Способ выделения белков из костного мозга животных Российский патент 2020 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к биохимии, а именно к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Описан способ получения белка, RU 2298939 С2, A61K 35/28, 20.05.2007, путем выделения клеток из костного мозга лисиц, их суспендирование, фильтрация, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию в холодильной камере, фильтрации через капроновые фильтры и осаждению 10% раствором трихлоруксусной кислоты и последующему диализу проточной водой.

Предложен также способ получения белка, RU 2553334 С2 A61K 35/28, 10.06.2015, предусматривающий извлечение костного мозга из трубчатых костей сибирской косули, его суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, гомогенизацию, фильтрацию через капроновые фильтры, высаливание с помощью сульфата аммония с последующим центрифугированием, осаждение 1% раствором трихлоруксусной кислоты, центрифугирование с последующим диализом проточной водой.

Недостатки данных способов заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Использование указанных концентраций трихлоруксусной кислоты не обеспечивает максимальный выход белка из раствора. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Задача изобретения заключается в упрощении способа выделения общего белка из костного мозга трубчатых костей, увеличение объема выхода белка из того же количества клеток костного мозга и повышение чистоты целевого продукта.

Способ осуществления задачи изобретения достигается тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных животных, трубчатые кости отделяют от плоти, в верхней и нижней части кости делают распил. Клетки костного мозга из бедренной или плечевой кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой Игла М (средой 199) в колбу. Содержимое колбы тщательно перемешивают до однородного состава. Для тщательной очистки от желтого костного мозга суспензию пропускают через капроновые фильтры и отмывают 3 раза охлажденной средой Игла М (средой 199). Суспензию подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, в результате чего достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга, происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождение от обломков клеток содержимое пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор. Выделение белка проводят следующим образом.

В пробирки для центрифугирования с раствором белка добавляют раствор 20% раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 2 капли раствора кислоты на 5 капель раствора белка. Для ретракции белков пробирки с содержимым оставляют на 12 ч в холодильнике при температуре +4°С. Для полного осаждения белка к надосадочной жидкости добавляют 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты из того же расчета. Белок от раствора отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин - все приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. полное осаждение и отделение белка костного мозга из раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, а затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью удалению трихлоруксусной кислоты и восстановления гидратных оболочек протеина.

Для перевода сухого кристаллического белка в раствор берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) целлофановой мембраной. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 суток при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1 часа. Отсутствие кислоты контролируют нейтральной реакцией с индикатором. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.

Пример 1.

Трубчатые кости от 3 голов крупного рогатого скота отделяют от плоти, затем производят распил с двух сторон и вымывают костное содержимое средой Игла М (среда 199) в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры, которые предварительно стерилизуют. Суспензию подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию. В процессе проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой Игла М (среда 199) в разведении 1:10 в камере Горяева. При последнем оттаивании в осадке обнаруживается гомогенная масса. Белки осаждают из раствора 20% трихлоруксусной кислотой из расчета 2 капли кислоты на 5 капель раствора белка, оставляют отстаиваться на 12 ч при температуре +4°С. Для дополнительного осаждения белка к надосадочной жидкости добавляют 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты из того же расчета. Белок выделяют из раствора центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга крупного рогатого скота, составляет 479±1,23 мг. Белок представляет собой аморфный порошок буро-коричневого цвета.

Пример 2.

Бедренные кости от 6 коз отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают 20% раствором трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок оставляют в холодильнике на 12 ч при температуре +4°С. Для дополнительного выделения белка в пробирки вносят 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из костного мозга коз составляет 259±0,58 мг. Белок представляет собой аморфный порошок красно-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Бедренные кости от 5 поросят отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка, выделенного из костного мозга поросят, составляет 165±0,62 мг. Сухой кристаллический переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подергают диализу, поместив в емкость с целлофановой мембраной. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде проводят сутки. Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение часа. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из костного мозга трубчатых костей является доступность, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, увеличение веса целевого продукта.

Изобретение относится к биохимии, а именно к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных. Раскрыт способ выделения белков из костного мозга животных, включающий суспендирование клеток костного мозга, их фильтрацию, при этом суспензию клеток костного мозга подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию, фильтрации через капроновые фильтры, далее проводят осаждение белка 20% раствором трихлоруксусной кислоты, отстаивание в течение 12 ч при температуре +4°С в холодильной камере, затем к надосадочной жидкости добавляют 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты, отделяют белок центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, к полученному порошку добавляют 0,9% раствор хлорида натрия, тщательно перемешивают, а затем подвергают диализу проточной водой в течение суток и дистиллированной водой в течение 1 ч, раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле. Изобретение обеспечивает упрощение способа выделения общего белка из костного мозга, увеличение объема выхода белка и повышение чистоты целевого продукта. 3 пр.

Способ выделения белков из костного мозга животных, включающий суспендирование клеток костного мозга, их фильтрацию, отличающийся тем, что суспензию клеток костного мозга подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию, фильтрации через капроновые фильтры, далее проводят осаждение белка 20% раствором трихлоруксусной кислоты, отстаивание в течение 12 ч при температуре +4°С в холодильной камере, затем к надосадочной жидкости добавляют 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты, отделяют белок центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, к полученному порошку добавляют 0,9% раствор хлорида натрия, тщательно перемешивают, а затем подвергают диализу проточной водой в течение суток и дистиллированной водой в течение 1 ч, раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.