СПОСОБ СОЗДАНИЯ ИСКУССТВЕННЫХ РЕФЕРЕНСНЫХ ОБРАЗЦОВ ДНК ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ И ТЕСТ-СИСТЕМА С ОБРАЗЦАМИ, ПОЛУЧЕННЫМИ УКАЗАННЫМ СПОСОБОМ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/00 

Описание патента на изобретение RU2724504C1

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области генетического тестирования и может быть использовано при выявлении мутаций, в том числе вызывающих наследственные заболевания у человека и других организмов.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Аллель — различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках гомологичных хромосом. Аллели отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов, причем эти отличия приводят к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта гена и/или к изменению уровня экспрессии гена, что обусловливает фенотипические различия одного и того же наследственного признака организма.

Амплификация — увеличение числа копий определенной последовательности нуклеотидов во время ПЦР.

Биологический образец — органы, ткани (включая кровь), продукты секреции и экскреции, из которых может быть выделена ДНК для генетического тестирования.

Генетический вектор – кольцевая или линейная молекула ДНК, способная включать чужеродную ДНК, а также способная к репликации в бактериальной или эукариотической клетке. Рекомбинантным вектором называют генетический вектор, в который был клонирован референсный фрагмент ДНК. При этом нормальный рекомбинантный вектор содержит нормальный референсный фрагмент ДНК, а мутантный рекомбинантный вектор содержит мутантный референсный фрагмент ДНК.

Генетический вариант — это вариант последовательности нуклеотидов конкретного участка ДНК, встречаемый в геноме конкретного вида. Как правило, генетические варианты затрагивают определенный ген или регуляторную область определенного гена. Различные генетические варианты могут приводить к различиям в уровне экспрессии определенного гена, к различиям в последовательности рибонуклеотидов в РНК, считываемой с этого гена, и/или аминокислотной последовательности белкового продукта этого гена, если этот ген кодирует белок. Однако различие генетических вариантов необязательно приводит к различиям продукта, кодируемого геном, или к различиям в уровне экспрессии гена.

Генетический вариант, который чаще всего встречается у определенного вида и ассоциирован с нормальным развитием и функционированием организма называют нормальным генетическим вариантом. Тот генетический вариант, который встречается в популяции с меньшей частотой, чем нормальный генетический вариант, называют мутантным генетическим вариантом. Некоторые мутантные генетические варианты ассоциированы с появлением полезных для организма признаков. Однако исследуются в большей степени мутантные генетические варианты ассоциированные с наследственными заболеваниями и нарушениями развития организма.

Если мутантный генетический вариант приводит к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта определенного гена или изменению уровня экспрессии этого гена, то такой генетический вариант называют мутантным аллелем этого гена. А соответствующий нормальный генетический вариант называют нормальным аллелем этого гена.

Генетическое тестирование – лабораторная процедура, направленная на выявление определенного генетического варианта в ДНК, выделенной из какого-либо биологического образца.

Геном — совокупность генетического материала гаплоидного набора хромосом данного вида.

Генотип — совокупность генов данного организма. В более узком смысле под генотипом понимают комбинацию определенных генетических вариантов у конкретной особи.

Гомозигота — особь, в генотипе которой присутствует один генетический вариант в двух копиях. Такая особь от обоих родителей получила одинаковые генетические варианты на гомологичных хромосомах.

Гетерозигота — особь, в генотипе которой присутствует два разных генетических варианта, каждый в одной копии. Такая особь от каждого из родителей получила различные генетические варианты на гомологичных хромосомах. В случае наследования генетических вариантов на половых хромосомах такие особи называют гемизиготами.

ДНК-полимераза — имеется в виду ДНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент, катализирующий полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль уже существующей цепи нуклеотидов, которую фермент использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется комплементарностью с нуклеотидом в составе уже существующей цепи. Таким образом ДНК-полимераза участвует в синтезе новой одноцепочечной молекулы ДНК, полностью комплементарной уже существующей одноцепочечной молекуле ДНК. При полимеризации нуклеотидов ДНК-полимераза способна катализировать только присоединение нуклеотида к 3’-концу уже существующей цепи нуклеотидов, поэтому для начала полимеризации ДНК-полимеразе необходим праймер, по крайней мере частично комплементарный участку существующей цепи нуклеотидов, причем критически важной для полимеризации является комплементарность крайнего нуклеотида, находящегося на 3’-конце праймера. ДНК-полимераза начинает синтез второй цепи ДНК от 3'-конца праймера, который связался с уже существующей цепью ДНК, синтезируя новую цепь ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу.

Кинетические свойства референсных образцов ДНК — это те свойства ДНК, которые определяют такие параметры ПЦР, как эффективность амплификации, время (в циклах) перехода роста количества продукта ПЦР в экспоненциальную стадию и в стадию плато, время (в циклах) достижения заданного уровня флуоресценции в количественной ПЦР (Ct), а также сам профиль кинетических кривых в количественной ПЦР.

Клонирование — здесь: интеграция определенного фрагмента ДНК в молекулу ДНК генетического вектора с получением рекомбинантного вектора.

Количественная ПЦР (или ПЦР в реальном времени, Real-time PCR) — лабораторный метод, который используется для измерения количества исходной ДНК-матрицы путем измерения кинетики прохождения ПЦР. Как и в классической ПЦР сначала количество специфического продукта ПЦР увеличивается экспоненциально. Экспоненциальный рост количества продукта ПЦР ограничен количеством реагентов, присутствием в реакционной смеси ингибиторов ПЦР, образованием побочных, неспецифических продуктов реакции. На последних циклах реакции рост замедляется, эта стадия ПЦР называется «стадией плато». Основное отличие количественной ПЦР от классической ПЦР состоит в том, что после каждого цикла амплификации косвенным образом измеряется количество амплифицированной ДНК. Для определения количества амплифицированной ДНК используют либо флюоресцентные красители, испускающие свет при интеркаляции в двуцепочечные молекулы ДНК, либо модифицированные олигонуклеотиды — например, TaqMan-зонды, которые флюоресцируют после их расщепления ДНК-полимеразой во время синтеза ДНК. И в том, и в другом случае флюоресценция усиливается с каждым циклом реакции по мере накопления продукта ПЦР в реакционной смеси. Для определения количества амплифицированной ДНК после каждого цикла измеряется общая флюоресценция, исходящая от реакционной смеси. Измерение флюоресценции, исходящей от реакционной смеси, происходит во время ПЦР в автоматическом режиме. По результатам измерений строится кривая, характеризующая зависимость флюоресценции в реакционной смеси от номера цикла амплификации. Тот цикл, на котором флюоресценция достигает заданного порогового уровня, называется пороговым циклом, или Ct (от англ. threshold cycle). Сравнивая величину Ct, полученную в ПЦР с исследуемым образцом ДНК, и величину Ct, полученную в ПЦР с референсным образцом ДНК, можно судить о наличии и количестве ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов в исследуемом образце ДНК. При анализе данных количественной ПЦР помимо величины Ct важно учитывать профиль описанной кривой флюоресценции. Профиль кривой говорит об эффективности амплификации, которая зависит от таких параметров, как активность ДНК-полимеразы, эффективность гибридизации праймеров, чистота ДНК-матрицы от ингибиторов ПЦР, исходная концентрация ДНК-матрицы, сложность ДНК-матрицы, конформационные особенности ДНК-матрицы.

Комплементарность — здесь: взаимное соответствие нуклеотидов, обеспечивающее образование водородных связей между двумя цепями, образующими спираль ДНК. Азотистые основания нуклеотидов способны вследствие образования водородных связей формировать парные комплексы аденин-тимин и гуанин-цитозин при взаимодействии цепей ДНК. Такое взаимодействие играет ключевую роль в синтезе новой цепи ДНК по шаблону уже существующей цепи ДНК.

Мутациями называют любые изменения последовательности нуклеотидных остатков конкретного участка ДНК. Основные виды мутаций включают замены одних нуклеотидов другими с сохранением количества нуклеотидов, делеции — удаление нуклеотидов, инсерции — вставки нуклеотидов. При этом мутации, которые затрагивают один нуклеотид, называют точечными.

Наследственное заболевание – патологическое состояние, вызванное мутацией или несколькими мутациями, нарушающими нормальное протекание физиологических процессов в организме. При этом для того, чтобы заболевание было именно наследственным, то есть передающимся от родителей потомству, мутации, вызывающие заболевание, должны произойти в половых клетках одного из родителей или в половых клетках обоих родителей.

Наследственный признак – свойство организма, передающееся по наследству от родителей потомству генетическими механизмами. Наследственные признаки определяются сочетанием генетических вариантов, полученных от родителей.

Нуклеотиды — нуклеозидфосфаты, которые являются мономерами в составе нуклеиновых кислот, связанными 3′-5′-фосфодиэфирными связями. В настоящем тексте заявки под нуклеотидами понимаются дезоксирибонуклеотиды, из которых состоит ДНК. В ДНК всех организмов присутствуют 4 вида нуклеотидов: A – Аденин; G — Гуанин; C — Цитозин; T — Тимин. Последовательность чередования нуклеотидов в ДНК является физической основой генетической информации. Длину любого участка двуцепочечной ДНК указывают в парах нуклеотидов, подразумевая под этим элементарную единицу двуцепочечной молекулы ДНК, сложенную из двух комплементарных нуклеотоидов, соединенных друг с другом за счет водородных связей. Длину одноцепочечных молекул ДНК, например длину праймеров, указывают в нуклеотидах.

