НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ САТН2 Российский патент 2020 года по МПК A61K38/17 A61P31/00 C07K14/465 C07K7/08 

Изобретение относится к области антибиотиков и иммуностимулирующих веществ, в частности, к пептидам, обладающим такой активностью, в частности, к специфическим пептидам, производным от СМАР27, также известного как САТН2.

САТН2 или СМАР27 является представителем антимикробных пептидов. К настоящему моменту многие типы антимикробных пептидов были выделены и отсеквенированы в течение последних десяти лет (см. избранные обзоры: Otvos Jr., L. Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59:1138; Otvos, Jr., L.J. Peptide Sci. 2000, 6:497; Tan, Y.-T. et al., Mol. Med. Today 2000, 6:309; Scott, M.G. and Hancock, R.E.W., Crit. Rev. Immunol. 2000, 20:407; Hancock, R.E.W. and Chapple, D.S. Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43:1317; Hetru, C. et al., In: Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects; Brey, P. and Hultmark, D. Ed., Chapman and Hall, London, 1998, pp. 40-66; Hancock, R.E.W. et al., Adv. Microb. Physiol. 1995 37:135; Vaara, M. Microbiol. Rev. 1992, 395). У млекопитающих и птиц большинство открытых на данный момент антимикробных пептидов принадлежат к суперсемейству кателицидина и дефензина. Было обнаружено, что кателицидины широко распространены среди разошедшихся видов, т.е. у млекопитающих, птиц, рыб и рептилий, что указывает на их эволюционную значимость, но их спектр существенно различается среди видов. Антимикробные пептиды семейства кателицидина закодированы в геноме как препропептиды и протеолитически расщепляются для образования биологически активных пептидов в диапазоне от 12 до 97 аминокислот (Ramanathan, В. et al., 2002, Microbes Infect. 4:361-372). Исходя из их типичной первичной и вторичной структуры полученные С-концевые пептиды могут быть разделены на четыре основных класса, названные 1) α-спиральные пептиды, линейные пептиды, которые, контактируя с окружением, имитирующим биологические мембраны, принимают амфипатическую структуру (LL-37, Agerberth, В., et al., PNAS 1995, 92:195; SMAP-29, Anderson, R.C., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48:673); 2) β-шпилечные пептиды, короткие циклические пептиды, образованные одним или двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (протегрины, Kokryakov, V.N., et al., FEBS Lett. 1993, 327:231; dodecapeptide, Romeo, D., et al., J. Biol. Chem. 1988, 263:9573); 3) триптофан-богатые пептиды (индолицидин) (Индолицидин, Selsted, М.Е., et al., J. Biol. Chem. 1992, 267:4292) и 4) пролин/аргинин-богатые пептиды (бактенецины, Gennaro, R., et al., Infect. Immun. 1989, 57:3142; PR39, Agerberth, В., et al., Eur. J. Biochem. 1991, 202:849).

Большинство кателицидинов демонстрирует широкую активность против некоторых грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов, простейших и вирусов с оболочкой (Zaiou, М. and Gallo, R.L., 2002, J. Mol. Med. 80:549-561). Van Dijk и соавт. (2005, Vet. Immunol. Immunopath. 106:321-327) обнаружили у курицы новый белок из семейства кателицидинов. Он относится к 1 группе (α-спиральных) пептидов и был обозначен СМАР27, также известен как САТН-2. Как и другие представители семейства кателицидинов СМАР27 закодирован как препропептид (154 аминокислот), и после протеолитической обработки высвобождается С-концевой пептид, который продемонстрировал потенциальную широкую противомикробную активность. Последовательность аминокислот данного С-концевого пептида, называемого СМАР27 или САТН2, представляет собой RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG.

В то же время были синтезированы различные производные СМАР27, и в более ранних исследованиях было показано (см. WO 2010/093245), что С-концевые усеченные производные СМАР27 не только сохраняют антибиотические свойства СМАР27 против грам(-) бактерий, но также они оказывают антибиотическое действие на грам(+) бактерии, такие как S. aureus и В. anthracis. Несмотря на то, что они, ак было обнаружено, довольно эффективны, сохраняется необходимость в дополнительных активных производных СМАР27.

Краткое описание изобретения

Авторы изобретения обнаружили новые производные СМАР27. В одном варианте реализации настоящее изобретение включает новое усеченное с N-конца производное СМАР27, в то время как в другом варианте реализации настоящее изобретение включает новые инверсные и ретро-инверсные производные СМАР27.

Кроме того, настоящее изобретение включает способ для in ovo вакцинации домашней птицы, предпочтительно куриц, включая введение производного СМАР27, где указанное производное СМАР27 выбрано из группы усеченных с С-конца производных СМАР27, усеченных с N-конца производных СМАР27, D-аминокислотных производных СМАР27, циклических производных СМАР27, инверсных и ретро-инверстных производных СМАР27.

Также частью изобретения является способ активирования иммунного ответа животного или человека, включающий введение указанному животному или человеку производного СМАР27, где указанное производное СМАР27 выбрано из группы усеченных с С-конца производных СМАР27, усеченных с N-конца производных СМАР27, D-аминокислотных производных СМАР27, циклических производных СМАР27, инверсных и ретро-инверсных производных СМАР27. Предпочтительно в указанном способе активация иммунного ответа выбрана из усиленной активации Толл-подобного рецептора путем увеличения захвата ДНК, нейтрализации эндотоксина, стимуляции производства иммунными клетками цитокинов/хемокинов, прямого хемотаксиса, усиленного фагоцитоза и стимуляции пролиферации и дифференцировки иммунных клеток.

Следующая часть настоящего изобретения представляет собой иммунологическую композицию, содержащую производное СМАР27, выбранное из группы усеченных с N-конца производных СМАР27, инверсных и ретро-инверстных производных СМАР27.

Также изобретение включает применение производного СМАР27, выбранного из группы усеченных с N-конца производных СМАР27, инверсных и ретро-инверстных производных СМАР27, для приготовления лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания или для приготовления вакцины, в частности, когда указанное применение представляет собой применение в качестве антибиотика или увеличение веса животного, на которого воздействуют соединением.

Кроме того, частью настоящего изобретения также является способ увеличения веса домашней птицы с помощью in ovo вакцинирования яиц указанных видов домашней птицы производным СМАР27, где указанное производное СМАР27 выбрано из группы усеченных с С-конца производных СМАР27, усеченных с N-конца производных СМАР27, D-аминокислотных производных СМАР27, циклических производных СМАР27, инверсных и ретро-инверсных производных СМАР27.

Описание чертежей

Фиг. 1 - Дифференциальный и общий подсчет лейкоцитов в периферической крови куриц на 2 день после подкожной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Salmonella enteritis pt13a. А) общий подсчет. В) дифференциальный подсчет.

Фиг. 2 - Смертность после подкожной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Salmonella enteritis pt13a. А) Кривые выживаемости птиц, обработанных пептидом, и необработанных птиц в течение 7 дней после заражения. В) Снижение смертности (%) относительно необработанных инфицированных птиц (+ контроль).

Фиг. 3 - Баллы, определенные для поражений, на 7 день после подкожной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Salmonella enteritis pt13a. Левый и правый грудные воздушные мешочки (дыхательные пути), печень и сердце (системная инфекция) были отдельно оценены с помощью балльной системы: 0 = без поражений, 1 = легкие поражения, 2 = умеренные поражения и 3 = тяжелые поражения. Средние оценки поражения (СОП, MLS) были рассчитаны как сумма баллов за поражения на птицу. А) Процент сальмонеллез-положительных птиц (СОП>1) и уменьшение числа сальмонеллез-положительных птиц относительно необработанных птиц. В) Средние баллы поражения относительно необработанных инфицированных птиц.

