листьев. Чтобы отобразить местоположение QTL некроза и BRIX, был разработан дополнительный набор маркеров SNP. При последующем картировании с применением популяции BC1F5 из скрещивания FIR-150-2044 x LEASE можно было картировать фенотип некроза листьев (в маркерных локусах M1 и M2) на расстоянии 0,9 сМ от аллеля, повышающего уровни BRIX, начиная с локуса маркера М4 (SEQ ID NO: 16).

[0070] С целью подтверждения удаления вредного признака некроза на хромосоме 1, была разработана вторая популяция с рекуррентным родителем, который был гораздо более чувствительным к некрозу листьев, чем рекуррентный родитель, использованный в исходном картировании. Этот эксперимент проводился в зимний период для обеспечения оптимальных условий появления некроза листьев. Сестринские линии с интрогрессией S. pennellii и без нее были соединены в эксперименте и размещены случайным образом в пределах повторений. Растения фенотипировали, как описано ранее, и генотипировали с применением тех же маркеров, что и для исходного картирования популяции. Результаты этого эксперимента подтвердили, что акт рекомбинации между маркером M2 и маркерами M3 или M4 удалит вредный признак некроза из локуса, отвечающего за повышение уровня BRIX.

Таблица 1. Перечень маркеров и благоприятных аллелей возле каждого маркера для создания акта селекции. Название маркера Благопр. аллель Хром. Генетическая позиция (сМ) Открытое положение маркера (п.н.)
(SL3.0) Открытое положение SNP (п.н.) (SL3.0) Размер маркера (п.н.) Положение SNP в маркере (п.н.) Изменение SNP Благопр. аллель Последовательность маркера Прямой праймер Обратный праймер зонд 1 зонд 2 M1 S 1 154,5 96 680 541-96 680 422 96 680 481 123 61 G/C G 1 2 3 4 5 M2 rp 1 155 96 760 850-96 761 549 96 761 293 700 443 T/G T 6 7 8 9 10 M3 донор 1 155,7 96 871 011-96 872 011 96 871 421 1001 411 A/G G 11 12 13 14 15 M4 донор 1 155,9 96 901 574-96 902 518 96 902 157 972 611 C/G G 16 17 18 19 20 M5 донор 1 156,1 96 933 578-96 934 569 96 934 226 995 651 G/A A 21 22 23 24 25 M6 донор 1 156,3 97 023 453-97 023 334 97 023 393 121 61 G/A G 26 27 28 29 30 M7 донор 1 156,4 96 984 621-96 985 457 96 985 002 843 382 G/A G 31 32 33 34 35 M8 донор 1 156,5 96 998 808-96 999 921 96 998 916 1114 108 T/A A 36 37 38 39 40 M12 донор 1 156,9 97 061 857-97 062 457 97 062 157 601 301 G/A G 56 57 58 59 60 M9 донор 1 158 97 236 955-97 237 935 97 237 436 980 481 A/G G 41 42 43 44 45 M13 rp 1 158,2 97 261 344-97 261 944 97 261 644 601 301 T/G G 61 62 63 64 65 M10 rp 1 161,6 98 155 701-98 155 818 98 155 761 121 61 C/T C 46 47 48 49 50 M11 rp 1 164,3 97 847 339-97 845 480 97 845 746 1877 1592 A/G 51 52 53 54 55

«rp» = рекуррентный родительский аллель

«донор» = донорный аллель

Пример 3. Валидация локуса, отвечающего за повышенные уровни BRIX

[0071] Чтобы гарантировать, что локус, отвечающий за повышенные уровни BRIX, на хромосоме 1 будет эффективным в разных генотипических фонах, популяции трех разных типов томатов: крупно- средний тип томатов (популяция (BC₃F₂, 96 растений), тип розовых томатов (популяция F₂, 101 растение) и тип томатов "черри" (популяция BC₂F₄, 98 растений), сегрегирующиеся по аллелю BRIX на хромосоме 1, были протестированы на эффективность аллеля BRIX. Популяции были случайным образом посажены в теплице, и каждое растение оценивали на генотип и BRIX. В каждой популяции были обнаружены три класса генотипов: гетерозиготный, гомозиготный по присутствию аллеля BRIX и гомозиготный по отсутствию аллеля BRIX. Затем данные были проанализированы для каждой популяции независимо, и было обнаружено, что локус на хромосоме 1, повышающий уровень BRIX, оказывает существенное влияние на повышение уровня BRIX во всех трех популяциях (Таблица 2).