Праймеры — здесь: короткие одноцепочечные молекулы ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов, которые используются в реакции ПЦР и определяют начало и конец фрагмента ДНК, амплифицируемого в ходе ПЦР. Как правило, в ПЦР используется два праймера — прямой и обратный. Прямой праймер соответствует крайним N нуклеотидам одной цепи амплифицируемого фрагмента ДНК, где N равно длине прямого праймера. Обратный праймер соответствует крайним М нуклеотидам комплементарной цепи амплифицируемого фрагмента ДНК, где М равно длине праймера.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод молекулярной биологии, позволяющий амплифицировать определенный участок ДНК, который называется продуктом ПЦР. Границы продукта ПЦР задаются специфическими праймерами. Амплификация происходит в результате многократного повторения циклов изменения температуры реакционной смеси. Каждый цикл состоит из трех стадий: 1) на стадии денатурации реакционную смесь нагревают до 94-98 °C, при этом происходит разрушение водородных связей между двумя цепями ДНК; 2) на стадии отжига праймеров температуру реакционной смеси понижают, чтобы праймеры могли связаться с денатурированной одноцепочечной ДНК, при этом температура отжига зависит от состава и длины праймеров; 3) на стадии элонгации ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, синтезирует новую цепь ДНК по шаблону уже имеющейся цепи ДНК, которая называется ДНК-матрицей, при этом температура реакционной смеси зависит от используемой ДНК-полимеразы. Анализ продукта классической ПЦР проводят после окончания реакции. Как правило, для анализа используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле с красителем, интеркалирующим в ДНК. Такой анализ является полуколичественным и позволяет приблизительно оценить размер и количество полученного продукта ПЦР.

Референсный образец ДНК – образец ДНК с известными свойствами, содержащий фрагмент ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. При генетическом тестировании сравнение исследуемого образца ДНК с одним или несколькими референсными образцами ДНК позволяет определить наличие или отсутствие мутантного генетического варианта в исследуемом образце ДНК. Под естественными референсными образцами ДНК в описании настоящего изобретения подразумеваются ДНК, выделенные из организма, являющегося гомо- или гетерозиготой по определенному генетическому варианту. При этом в большинстве случаев речь идет о геномной ДНК. Под искусственными референсными образцами ДНК в описании настоящего изобретения подразумеваются приготовленные описанным способом растворы плазмидных векторов, содержащих референсные фрагменты ДНК. При этом нормальный искусственный референсный образец ДНК содержит нормальный референсный фрагмент ДНК, мутантный искусственный референсный образец ДНК содержит мутантный референсный фрагмент ДНК, а гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК содержит в равных количествах нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК.

Референсный фрагмент ДНК — клонированный в плазмидный вектор фрагмент ДНК, содержащий нормальный или мутантный генетический вариант. Нормальный референсный фрагмент ДНК содержит нормальный генетический вариант. Мутантный референсный фрагмент ДНК содержит мутантный генетический вариант.

Секвенирование — метод молекулярной биологии, позволяющий определять последовательность нуклеотидов в ДНК.

Сверхспирализация ДНК — явление перескручивания кольцевых молекул ДНК, в результате которого ось двойной спирали ДНК сама закручивается в спираль более высокого порядка. Сверхспирализованная кольцевая ДНК может перейти в релаксированное состояние, если произвести разрыв одной или обеих цепей ДНК. При этом разрыв обеих цепей ДНК приводит к линеаризации, т. е. преобразование кольцевой молекулы ДНК в линейную. Чаще всего линеаризацию проводят путем гидролиза кольцевой молекулы ДНК эндонуклеазой рестрикции.

Тест-система – набор реактивов для генетического тестирования.

Чужеродная ДНК — любая ДНК, которая не содержит последовательности нуклеотидов, комплементарной праймерам, используемым при генетическом тестировании.

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР — полимеразная цепная реакция

п.н. — пара нуклеотидов

E.coli — Escherichia coli

HRM — high resolution melting

BAC — bacterial artificial chromosome

YAC — yeast artificial chromosome

ДМСО — диметилсульфоксид

БСА — бычий сывороточный альбумин

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Генетическое тестирование в основном применяют для того, чтобы определить наличие в конкретном организме определенных генетических вариантов. Сочетание генетических вариантов определяет проявление наследственных признаков у конкретного организма. Согласно базе данных OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, http://omim.org/), по состоянию на 15 Ноября 2018 года число исследованных генетических вариантов, ассоциированных с определенными наследственными признаками, у человека превышает 3600, причем большинство их них связаны с развитием или с предрасположенностями к развитию различных заболеваний. К подобным заболеваниям у человека, например, относятся наследственная глухота, наследственная слепота (болезнь Лебера), фенилкетонурия, прогерия и многие другие. Аналогичная база данных OMIA (Online Mendelian Inheritance In Animals, https://omia.org/home/) содержит информацию об изученных наследственных признаках у животных. Наиболее исследованным организмом среди животных является домашняя собака (243 исследованных наследственных признака), крупный рогатый скот (149 признаков), домашняя кошка и другие.

Информацию о генетических вариантах используют в медицине, например, при выборе оптимального набора лекарственных препаратов для пациента, для коррекции питания и образа жизни, помогающих избежать или смягчить проявление наследственного заболевания и др. (Krontiras et al., 2018; Valente et al., 2018). Также информация о генетических вариантах родителей позволяет оценить риски рождения детей с наследственными заболеваниями (Handyside, 2018). Кроме того, в медицине генетическое тестирование используют для определения видовой принадлежности патогенных организмов.

В сельском хозяйстве информацию о генетических вариантах используют при разведении животных, при выведении новых сортов растений. У домашних животных и культурных растений генетическое тестирование позволяет избежать появления потомства с нежелательными признаками (Leeb et al., 2017; Bellone, 2017; Poland and Rutkoski, 2016). Стоит отметить, что не все генетические варианты ассоциированы с заболеваниями и нарушениями развития организма. Некоторые генетические варианты ассоциированы с появлением полезных признаков, что активно используется при селекции сельскохозяйственных растений и животных. Также генетическое тестирование в сельском хозяйстве используют для определения видовой принадлежности животных и растений, для выявления генетически модифицированных организмов.

Следует отметить, что генетическое тестирование применяют для выявления как доминантных, так и рецессивных мутантных генетических вариантов, ассоциированных с наследственными заболеваниями.

Методы генетического тестирования можно разделить на прямые и непрямые. В прямых методах генетический вариант определяют непосредственно с помощью секвенирования последовательности нуклеотидов участка ДНК, содержащего исследуемый генетический вариант. В случае непрямых методов наличие определенного генетического варианта определяют по косвенным признакам, таким как кинетика протекания биохимической реакции, размер продукта реакции и так далее. Несмотря на очевидные преимущества секвенирования, этот метод не всегда применяют на практике, поскольку он требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала, а потому доступен не всем организациям специализирующимся на генетическом тестировании. Поэтому чаще используют непрямые методы генетического тестирования, основанные на ПЦР, которые гораздо проще в применении и существенно дешевле.

ПЦР используют для того, чтобы избирательно амплифицировать отдельный участок ДНК из всего генома тестируемого организма, что позволяет прицельно проанализировать этот участок ДНК различными методами, такими как определение длины амплифицированного участка ДНК, расщепление амплифицированного участка ДНК специфическими ферментами или определение термодинамических характеристик амплифицированного участка ДНК. В отличие от прямого секвенирования, методы, основанные на ПЦР, требуют параллельного анализа тестируемого образца ДНК и референсных образцов ДНК с известными характеристиками. В качестве референсных образцов ДНК чаще всего используют образцы ДНК, полученные от охарактеризованных организмов, у которых генетические варианты были ранее определены с помощью секвенирования. Для получения качественного результата в каждом тесте необходимо параллельно с тестируемым образцом ДНК проводить обработку первого референсного образца ДНК, содержащего мутантный генетический вариант, второго референсного образца ДНК, не содержащего мутантный генетический вариант, а также третьего референсного образца ДНК, содержащего смесь молекул ДНК с мутантным и нормальным генетическим вариантами в соотношении 1:1 (так называемый, гетерозиготный референсный образец ДНК). Такие референсные образцы ДНК используются для сравнения с тестируемым образцом ДНК при интерпретации результатов генетического тестирования.

Как правило, при создании референсных образцов ДНК для тест-систем находят организмы, содержащие генетические варианты, обусловливающие исследуемый наследственный признак. Часто ограничиваются геномной ДНК, выделенной из гомозигот по нормальному генетическому варианту и гомозигот по мутантному генетическому варианту. Так, известен ряд методов и тест-систем на основе ПЦР для выявления точечных мутаций, делеций, инсерций и хромосомных перестроек у человека, где в качестве референсных образцов ДНК используется геномная ДНК человека, выделенная из образцов здоровых людей и/или людей, гомозиготных по мутантным генетическим вариантам (патенты № CN107400716, CN102660641, EP1329517).

Получение референсных образцов может быть сопряжено с существенными трудностями при поиске организмов с соответствующими генотипами. Если какой-то генетический вариант редко встречается в популяции, поиск организмов, содержащих этот генетический вариант может занимать продолжительное время и требовать значительных финансовых затрат, поскольку поиск должен проводиться дорогостоящими методами секвенирования ДНК. Кроме того, даже при наличии организма с необходимым генотипом, количество ДНК в биологических образцах ограничено естественными причинами, что не может обеспечить постоянную доступность референсных образцов ДНК, особенно в случае крупномасштабных популяционных исследований.