Рим. 4 - Дифференциальный и общий подсчет лейкоцитов в периферической крови куриц на 2 день после интратрахеальной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Е. coli 506. А) общей подсчет. В) дифференциальный подсчет.

Фиг. 5 - Смертность после интратрахеальной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Е. coli 506. А) Кривые выживаемости птиц, обработанных пептидом, и необработанных птиц в течение 7 дней после заражения. В) Снижение смертности (%) относительно необработанных инфицированных птиц (+ контроль).

Фиг. 6 - Баллы, определенные для поражений, на 7 день после подкожной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Е. coli 506. Левый и правый грудные воздушные мешочки (дыхательные пути), печень и сердце (системная инфекция) были отдельно оценены с помощью балльной системы: 0 = без поражений, 1 = легкие поражения, 2 = умеренные поражения и 3 = тяжелые поражения. Средние оценки поражения (СОП, MLS) были рассчитаны как сумма баллов за поражения на птицу. А) Процент колибацилоз-положительных птиц (СОП>1) и уменьшение числа колибацилоз-положительных птиц относительно необработанных птиц. В) Средние баллы поражения относительно необработанных инфицированных птиц.

Фиг. 7 - Подсчет для грудного воздушного мешка на 7 день после интратрахеальной инъекции 10⁶ КОЕ птичьего патогена Е. coli 506.

Фиг. 8 - Масса тела бройлеров Ross308 при вылуплении (D0) (Фиг. 8А) и на 7 день после вылупления (D7) (Фиг. 8B). Птицам вводили на 18 эмбриональный день 1 мг/кг пептида или носителя.

Фиг. 9 - Антибактериальная активность пептидов производных от СМАР27 in vitro против полевого изолята птичьего патогена Escherichia coli O78 (АРЕС O78). А) Антибактериальная активность пептидов (5 мкМ) против АРЕС O78 (2×10⁶ КОЕ/мл) в 50% бульоне Мюллера-Хинтона с использованием теста подсчета колоний. В) Антибактериальная активность пептидов (5 мкМ) против АРЕС O78 (3×10⁵ КОЕ/мл) в DMEM, содержащем 10% фетальной телячей сыворотки (FCS), с использованием теста подсчета колоний. С) Продукция клетками J774.A1 TNFα (ELISA) после 2 ч инкубации при 37°C с живыми или обработанными теплом АРЕС O78 (3×10⁵ КОЕ/мл) в DMEM/10% FCS, в присутствии и отсутствии 5 мкМ пептида. Данные представляют средние значения ± СОС (стандартная ошибка среднего) от 3 независимых экспериментов.

Фиг. 10 - Индукция пептидами производными от СМАР27 хемокинов в клетках HD11. HD11 клетки высевали на 96-луночные культуральные платы (2×10⁵ клеток/мл) в RPMI-1640/10% FCS и инкубировали при 37°C (5% CO₂) в среде с пептидом (20 мкМ) в течение 4 ч (не закрашены) или 24 ч (закрашены). Уровни транскрипции интерлейкина-1β, IL-8 (CXCLi2), моноцитарного хемотаксического белка-3 (МХБ-3) и RANTES (CCLi4) определяли с помощью ПЦР в реальном времени (real time PCR). Уровни значимости: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. Данные представляют средние значения ± СОС (стандартная ошибка среднего) от 3-4 независимых экспериментов.

Фиг. 11 - Нейтрализация пептидами производными от СМАР27 индукции Клетки HD11 высевали на 96-луночные культуральные платы (2×10⁵ клеток/мл) в RPMI-1640/10% FCS. Итоговые концентрации 50 нг/мл ЛПС пре-инкубировали с или без 20 мкМ пептида в течение 30 мин при 37°C (5% CO₂), наносили на клетки и инкубировали в течение 4 ч и 24 ч. А) Уровни транскрипции интерлейкина-1 определяли с помощью ПЦР в реальном времени (только для 4 ч). В) Супернатанты собирали для определения производства оксида азота (только для 24 ч) в тесте Грисса. Уровни значимости: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. Данные представляют средние значения ± СОС (стандартная ошибка среднего) от 3-4 независимых экспериментов.

Фиг. 12 - Замена фенилаланиновых остатков на триптофан усиливает in vitro способность СМАР27 нейтрализовать ЛПС. Клетки HD11 высевали на 96-луночные культуральные платы (2×10⁵ клеток/мл) в RPMI-1640/10% FCS. Итоговые концентрации 50 нг/мл ЛПС пре-инкубировали с или без 20 мкМ пептида в течение 30 мин при 37°C (5% CO₂), наносили на клетки и инкубировали в течение 4 ч и 24 ч. А) Уровни транскрипции интерлейкина-1 определяли с помощью ПЦР в реальном времени (только для 4 ч). В) Супернатанты собирали для определения производства оксида азота (только для 24 ч) в тесте Грисса. Уровни значимости: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. Данные представляют средние значения ± СОС (стандартная ошибка среднего) от 3-4 независимых экспериментов.

Фиг. 13 - Пептиды производные от СМАР27 усиливают захват ДНК и ДНК-индуцированную активацию. А) Клетки HD11 стимулировали в течение 4 ч 2.5 нМ Alexa-Fluor 488 меченой ODN-2006 в отсутствии и присутствии пептидов производных СМАР27 (5 мкМ), после чего захват ДНК анализировали с помощью проточной цитометрии. В) Супернатанты клеток HD11 стимулированные большее время (17 h) при тех же условиях собирали и использовали для определения продукции оксида азота в тесте Грисса. Данные представляют средние значения ± СОС (стандартная ошибка среднего) от 3-4 независимых экспериментов.

Определения

Используемые в настоящей заявке термины "СМАР27" или "САТН2" определены как белки, имеющие последовательность RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG, но также аминированный с С-конца вариант RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH₂, также обозначаемый как CMAP1-26-NH2, включен в это определение. Так как известно, что у кателицидинов аминирование С-концевого глицинового остатка добавляет функциональность (Shinnar, А.Е. et al., 2003, Bioorg. Chem. 31:425-436; Tomasinsig, I. And Zanetti, M, 2005, Curr. Prot. Pept. Sci. 6:23-34), то предполагается, что CMAP1-26-NH2 представляет собой активная форма пептида.

Термин "пептид" обозначает в настоящей заявке последовательность аминокислот, соединенных пептидной связью, где аминокислоты взяты из двадцати протеиногенных аминокислот и где одна или несколько аминокислот могут находиться L-конфигурации или D-конфигурации, или, изолейцин и треонин в D-алло конфигурации (инверсия только в одном хиральном центре). Пептид согласно изобретению может быть линейным, т.е. иметь первую и последнюю аминокислоты в последовательности со свободными NH₂- или COOH-группой, соответственно, или быть модифицированным с N-конца (ацетилирование) и/или с С-конца (аминирование).

"Усеченные с С-конца производные СМАР27" в настоящей заявке определены как усеченные пептиды, описанные в WO 2010/093245, в частности перечисленные пептиды: CMAP26-NH2, СМАР26, СМАР26 (P14→G), СМАР26 (P14→L), СМАР1-21, СМАР1-15, CMAP1-15 (F2→L), CMAP1-15 (F5→L), CMAP1-15 (F12→L), CMAP1-15 (3xF→L), CMAP1-15 (F2→W), CMAP1-15 (F5→W), CMAP1-15 (F12→W), CMAP1-15 (F2→W; F5→W; F12→W), CMAP1-13, CMAP1-12, CMAP1-11 и CMAP1-10 в Таблице 1 указанного документа и их ацетилированные и/или аминированные производные. Кроме того предпочтительными являются: СМАР1-21 (F2→W), СМАР1-21 (F5→W), СМАР1-21 (F12→W), CMAP1-21 (F2, 5→W), CMAP1-21 (F5, 12→W), CMAP1-21 (F2, 12→W), CMAP1-21 (F2, 5, 12→W), CMAP1-21 (F2→Y), CMAP1-21 (F5→Y), CMAP1-21 (F12→Y), CMAP1-21 (F2, 5→Y), CMAP1-21 (F5, 12→Y), CMAP1-21 (F2, 12→Y), CMAP1-21 (F2, 5, 12→Y), CMAP1-21 (F2→W; F5→Y), CMAP1-21 (F2→Y; F5→W), CMAP1-21 (F5→W; F12→Y), CMAP1-21 (F5→Y; F12→W), CMAP1-21 (F2→W; F12→Y), CMAP1-21 (F2→Y; F12→W), CMAP1-21 (F2→W; F5→Y; F12→Y), CMAP1-21 (F2→Y; F5→W; F12→Y), and CMAP1-21 (F2→Y; F12→Y; F12→W). Белки СМАР, указанные выше, также могут быть обозначены как пептиды САТН2. СМАР1-21 будет обозначен как САТН2(1-21).