Таблица 2. Статистический анализ трех различных популяций типов томатов относительно влияния QTL BRIX на хромосоме 1. Среднее значение BRIX Популяция R² QTL эффект Р-значение -/- +/- +/+ Крупно-средние 0,27 < 0,0001 4,84 5,20 5,46 Розовые 0,10 0,0088 6,74 7,24 7,42 «Черри» 0,11 0,0042 8,22 8,66 8,69

Пример 4. Создание акта селекции

[0072] Чтобы способствовать селекции, был разработан донор акта селекции для аллеля, повышающего уровни BRIX, без вредного аллеля некроза, который можно было бы применять в различных программах селекции. Первым этапом создания донора для такого акта был отбор растений с актом рекомбинации между M2 (SEQ ID NO: 6) и M3 (SEQ ID NO: 11) из популяции с высокоточным картированием. Затем растения применяли для разработки материала BC₄F₂. После чего эти растения оценивали и сравнивали с родительским S. lycopersicum (FIR-150-244, растения без некроза и без повышенного уровня BRIX) и с растениями BC₁F₄, которые содержали полный интервал (растения с некрозом и повышенным уровнем BRIX) в рандомизированном блок-дизайне с 5 повторностями и 4 растениями на участке. При этом было обнаружено, что все четыре проанализированные линии с актом рекомбинации между M2 (SEQ ID NO: 6) и M3 (SEQ ID NO: 11) продемонстрировали повышение уровня BRIX (Таблица 3) и отсутствие некроза (Таблица 4). Эти линии можно применять в качестве доноров для генетических актов, но можно также сократить количество ДНК S. pennellii на другой стороне аллеля BRIX. Для этого можно искать акт рекомбинации между M5 (SEQ ID NO: 21) и любым маркером в южном направлении или между двумя маркерами в южном направлении от M5. Например, между M9 (SEQ ID NO: 41) и M10 (SEQ ID NO: 46), что было выбрано для акта селекции, описанного в данном документе. В Таблице 1 представлен обзор маркеров и их предпочтительных аллелей для разработки акта селекции, описанного в данном документе. Дальнейшее сокращение акта селекции при сохранении повышенного уровня BRIX возможно путем отбора растений с актом рекомбинации между M12 (SEQ ID NO: 56) и M13 (SEQ ID NO: 61). В этом случае выбирают донорный аллель S. pennellii на M12 и рекуррентный родительский аллель S. lycopersicum на M13.

Таблица 3. Статистический анализ измерений BRIX для линий с актами скрещивания по сравнению с рекуррентным родителем (без повышения уровня BRIX) и растениями BC1F4 с полным интервалом (с повышенным уровнем BRIX) для двух сборов. Те материалы, которые статистически не отличаются друг от друга, помещены в одну группу. Brix Материал Группа LSM H1 Группа LSM H2 Полный интервал А 3,9 В 4,8 Акт скрещивания А 3,7 А 5,2 FIR-150-2044 В 3,3 С 4,3

Таблица 4. Статистический анализ измерений некроза листьев для линий с актами скрещивания по сравнению с рекуррентным родителем (без повышения уровня BRIX) и растениями BC1F4 с полным интервалом (с повышенным уровнем BRIX). Те материалы, которые статистически не отличаются друг от друга, помещены в одну группу. Некроз Материал Группа LSM Проверка_полный интервал А 2,9 Акт скрещивания В 1,7 RP FIR-150-2044 В 2,0

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Seminis Vegetable Seeds, Inc.

<120> РАСТЕНИЯ ТОМАТОВ С УЛУЧШЕННЫМИ ПРИЗНАКАМИ

<130> SEMB:033WO

<150> US 62/613,617

<151> 2018-01-04

<160> 65

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (99)..(99)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 1

acagagctaa gaattacttg tggctggtga accagcagaa gctttccaat taaaatgttg 60

scctttccag tcggttattg ttcctccagc accttctant actggtacaa gtgagaggaa 120

g 121

<210> 2

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 2

gaaccagcag aagctttcca attaa 25

<210> 3

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 3

aggtgctgga ggaacaataa cc 22

<210> 4

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 4

actggaaagg gcaacat 17

<210> 5

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 5

actggaaagg ccaacat 17

<210> 6

<211> 700

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (279)..(279)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (354)..(354)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (602)..(602)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (614)..(614)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (636)..(636)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 6