В связи с описанными трудностями получения естественных референсных образцов ДНК в тестах-системах используют искусственные референсные образцы ДНК, которые представляют собой клонированные в плазмидный вектор фрагменты ДНК, содержащие мутантный генетический вариант. Это позволяет получить практически неограниченное количество референсного образца ДНК в лабораторных условиях. Известны тест-системы на основе ПЦР с использованием описанных искусственных референсных образцов ДНК. При этом тест-системы применяются в различных ситуациях: для определения копийности гена при выборе таргетированной терапии рака груди и рака кишечника (заявка №WO2018086263); для определения химерности при трансплантации клеток костного мозга (заявка №CN101575643); для выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (заявка №WO2013129906); для выявления патогенных микроорганизмов в образце, взятом из раны пациента (заявка №WO2018156664); для выявления трансгенных организмов (заявка № CN101775440); для определения видовой принадлежности животных (заявка №WO2009083620).

При создании искусственных референсных образцов ДНК, фрагменты ДНК, содержащие мутантный генетический вариант, могут быть получены различными методами. Если доступен организм, содержащий мутантный генетический вариант, мутантный референсный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР с использованием геномной ДНК данного организма в качестве матрицы. Если такой организм недоступен, мутантный референсный фрагмент ДНК может быть получен методом направленного мутагенеза или синтезирован химически.

Наиболее близким к заявленному изобретению является метод получения искусственных референсных образцов ДНК путем клонирования в плазмидный вектор одного или нескольких фрагментов ДНК, содержащих разные генетические варианты (патент №EP1601784). При этом мутантные последовательности могут быть выделены из мутантных организмов, получены методом ПЦР, синтезированы химически или получены направленным мутагенезом. Клонированные в векторы фрагменты ДНК проверяют секвенированием. Недостатком этого метода является непригодность получаемых искусственных референсных образцов ДНК для применения в тест-системах, основанных на количественной ПЦР, которые часто применяются для выявления мутантных генетических вариантов, появившихся в результате точечной мутации.

Количественная ПЦР — современная технология, позволяющая количественно измерять такие кинетические характеристики ПЦР, как эффективность амплификации, температура денатурации продукта ПЦР, и т. д. Измерение кинетики прохождения ПЦР является одним из косвенных способов выявления мутантных генетических вариантов при генетическом тестировании. Количественная ПЦР очень чувствительна к характеристикам ДНК-матрицы. С одной стороны, благодаря этой чувствительности количественная ПЦР позволяет быстро и надежно выявлять различия между генетическими вариантами, вызванными даже точечными мутациями. Но с другой стороны, та же чувствительность количественной ПЦР накладывает значительные ограничения на качество референсных образцов ДНК. Важно, чтобы референсные образцы ДНК были по своим биохимическим свойствам аналогичны тестируемым образцам. При этом, помимо линейной структуры референсного образца, важны абсолютное количество референсного образца в реакционной смеси, концентрация референсного образца в реакционной смеси, важна сложность состава ДНК в референсном образце ДНК, т. е. соотношение амплифицируемого участка ДНК и остальной ДНК, которая может влиять на кинетику ПЦР.

Таким образом, в области, связанной с разработкой тест-систем, основанных на количественной ПЦР, имеется потребность в технологии создания искусственных референсных образцов ДНК, которые обладают теми же свойствами, что и естественные референсные образцы ДНК.

Краткое описание изобретения

Технической задачей изобретения является разработка способа создания искусственных референсных образцов ДНК для применения в тест-системах, основанных на методе ПЦР, в том числе количественной ПЦР.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание искусственных референсных образцов ДНК, которые характеризуются такой же кинетикой ПЦР, что и естественные референсные образцы ДНК, а также сокращение времени, необходимого для разработки тест-системы.

Технический результат достигается тем, что способ создания искусственных референсных образцов ДНК включает следующие этапы. На первом этапе получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК. В одном из вариантов реализации, референсные фрагменты ДНК получают методом ПЦР, используя любые молекулы ДНК, содержащие необходимый генетический вариант. Чаще всего ДНК-матрица является геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному или мутантному генетическому варианту. Также в качестве ДНК-матрицы может быть использована геномная ДНК, выделенная из гетерозиготы, содержащей как нормальный, так и мутантный генетические варианты. Кроме геномной ДНК, в качестве ДНК-матрицы могут быть использованы продукты ПЦР, химически синтезированные молекулы или векторы различной природы, содержащие необходимый генетический вариант. В случае, когда ДНК, содержащая один из генетических вариантов, недоступна или ее получение связано со значительными временными, финансовыми или иными затратами, соответствующий референсный фрагмент ДНК может быть получен методом направленного мутагенеза. Направленный мутагенез может производиться любыми способами, известными специалистам в данной области. Однако предпочтительным является описанный далее способ, основанный на методе ПЦР, так как он не требует никаких реактивов и оборудования в дополнение к тем, которые используются на предыдущих и последующих этапах создания искусственных референсных образцов ДНК. Получение референсного фрагмента ДНК методом направленного мутагенеза позволяет значительно сэкономить время на поиске особи, содержащей мутантный генетический вариант, и сократить время разработки тест-системы. В одном из вариантов реализации один или оба референсных фрагментов ДНК могут быть полностью или частично синтезированы химически.

На втором этапе создания искусственных референсных образцов ДНК референсные фрагменты ДНК клонируют в генетические векторы. В результате получают рекомбинантные векторы. Этот шаг, во-первых, позволяет в короткие сроки в лабораторных условиях получать референсные фрагменты ДНК в любых количествах, необходимых для дальнейшей работы. Во-вторых, этот шаг исключает необходимость каждый раз при приготовлении референсных образцов ДНК получать нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК и подтверждать секвенированием, что референсные фрагменты ДНК действительно содержат нормальный и мутантный генетические варианты.

На третьем этапе создания искусственных референсных образцов ДНК последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов, верифицируют методом секвенирования. Этот шаг необходим, чтобы гарантировать, что будущие референсные образцы ДНК действительно будут содержать нормальный и мутантный генетические варианты.

Заключительным этапом является получение таких растворов рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК, то есть таких образцов, которые проявляют кинетику амплификации в ПЦР (эффективность амплификации), не отличимую от кинетики амплификации естественных образцов.

Варианты создания таких искусственных референсных образцов ДНК зависят от принципа работы тест-системы, для которой создаются искусственные референсные образцы ДНК.

В одном варианте реализации настоящего изобретения растворы, содержащие рекомбинантные векторы разбавляют до концентраций рекомбинантных векторов 100-10000 молекул в микролитре, что сопоставимо с концентрациями исследуемых образцов ДНК. При этом разбавителем может служить буферный раствор, который не препятствует прохождению ПЦР при генетическом тестировании. Однако в предпочтительном варианте исполнения растворы рекомбинантных векторов разбавляют очищенной водой. Разбавление позволяет снизить концентрацию ингибиторов ПЦР, которые могут попадать в раствор при выделении рекомбинантных векторов, а также облегчает дальнейший анализ и интерпретацию результатов генетического тестирования.

В результате указанного разбавления получают искусственные референсные образцы ДНК, пригодные для использования в тест-системах, основанных на классической ПЦР, с последующим анализом длины продуктов ПЦР и/или анализом паттерна расщепления продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами рестрикции.

В другом варианте реализации настоящего изобретения после верификации последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов ДНК рекомбинантных векторов приводят в релаксированное состояние. Для этого используют любую подходящую нуклеазу, которая производит не менее одного разрыва ДНК в любом месте рекомбинантного вектора, кроме того участка референсного фрагмента ДНК, который будет амплифицирован в ходе ПЦР при генетическом тестировании. Внесение разрыва в ДНК рекомбинантного вектора позволяет убрать сверхспирализацию ДНК, свойственную кольцевым молекулам. В предпочтительном варианте изобретения для релаксации используют эндонуклеазу рестрикции, которая вносит двуцепочечный разрыв, что приводит к линеаризации рекомбинантных векторов. ДНК рекомбинантных векторов приводят в релаксированное состояние в том случае, если искусственные референсные образцы ДНК создают для тест-системы, направленной на выявление генетического варианта в образце ДНК, не подверженной сверхспирализации. Предпочтительно релаксацию ДНК рекомбинантных векторов проводят до описанного ниже разбавления растворов рекомбинантных референсных образцов, однако релаксация может быть проведена и после этого разбавления.

На следующем этапе создания искусственных референсных образцов ДНК растворы, содержащие рекомбинантные векторы разбавляют до концентрации 100-10000 молекул в микролитре. Такая концентрация сопоставима с концентрацией исследуемых образцов ДНК. При этом разбавление проводят раствором, содержащим чужеродную ДНК. Разбавление раствором чужеродной ДНК позволяет получать воспроизводимые низкие концентрации рекомбинантных векторов, а также обеспечивает сложность состава искусственных референсных образцов ДНК, сопоставимую со сложностью состава тестируемых образцов ДНК.