"Усеченные с N-конца производные СМАР27" представляют собой производные СМАР-27, которые усечены на N-концевой аминокислоте (аргинин) СМАР27. В частности, упомянуты производные, выбранные из группы, содержащей усеченные с N-конца варианты CMAP1-21: СМАР4-21, СМАР5-21, СМАР6-21, СМАР7-21, СМАР8-21, СМАР9-21, СМАР10-21, СМАР11-21, СМАР4-21 (F5→W), СМАР4-21 (F5→Y), СМАР4-21 (F12→W), СМАР4-21 (F12→Y), СМАР4-21 (F5, F12→W), СМАР4-21 (F5, F12→Y), СМАР4-21 (F5→W, F12→Y), CMAP4-21 (F5→Y, F12→W), CMAP7-21 (F12→W), CMAP7-21 (F12→Y), CMAP10-21 (F12→W) и CMAP10-21 (F12→Y).

"D-аминокислотные производные CMAP27" или "D-аминокислотные производные CATH2" представляют собой определенные в настоящей заявке производные СМАР-27/САТН2 (включая определенные выше производные СМАР27 усеченные с С- и N-конца), которые содержат по меньшей мере одну аминокислоту в D конфигурации. Особую категорию таких D-аминокислотных производных СМАР27/САТН2 составляют пептиды, состоящие только из D аминокислот (т.е. в которых нет L аминокислот). Эта особая категория определена в настоящей заявке как производные СМАР27, содержащие только D-аминокислоты. Также сами СМАР27/САТН2, содержащие одну или более, или, в альтернативном варианте, все D-аминокислоты, включены в это определение.

Предпочтительными D-аминокислотными производными СМАР27 являются следующие полные D-аминокислотные производные САТН2 (в которых все аминокислоты находятся в D-форме):

"Циклические производные СМАР27" или "циклические производные САН2" представляют собой производные СМАР27/САТН2, в которых по крайней мере две несмежных аминокислоты соединены с образованием кольцевой структуры. Хотя принципиально любая конструкция для химического связывания может быть использована, такая как замена двух несмежных аминокислот в любом из производных СМАР27, указанных выше, на цистеины, где эти цистеины потом образуют S-S мостик, предпочтительной является система, использующая связывание Bpg (Fmoc-L-бисгомопропаргилглицин) и азидо-смолы, где Bpg присоединен к внутреннему аргининовому, лейциновому, фенилаланиновому или триптофановому остатку и азидо-смола присоединена к С-концевому глутаминовому остатку. В частности, таким производными являются:

"Инверсные" и "ретро-инверсные" или, соответственно. "I"-СМАР27 и "RI"-СМАР27-производные ("I"-САТН2 и "RI"-САТН2 производные) представляют собой пептиды, которые имеют обратную последовательность по отношению к указанной выше последовательности производных СМАР27, в том смысле, что аминокислоты соединены друг с другом в обратном порядке. I и RI эквивалентом СМАР27/САТН2 будут GFRASGQITITVKPRFRRIKRLFRGFR и другие предпочтительные примеры таких I или RI-СМАР27-производных:

Конечно I и RI-CMAP27 производные могут быть ацетилированы на их N-конце и/или аминированы на С-конце. Когда обращенные производные СМАР27 содержат одну или более D аминокислот они называются "ретро-инверсными" или "RI". Если обращенное производное содержит только L-аминокислоты, оно называется "инверсным" или "I".

Пептиды по изобретению могут быть получены синтетически или, когда это применимо, рекомбинантно традиционными способами. Особые варианты реализации антибиотических пептидных производных СМАР27 подробно описаны в экспериментальной части ниже. Предпочтительно, пептиды или производные пептидов по изобретению получают хорошо известивши способами химического синтеза, такими как, например, раскрыты в Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2154). Они могут быть выделены из реакционной смеси хроматографическими методами, такими как обратно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (High Performance Liquid Chromatography, HPLC).

В альтернативном варианте пептиды по настоящему изобретению могут быть получены методом рекомбинантной ДНК клонированием и экспрессией в микроорганизме-хозяине или клетке с фрагментов ДНК, содержащем последовательность, кодирующую один из пептидов, описанных выше. Нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность, может быть получена синтетически или может быть выделена из существующих последовательностей нуклеиновых кислот (например, последовательности, кодирующей САТН2 дикого типа) сайт-специфическим мутагенезом. Эти нуклеиновые кислоты могут затем быть клонированы в подходящий вектор для экспрессии, трансформированы или трансфецированы в подходящую клетку-хозяин, такие как Е. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, клетки млекопитающих (такие как СНО, HEK или клетки COS-1), дрожжи (например, Saccharomyces, Schizophyllum), клетки насекомых, или вирусные системы экспрессии, такие как бакуловирусные системы или клетки растений. Специалист в данной области техники будет иметь знания о методах построения последовательности нуклеиновых кислот и способах обеспечения их экспрессии.

В частности успешно для экспрессии пептидов по настоящему изобретению могут быть использованы клетки растений, так как пептид в таком случае может быть введен человеку или животному перорально напрямую, т.е. без какой-либо дополнительной очистки.

В последствии пептид может быть выделен из культуры клеток-хозяев. Это может быть достигнуто общепринятыми методами очистки и выделения белков, известными в данной области техники. Такие методы, например, могут включать иммуноадсорбцию или хроматографию. Также возможно в ходе синтеза обеспечить пептиды меткой (такой как гистидиновая метка), которая позволяет осуществлять быстрое связывание и очистку, после которой метка ферментативно удаляется с получением активного пептида.

Альтернативно, пептиды могут быть произведены в бесклеточных системах, таких как бесклеточная система Expressway™ от Invitrogen.

Некоторые более полные сводки методов, которые могут быть применены при получении пептидов, описаны в: W.F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D.J.A. Crommelin and R.D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G.B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.

Новые пептиды, описанные здесь, могут быть легко созданы специалистом в данной области техники.

СМАР27- или САТН2-производные по изобретению могут использоваться по одному или в сочетании с мультимерными формами. Подходящие комбинации пептидов по изобретению включают конкатамеры пептидов по изобретению, соединенные друг за другом спейсерами, например, в виде пептидных димеров, пептидных тримеров и т.д., в которых отдельные пептиды последовательно выровнены. Один пептид или пептидомиметические цепи могут быть соединены с биосовместимым белками, такими как сывороточный альбумин человека, гуманизированными антителами, липосомами, мицеллами, синтетическими полимерами, наночастицами и фагами. В альтернативном варианте мультимеры индивидуально объединенных пептидов по настоящему изобретению могут быть получены из дендримеров или кластеров, в которых три или более пептида присоединены к общему центру.