tctttgccca cttacaggat gaaatcgaat acaaagctgt gaagagactc cataaatcac 60

cctaatgcaa aggcctctag aaatatccca tactctgaca gttttatcca ttgaagatga 120

tgcaatgtac tgattgtttg tggagaagtc aaaatctgaa aaaaggtcag atttcaaaaa 180

taataacagt aacatgttaa acatagataa agcatagcta gcatttagtc cctcttgacc 240

gaggaacaga cttgcaatta gagtcacaaa gaggcatgnt aagaaaatca aaaggaactc 300

cataagagca ccatagtgtg gtttctggct ttctggatta ctcagtttag accntcaatg 360

gattggggta ggaactaaaa cacatgaact aatttcgcat atccagaaaa ctatgagaat 420

taaaaggatt ctttacaaaa cckatatcaa atttgaaata agaggtttaa ataaagtact 480

aacattaaaa gactcgtgtg atgataaaag ctcttggaaa agccgggtat caaaagaaag 540

tgctgccttt ctgtcaactc aaaatgaggc ttaacaacaa ccaccaatat ttgagtttgg 600

ancaaaacta atanaaaatt aataaaaaga agaaantaat ttttttgtaa ggtaataaaa 660

ttgctgtttt agtgggtcat atatacatgg ggagggtgtt 700

<210> 7

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 7

cacatgaact aatttcgcat atccagaaa 29

<210> 8

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 8

tcatcacacg agtcttttaa tgttagtact ttatt 35

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 9

ctttacaaaa ccgatatcaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 10

ttctttacaa aacctatatc aa 22

<210> 11

<211> 1001

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (183)..(183)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (241)..(241)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (263)..(263)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (338)..(338)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (443)..(443)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (473)..(473)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (487)..(488)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (538)..(538)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (646)..(646)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (661)..(661)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (699)..(699)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (702)..(702)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (756)..(756)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (796)..(796)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (801)..(801)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (830)..(830)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (833)..(833)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (842)..(842)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (847)..(847)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (850)..(850)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (856)..(856)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (877)..(877)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 11

aagggacaac agtcaaactt gactaataaa taataatcac tacccattca aggaaacaca 60

acaaagccat tccagctaaa atcctcaatt acttgttagc tttataatgt catngttgtc 120

ttcagaagac ctctcaaaca tactgagaaa cagcaatagt aacttctcaa aaacttgtgt 180

tcnaactcga taacttgaat accaaaacat taaaaccttc agctgaccaa aaaactgatg 240

nttaatgctg gatgaggggt ttnaactcac gataacttat gtgaacaaga taagcagaat 300

ttcagattaa acaaagaaat gtagcagagt gaacatcntt atccactaac caaggtgaat 360

attgtatgac tgcggctact aaacagattg aaattatttg aaccaacgtg rcggtgctct 420

gcaacattaa gaatgtaatc aanatcagga tccacgaaag cttgcctata tantcagcag 480

gatccannaa agcttgccta tgaaaaaatg tgacttccgg acaaagaaca gattcaanaa 540

ttaccttccc cagcagcaat aaacgaaaga gcatgcccag gtgacaaaac aacttcctcc 600

ttcatacctt caacataagt accctgcata atagcaagta taaaanaatg acgaaccata 660

nagcagcatt acaatcatga actatgatag aaaaacatna anatctattt tctagtagaa 720

caactacagg ctaaaagcac cacctgcagt gctggnaggt aatgataggt tttgatcttc 780

aggtgacaaa aagaangcta nattttgttt atttcttagt acatctcagn aantaaatag 840

gnattantan gtttgnttat atttttcctg ataaatnaag actcgggcat gtgataacat 900

gtaggaaaca ctttttctta tcttattatt tacaaaatat actaaaatgg ttgtcctagc 960

ccataggaac acagctattc tttgattctt ctcataaaaa c 1001

<210> 12

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 12

actgcggcta ctaaacagat tgaaa 25

<210> 13

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 13

gcaagctttc gtggatcctg at 22

<210> 14

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 14

ccaacgtggc ggtgc 15

<210> 15

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 15

ccaacgtgac ggtgc 15

<210> 16

<211> 972

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (90)..(91)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(96)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(105)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(112)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (117)..(119)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (123)..(124)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (128)..(130)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (132)..(136)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (138)..(139)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (141)..(141)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (147)..(147)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (155)..(155)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (164)..(164)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (176)..(176)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (178)..(178)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (206)..(206)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (262)..(262)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(342)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (353)..(360)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (362)..(364)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (366)..(366)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (430)..(430)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (463)..(463)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (466)..(467)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (511)..(511)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (520)..(520)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (553)..(553)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (556)..(556)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (567)..(567)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (618)..(618)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (714)..(714)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (928)..(928)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (930)..(930)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 16