В результате разбавления раствором чужеродной ДНК получают нормальный искусственный референсный образец ДНК, который по кинетическим свойствам соответствуют естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по нормальному генетическому варианту, а также мутантный искусственный референсный образец ДНК, который по своим кинетическим свойствам соответствуют естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по мутантному генетическому варианту.

На следующем этапе создают искусственный референсный образец ДНК, который имитирует гетерозиготное состояние мутантного генетического варианта. При необходимости искусственные референсные образцы ДНК, полученные на предыдущем этапе, дополнительно разбавляют так, чтобы концентрация нормального рекомбинантного вектора в разбавленном нормальном искусственном референсном образце ДНК не отличалась более, чем на 40%, от концентрации мутантного рекомбинантного вектора в разбавленном мутантном искусственном референсном образце ДНК. Затем разбавленные нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК смешивают между собой так, чтобы концентрации рекомбинантных векторов в смеси не отличались друг от друга более, чем на 40%. В результате получают гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК, который по кинетическим свойствам соответствует естественному образцу ДНК, полученному из гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты. Этот шаг позволяет сэкономить время на поиске гетерозиготы по мутантному генетическому варианту и значительно сократить время разработки тест-системы.

Важно, что в любом случае для реализации способа используют искусственные референсные образцы ДНК, которые по своим кинетическим свойствам соответствуют естественным образцам ДНК, такие образцы могут быть использованы в том числе тест-системах, основанных на количественной ПЦР. В одном варианте реализации такие тест-системы включают флюоресцентный краситель, интеркалирующий в двуцепочечную ДНК. При этом для выявления определенного генетического варианта может быть использован вариант-специфический праймер или анализ кривых плавления высокого разрешения (метод HRM). В предпочтительном варианте реализации тест-системы на основе количественной ПЦР вместо интеркалирующего флюоресцентного красителя включают модифицированные олигонуклеотиды, содержащие флюорофоры, например TaqMan зонды. При этом каждому генетическому варианту однозначно соответствует определенный модифицированный олигонуклеотид.

Описанные выше тест-системы, основанные как на классической, так и на количественной ПЦР, содержат общие компоненты, необходимые для проведения ПЦР: буферный раствор, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры, комплементарные нормальному и мутантному референсным фрагментам ДНК. Буферный раствор представляет собой смесь различных веществ, обеспечивающей оптимальные условия для работы ДНК-полимеразы. В указанной тест-системе используют термостабильную ДНК-полимеразу, которая катализирует реакцию полимеризации дезоксинуклеозидтрифосфатов и обеспечивает достраивание 3'-конца новой цепи ДНК согласно принципу комплементарности. Дезоксинуклеозидтрифосфаты представлены смесью дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитозинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата. Праймеры в составе тест-систем комплементарны нормальному и мутантному референсным фрагментам ДНК. В одном варианте реализации тест-система может включать один или два праймера, комплементарных только одному референсному фрагменту ДНК. В этом случае тест-система включает более двух праймеров. В другом варианте реализации тест-система включает два праймера, составляющих пару, которые комплементарны как нормальному, так и мутантному референсному фрагменту ДНК.

Краткое описание рисунков

Заявленное изобретения поясняется следующими рисунками:

На Фиг.1А схематично показано взаимное расположение генетического варианта и фланкирующих праймеров.

На Фиг.1Б-В схематично показано взаимное расположение мутантного генетического варианта и праймеров, используемых для получения мутантного референсного фрагмента ДНК.

Фиг.2 представляет один из возможных способов получения мутантного референсного фрагмента ДНК методов направленного мутагенеза.

Фиг. 3А-В сравнение кинетических свойств искусственных референсных образцов ДНК с естественными образцами ДНК.

Подробное описание изобретения

Особенности изобретения раскрыты в следующем описании. В рамках данного изобретения могут быть разработаны альтернативные варианты его реализации. Кроме того, хорошо известные элементы изобретения не будут описаны подробно или будут опущены, чтобы не перегружать подробностями описание настоящего изобретения.

Изобретение описывает способ создания искусственных референсных образцов ДНК и тест-систем для генетического тестирования с применением искусственных референсных образцов ДНК, полученных описанным способом.

Для создания искусственных референсных образцов ДНК получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК.

В одном варианте реализации настоящего изобретения, показанном на Фиг.1, референсные фрагменты ДНК 5 получают с помощью ПЦР, используя подходящую ДНК-матрицу 1 и специфические праймеры 3 и 4. Разработку дизайна последовательности нуклеотидов праймеров производят при помощи любой известной в данной области компьютерной программы. При разработке дизайна последовательности нуклеотидов специфических праймеров 3 и 4 учитывают следующие параметры: размер референсного фрагмента ДНК 5, полученного в результате ПЦР со специфическими праймерами 3 и 4, должен составлять 100-30000 п.н. Размер референсного фрагмента ДНК 5, с одной стороны, определяются тем, что референсный фрагмент ДНК 5 должен быть не меньше продукта ПЦР, получаемого в ходе применения тест-системы, для которой разрабатываются искусственные референсные образцы ДНК. С другой стороны, референсный фрагмент ДНК 5 должен быть удобен при клонировании в вектор и последующей наработке рекомбинантного вектора. Температура денатурации специфических праймеров 3 и 4 должна находиться в диапазоне 45-85°C. При этом длина последовательности нуклеотидов каждого специфического праймера обычно составляет 17-25, но может выходить за эти рамки, если позволяет получать специфический продукт ПЦР. Из списка предложенных компьютерной программой последовательностей нуклеотидов специфических праймеров выбирают те, которые имеют минимальное число неспецифических частично комплементарных участков в геноме того организма, для генетического тестирования которого разрабатывается тест-система.

В одном варианте реализации ДНК-матрица 1 является геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному или мутантному генетическому варианту. В другом варианте реализации ДНК-матрица 1 является геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы, содержащей как нормальный, так и мутантный генетические варианты. Кроме геномной ДНК в качестве ДНК-матрицы 1 могут быть использованы любые молекулы ДНК, содержащие необходимый генетический вариант. Такие молекулы могут представлять собой продукты ПЦР, химически синтезированные молекулы или рекомбинантрные векторы различной природы, включая, но не ограничиваясь BAC, YAC, плазмидные или вирусные векторы.

Специфические праймеры 3 и 4, используемые в ПЦР для получения референсных фрагментов ДНК 5, могут окружать генетический вариант 2, как показано на Фиг.1А. Такие праймеры называют фланкирующими. Если мутантный генетический вариант представляет собой замену, инсерцию или делецию такого количества нуклеотидов, что продукт ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4 и ДНК, содержащей мутантный генетический вариант, имеет размер 100-30000 п.н., тогда для получения нормального и мутантного референсных фрагментов могут быть использованы одни и те же фланкирующие праймеры 3 и 4.

В случае, если мутантный генетический вариант представляет собой такую делецию, что получение продукта ПЦР длиной 100-30000 п.н. с использованием фланкирующих праймеров оказывается невозможным, тогда для получения мутантного референсного фрагмента ДНК проводят ПЦР с использованием одного или двух дополнительных фланкирующих праймеров. На Фиг.1Б показан пример, когда делеция 7 удаляет последовательности нуклеотидов, комплементарные обоим фланкирующим праймерам 3 и 4. В этом случае мутантный референсный фрагмент ДНК 8 получают с помощью ПЦР с ДНК 6, содержащей мутантный генетический вариант, и двумя дополнительными фланкирующими праймерами 9 и 10. Если делеция удаляет последовательность нуклеотидов, комплементарную только одному из фланкирующих праймеров, тогда для получения мутантного референсного фрагмента ДНК может быть использован второй фланкирующий праймер в паре с подходящим дополнитеным фланкирующим праймером.

В том случае, когда мутантный генетический вариант представляет собой инсерцию 11 такого количества нуклеотидов, что размер продукта ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4 с учетом инсерции значительно превышает 30000 п.н., тогда для получения мутантного референсного фрагмента ДНК 8 проводят ПЦР с ДНК 6, содержащей мутантный генетический вариант, и внутренним праймером 12 в паре с одним из фланкирующих праймеров, как показано на Фиг.1В. Полученный референсный фрагмент ДНК 8 имеет последовательность нуклеотидов, одна часть которой идентична последовательности нуклеотидов ДНК, расположенной с одной стороны инсерции, а вторая часть идентична части инсерции 11. ПЦР с внутренним праймером и одним из фланкирующих праймеров проводят для получения мутантного референсного фрагмента ДНК и в том случае, если мутантный генетический вариант представляет собой замену значительного количества нуклеотидов, включая нуклеотиды, комплементарные одному из фланкирующих праймеров.

В том случае, когда ДНК, содержащая один из генетических вариантов, недоступна или ее получение связано со значительными временными, финансовыми или иными затратами, референсный фрагмент ДНК, содержащий этот генетический вариант, может быть получен с помощью направленного мутагенеза. Направленный мутагенез может производиться любыми методами, известными специалистам в данной области техники. Однако предпочтительным является метод на основе ПЦР, представленный на Фиг.2. Указанный метод не требует никаких реактивов и оборудования в дополнение к тем, которые используются на предыдущих и последующих этапах создания искусственных референсных образцов ДНК. Чаще всего, недоступной бывает ДНК, содержащая мутантный генетический вариант, поэтому ниже описано применение метода направленного мутагенеза для получения мутантного референсного фрагмента ДНК.