Кроме того, другие комбинации в виде мультимеров могут быть образованы шариками, на поверхности которых экспонированы пептиды по изобретению. Гранула может затем служить в качестве носителя для пептида и может аналогичным образом служить в качестве детектируемой метки. Мультимеры могут, например, быть получены биотинилированием N-конца пептидной цепи и последовательным последующим комплексообразованием со стрептавидином. Так как стрептавидин способен присоединить 4 молекулы биотина или конъюгатов с высокой аффинностью, очень стабильные тетрамерные пептидные комплексы могут быть образованы с помощью этого метода. Мультимеры могут состоять из одинаковых или различных пептидов или пептидомиметиков в соответствии с изобретением. Предпочтительно, однако, чтобы мультимеры по настоящему изобретению состояли из двух или более пептидов или пептидомиметиков, в которых каждый компонент отвечает за одно направление общей биоцидной активности (таргетинг, антимикробная активность, очистка).

Фармацевтические композиции по изобретению включают терапевтически эффективное количество одного или более производного СМАР27 по настоящему изобретению. Составленные фармацевтические композиции по изобретению можно напрямую вводить субъекту в способе лечения бактериальной инфекции, включающем введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для модуляции иммунной системы.

Прямая доставка композиций обычно может быть осуществлена путем местного применения или других форм введения, либо перорально, парентерально, подкожно, сублингвально, внутрь поражения, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, через дыхательные пути, или доставлены в интерстициальное пространство ткани.

Одним особенно предпочтительным способом введения производного СМАР-27 является введение in ovo. Под "in ovo введением" понимается введение яйцам птиц, предпочтительно на четвертом квартале инкубации. То есть для куриных яиц введение предпочтительно проводится приблизительно от пятнадцатого до девятнадцатого дня инкубации, более предпочтительно от примерно восемнадцатого дня инкубации. Для яиц индейки введение проводится предпочтительно от примерно двадцать первого до двадцать шестого дня инкубации, более предпочтительно от примерно двадцать пятого дня инкубации. Такое введение может быть проведено любым способом, который приводит к введению одного или нескольких производных СМАР-27 в яйцо через оболочку. Предпочтительным методом введения является инъекция. Инъекции могут быть произведены, используя любое из известных устройств для инъекций яйцам, такое как обычный подкожный шприц, снабженный иглой приблизительно от 18 до 22 размера, или высокоскоростной автоматизированной системой инъекций яйцам, описанной U.S. Pat. Nos. 4,681,063, 4,040,388, 4,469,047, и 4,593,646.

Фармацевтические композиции могут также включать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и могут быть в форме капсулы, таблетки, лепешки, драже, пилюли, капель, свечей, порошка, спрея, вакцины, мази, пасты, крема, ингаляции, пластыря, аэрозоли и т.п.. В качестве фармацевтически приемлемого носителя может использоваться любой растворитель, разбавитель или другой жидкий носитель, дисперсия или суспензия, поверхностно-активный агент, изотонический агент, загуститель или эмульгатор, консервант, инкапсулирующий агент, твердое связующее или смазочное вещество, которое наиболее подходит для конкретной лекарственной формы и которое совместимо с пептидом или пептидным конъюгатом.

Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "Фармацевтический приемлемый носитель" также включает носитель для введения терапевтического агента, такого как антитела или полипептид, гены или другие терапевтические агенты. Термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не индуцирует продукцию антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, и который может быть введен без чрезмерной токсичности. Подходящие носители могут быть большими, медленно метаболизирующимися макромолекулами, такими как белки, полисахариды, полилактидные кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники.

Соли пептидов или функциональные эквиваленты приготовляют известными способами, которые обычно включают смешение пептида с другой фармацевтически приемлемой кислотой для образования кислотно-аддитивной соли или с фармацевтически приемлемым основанием для образования основно-аддитивной соли. Являются ли в конкретном случае фармацевтически приемлемыми кислота или основание решает специалист в данной области техники, учитывая специфику предусматриваемого использования рассматриваемого соединения. Например, не все кислоты и основания приемлемые для ex vivo применений могут быть использованы как терапевтические композиции. В зависимости от предусматриваемого использования фармацевтически приемлемые кислоты включают органические и неорганические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, гликолевая кислота, щавелевая кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, коричная кислота, серная кислота, соляная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота, хлорная кислота, фосфорная кислота и тиоциановая кислота, которые образуют соли аммония со свободными аминогруппами пептидов и функциональных эквивалентов. Фармацевтически приемлемые основания, которые образуют соли карбоновых кислот со свободными карбоксильными группами пептидов и функциональных эквивалентов, включают этиламин, метиламин, диметиламин, триэтиламин, изопропиламин, диизопропиламин и другие моно-, ди- и триалкиламины, такие как ариламины. Более того, также включаются фармацевтически приемлемые сольваты.

Фармацевтически приемлемые соли могут использоваться в данном случае, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п.. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Производные по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями указанными ранее способами, и такое введение может быть проведено с одной или многими дозами. В частности, активные соединения могут быть введены в большом разнообразии различных лекарственных форм, т.е. они могут быть совмещены с различными фармацевтически приемлемыми инертными носителями в форме таблеток, капсул, лепешек, пастилок, твердых леденцов, порошков, спреев, кремов, бальзамов, суппозиториев, желе, гелей, паст, лосьонов, мазей, водных суспензий, растворов для инъекций, эликсиров сиропов и т.п. Такие носители включают твердые разбавители или наполнители, стерильные водные среды и различные не токсичные органические растворители и т.д. Более того, пероральные фармацевтические композиции могут быть соответствующим образом подслащены и/или ароматизированы. Обычно активные соединения находятся в лекарственной форме в концентрации, варьирующейся от примерно 5.0% до примерно 70% по массе.

Для перорального введения таблетки, содержащие различные наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, цитрат натрия, карбонат кальция, дикальцийфосфат и глицин, могут применяться наряду с различными разрыхлителями, такими как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный крахмал или крахмал из тапиоки), альгиновая кислота и некоторые комплексные силикаты, вместе со связующими гранулами, такими как поливинилпирролидон, сахароза, желатин и аравийская камедь. Дополнительно для таблетирования часто полезны смазывающие агенты, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Твердые композиции подобного типа могут также быть использованы в качестве наполнителей в желатиновых капсулах; предпочтительные материалы в этой связи также включают лактозу или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Когда водные суспензии и/или эликсиры готовятся для перорального введения, активное соединение может быть объединено с различными подсластителями или ароматизаторами, красящие вещества или красителями и, по желанию, эмульгирующими и/или суспендирующими агентами, а также вместе с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин их различными комбинациями.

Для парентерального введения могут быть использованы растворы активного соединения либо в кунжутном или арахисовом масле, либо в водном пропиленгликоле. Если это необходимо, водные растворы должны быть соответствующим образом буферизованы (предпочтительно pH более 8), а жидкий разбавитель сначала сделан изотоническим. Эти водные растворы пригодны для внутривенных инъекций. Масляные растворы пригодны для внутрисуставных, внутримышечных и подкожных инъекций. Приготовление всех этих растворов в стерильных условиях легко осуществимо с помощью стандартных фармацевтических методов, известных специалистам в данной области техники.

Кроме того, также возможно вводить активные соединения по настоящему изобретению местно, и это может быть сделано с помощью кремов, желе, гелей, паст, пластырей, мазей и т.п., в соответствии со стандартной фармацевтической практикой.

Для введения животным отличным от человека, таким как крупный рогатый скот или домашние животные, активные соединения могут быть введены в корм животных или перорально в смоченном виде.

Активные соединения могут быть также введены в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из множества (фосфо)липидов, таких как холестерин, стериламин или фосфатидилхолины.