cttatctatc aactttcaaa tttaagagac aagtgcgtta tntttcactt tattttggtt 60

cgatcccaat cttattaaag ggaaaataan ntttnnttan attnnannnn nncaatnnnt 120

gtnntctnnn cnnnnnannt ntctttngtg atttngactt gaantttttt taagantnaa 180

tattgaaatc cgtctacttc atcacnttct ttccttttca aaatgaataa aatttgactt 240

acataatatc ttcataaatt antcaccaaa atagatagct cttttaaata aatttatgaa 300

aaacaaaata tataaactta ctataataaa tttgtttttt gnaattaata tannnnnnnn 360

annntntata atctagacat tgtcttcctc ttttttattg cagtattatc ctgcctttta 420

tgttagtaan tgtgactgcc tctttcattt atctgttcaa atntgnntca ctttttcata 480

tataaaagaa acaaccaaac agtttttttt nttcaaaatn acttcaattt tatcaattgt 540

acctccatgg ctnctnttcg taagagnttg ttgaacccgg atgcatccga atatatacct 600

atttccactc sgccaccncc tcctcctcct cctaccgttg attcaccacc acgggagaat 660

gtgcgatcgc catcggtgga acacccgtgg ttgaacattc ctcctagatt gatnaatgat 720

tatgtctcta gaacaaaatt ttctccatcc attaagggaa tcagaggtga agagtggtcg 780

aaaaacgatg gcccgacgaa atacagatac agtgttatac ctataagaag gagccataag 840

aacgtgacta ctatcgtgat taagaatatt ccatatgact acaagtaatt ttaatctatt 900

taattgttca gattactttt tctgggangn tgattataac aaaatttaat ggtttgactc 960

tctagtggca ta 972

<210> 17

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 17

aacccggatg catccgaata tatac 25

<210> 18

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 18

ggtggtgaat caacggtagg a 21

<210> 19

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 19

ctatttccac tccgccacc 19

<210> 20

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 20

tttccactcg gccacc 16

<210> 21

<211> 995

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (162)..(162)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (202)..(202)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (265)..(265)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (267)..(267)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (374)..(374)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (455)..(455)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (508)..(508)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (516)..(516)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (675)..(675)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (731)..(731)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (734)..(734)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (846)..(847)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (850)..(850)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (949)..(949)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 21

ttgttttaaa tttnnttttt gaacttccat tgaacgttgc aggtatgcat attctatttg 60

gtccttcgag cacttgacac tgttggtaag ctcagttact atcatctaaa tttgcttgta 120

ctttatgaat gcttaggaga tatgaaactc agaaagtatt anttcttcat tttttgtgca 180

aaatttggtg taattaattt antcttctat ctttgaaaga gtaggttgaa tcgttgattt 240

agttcatcat gcttatcttc tattncntct tgagaggaac aaaagatgac gagagaggga 300

ataataactt gttgaaaatt tcaactgctt attaattaaa aagaggaaaa gatgcaagct 360

gttcttcctt atcnaaaaaa aaaaaggaaa agaagcaagt cgttcttctc atactagtta 420

tattggtatt tgatatttag cttatatgat actgngctgc ctaccagctt cctgttgaac 480

tcttcttggt tataaacaag ttctgacnaa cttttnttgc ttaaatacta gtaggaatta 540

tcatatgcta cttattattt catttcattc tagacattca caaggtagtt tttaggttgt 600

aatcttagct gattcaaggg ttgttgcagt catatttttg agtaacacat rttttgctta 660

tttttcatat ttggntgttc ttattgtgga cagaggatga taccagcata cccaccgatg 720

ttaaagtacc natnttgatc tcttttcatc agcatgttta tgatcgcgaa tggcactttg 780

catgtaagtc tctgaatgca acttgttgat ctccctaagt tctcaatatt gcttctctct 840

tattannagn gtacttttgc aattgaagaa tcccaagttg gaatgacttc aactactttt 900

tagaggttac taaggagatt attttgaata agtcagatgg aaaccaatnc aaaatatttc 960

actgtctacc caaaaatgtt tttcttttgc tgcac 995

<210> 22

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 22

tgattcaagg gttgttgcag tcata 25

<210> 23

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 23

ctggtatcat cctctgtcca caat 24

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 24

ttgagtaaca catgttttgc 20

<210> 25

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 25

tgagtaacac atattttgc 19

<210> 26

<211> 121

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 26

aagatgtgaa agatttcaac agaacttatg ncggctataa tttcaaggct tcttgttgat 60

rgctgagaaa tccctgcttg ccagtagtga cattttgaaa ttcagtggaa aatgggctcc 120

a 121

<210> 27

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 27

aagatgtgaa agatttcaac agaacttatg 30

<210> 28

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 28

tcaaaatgtc actactggca agca 24

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 29

atttctcagc tatcaacaag 20

<210> 30

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 30

ctcagccatc aacaag 16

<210> 31

<211> 843

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (59)..(59)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (66)..(66)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (147)..(147)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (153)..(153)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (218)..(218)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (398)..(398)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (492)..(492)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (531)..(531)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (549)..(549)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (564)..(564)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (573)..(573)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (583)..(583)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (597)..(597)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (609)..(609)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (619)..(619)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (623)..(623)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (625)..(625)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (635)..(635)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (638)..(639)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (648)..(648)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (670)..(672)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (674)..(675)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (696)..(697)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (734)..(734)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (743)..(743)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (746)..(746)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (757)..(759)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (765)..(765)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (813)..(813)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (820)..(820)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (825)..(825)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (827)..(827)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 31