В методе направленного мутагенеза, представленном на Фиг.2, в дополнение к фланкирующим праймерам используют пару центральных праймеров 14 и 15. Если мутантный генетический вариант 13 представляет собой замену или инсерцию такого количества нуклеотидов, которое может быть включено в последовательность праймера для ПЦР, тогда последовательности нуклеотидов центральных праймеров 14 и 15 содержат мутантный генетический вариант 13. В одном варианте реализации мутантный генетический вариант располагается на 5´-конце каждого центрального праймера, а остальная часть последовательности нуклеотидов каждого центрального праймера комплементарна последовательности нуклеотидов ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. В другом варианте реализации мутантный генетический вариант 13 располагается максимально близко (±5 п.н.) к центру центральных праймеров 14 и 15, а остальная часть последовательности нуклеотидов центральных праймеров комплементарна последовательности нуклеотидов ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. Общая длина каждого центрального праймера определяется длиной мутантного генетического варианта 13, а также длиной той части каждого центрального праймера, которая комплементарна участку ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. Длина этой комплементарной части должна быть достаточной, чтобы однозначно задавать одну из границ специфического продукта ПЦР. Вторую границу специфического продукта ПЦР задает один из фланкирующих праймеров 3 и 4. При этом пару прямому фланкирующему праймеру 3 составляет обратный центральный праймер 14, а пару обратному фланкирующему праймеру 4 составляет прямой центральный праймер 15. Еще одним важным параметром, определяющим длину и состав центральных праймеров является длина области взаимной комплементарности центральных праймеров, которая должна в дальнейшем обеспечить устойчивую ренатурацию продуктов ПЦР 18 и 19, полученных при участии центральных праймеров. Область взаимной комплементарности включает в себя, как минимум, мутантный генетический вариант 13, а также может включать часть последовательности нуклеотидов, комплементарной ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. При этом нуклеотиды, расположенные ближе к 3´-концу прямого центрального праймера 15, будут комплементарны нуклеотидам, расположенным ближе к 5´-концу обратного центрального праймера 14, и наоборот. В предпочтительном варианте реализации центральные праймеры полностью комплементарны друг другу, так как чем больше длина области взаимной комплементарности центральных праймеров, тем устойчивее в дальнейшем будет ренатурация продуктов ПЦР 18 и 19, полученных при участии центральных праймеров.

В случае, когда мутантный генетический вариант представляет собой делецию такого количества нуклеотидов, которое не может быть включено в последовательность праймера для ПЦР, тогда одна часть последовательности нуклеотидов каждого центрального праймера комплементарна участку ДНК, содержащей нормальный генетический вариант, примыкающему к одной границе делеции, а вторая часть последовательности нуклеотидов каждого центрального праймера комплементарна участку ДНК, содержащей нормальный генетический вариант, примыкающему ко второй границе делеции.

Для получения мутантного референсного фрагмента ДНК 8 проводят две независимые ПЦР с ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант 17. В одной ПЦР используется прямой фланкирующий праймер 3 и обратный центральный праймер 14, во второй ПЦР используется прямой центральный праймер 15 и обратный фланкирующий праймер 4. В результате получают два частично совпадающих продукта ПЦР 18 и 19, которые содержат мутантный генетический вариант 13. Длина совпадающего участка соответствует области взаимной комплементарности центральных праймеров. Продукты ПЦР 18 и 19 очищают от оставшихся праймеров и смешивают в эквимолярных концентрациях. Полученную смесь используют для проведения 8-15 ПЦР в отсутствие праймеров. В этой реакции продукты ПЦР 18 и 19 сначала денатурируют, а затем ренатурируют с образованием гетерокомплексов 20, в которых цепи ДНК денатурированных продуктов ПЦР 18 и 19 образуют водородные связи на комплементарном участке, соответствующем области взаимной комплементарности центральных праймеров. ДНК-полимераза использует 3´-конец каждой цепи ДНК гетерокомплекса в качестве праймера и достраивает одну цепь ДНК по шаблону другой цепи ДНК. В результате этой реакции получается мутантный референсный фрагмент ДНК 8, однако его количества недостаточно, для дальнейшего создания искусственного референсного образца ДНК. Поэтому реакционную смесь, содержащую мутантный референсный фрагмент ДНК 8, разбавляют в 100-1000 раз и используют в ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4. В результате получают мутантный референсный фрагмент ДНК 8 в том количестве, которое необходимо для дальнейших этапов создания искусственного мутантного референсного образца ДНК.

Если мутантный генетический вариант представляет собой делецию такого количества нуклеотидов, что получить мутантный референсный фрагмент ДНК 8 размером 100-1000 п.н в ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4 оказывается невозможно, тогда в описанном методе направленного мутагенеза вместо одного или двух фланкирующих праймеров 3 и 4 могут быть использованы один или два дополнительных фланкирующих праймера 9 и 10.

Получение мутантного референсного фрагмента ДНК методом направленного мутагенеза позволяет значительно сэкономить время на поиске особи, содержащей мутантный генетический вариант, и сократить время разработки тест-системы.

Понятно, что если доступна ДНК, содержащая мутантный генетический вариант, но недоступна ДНК, содержащая нормальный генетический вариант, тогда нормальный референсный фрагмент ДНК может быть получен с помощью метода направленного мутагенеза, описанного выше.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, мутантный референсный фрагмент ДНК и/или нормальный референсный фрагмент ДНК могут быть синтезированы химически, получены методами клонирования или получены с помощью любой комбинации методов химического синтеза, клонирования и направленного мутагенеза.

На следующем этапе создания искусственных референсных образцов ДНК, полученные описанными выше способами референсные фрагменты ДНК клонируют в генетические векторы. Этот шаг позволяет в короткие сроки в лабораторных условиях получать референсные фрагменты ДНК в любых количествах, необходимых для дальнейшей работы. Для клонирования могут применяться любые методы, известные в данной области техники. Генетические векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы (в том числе фаговые векторы), BAC, YAC, а также любые подходящие генетические векторы.

Последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК, клонированных в векторы, верифицируют методом секвенирования. Этот шаг необходим для того, чтобы гарантировать, что референсные фрагменты ДНК в составе рекомбинантных векторов действительно содержат нормальный и мутантный генетические варианты. Верификацию последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК достаточно провести один раз за все время создания искусственных референсных образцов ДНК, так как последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов не меняются при дальнейших манипуляциях согласно настоящему изобретению. Для дальнейших этапов создания искусственных референсных образцов ДНК выбирают только те рекомбинантные векторы, которые содержат референсные фрагменты ДНК с ожидаемой последовательностью нуклеотидов, содержащей нормальный или мутантный генетические варианты.

Дальнейшие этапы создания искусственных референсных образцов ДНК зависят от принципа работы тест-системы, для которой создаются искусственные референсные образцы ДНК. В одном из вариантов реализации после выделения рекомбинантных векторов из клеток, концентрацию рекомбинантных векторов измеряют на высокоточном спектрофотометре (например, NanoDrop) или на любом другом подходящем приборе. После этого растворы рекомбинантных векторов разбавляют так, чтобы молярные концентрации рекомбинантных векторов были сопоставимы с концентрацией исследуемого образца. Разбавление необходимо для того, чтобы снизить концентрацию ингибиторов ПЦР, которые могут попалать в растворы рекомбинантных векторов при выделенных из клеток. Кроме того, разбавление облегчает дальнейший анализ и интерпретацию результата генетического тестирования. Если не проводить разбавления, то при электрофорезе можно перегрузить дорожку геля продуктами ПЦР, полученными при использовании неразбавленных растворов рекомбинантных векторов. При подобном перегрузе продукты ПЦР в геле будут двигаться иначе, чем фрагменты ДНК, нанесенные на гель без перегруза. В этом случае будет сложно сравнить размеры продуктов ПЦР, полученных при использовании искусственных референсных образцов ДНК и при использовании тестируемого образца ДНК. Слишком большое количество продуктов ПЦР, полученных при использовании неразбавленных растворов рекомбинантных векторов, может также исказить паттерн расщепления специфической эндонуклеазой рестрикции, какая-то часть продуктов ПЦР может оказаться нерасщепленной. Все это затрудняет интерпретацию результатов генетического тестирования, полученных при использовании тест-систем на основе классической ПЦР. В одном варианте реализации разбавление проводят очищенной водой, в другом варианте реализации разбавление проводят любым буферным раствором, который не препятствует прохождению ПЦР при дальнейшем генетическом тестировании. В результате получают искусственные референсные образцы ДНК, которые могут применяться в тест-системах, основанных на классической ПЦР.

Для получения искусственных референсных образцов ДНК для тест-систем, основанных на количественной ПЦР, после выделения рекомбинантных векторов их ДНК приводят в релаксированное состояние. Релаксация ДНК рекомбинантных векторов позволяет избежать искажений кинетики ПЦР, связанных со сверхспирализацией ДНК, характерной для кольцевых молекул (Hou et al., 2010). Сверхспирализация влияет на температуру денатурации ДНК-матрицы, затрудняет комплементарное связывание праймера с ДНК-матрицей, затрудняет синтез новой цепи ДНК. Таким образом сверхспирализация ДНК-матрицы снижает эффективность амплификации. Если не проводить релаксацию ДНК рекомбинантных векторов, то в количественной ПЦР референсные образцы ДНК будут демонстрировать кинетические свойства, отличные от кинетических свойств тестируемых образцов ДНК, которые чаще всего представлены линейной геномной ДНК. Релаксацию ДНК рекомбинантных векторов проводят с помощью нуклеазы, которая вносит не менее одного разрыва в любом месте рекомбинантного вектора, кроме того участка референсного фрагмента ДНК, который будет амплифицирован в ПЦР в ходе использования тест-системы. В предпочтительном варианте исполнения используют эндонуклеазу, которая производит двуцепочечный разрыв ДНК, что приводит к лианеризации рекомбинантных векторов. Релаксация ДНК рекомбинантных векторов может проводиться как до, так и после разбавления растворов рекомбинантных векторов, которое описано ниже.