Активные соединения также могут быть соединены с растворимыми полимерами в качестве носителей лекарственного средства. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропилметакриламид фенил, полигидроксиэтилраспартамид-фенол или полифениленоксид-полилизин, замещенный остатками пальмитоила. Более того, активные соединения могут быть соединены с классом биодеградируемых полимеров, используемых для достижения контролируемого высвобождения лекарственного средства, например, полимолочной кислотой, полигликолевой кислотой, сополимерами полимолочной и полигликолевой кислоты, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полидигидропиранами, полицианоакрилатами и кросс-линкерными или амфипатическими блок-сополимерами гидрогелей.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать другие активные агенты, такие как обычные антибиотики (например, ванкомицин, стрептомицин, тетрациклин, пенициллин) или другие противомикробные средства, такие как антигрибковые, например, итраконазол или миконазол. Также могут быть добавлены соединения, облегчающие другие симптомы инфекции, такие как лихорадка (например, салициловая кислота) или сыпь на коже.

Терапевтически эффективные дозы пептида или пептидного конъюгата, необходимые для лечения бактериальной инфекции в организме человека или животного, легко могут быть определены специалистом в данной области техники, например, с использованием животных моделей.

Термин "терапевтически эффективное количество" используется в настоящем изобретении для обозначения количества терапевтического средства, а именно пептида или пептидного конъюгата по настоящему изобретению для уменьшения или предотвращения роста и колонизации бактерий или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Эффект может быть обнаружен, например, культивированием биопсий, тестированием бактериальной активности или любым другим подходящим способом оценки прогресса или тяжести бактериальной инфекции. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и здоровья субъекта, характера и степени состояния и терапевтического средства или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Таким образом, бесполезно определять точное эффективное количество заранее. Тем не менее, эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено с помощью рутинных экспериментов и находится под ответственностью клинициста или экспериментатора. В частности, композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для уменьшения или предотвращения бактериальной инфекции и/или сопровождающих ее биологических или физических проявлений, таких как снижение лихорадки. Методы, которые позволяют клиницисту установить начальные дозы известны в данной области техники. Определенные дозы для введения должны быть безопасными и эффективными.

Для целей настоящего изобретения, эффективная доза будет составлять от приблизительно 0,01 мкг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,5 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг пептида или пептидного конъюгата для индивидуума, которому его вводят. Дозы для достижения терапевтического эффекта фармацевтической композиции, описанной в данном документе, могут быть легко определены специалистом. Для применения in ovo могут быть использованы те же дозы, но в пересчете по отношению к весу эмбриона.

Кроме того, в другом альтернативном варианте пептид или пептидный конъюгат или композиции по настоящему изобретению могут быть введены из матрицы контролируемым или с замедленным высвобождением, помещенной в организм субъекта.

Кроме того, может быть предпочтительным вводить соединение по изобретению в виде лекарственной формы через слизистую оболочку. Этот путь введения является неинвазивным и, таким образом, менее обременительным для субъекта, который проходит лечение, и для человека, предоставляющего лечение; в то же время это может привести к улучшению биологической доступности соединения по сравнению с пероральным введением, особенно если соединение не является стабильным в жидкостях пищеварительной системы или если оно слишком велико, чтобы всасываться из кишечника эффективно. Введение через слизистые оболочки возможно, например, с помощью назальной, буккальной, сублингвальной, десневой или вагинальной лекарственных форм. Эти лекарственные формы могут быть приготовлены известными способами; они могут представлять собой капли или спреи для носа, вставки, пленки, пластыри, гели, мази или таблетки. Предпочтительно, наполнители, используемые для лекарственной формы, проникающей через слизистую оболочку, включают одно или несколько веществ, способных к мукоадгезии, тем самым увеличивая время контакта лекарственной формы с местом абсорбции и, таким образом, потенциально увеличивая степень поглощения.

В еще одном варианте реализации соединения вводят через легкие с использованием дозирующего ингалятора, небулайзера, аэрозольного спрея или сухого порошкового ингалятора. Подходящие составы могут быть получены известными способами и методами. Трансдермальное, ректальное или глазное введение могут также быть целесообразны в некоторых случаях.

Может быть выгодно использовать продвинутые методы доставки лекарственного средства для осуществления доставки соединений по настоящему изобретению более эффективно.

Например, если выбран непарентеральный способ доставки, соответствующая лекарственная форма может содержать агент, усиливающий биодоступность, которым может быть любое вещество или смесь веществ, которые увеличивают доступность соединения. Это может быть достигнуто, например, защитой соединения от разложения, такой как ингибирование ферментов или антиоксидантами. Более предпочтительно, чтобы агент, повышающий биодоступность соединения, увеличивал ее за счет увеличения проницаемости поглощающих барьеров, которыми обычно являются слизистые оболочки. Усилители проницаемости могут работать с помощью различных механизмов; некоторые увеличивают текучесть слизистых оболочек, в то время как другие открывают или увеличивают разрывы соединений между клетками слизистой. Кроме того, другие уменьшают вязкость слизи, покрывающий слой клеток слизистой. Предпочтительными усилителями биодоступности являются амфифильные вещества, такие как производные холевой кислоты, фосфолипиды, холестерин и его производные, этанол, жирные кислоты, олеиновой кислоты, производные жирных кислот, ЭДТА, карбомеров, поликарбофила и хитозана.

Показаниями, при которых производные СМАР27 по изобретению могут быть использованы, являются как грамположительные, так и грамотрицательные бактериальные инфекции, такие как Е. coli, Agrobacterium tumefaciens, Salmonella typhimurum, Erwinia carotovora, E. herbicola, E. chrysanthemi, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Francisella tularensis, Archanobacterium pyogenes, Avibacterium paragallinarum, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, Bordetelle spp., Brachyspira spp., Brucella spp., Campylobacter spp., Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Corynebacterium pyogenes, Coxiella burnetii, Enterococcus spp., Haemophilus somnus, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Mannheimia haemolytica, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella aeruginosa, Pastuerella multocida, Pneumococcus spp. Pseudomonas aeruginosa, Riemerella anatipestifer, Salmonella spp., Streptococcus uberis, Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyrogenes, Truperella pygoenes, Vibria cholerae, Micrococcus luteus, Moraxella, Neisseria ghonnorhoea, Aerobacter, Borellia. Помимо бактериальных инфекций, также другие инфекции, такие как инфекции вирусами, грибами, дрожжами и паразитами, могут быть вылечены пептидами по изобретению.

Эффективность соединений по изобретению обеспечивается не только их антибиотическим эффектом, но также с помощью их иммуномодулирующих эффектов. Кроме того, открытые недавно иммуноактивирующие эффекты (смотри выше) обеспечивают еще одно преимущество данных соединений.

Кроме терапевтического применения для лечения инфекций, возможно использовать антибиотические пептиды по изобретению в бактерицидных композициях, использующихся для очистки поверхностей и/или оборудования. Другой областью применения является упаковка, где пептиды могут быть присоединены или внедрены в упаковочный материал для упаковки еды или других материалов, которые легко разлагаются микроорганизмами. Производные СМАР27 по изобретению в частности удобны для упаковок, так как они не токсичны при контакте или проглатывании.

В частности полезно применение производных СМАР27 в ветеринарных применениях, в частности в птицеводстве. Инфекции Salmonella enteritidis могут приводить к значительной смертности и заболеваемости у молодых кур. В частности, в первые две недели после вылупления, когда их приобретенная иммунная система еще недостаточно развита, бройлерные цыплята очень подвержены. Возможная стратегия по улучшению состояния здоровья цыплят-бройлеров заключается в повышении их врожденной иммунной системы для преодолевания разрыва между угасанием материнской защиты и созревания адаптивного иммунитета. Иммуномодулирующие свойства производных куриного кателицидина-2 (САТН2 или СМАР27) in vitro показали, что соединения по данному изобретению могут быть использованы для повышения врожденного иммунного ответа молодых цыплят-бройлеров. Это может быть достигнуто in ovo вакцинацией куриных эмбрионов или вакцинацией молодых куриц. Удивительно, но такие in ovo вакцинации также имеют эффект, который известен при лечения антибиотиками в период роста и развития птицы, предпочтительно (бройлер) курица, т.е. увеличение массы тела по сравнению с необработанными животными. Таким образом, однократная in ovo вакцинация может заменить применение антибиотиков при выращивании животных.