cacacaccta ctagtaatag tagnnagaag agaagaagct tagaaaaaaa aatgaagana 60

aanatnattt cttcaaaatt aatgctgctt cttctccttc ttcttccatt attaaactgc 120

catggaagct accttgatta tacagangca ttnaccaaat ccattctctt cttcgaaggc 180

caacgctccg gctatttacc gcaggaccag agaatganct ggcgaggaca ttccggttta 240

agcgatggat gggagatgaa tgttgatttg accggcggtt actacgacgc cggagataat 300

gtgaagttta attttccgat ggcgtttacg acgacgttgc ttgcgtggag tgtaattgaa 360

tttggggaaa ttatgccgcc trctgaatta cggaatgntt tagtcgctat ccgttggtcc 420

actgattatc ttctcaaaac tgtttctcag ccagatcgca ttttcgtcca ggtttgttat 480

tcactttttt anttattatt ttttggatgg gactaaacga acaaaattaa naacaacatc 540

aacaacagna aatcccgcaa gtgnaatata ganagggtaa aancgtatat ttaatcntat 600

cactttttng cagagatana aanantgttt ccgcnaanna accaactntt ttatgctctg 660

tttctactgn nntnngtatg ttttgtgcat gtaaanntat tactcctctg tttttacatt 720

ttgtgattat aagnatgtca ttnatnaatt aagaggnnnt aatgnttttt ttaagaaaaa 780

attagccaaa atattttaga aatacgaaat tgntattatn ttttnanaaa agattaatag 840

tgg 843

<210> 32

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 32

ttgcgtggag tgtaattgaa tttgg 25

<210> 33

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 33

ggaccaacgg atagcgacta aa 22

<210> 34

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 34

tatgccgcct gctgaat 17

<210> 35

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 35

tatgccgcct actgaat 17

<210> 36

<211> 1095

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(93)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (222)..(222)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (295)..(295)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (350)..(350)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (370)..(370)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (373)..(373)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (384)..(384)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (480)..(480)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (605)..(605)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (632)..(632)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (650)..(650)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (654)..(654)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (698)..(699)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (718)..(718)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (733)..(733)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (804)..(804)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (854)..(854)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1055)..(1055)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 36

gcntaccgta ccttgctggt gtcagctcca ggccttggac agtacatctc tggtgctatt 60

ctttttgagg agaccctcta ccagtctacc gtngatggac gcaaaatwgt tgatgttctt 120

attgagcaaa acattgttcc tggtatcaaa gttgacaagg tatattaacc tgcacccaca 180

acttgaaaaa ggacaatagt aaagagttat tgttgctggt gnaaaaatat agcgaacttt 240

tattttgtat aatattggtc tgagcagaaa cttaaatgga atgacatgat cagtnaggat 300

ttgtataacc gaccccaact tgcttggtca tatatgtggt tatactaacn atagaagagg 360

aaaggcaggn ttntaactgt ttancaagaa caagttatac tgaaatgaga tttctgtcaa 420

tctcctaatc attatatctg ttcacagggt ttggttcccc ttgctggttc aaatgatgan 480

tcatggtgtc aaggtcttga tggacttgcc tcgcgctctg ctgcatacta ccaacaggga 540

gcacgtttcg ccaaatggta catttggagt cctaattcac tttgttattt tctcataatg 600

cacancggaa gaagaaaaaa tttatatgga cnataccaaa tagttgtttn aaanggtctt 660

tttcatcatg ttagaagttt atatgctaat ctatcctnnt tttgcacaat attggtantg 720

agatgaatta aantagagcg acaagtcagt gaagattcat atacccgacc catgttaaga 780

ttaatgctaa aattatggta actnataggc gtaccgtggt gagcattccc aacggaccat 840

ctgcattggc tgtnaaggaa gcagcatggg gcttggctcg ctacgctgcc atttctcagg 900

acaatggttt ggtcccaatt gtggagccag agatcttgtt ggacggtgaa cacggcattg 960

acaggacttt tgaggtagca cagaaggtct gggctgaagt cttcttctac ttggctgaga 1020

acaatgtcat gtttgagggt atcctcttga aaccnagcat ggttactcct ggtgctgaat 1080

gcaaagacag ggcca 1095

<210> 37

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 37

gaggagaccc tctaccagtc tac 23

<210> 38

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 38

gataccagga acaatgtttt gctcaa 26

<210> 39

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 39

acatcaacaa ttttgc 16

<210> 40

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 40

aacatcaact attttgc 17

<210> 41

<211> 980

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(225)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 41

ttgtggaaga taccactttg gatgtttata taggcaatat cgactcattc tgatgtattt 60

tgagtaggaa tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnntcata aagttcttga 240

ttctggtgaa gagccatttg gattggacat cagttaaaga cgatgatata tcagtaatca 300

catggccctg ccttccagct agttgacatg agtaattgct ttagctcatc agatcaagtt 360

caataggtcc tgcatatatt ttcctatagg gaaccaagga tctctaagaa tcaaatccat 420

aaaaattgct ggtagcctat gatgcaaact gtgtccactt atatacaaac tataagagaa 480

wagaagtcaa aaatatgaaa gatttcactg gtggagaggt atttgttgca ctgtttattg 540

acaatagcac atgaagcatc acatggtgtt gttgccaact cattgtctaa tatatatgat 600

cttagcaaat tgctcatgaa tatcatcaga ccccagtgtt tttcatgaca agatagagaa 660

cagactatct ttagagatca aattgataat ttactgcaat agttgacaac ttgtgggatc 720

aacattccgg atgagaataa cccatggtat ttcaatagtt tttgacaagt gttttcaaat 780

agtagataac agaaatgttt attgactatc aatatgtcta tgttttgcat atccatcaaa 840

ttatgagtca gtcagaacct tactgttgcc agaaatttga atccatattc aagaaaagta 900

tagatattat atcttattaa gagttgatga atttacatcc attttctatc tcattcagtt 960

aactcagtaa tttcacatta 980

<210> 42

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 42

cctatgatgc aaactgtgtc cactt 25

<210> 43

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 43

tcaataaaca gtgcaacaaa tacctctc 28

<210> 44

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 44

catatttttg acttcttttc tct 23

<210> 45

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 45

catatttttg acttctcttc tct 23

<210> 46

<211> 121

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (119)..(119)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 46