Рекомбинантные векторы разбавляют до концентрации 100-10000 молекул в микролитре, что сопоставимо с концентрациями тестируемых образцов ДНК. Для этого с раствором каждого рекомбинантного вектора проводят серию последовательных разведений. Затем проводят количественные ПЦР с растворами, полученными в результате последовательных разведений, и с естественным образцом ДНК. Выбирают тот раствор, Ct которого максимально близок к Ct естественного образца ДНК. Если необходимо, концентрацию рекомбинантного вектора в выбранном растворе корректируют так, чтобы Ct скорректированного раствора находился между 20 и 30 циклом.

Как правило, тестируемые образцы ДНК представляют собой геномную ДНК или митохондриальную ДНК, выделенную из биологических образцов, взятых у особи, в отношении которой проводится тестирование. Генетический вариант, на выявление которого направлена тест-система, составляет малую часть геномной или митохондриальной ДНК. Соответственно, количество участка ДНК, содержащего исследуемый генетический вариант, которое может быть использовано для генетического тестирования, очень мало и составляет приблизительно от 100 до 10000 копий в микролитре раствора. Как показал опыт, разбавление раствора рекомбинантных векторов чистой водой до концентрации приблизительно от 100 до 10000 молекул в микролитре дает плохо воспроизводимые результаты в количественной ПЦР: разница между Ct даже в двух технических повторах может достигать 7 циклов. Чтобы решить эту проблему, разбавление растворов рекомбинантных векторов проводят не чистой водой, а раствором чужеродной ДНК. В предпочтительном варианте реализации чужеродная ДНК является геномной ДНК, выделенной из особей эволюционно отдаленного биологического вида. При этом выбирают такую чужеродную ДНК, которая обеспечивает наилучший результат. После разбавления растворов рекомбинантных векторов раствором выбранной чужеродной ДНК разница между Ct в двух технических повторах не должна превышать 0,5 цикла. При этом концентрация чужеродной ДНК в разбавленных растворах рекомбинантных векторов составляет 1-10 нг/мкл. Помимо стабилизации кинетики ПЦР разбавление раствором чужеродной ДНК обеспечивает сложность состава ДНК референсных образцов, сопоставимую со сложностью исследуемых образцов ДНК.

В результате корректировки концентрации рекомбинантных векторов получают два искусственных референсных образца ДНК. Нормальный искусственный референсный образец ДНК содержит нормальный генетический вариант и по кинетическим свойствам соответствует естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по нормальному генетическому варианту. Мутантный искусственный референсный образец ДНК содержит мутантный генетический вариант и по кинетическим свойствам соответствует естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по мутантному генетическому варианту.

Для создания искусственного референсного образца ДНК, соответствующего гетерозиготному состоянию исследуемого генетического варианта, получают два раствора с приблизительно равными концентрациями релаксированных рекомбинантных векторов. Для этого при необходимости нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК разбавляют раствором чужеродной ДНК так, чтобы разница между Ct для разбавленных нормального и мутантного искусственных референсных образцов ДНК составляла не более 0,5 цикла, что при максимальной эффективности праймеров соответствует 40%. При этом Ct для разбавленных нормального и мутантного искусственных референсных образцов ДНК должны находится в пределах между 20 и 30 циклом. Разбавленные нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК смешивают между собой так, чтобы концентрации рекомбинантных векторов в смеси не отличались друг от друга более, чем на 40%. В результате получают гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК, содержащий в равных количествах нормальный и мутантный генетические варианты. При этом кинетические свойства гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК соответствуют естественному образцу ДНК, полученному из гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты.

Тест-системы, включающие искусственные референсные образцы ДНК, созданные способом, описанным в настоящем изобретении

Искусственные референсные образцы ДНК, полученные описанным способом используют в тест-системах, основанных на ПЦР. Такие тест-системы, помимо референсных образцов ДНК, содержат буферный раствор для проведения ПЦР, ДНК-полимеразу дезоксинуклеозидтрифосфаты и специфические праймеры.

Буферный раствор представляет собой смесь различных солей, обеспечивающей оптимальные условия для работы ДНК-полимеразы, в том числе стабильное значение  рН 6-10 (при 25 °С). Основой буферного раствора могут служить такие буферные вещества, как соли трис(гидроксиметил)аминометана (Tris), HEPES, MOPS и др. Буферный раствор содержит ионы Mg2+, которые необходимы для ферментативной активности ДНК-полимеразы. Среди прочих солей буферный раствор может содержать КСl, который стимулирует активность ДНК-полимеразы. Буферный раствор может содержать детергенты, например, NP-40, Triton X-100 или Tween 20, предотвращающие адсорбцию ДНК-полимеразы на пластиковых поверхностях (пробирки или лунки планшета, в которой проходит реакция ПЦР). Кроме того, буферный раствор может содержать дополнительные компоненты, повышающие специфичность и/или эффективность амплификации, например, диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, бетаин, ацетамид, бычий сывороточный альбумин (БСА), полиэтиленгликоль (PEG) и другие.

ДНК-полимераза катализирует реакцию полимеризации дезоксинуклеозидтрифосфатов и обеспечивает достраивание 3'-конца новой цепи ДНК согласно принципу комплементарности. ДНК-полимераза для использования в ПЦР должна сохранять ферментативную активность при высокой температуре длительное время. Поэтому описанные тест-системы включают термостабильные ДНК-полимеразы, например, Taq-полимеразу, Pfu-полимеразу, Pwo-полимеразу, а также различные ДНК-полимеразы, полученные генно-инженерным путём.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты служат субстратом для ДНК-полимеразы при синтезе новой цепи ДНК. В тест-системах на основе ПЦР дезоксинуклеозидтрифосфаты представлены смесью дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитозинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата, где указанные дезоксинуклеозидтрифосфаты смешаны в приблизительно равных пропорциях. При этом описанная смесь обеспечивает общую концентрацию дезоксинуклеозидтрифосфатов в конечной реакционной смеси при использовании тест-системы 10-500 микромоль/л.

Праймеры в составе тест-систем комплементарны нормальному и мутантному референсным фрагментам ДНК. В одном варианте реализации тест-система может включать один или два праймера, комплементарных только одному референсному фрагменту ДНК. В этом случае тест-система включает более двух праймеров. В другом варианте реализации тест-система включает два праймера, составляющих пару, которые комплементарны как нормальному, так и мутантному референсному фрагменту ДНК. В этом случае праймеры в составе тест-системы окружают генетические варианты. Праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Температура денатурации специфических праймеров 3 и 4 должна находиться в диапазоне 45-85°C. При этом длина последовательности нуклеотидов каждого специфического праймера обычно составляет 17-25, но может выходить за эти рамки, если позволяет получать специфический продукт ПЦР. В первую очередь праймеры должны быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них ДНК-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если специфичность праймеров недостаточна, то высока вероятность образования неспецифического продукта ПЦР при использовании тест-системы, что может дать ложно-позитивный результат генетического тестирования.

В некоторых вариантах реализации в одном растворе могут быть смешаны в различных сочетаниях описанные выше буферный раствор, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов и праймеры.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения тест-система может быть основана на классической ПЦР. Искусственные референсные образцы ДНК в такой тест-системе представляют собой рекомбинантные векторы, разбавленные очищенной водой или любым подходящим буферным раствором. При этом ДНК рекомбинантных векторов могут иметь релаксированную форму или кольцевую сверхспирализованную форму, а концентрации искусственных референсных образцов ДНК могут различаться между собой в 1-100 раз. В одном из вариантов реализации определение генетического варианта в тестируемом образце ДНК, проводят путем сравнения размера продукта ПЦР, полученного при использовании тестируемого образца ДНК, с размерами продуктов ПЦР, полученных при использовании искусственных референсных образцов ДНК. При этом размеры продуктов ПЦР чаще всего оценивают с помощью электрофореза. При этом буферный раствор в составе тест-системы может включать в себя инертные красители ДНК, позволяющие анализировать размер продуктов ПЦР с помощью электрофореза. Описанная тест-система может применяться для выявления мутантных генетических вариантов, представляющих собой делецию или инсерцию такого количества нуклеотидов, которое приведет к изменениям размера продукта ПЦР, которое можно однозначно детектировать с помощью электрофореза. В другом варианте реализации определение генетического варианта в тестируемом образце ДНК, может проводиться путем сравнения паттерна расщепления специфической эндонуклеазой рестрикции продукта ПЦР, полученного при использовании тестируемого образца ДНК, с паттерном расщепления этой же эндонуклеазой рестрикции продуктов ПЦР, полученных при использовании искусственных референсных образцов ДНК. В этом случае тест-система дополнительно включает специфическую эндонуклеазу рестрикции Для оценки паттерна расщепления продуктов ПЦР специфической эндонуклеазой рестрикции чаще всего используют электрофорез. В этом варианте реализации буферный раствор в составе тест-системы также может включать в себя инертные красители ДНК. Описанная тест-система может применяться для выявления мутантных генетических вариантов, представляющих собой делецию, инсерцию или замену нуклеотидов, которые приводят к исчезновению таких сайтов рестрикции специфической эндонуклеазы, что изменения паттерна расщепления продуктов ПЦР этой специфической эндонуклеазой рестрикции можно однозначно детектировать с помощью электрофореза.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения тест-система, включающая искусственные референсные образцы ДНК, созданные описанным выше способом, может быть основана на количественной ПЦР. Искусственные референсные образцы ДНК в такой тест-системе представляют собой растворы рекомбинантных векторов, разбавленные раствором чужеродной ДНК. При этом ДНК рекомбинантных векторов могут быть в релаксированном состоянии для того, чтобы воспроизводить свойства естественных образцов ДНК. При этом кинетические свойства нормального искусственного референсного образца ДНК соответствуют кинетическим свойствам естественного образца ДНК, полученного от гомозиготы по нормальному генетическому варианту, а кинетические свойства мутантного искусственного референсного образца ДНК соответствуют кинетическим свойствам естественного образца ДНК, полученного от гомозиготы по мутантному генетическому варианту. Указанная тест-система может содержать гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК, содержащий в приблизительно равных количествах линеаризованные плазмидные векторы с клонированными в них нормальным и мутантным референсными фрагментами ДНК. При этом кинетические свойства гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК соответствуют кинетическим свойствам естественного образца ДНК, полученного из гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты.