В этом и других ветеринарных применениях композиции, содержащие производные САТН2 или СМАР27, дополнительно включают в себя ветеринарно приемлемый носитель. Такой ветеринарно приемлемый носитель может включать растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, противогрибковые агенты, изотонические агенты, адсорбционные задерживающие агенты и т.п. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п.Изотонические агенты среди прочих могут включать в себя хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы среди прочих включают альбумин.

Адъюванты, подходящие для настоящего способа включают, но не ограничиваются: минеральные гели, например, гидроксид алюминия; поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин; гликозиды, например, производные сапонина, такие как Quil А или GPI-0100 (U.S. Pat. No. 5,977,081); катионные поверхностно-активные вещества, такие как DDA, плюроновые полиолы; полианионы; неионные блок-сополимеры, например, Pluronic F-127 (B.A.S.F., USA); пептиды; минеральные масла, например, Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, France), карбопол, Amphigen (Hydronics, Omaha, Nebr. USA), Alhydrogel (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark) масляные эмульсии, например, эмульсия минерального масла, такого как BayolF/Arlacel А и вода, или эмульсия растительного масла, вода и эмульгатор, такой как лецитин; квасцы, холестерин, rmLT, цитокины и их комбинации. Иммуногенные компонент может быть также внедрен в липосомы или конъюгирован с полисахаридами и/или другими полимерами для использования в составах для вакцин. Дополнительные вещества, которые могут быть включены в продукты для использования в настоящем способе включают, но не ограничиваются одним или более консервантами, такими как динатриевая или тетранатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), мертиолат и т.п. Иммуностимуляторы, которые усиливают ответ иммунной системы на антигены могут быть также включены в продукт. Примеры подходящих иммуностимуляторов включают цитокины, такие как IL-12 или IL-2, или стимулирующие молекулы, такие как мурамилдипептиды, аминохинолоны, липополисахариды и т.п.

Было обнаружено, что усеченные с N-конца производные СМАР-27, определенные выше, не только по-прежнему сохраняют антибактериальное действие, но также сохраняют свой иммуномодулирующий эффект. Этот иммуномодулирующий эффект может быть продемонстрирован способностью усеченных с N-конца производных СМАР-27 нейтрализовать транскрипцию LPS-индуцированных провоспалительных цитокинов (IL-1β). Тем не менее, кроме того, было обнаружено, что все производные СМАР-27, включая усеченные с N-конца производные, описанные выше, демонстрируют иммуноактивирующую активность, которая отличает их от уже известных (усеченных с N-конца) производных СМАР27. Эти иммуноактивирующие эффекты могут задействовать много механизмов, включая усиленную активацию Толл-подобных рецепторов посредством усиленного захвата ДНК, стимуляцию продукции иммунными клетками цитокинов/хемокинов, прямой хемотаксис, усиленный фагоцитоз и стимуляцию пролиферации и дифференцировки иммунных клеток, и отличаются от описанных ранее иммуномодулирующих и антибиотических эффектов пептидных производных.

Частью настоящего изобретения является тот факт, что эти иммуномодулирующие эффекты, в частности влияние на пролиферацию и дифференцировку иммунных клеток, являются большим преимуществом соединений при применении в вакцинации, в частности in ovo вакцинации.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Эффективность производных СМАР-27, введенных in ovo.

Пептид DCATH2 (полностью D-аминокислотный аналог СМАР1-26) суспендировали в холестерол/PBS составе. Яйцам Ross308 в околоплодную жидкость на 18 день жизни эмбриона сделали инъекцию 100 мкл суспензии, содержащей DCATH2 и вернули яйцо в инкубатор для вылупления (~21 день жизни эмбриона). Обеим контрольным группам делали инъекцию в околоплодную жидкость холестерол/PBS состава. Доза пептида 1 мг/кг массы была рассчитана, основываясь на массе тела эмбриона в 22 г. После вылупления птицы были помещены в 4 клетки для обработки (n=40/группу). Через три дня после вылупления всем птицам за исключением отрицательного контроля был подкожно привит птичий патоген Salmonella enteritidis pt13a в дозе 5×10⁶ КОЕ на птицу. Через два дня после испытания 12 птиц из группы забили и взяли у них образцы крови и органов для анализа. Образцы крови были взяты для определения общего счета лейкоцитов и лейкоцитарной дифференцировки. В течение 7 дней испытания каждый день регистрировали смертность. В конце испытания на 7 день после инъекции все оставшиеся птицы были забиты и левый и правый грудные воздушные мешочки, печень и сердце были обследованы для выставления баллов за поражения.

Анализ мазков крови, полученных через 2 дня после инъекции, показал, что общее число лейкоцитов периферической крови у цыплят-бройлеров, получавших соединения по настоящему изобретению, было значительно выше по сравнению с незараженными птицами (Фиг. 1А). Это увеличение отсутствовало у необработанных зараженных птиц. Подсчет лейкоцитов вручную в мазках крови, окрашенной по Гимзе, показал, что абсолютное число гетерофилов периферической крови было значительно больше у птиц, обработанных DCATH2, по сравнению с незараженными птицами (Фиг. 1B). На число гетерофилов не влиял статус заражения. Гетерофилы являются птичьим аналогом нейтрофилов млекопитающих, и было показано, что у кур гетерофилы играют ключевую роль в защите от бактериальных инфекций.

Развитие сальмонеллеза и тяжесть поражений, связанных с сальмонеллезом, определяли в течение 7 дней. В течение испытания Salmonella enteritidis смертность постепенно увеличивалась до 35% для необработанных зараженных птиц. Задержка до 3 дней после инъекции наблюдалась у птиц, обработанных DCATH2 (Фиг. 2А). На 7 день после инъекции смертность уменьшилась на 50% у обработанных DCATH2 птиц (Фиг. 2B).

Процент сальмонеллез-положительных птиц, т.е. имеющих средний балл поражений >1, в необработанной зараженной группе был приблизительно 85%; он был снижен на 53% у обработанной DCATH2 целевой группы (Фиг. 3А). Кроме того, тяжесть поражений у сальмонеллез-положительных птиц уменьшилась на 69% у обработанных DCATH2 птиц (Фиг. 3В).

В заключении, обработка in ovo 1 мг/кг пептидом DCATH2 уменьшала Salmonella-индуцированную смертность на 7 день после инъекции на 50%, снижала число сальмонеллез-положительных среди выживших птиц на 53% и снижала тяжесть поражений на 69%. Сниженная восприимчивость к Salmonella у птиц, обработанных DCATH2, может быть частично объяснена увеличением набора гетерофилов и кроветворением.

Пример 2 - защита от инфекции Е. coli после введения пептида in ovo.

Пептид DCATH2 peptide (полностью D-аминокислотный аналог СМАР1-26) суспендировали в холестерол/PBS составе. Яйцам Ross308 в околоплодную жидкость на 18 день жизни эмбриона сделали инъекцию 100 мкл суспензии, содержащей DCATH2 и вернули яйцо в инкубатор для вылупления (~21 день жизни эмбриона). Обеим контрольным группам делали инъекцию в околоплодную жидкость холестерол/PBS состава. Доза пептида 1 мг/кг массы была рассчитана, основываясь на массе тела эмбриона в 22 г. После вылупления птицы были помещены в изолированные ячейки для обработки (n=54/группу). Через три дня после вылупления всем птицам за исключением отрицательного контроля был интратрахеально привит птичий патоген Escherichia coli 506 (UU штамм) в дозе 1×10⁶ КОЕ на птицу. Через два дня после заражения 13 птиц в каждой группе забивали и брали образцы для анализа крови и органов. Образцы крови были взяты для определения общего счета лейкоцитов и лейкоцитарной дифференцировки. В течение 7-дневного периода каждый день регистрировали смертность. В конце испытания через 7 дней после заражения все оставшиеся птицы были умерщвлены и левый и правые грудной воздушный мешочек, печень и сердце анализировали для расставления баллов за поражения.