aactccctcc cctcacccga gagggcaaga tcaacaatca aatcaatctt ctttctccta 60

yggaccggtt gtttgtgccc accattcctt cctcgtcgtg aagaatctgg aagcatacnc 120

a 121

<210> 47

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 47

cgagagggca agatcaacaa tcaaa 25

<210> 48

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 48

ggaaggaatg gtgggcacaa a 21

<210> 49

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 49

caaccggtcc gtaggag 17

<210> 50

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 50

aaccggtcca taggag 16

<210> 51

<211> 1877

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<400> 51

acgactgtca agagctcacc agtcgcagtt gaagcaccag cttctaaaga gttaggtgtt 60

caagcaggag tctatggagc cttaatggtc ttaacatatg ttaatggagc ctcaacacct 120

ttaggagtat cgtatggagc tgatgttcct ggactaatct tagccacaag ctttggggcc 180

accttgtact tcatgaccaa gaaaaatgtc aagttgggta aggaagatac gttgcttctc 240

tttgtttcac ttctaggtag atttattgca ttttgtgagt tcaaatataa acattagtac 300

gtgattgcag tcatgcaaaa gtaatgacca aattgtttgt taaagtatat aatagccccc 360

catatacgtg ttaagtttgc tcattgacat tccatactaa ctgaatctta agcattatct 420

ctggatcact taagctttca caatttcaac ttaccctcaa gaaaaccata gctagggttg 480

taatccctta tcatatgcat ttctaacctt gtgagaaaaa tagacttgac ttgatgctca 540

tgctagtatc cataaaatct ttttggcgtg taagaagtgt ctttctcatc aacaattatg 600

aacataattc acagattttc ctgtgttgct aaatcatttt tttttcttaa ttaataggac 660

tggattattg tcaatagttg aatgtgtttc ttctaattag ttatggatcc atgtctttta 720

tcacgttgat aatgaacaaa cattttggtc ttcaactcct taatactccc attaaatcta 780

agttgtcgac tatttgatga agacttactt gaatatttcc tattatacaa aaaaactacg 840

tgatggtttg atttgatgag agttattaag gtgagaatta ggaatacgta tcatgcaatg 900

taaatatgga agaagcttgt catgtataca ctggttcgtc aagtgttatg aactgaagaa 960

gtgtttcagt acaattattt gaagaaatat ataaaaaaag gatcacatta tatgtaggga 1020

agatcacatt atacaaattt tccatgttgc tgaagtggaa atcattctaa ggttgtggag 1080

agtggagacc atgatttatt tattttaatt gaaaacaagt ttatataatc cttatctatc 1140

atatgaaaat gacatgagta gtagccacat aagagccaat gaaattttga aggagttgat 1200

ttgtgtggaa gtactgttct ggcttctgga taatgcaaat gagactttgg aaataccaac 1260

aatggatttg taccgtgtta tgattccgat tagtgtttat ttcatctaag ctgtatttct 1320

gccaaaaaaa tatttgtaga actaaatatt ggcttttcct gaaaaaaatg actcaaactt 1380

tacttgcaaa cagggaaagc aagcgtcata acaattggtg ggctggtcgc tggtgcagtg 1440

gtaggttcag cagtagaaaa ttggttgcaa gtagacattg tcccgttact gggtatacac 1500

actcctgcta cggttgtgag tgaatttata cttttctcgc aatttctggt ctcgttgtat 1560

ctgatatagg gtaactcaaa ggcttgtatg arctgctact gtaagaaggt ctatggctat 1620

ttgttgccta ctcaggttct tgttcttatc taggaccagt aatttgttaa atgtacaaaa 1680

gaatgttacc aaaactctgg aagttctgat atttgtttta taaagctagt atagattctc 1740

agctttgctc ttctatcaac ggtattttaa tccctagttt gttctgatat taagttgtgg 1800

cttactgtgt tttaattgga atttgacgta tttattttct cacagaaggg tacattgatt 1860

ataacaggct tggactc 1877

<210> 52

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 52

gcaatttctg gtctcgttgt atctgata 28

<210> 53

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 53

cctgagtagg caacaaatag ccata 25

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 54

cttacagtag cagttcatac 20

<210> 55

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 55

acagtagcag ctcatac 17

<210> 56

<211> 601

<212> ДНК

<213> Solanum pennellii

<220>

<221> misc_feature

<222> (295)..(295)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (455)..(455)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (468)..(468)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (535)..(535)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (597)..(597)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 56