В одном из воплощений настоящего изобретения тест-система на основе количественной ПЦР в дополнение к перечисленным выше компонентам содержит любой подходящий краситель, интеркалирующий в двуцепочечную ДНК. Чаще всего таким красителем является SYBR Green. При этом в одном из вариантов реализации определенный генетический вариант в тестируемом образце ДНК выявляют за счет использования праймеров, специфических только этого определенного генетического варианта. В другом варианте реализации для определения генетического варианта в тестируемом образце ДНК используют метод HRM (high-resolution melting).

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения тест-система на основе количественной ПЦР в дополнение к общим компонентам содержит флюорофор-содержащие олигонуклеотиды, например, Taq-Man зонды, которые флюоресцируют после расщепления ДНК-полимеразой во время синтеза каждой новой цепи ДНК. При этом в тест-системе используют Taq-Man зонды, каждый из которых специфичен для одного определенного генетического варианта. Соответственно, Taq-Man зонды отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов, могут отличаться флюорофорами и гасителями, поглощающими свет, испускаемый флюорофорами.

Пример 1: Создание искусственных референсных образцов для выявления мутантного генетического варианта, ассоциированного с дегенеративной миелопатией у собак.

Дегенеративная миелопатия - это тяжёлое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, приводящее к параличу задних конечностей у собак, гомозиготных по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Этот мутантный аллель с разной частотой встречается у многих пород собак. Например, у собак породы Вельш корги пемброк только около 7% особей являются гомозиготами по нормальному аллелю гена SOD1. Около 28% особей являются гетерозиготами по указанному мутантному аллелю, а 65% особей являются гомозиготами по указанному мутантному аллелю и с высокой вероятностью (около 60% после 10 года жизни) проявляют признаки дегенеративной миелопатии (Zheng et al., 2014).

Участок геномной последовательности гена SOD1, содержащий мутантный генетический вариант c.118G>A (p.E40K) приведен ниже:

5'-gtatcaggaaccattacagggctgactG/Aaaggcgagcatggattccacgt-3'

Положение, в котором находится мутантный генетический вариант, отмечено жирным шрифтом, заглавными буквами. В нормальном аллеле в этом положении находится нуклеотид G, а в мутантном аллеле он заменен на нуклеотид A.

В приведенном примере поиск ДНК, содержащей мутантный генетический вариант, был связан с большими временными затратами, поэтому мутантный референсный фрагмент ДНК получали методом направленного мутагенеза. Дизайн последовательностей нуклеотидов пары фланкирующих и пары центральных праймеров разрабатывали с использованием программы Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) с учетом параметров, приведенных в подробном описании изобретения. Прямой фланкирующий праймер SOD1-F имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 56.7ºC. Обратный фланкирующий праймер SOD1-seq имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 56.4ºC. Прямой центральный праймер DM-m-for имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 59.9ºC. Обратный центральный праймер DM-m-rev имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 59.9ºC.

Для получения нормального референсного фрагмента ДНК использовали геномную ДНК домашней собаки, в которой наличие нормального генетического варианта было подтверждено секвенированием. Нормальный референсный фрагмент ДНК длиной 354 п.н. получили при помощи ПЦР с фланкирующими праймерами SOD1-F и SOD1-seq. Нормальный референсный фрагмент ДНК клонировали в плазмидный вектор pGEM-T Easy (№ A1360, Promega, USA). Полученный нормальный рекомбинантный вектор размножили в бактериях E. coli и выделили из бактериальных клеток. Последовательность нуклеотидов нормального референсного фрагмента ДНК в составе нормального рекомбинантного вектора верифицировали секвенированием.

Для получения мутантного референсного фрагмента ДНК параллельно проводили две ПЦР с геномной ДНК домашней собаки, содержащей нормальный генетический вариант. При этом в одной ПЦР использовали прямой фланкирующий праймер SOD1-F и обратный центральный праймер DM-m-rev, а в другой ПЦР использовали обратный фланкирующий праймер SOD1-seq и прямой центральный праймер DM-m-for. В результате получали два продукта ПЦР, которые имели совпадающий участок длиной 20 п.н. Этот совпадающий участок участок соответствовал центральным праймерам и содержал мутантный генетический вариант. Полученные продукты ПЦР очищали от оставшихся праймеров и смешивали в эквимолярных концентрациях. Полученную смесь использовали для проведения 10 циклов ПЦР в отсутствие праймеров. На следующем этапе реакционную смесь разбавляли в 1000 раз и использовали в качестве ДНК-матрицы в ПЦР с фланкирующими праймерами SOD1-F и SOD1-seq. В результате был получен мутантный референсный фрагмент ДНК, который затем клонировали в плазмидный вектор pGEM-T Easy (№ A1360, Promega, USA). Полученный мутантный рекомбинантный вектор размножили в бактериях E.coli, выделили из бактериальных клеток. Последовательность нуклеотидов мутантного референсного фрагмента ДНК в составе мутантного рекомбинантного вектора верифицировали секвенированием.

Рекомбинантные векторы линеаризовали, используя эндонуклеазу рестрикции MluI, которая вносит один двуцепочечный разрыв в ДНК рекомбинантных векторов. При этом точка разрыва находится за пределами клонированных референсных фрагментов ДНК.

На следующем этапе линеаризованные рекомбинантные векторы разбавили до концентрации 100-10000 молекул в микролитре. Разбавления проводили раствором геномной ДНК лососевых рыб, фрагментированной ультразвуком до фрагментов со средней длиной 500-1000 пар нуклеотидов. Концентрация раствора геномной ДНК лососевых рыб в разбавленных растворах рекомбинантных векторов составляла приблизительно 3-5 нг/мкл.

Концентрации линеаризованных рекомбинантных векторов, содержащих референсные фрагменты ДНК, измеряли с помощью количественной ПЦР с праймерами, используемыми в тест-системе. Последовательности нуклеотидов этих праймеров не имеют отношения к настоящему изобретению, поэтому здесь не приводятся. По результатам количественной ПЦР концентрации линеаризованных рекомбинантных векторов, содержащих референсные фрагменты ДНК, скорректировали так, что разница между Ct для нормального и мутантного искусственных референсных образцов ДНК составляла 0,3 цикла. В результате были получены нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК.

На Фиг.3А на графике 27 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием нормального искусственного референсного образца ДНК. На графике 28 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному аллелю гена SOD1. Кривые 21 и 21´ отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для нормального генетического варианта. Кривые 22 и 22´отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для мутантного генетического варианта. Видно, что профиль соответствующих кинетических кривых, а также Ct, полученные в ПЦР с нормальным искусственным референсным образцом ДНК и с геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному аллелю гена SOD1, очень похожи. Это говорит о том, что нормальный искусственный референсный образец ДНК по кинетическим характеристикам соответствует геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному аллелю гена SOD1.

На Фиг.3Б на графике 29 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием мутантного искусственного референсного образца ДНК. На графике 30 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Кривые 24 и 24´ отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для нормального генетического варианта. Кривые 23 и 23´отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для мутантного генетического варианта. Видно, что профиль соответствующих кинетических кривых, а также Ct, полученные в ПЦР с мутантным искусственным референсным образцом ДНК и с геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, очень похожи. Это говорит о том, что мутантный искусственный референсный образец ДНК по кинетическим характеристикам соответствует геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Геномная ДНК, выделенная из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, оказалась доступна намного позже, чем был получен мутантный искусственный референсный образец ДНК. До этого результаты генетического тестирования приходилось дополнительно верифицировать с помощью секвенирования. В результате очередного генетического тестирования была найдена особь, гомозиготная по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. После того, как было показано соответствие кинетических характеристик мутантного искусственного референсного образца ДНК и геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, необходимость в верификации с помощью секвенирования отпала. Это значительно ускорило и удешевило процедуру генетического тестирования, не снизив достоверности ее результатов.