Развитие колибацилоза определяли в течение 7 дней. На 2 день после инъекции обработанные DCATH2 in ovo птицы показали значительно более высокие количества лейкоцитов периферической крови и гетерофилов по сравнению с необработанными незараженными птицами (Фиг. 4). Никаких различий абсолютного числа моноцитов и лимфоцитов чисел у обработанных DCATH2 птиц по сравнению с необработанными незараженными животными найдено не было.

Испытание Е. coli привело к постепенному увеличению смертности до 27% у необработанных зараженных птиц (Фиг. 5А). На 7 день после инъекции смертность уменьшилась на 30% у птиц, обработанных DCATH2 in ovo (Фиг. 5b).

Процент колибацилоз-положительных птиц был 65% в необработанной зараженной группе; он был снижен на 52% у обработанных птиц DCATH2 (Фиг. 6А). Тяжесть поражений, связанных с колибацилозом, была уменьшена на 64% у обработанных САТН2 птиц (Фиг. 6B). Более того, заражение воздушных мешочков Е. coli также было снижено обработкой DCATH2 in ovo на 93% (Фиг. 7).

В итоге, обработка 1 мг/кг пептидом DCATH2 (дыхательные пути) уменьшала индуцированную Е. coli смертность на 7 день после инъекции на 30%, уменьшала число колибацилоз-положительных птиц среди выживших на 52%, уменьшала тяжесть поражений на 64% и уменьшала заражение Е. coli воздушных мешочков на 93%. Сниженная восприимчивость к Е. coli у птиц, обработанных DCATH2, может быть частично объяснена увеличением набора гетерофилов и кроветворением.

Пример 3 - Увеличение массы цыплят in ovo обработкой

Пептид DCATH2 и усеченные аналоги D-CMAP(1-21) и D-CMAP(4-21) суспендировали в холестерол/PBS составе. Яйцам Ross308 в околоплодную жидкость на 18 день жизни эмбриона сделали инъекцию 100 мкл суспензии, содержащей DCATH2 и вернули яйцо в инкубатор для вылупления (~21 день жизни эмбриона). Обеим контрольным группам делали инъекцию в околоплодную жидкость холестерол/PBS состава. Доза пептида 1 мг/кг массы была рассчитана, основываясь на массе тела эмбриона в 22 г. После вылупления все птицы были индивидуально взвешены (D0) и помещены в отдельные ячейки для обработки (n=120/группу). Птицы ели свободно на 7 день (D7) после вылупления были оценены индивидуальные массы птиц.

Обработка пептидом на 18 день жизни эмбриона не повлияла на вылупляемость (таблица 1).

Обработка пептидом in ovo на 18 день развития эмбриона значительно не повлияла на массу тела циплят-бройлеров при вылуплении (D0, Фиг. 8А). Однако, на 7 день после вылупления птицы, обработанные in ovo 1 мг/кг пептидами DCATH2, D-CMAP(1-21) или D-CMAP(4-21), продемонстрировали значительно большие массы по сравнению с птицами, обработанными контролем (Фиг. 8B).

Пример 4 - Антибактериальная активность пептидов производных от СМАР27 in vitro.

Полевой изолят птичьего патогена Escherichia coli O78 (АРЕС O78) использовали для того, чтобы продемонстрировать in ovo эффективность пептида DCATH2, который применяли для проверки антибактериальной эффективности пептидов производных от СМАР27 in vitro. Культуры, выращенные в течение ночи в бульоне Мюллера-Хинтона (МХБ) при 37°C разбавляли до концентрации 2×10⁶ КОЕ/мл в 50% бульоне Мюллера-Хинтона и на 96-луночных полипропиленовых микроплатах смешивали в соотношении 1:1 с пептидом (итоговая концентрация от 1.25 до 40 мкМ). После 3 ч инкубации образцы были несколько раз разбавлены в среде, нанесены на триптон-соевый агар и подсчитаны после 24 ч инкубации. Все тестированные пептиды продемонстрировали антибактериальную активность против полевого изолята АРЕС O78 с минимальными ингибирующими концентрациями в диапазоне от 5 до 14 мкМ (Фиг. 9А).

Для тестирования способности пептидов ингибировать бактерии в более трудных условиях, например, в присутствии солей или сывороточных белков, АРЕС O78 инкубировали с пептидом в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячей сыворотки. Если кратко, то выживаемость бактерий оценивалась инкубированием 3×10⁵ КОЕ/мл АРЕС O78 в течение 2 ч при 37°C в DMEM/10% FCS в присутствии или отсутствии 5 мкМ пептида, после чего делали несколько разбавлений, наносили на агар и считали колонии после 24 ч инкубации при 37°C. В отличии от тестирования в среде МХБ пептиды, протестированные в DMEM, содержащем 10% фетальной телячей сыворотки, только CMAP1-26-NH₂, CMAP1-21-NH₂ и CMAP4-21-NH₂ существенно ингибировали рост бактерий (Фиг. 9B), в случае CMAP1-26-NH₂ до нижнего предела детектирования в 100 клеток/мл.

Пептид-опосредованное ингибирование активации макрофагов, индуцированной живыми или обработанными теплом АРЕС O78 было изучено с использованием клеток линии макрофагов мурены J774.A1. Для этой цели, клетки J774.A1 (150,000 клеток/лунку) культивируемые в DMEM, содержащем 10% FCS, в течение 2 часов при 37°C подвергали воздействию 3×10⁵ КОЕ/мл АРЕС O78 с или без 5 мкМ пептида, после чего супернатанты собирали и использовали для определения продукции TNFα (ELISA). В этих условиях и живые, и обработанные теплом (30' при 70°C) бактерии сильно индуцировали продукцию TNFα клетками J774.A1 в отсутствии пептида (Фиг. 9С). Пептиды CMAP1-26-NH₂ и CMAP1-21-NH₂ существенно ингибировали продукцию TNFα, индуцированную живыми или обработанными теплом бактериями.

Дальнейшее усечение CMAP1-21-NH₂ с N-конца приводило к постепенному спаду ингибирования продукции TNFα, индуцированной обработанными теплом бактериями, и полному прекращению ингибирования продукции TNFa, индуцированной живыми бактериями. Продукция TNFα, индуцированная обработанными теплом бактериями также в некоторой степени была ингибирована пептидами, не проявляющими антибактериальной активности в этих условиях, например, CMAP7-21-NH₂.

В итоге, пептиды производные от СМАР27 демонстрируют антибактериальную активность in vitro, включая условия с относительно высоким содержанием солей и сывороточных белков. Прямая антибактериальная активность быстро пропадает при дальнейшем усечении пептида CMAP1-21-NH₂ с N-конца. Более того, эта утрата антибактериальной активности коррелирует со способностью пептида ингибировать продукцию TNFα в ответ на живых бактерий.

Пример 5 - Индукция хемокинов в клетках HD11.

Клетки линии куриных макрофагов HD11 высевали на 96-луночные культуральные платы (2×10⁵ клеток/мл) в RPMI-1640/10% FCS и инкубировали при 37°C (5% CO₂) в среде с пептидом (20 мкМ) в течение 4 ч или 24 ч. Уровни транскрипции интерлейкина-1β, -8 (CXCLi2), моноцитарного хемотаксического белка-3 (МСР-3) и RANTES (CCLi4) определяли с помощью ПЦР в реальном времени.