cattttggat ccacttctgg tgaaaagggt aagtttgggt tgacaacaac ccagattctt 60

cgtgtagtga agaagcttga tgaatctgga atgctggatt gtctccagtt attgcatttt 120

cacattggat ctcagatccc cacaacagag ttgcttgctg atggtgttgg tgaggccact 180

cagatttact ctgaattagt ccgtcttgga gctggtatga aattcattga tatcggaggg 240

gggcttggaa tcgactatga cggttctaaa tcaagcaatt ctgatgtctc tgttngctat 300

rgcattgaag aatatgcctc tgctgttgtc caagcggtcc tctatgtctg tgatcgtaag 360

ggcgtaaagc atccagtgat ttgcagcgaa agtggcaggg caattgtttc tcaccattca 420

attctgattt ttgaagccgt gtctgcttct actantcatg tttctacnca gccatcttcg 480

ggtggtttac aatccttggt ggagactctc aatgaagatg cccgtgctga ctacngaaac 540

ttatctgctg ctgctgtccg tggagaatat gatacatgtc tcatctattc tgatcanttg 600

a 601

<210> 57

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 57

cgactatgac ggttctaaat caagca 26

<210> 58

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 58

aggaccgctt ggacaacag 19

<210> 59

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 59

catattcttc aatgctatag c 21

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 60

atattcttca atgccatagc 20

<210> 61

<211> 601

<212> ДНК

<213> Solanum lycopersicum

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (78)..(78)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (96)..(96)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (111)..(111)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (138)..(138)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (145)..(145)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (147)..(147)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (180)..(180)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (227)..(227)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (231)..(231)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (260)..(260)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (317)..(317)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(349)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (389)..(389)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (406)..(406)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (411)..(411)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (420)..(420)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (451)..(451)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (529)..(529)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (531)..(531)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 61

caaatctctt cttctgcttt tccccaacat aaacagcnaa gtggccttta ggaacatctc 60

cggttgtgga agacttcntg attatacgag ncatanggat agccatggtc ntttagttca 120

atataagatg agaaaatnag gatgngnaga attagtaaag actctgaaac cagagaaagn 180

tttgtatggt ttcaaatttt gctgagtgtt gttgcagtaa ccccttnttt ntatgtgttt 240

atataggcta atatcaagtn gtagaattct actgatgtgc attgaataga cattatgtgg 300

kcaccagcta aaggcantag cacctgaagt atcacatggt tttgccttnc aactcattct 360

cataatataa atacaatgaa agtagtctna aatcagaagg tcctantgat nttcacaacn 420

aataacagat ggaaatttta tacttcttga naaatggttt agcttcttga tgttaaatca 480

acaagtaata gtcagattcc aatgattgat caaccaccag acaccaatng nacaaagaaa 540

agtgggatgt tccagccttc cagatgctga attcaatcct aaatatcaag aatatcacaa 600

t 601

<210> 62

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 62

gctgagtgtt gttgcagtaa cc 22

<210> 63

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 63

aaggcaaaac catgtgatac ttcag 25

<210> 64

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 64

attatgtggg caccagc 17

<210> 65

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 65

cattatgtgg tcaccagc 18

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению Solanum lycopersicum, имеющему плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеющему некроза. Раскрыта часть указанного растения, рекомбинантная ДНК, которую содержит указанное растение. Также раскрыты способ получения указанного растения томата, способ отбора растения томата. Изобретение позволяет эффективно получать растения томатов, имеющие плоды с повышенным содержанием BRIX. 8 н. и 20 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил., 4 пр.

1. Растение Solanum lycopersicum, имеющее плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеющее некроза, где указанное растение содержит рекомбинантный хромосомный сегмент на хромосоме 1, который содержит донорную ДНК из Solanum pennellii между маркером SEQ ID NO: 6 и маркером SEQ ID NO: 46 и не содержит донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 6 и содержит ДНК из Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6, при этом указанное растение имеет плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеет некроза по сравнению с растением, не имеющим указанный хромосомный сегмент.

2. Растение по п. 1, отличающееся тем, что указанное растение содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в и между:

а) маркером SEQ ID NO: 11 и маркером SEQ ID NO: 51 на хромосоме 1;

b) маркером SEQ ID NO: 11 и маркером SEQ ID NO: 41 на хромосоме 1; или

c) маркером SEQ ID NO: 16 и маркером SEQ ID NO: 21 на хромосоме 1.

3. Растение по п. 1, отличающееся тем, что указанный рекомбинантный хромосомный сегмент содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 61 на хромосоме 1.

4. Растение по п. 1, отличающееся тем, что указанное растение содержит ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 11.

5. Растение по п. 4, дополнительно характеризующееся тем, что указанное растение содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 41 и ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 46.

6. Растение по п. 4, отличающееся тем, что указанное растение содержит ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и маркере SEQ ID NO: 46 и донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 56.

7. Растение по п. 1, отличающееся тем, что указанный хромосомный сегмент расположен в геноме указанного растения между 96871421 п.н. и 98155761 п.н. на карте Tomato SL3.0.