Полученные нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК частично использовали для приготовления гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК, имитирующего гетерозиготное состояние мутантного аллеля c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Для этого нормальный и мутантный референсные образцы ДНК смешали в равных объемах. На Фиг.3В на графике 31 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК. На графике 32 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Кривые 25 и 25´ отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для нормального генетического варианта. Кривые 26 и 26´отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для мутантного генетического варианта. Видно, что профиль соответствующих кинетических кривых, а также Ct, полученные в ПЦР с гетерозиготным искусственным референсным образцом ДНК и с геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, очень похожи. Это говорит о том, что гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК по кинетическим характеристикам соответствует геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1.

Описанные в тексте данной заявки варианты реализации последовательности действий в способе и составе тест-системы подтверждены испытаниями в лабораториях заявителя, но не являются единственно возможными и приведены с целью наиболее наглядного раскрытия сути изобретения.

Заявляемое изобретение является технологичным и простым в использовании и изготовлении относительно иных способов и тест-систем, известных в настоящий момент из уровня техники.

Похожие патенты RU2724504C1

название год авторы номер документа
Тест-система для диагностики наследственных заболеваний и способ ее применения 2021
  • Белякин Степан Николаевич
  • Максимов Даниил Александрович
  • Лактионов Петр Павлович
RU2773050C1
Способ преимплантационного генетического тестирования Гемофилии А 2022
  • Исаев Артур Александрович
  • Мусатова Елизавета Валерьевна
  • Софронова Яна Владиславовна
  • Жикривецкая Светлана Олеговна
  • Померанцева Екатерина Алексеевна
  • Марахонов Андрей Владимирович
  • Кушнир Арина Леонидовна
RU2795796C1
Способ идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор - пациент при планировании трансплантации гемопоэтических стволовых клеток 2017
  • Романюк Дмитрий Сергеевич
  • Постовская Анна Михайловна
  • Вдовин Александр Сергеевич
  • Ефимов Григорий Александрович
  • Савченко Валерий Григорьевич
RU2675597C1
Двухцепочечная РНК, способная снижать экспрессию мутантного аллеля с.607GA гена GNAO1 человека 2022
  • Бардина Марьяна Владимировна
  • Клементьева Наталия Владимировна
  • Светлова Екатерина Антоновна
  • Лунев Евгений Андреевич
RU2816137C1
Способ преимплантационного генетического тестирования наследственных множественных остеохондром типа 1 2022
  • Исаев Артур Александрович
  • Мусатова Елизавета Валерьевна
  • Софронова Яна Владиславовна
  • Жикривецкая Светлана Олеговна
  • Померанцева Екатерина Алексеевна
  • Орлова Анна Александровна
  • Кушнир Арина Леонидовна
RU2795824C1
НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В УВЕЛИЧЕНИИ ИЛИ УМЕНЬШЕНИИ СКОРОСТИ ОВУЛЯЦИИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ 2001
  • Ритвос Олли Виса-Пекка
  • Дэвис Джордж Генри
  • Гэллоуэй Сьюзан Мэй
  • Макнэтти Кеннет Паттрик
RU2283866C2
Способ преимплантационного генетического тестирования Блефарофимоза, птоза и синдрома обратного эпикантуса типа 1,2 2022
  • Исаев Артур Александрович
  • Мусатова Елизавета Валерьевна
  • Софронова Яна Владиславовна
  • Жикривецкая Светлана Олеговна
  • Померанцева Екатерина Алексеевна
  • Орлова Анна Александровна
  • Кушнир Арина Леонидовна
RU2799538C1
Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Альпорта 2022
  • Исаев Артур Александрович
  • Мусатова Елизавета Валерьевна
  • Софронова Яна Владиславовна
  • Жикривецкая Светлана Олеговна
  • Померанцева Екатерина Алексеевна
  • Орлова Анна Александровна
  • Кушнир Арина Леонидовна
RU2795481C1
Способ преимплантационного генетического тестирования анемии Фанкони 2022
  • Исаев Артур Александрович
  • Мусатова Елизавета Валерьевна
  • Софронова Яна Владиславовна
  • Жикривецкая Светлана Олеговна
  • Померанцева Екатерина Алексеевна
  • Марахонов Андрей Владимирович
  • Кушнир Арина Леонидовна
RU2792147C1
Способ преимплантационного генетического тестирования ахондроплазии 2022
  • Исаев Артур Александрович
  • Мусатова Елизавета Валерьевна
  • Софронова Яна Владиславовна
  • Жикривецкая Светлана Олеговна
  • Померанцева Екатерина Алексеевна
  • Орлова Анна Александровна
  • Кушнир Арина Леонидовна
RU2795482C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 724 504 C1

Реферат патента 2020 года СПОСОБ СОЗДАНИЯ ИСКУССТВЕННЫХ РЕФЕРЕНСНЫХ ОБРАЗЦОВ ДНК ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ И ТЕСТ-СИСТЕМА С ОБРАЗЦАМИ, ПОЛУЧЕННЫМИ УКАЗАННЫМ СПОСОБОМ

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ создания искусственных референсных образцов ДНК и тест-системы с использованием образцов ДНК, полученных указанным способом. Способ получения референсных образцов ДНК включает такие стадии, как получение нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК, получение нормального рекомбинантного вектора путем клонирования нормального референсного фрагмента ДНК в генетический вектор и мутантного рекомбинантного вектора путем клонирования мутантного референсного фрагмента ДНК в генетический вектор, верифицирование последовательности нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов и получение таких растворов рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК. Изобретение расширяет арсенал средств для создания искусственных референсных образцов ДНК. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 1 пр., 7 ил.

Формула изобретения RU 2 724 504 C1

1. Способ создания искусственных референсных образцов ДНК, который включает следующие этапы:

получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК;

получают нормальный рекомбинантный вектор путем клонирования нормального референсного фрагмента ДНК в генетический вектор и мутантный рекомбинантный вектор путем клонирования мутантного референсного фрагмента ДНК в генетический вектор;

верифицируют последовательности нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов;

получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один референсный фрагмент ДНК получают методом ПЦР.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве ДНК-матрицы используют геномную ДНК, выделенную из организма, содержащего нормальный генетический вариант и/или мутантный генетический вариант.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один референсный фрагмент ДНК получают методом направленного мутагенеза.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один референсный фрагмент ДНК получают методом химического синтеза.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что верификацию последовательностей нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов производят методом секвенирования.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые содержат 100-10000 молекул рекомбинантных векторов в микролитре раствора.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые дополнительно содержат чужеродную ДНК.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что получают такие растворы рекомбинантных векторов, в которых концентрации различных рекомбинантных векторов отличаются друг от друга не более чем на 40%.

10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ДНК рекомбинантных векторов дополнительно приводят в релаксированное состояние путем расщепления ДНК рекомбинантных векторов нуклеазой.

11. Тест-система, основанная на ПЦР, включающая: буферный раствор, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры, искусственные референсные образцы ДНК, при этом искусственные референсные образцы ДНК получены следующим способом:

получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК;

получают нормальный рекомбинантный вектор путем клонирования нормального референсного фрагмента ДНК в генетический вектор и мутантный рекомбинантный вектор путем клонирования мутантного референсного фрагмента ДНК в генетический вектор;

верифицируют последовательности нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов;

получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК.

12. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что искусственные референсные образцы содержат 100-10000 молекул рекомбинантных векторов в микролитре.

13. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что искусственные референсные образцы дополнительно содержат чужеродную ДНК.

14. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что ДНК искусственных референсных образцов находится в релаксированном состоянии.

15. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает не менее одной эндонуклеазы рестрикции.

16. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает флюорофорсодержащий олигонуклеотид, комплементарный нормальному генетическому варианту, и флюорофорсодержащий олигонуклеотид, комплементарный мутантному генетическому варианту.

17. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает искусственный референсный образец, полученный путем смешивания нормального и мутантного искусственных референсных образцов в таком соотношении, что количество нормального рекомбинантного вектора отличается от количества мутантного рекомбинантного вектора не более чем на 40%.

18. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает флюоресцентный краситель, интеркалирующий в двуцепочечную ДНК.

19. Тест-система по п. 15, отличающаяся тем, что дополнительно включает искусственный референсный образец, полученный путем смешивания нормального и мутантного искусственных референсных образцов в таком соотношении, что количество нормального рекомбинантного вектора отличается от количества мутантного рекомбинантного вектора не более чем на 40%.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2724504C1

Индукционный нагреватель для заготовок 1987
  • Лялин Виктор Михайлович
  • Павлов Александр Юрьевич
  • Журавлев Геннадий Модестович
  • Сергиенко Борис Иванович
SU1601784A1
EP 1329517 A1, 23.07.2003
WO 2018086263 A1, 17.05.2018
Каспирович, Д.А
Молекулярные механизмы генетических процессов: методы изучения геномов : методическое пособие / Д.А
Каспирович, Н.А
Глинская, Е.М
Волкова
- Пинск : ПолесГУ, 2015
Устройство для устранения мешающего действия зажигательной электрической системы двигателей внутреннего сгорания на радиоприем 1922
  • Кулебакин В.С.
SU52A1

RU 2 724 504 C1

Авторы

Белякин Степан Николаевич

Максимов Даниил Александрович

Лактионов Петр Павлович

Даты

2020-06-23Публикация

2019-08-16Подача