Было обнаружено, что CMAP1-26-NH₂ индуцирует транскрипцию хемокинов CXCLi2/IL-8, МСР-3 и CCLi4/RANTES в клетках HD11, в то время как провоспалительный цитокин IL-1β не индуцировался (Фиг. 10). На способность индуцировать транскрипцию хемокинов в клетках HD11 были проверены усеченные аналоги. Усеченные с N-конца аналоги CMAP1-21-NH₂ до 15 аминокислотных остатков, например, CMAP7-21-NH₂, сохраняли способность индуцировать транскрипцию CXCLi2 и МСР-3. Более длительное воздействие (24 ч) требовалось для индукции экспрессии CCLi4.

В итоге, избирательная индукция пептидами производными от СМАР экспрессии хемокинов в клетках HD11 указывает на то, что эти пептиды оказывают косвенное воздействие на хемотаксис моноцитов/макрофагов, и позволяет предположить, что в естественных условиях эти пептиды могут таким образом участвовать в накоплении и активации иммунных клеток.

В качестве положительного контроля использовали LL-37, человеческий пептид-кателицидин (см., например, Durr, U.H. et al., 2006, Biochim. Biophys. Acta 1758:1408-1425; Zuijderduijn, S. et al., 2006, J. Allergy Clin. Immunol. 117:1328-1335).

Пример 6 - Противовоспалительная активность пептидов производных от СМАР27 in vitro.

Клетки HD11 высевали на 96-луночные культуральные платы (2×10⁵ клеток/мл) в RPMI-1640/10% FCS. Итоговые концентрации 50 нг/мл Salmonella minnesota ЛПС пре-инкубировали с и без 20 мкМ пептида в течение 30 мин при 37°C (5% CO₂), наносили на клетки и инкубировали 4 ч и 24 ч. А) Уровни транскрипции интерлейкина-1 определяли с помощью ПЦР в реальном времени (только для 4 ч). В) Супернатанты собирали для определения продукции оксида азота (только для инкубаций 24 ч), используя тест Грисса.

ЛПС-индуцированную экспрессию IL-1β в клетках HD11 блокировали пептидом CMAP1-26-NH₂ (90.8%) и усеченными аналогами CMAP1-21-NH₂ (93.5%) и CMAP4-21-NH₂ (80.5%) (Фиг. 11А). Пептиды CMAP1-26-NH₂ и СМАР1-21-NH₂ блокировали соотв. 96.2% и 78.9% ЛПС-индуцированной (50 нг/мл) продукции NO, в то время как CMAP4-21-NH₂ нейтрализовал продукцию NO на 51% (Фиг. 11B).

Замена фенилаланиновых на триптофановые остатки в усеченных аналогах значительно снижала их способность блокировать ЛПС-индуцированную экспрессию IL-1β в клетках HD11 (Фиг. 12А), увеличивая CMAP4-21-NH₂-опосредованное ингибирование от 80.5% до 95.1%. Более того, в то время как пептиды CMAP7-21-NH₂ и СМАР10-21-NH₂ теряют ЛПС-нейтрализующую активность, их аналоги с Phe/Trp замещением сильно увеличивали ЛПС-индуцированную продукцию провоспалительного цитокина клетками HD11, т.е. 86.3% и 71.9% соответственно. Кроме того, оказалось, что замещение фенилаланина на триптофан в усеченных производных СМАР27 увеличивает способность C(1-21) и С(4-21) ингибировать LPS-индуцированную продукцию NO (Фиг. 12B).

В итоге, пептиды производные от СМАР27 способны нейтрализовать ЛПС-индуцированную продукцию про-воспалительных медиаторов, таких как IL-1β оксид азота, и таким образом снижая чрезмерный воспалительный ответ. Более того, замена фенилаланиновых остатков может быть использована для усиления/добавления противовоспалительной способности пептидам производным от СМАР27.

Пример 7 - пептиды производные от СМАР27 усиливают захват ДНК и активацию иммунных клеток ДНК.

Для изучения влияния пептидов на захват ДНК клетки HD11 высевали по 3×10⁵ клеток в 24-луночные платы, обрабатывали в течение 4 ч 2.5 нМ Alexa-Fluor 488 меченой ODN-2006 в присутствии и отсутствии пептидов производных от СМАР27 (5 мкМ), после чего захват ДНК анализировали с помощью проточной цитометрии. Активацию клеток HD11 проверяли, собирая супернатанты после 17 ч в таких же условиях и определяли продукцию оксида азота.

Все производные от СМАР27 пептиды CMAP1-26-NH₂, CMAP1-21-NH₂, CMAP4-21-NH₂, CMAP5-21-NH₂ и CMAP7-21-NH₂ усиливали захват ODN-2006 клетками HD11 (Фиг. 13А) и увеличивали ДНК-индуцированную продукцию оксида азота (Фиг. 13B). Усиленный захват ДНК и ДНК-индуцированная активация коррелировали, указывая на то, что усиленный пептидами производными от СМАР27 захват ДНК является ключевым шагом в усилении ДНК-индуцированной активации.

В итоге, в присутствии пептидов производных от СМАР27 бактериальная CpG-ДНК может быть быстрее распознана иммунными клетками при инфекциях.

Группа изобретений относится к области антибиотиков и иммуностимулирующих веществ. Раскрыто производное CMAP27, усеченное с N-конца, причем указанное производное выбрано из группы, состоящей из CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21 (F5→W), CMAP4-21 (F5→Y), CMAP4-21 (F12→W), CMAP4-21 (F12→Y), CMAP4-21 (F5, F12→W), CMAP4-21 (F5, F12→Y), CMAP4-21 (F5→W, F12→Y), CMAP4-21 (F5→Y, F12→W), CMAP7-21 (F12→W), CMAP7-21 (F12→Y), CMAP10-21 (F12→W) и CMAP10-21 (F12→Y). Также раскрыты способ in ovo вакцинации домашней птицы, способ активации иммунного ответа животного или человека, иммунологическая композиция, применение производного CMAP27 для приготовления лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания и для приготовления вакцины, способ увеличения массы домашней птицы путем in ovo вакцинации. Группа изобретений обеспечивает эффективную антимикробную активность. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Производное CMAP27, усеченное с N-конца, причем указанное производное выбрано из группы, состоящей из CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21 (F5→W), CMAP4-21 (F5→Y), CMAP4-21 (F12→W), CMAP4-21 (F12→Y), CMAP4-21 (F5, F12→W), CMAP4-21 (F5, F12→Y), CMAP4-21 (F5→W, F12→Y), CMAP4-21 (F5→Y, F12→W), CMAP7-21 (F12→W), CMAP7-21 (F12→Y), CMAP10-21 (F12→W) и CMAP10-21 (F12→Y).

2. Способ in ovo вакцинации домашней птицы, включающий введение производного CMAP27 по п.1.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что домашняя птица представляет собой курицу.

4. Способ активации иммунного ответа животного или человека, включающий введение указанному животному или человеку производного CMAP27 по п.1.

5. Способ по п. 4, в котором активация иммунного ответа выбрана из усиленной активации Толл-подобного рецептора путем увеличения захвата ДНК, нейтрализации эндотоксина, стимуляции производства иммунными клетками цитокинов/хемокинов, прямого хемотаксиса, усиленного фагоцитоза и стимуляции пролиферации и дифференцировки иммунных клеток.

6. Иммунологическая композиция, содержащая производное CMAP27 по п. 1.

7. Применение производного CMAP27 по п. 1 для приготовления лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания.

8. Применение производного CMAP27 по п. 1 для приготовления вакцины.

9. Производное CMAP27 по п. 1 для применения в качестве антибиотика.

10. Производное CMAP27 по п. 1 для применения для увеличения массы животных.

11. Способ увеличения массы домашней птицы путем in ovo вакцинации яиц указанных видов домашней птицы производным CMAP27 по п.1.