8. Часть растения, имеющая плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеющая некроза, где указанная часть растения представляет собой часть растения по п. 1, где указанная часть растения содержит рекомбинантный хромосомный сегмент на хромосоме 1, который содержит донорную ДНК из Solanum pennellii между маркером SEQ ID NO: 6 и маркером SEQ ID NO: 46 и не содержит донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 6 и содержит ДНК из Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6, при этом указанная часть растения имеет плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеет некроза по сравнению с частью растения, не имеющей указанный хромосомный сегмент.

9. Часть растения по п. 1, отличающаяся тем, что указанный хромосомный сегмент, обеспечивающий повышенные уровни BRIX, включает донорную ДНК между маркером SEQ ID NO: 6 и маркером SEQ ID NO: 46, полученный из линии LA0716 Solanum pennellii.

10. Сегмент рекомбинантной ДНК, который, когда присутствует в растении томата, обеспечивает повышенный уровень BRIX в плодах, продуцируемых указанным растением, и не вызывает некроза указанного растения, где указанный сегмент ДНК содержит донорную ДНК из Solanum pennellii между маркером SEQ ID NO: 6 и маркером SEQ ID NO: 46 и не содержит донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 6, и где указанный сегмент ДНК содержит ДНК из Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6.

11. Сегмент рекомбинантной ДНК по п. 10, отличающийся тем, что указанный сегмент рекомбинантной ДНК содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 61.

12. Сегмент рекомбинантной ДНК по п. 10, дополнительно определенный как содержащийся в растении, части растения, клетке растения или семени.

13. Сегмент рекомбинантной ДНК по п. 12, отличающийся тем, что указанный сегмент ДНК обеспечивает повышенный уровень ВRIX у плода указанного растения и не вызывает некроза указанного растения.

14. Способ получения растения томата, имеющего плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеющего некроза, включающий:

а) скрещивание растения томата по п. 1 с самим собой или с другим растением томата с иным генотипом для получения одного или большего количества растений потомства; и

b) отбор растения потомства путем обнаружения ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и обнаружения донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 11,

при этом указанное растение потомства имеет плоды с повышенным индексом BRIX и не имеет некроза по сравнению с растением томата, в котором отсутствует указанная ДНК из Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и указанная донорная ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 11.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что отбор указанного растения потомства дополнительно включает обнаружение донорной ДНК из Solanum pennellii по маркеру SEQ ID NO: 41 и обнаружение ДНК из Solanum lycopersicum по маркеру SEQ ID NO: 46.

16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанное растение потомства представляет собой растение потомства F₂-F₆.

17. Способ по п. 14, отличающийся тем, что получение указанного растения потомства включает возвратное скрещивание.

18. Способ получения растения томата, имеющего плод с повышенным уровнем BRIX и не имеющего некроза, включающий введение в растение рекомбинантного хромосомного сегмента на хромосоме 1, где указанный хромосомный сегмент содержит донорную ДНК из Solanum pennellii между маркером SEQ ID NO: 6 и маркером SEQ ID NO: 46 и не содержит донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 6, и содержит ДНК из Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6, при этом указанный хромосомный сегмент придает указанному плоду растения повышенный уровень BRIX и отсутствие некроза по сравнению с растением томата, не имеющим указанного хромосомного сегмента.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный хромосомный сегмент содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в или между:

a) маркером SEQ ID NO: 11 и маркером SEQ ID NO: 41 на хромосоме 1; или

b) маркером SEQ ID NO: 16 и маркером SEQ ID NO: 21 на хромосоме 1.

20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный хромосомный сегмент содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 61.

21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное растение содержит ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 11.

22. Способ по п. 21, дополнительно характеризующийся тем, что указанное растение содержит донорную ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 41 и Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 46.

23. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное интрогрессирование может включать возвратное скрещивание, селекцию с помощью маркеров или анализ указанного плода указанного растения на предмет повышенного уровня BRIX.

24. Растение томата, которое получают способом по п. 18, где указанное растение содержит указанный хромосомный сегмент, и при этом указанное растение имеет плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеет некроза по сравнению с растением, не содержащим указанный хромосомный сегмент.

25. Способ отбора растения томата, имеющего плоды с повышенным уровнем BRIX и не имеющего некроза, включающий:

а) скрещивание растения томата по п. 1 с самим собой или с другим растением томата с иным генотипом для получения одного или большего количества растений потомства; и

b) отбор растения потомства путем обнаружения ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и обнаружения донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 11,

при этом указанное растение потомства имеет плоды с повышенным индексом BRIX и не имеет некроза по сравнению с растением томата, в котором отсутствует указанная ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 6 и указанная донорная ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 11.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что отбор указанного растения потомства дополнительно включает обнаружение донорной ДНК из Solanum pennellii в маркере SEQ ID NO: 41 и обнаружение ДНК Solanum lycopersicum в маркере SEQ ID NO: 46.

27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанное растение потомства представляет собой растение потомства F₂-F₆.

28. Способ по п. 25, отличающийся тем, что получение указанного растения потомства включает возвратное скрещивание.