СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА Российский патент 2007 года по МПК A23J1/10 A61K35/28 

Описание патента на изобретение RU2298939C2

Изобретение относится к биохимии, а именно, к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Известен способ синтеза белка, описанный в RU 2041716 С1, А61К 35/28, 20.08.1995.

Недостатки данного способа заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Упрощение способа выделения общего белка из трубчатых костей костного мозга и повышение чистоты целевого продукта достигается тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. Трубчатые кости отделяют от плоти. У лабораторных животных и птиц создают отверстия в верхней и нижней части кости, у крупных животных производят распил костей. Клетки костного мозга из бедренной кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой 199 в колбу. Тщательно перемешивают содержимое колбы до однородного состава пипетированием. Полученные клеточные суспензии пропускают через капроновые фильтры d 10 см для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывают 3 раза охлажденной средой 199 (либо Игла). Фильтры готовят из капроновых изделий текстильной промышленности. Перед употреблением фильтры кипятят в дистиллированной воде 3 раза по 15 мин. Фильтрат подвергают центрифугированию в течение 5-7 мин при 3 тыс. об/мин. Осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, в результате которого достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга (который затем отбрасывают) и происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток, содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор.

Выделение общего белка проводят следующим образом.

В стаканы для центрифугирования с раствором белков добавляют 10% раствор трихлоруксусной кислоты из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли раствора кислоты. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревают до температуры 40-60°С (в том случае, если белки осаждаются плохо). Экстракты для полного осаждения оставляют на 12 ч в холодильнике при температуре +4°С. Осадок белков отделяют от раствора центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин - все перечисленные приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. более полное осаждение и отделение белка костного мозга от раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью полного удаления кислоты и восстановления гидратных оболочек пептида. Для этого раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) целлофановой мембраной. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 сут при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1-2 ч. Отсутствие кислоты контролируют нейтральной реакцией с индикатором.

Пример 1.

Бедренные кости от 5 поросят отделяют от плоти, затем проводят распил кости с двух сторон в центре и вымывают костное содержимое средой 199 в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры d 10 см, которые предварительно стерилизуют. Фильтрат центрифугируют в течение 7 минут при 3 тыс. об/мин. Осадок и надосадочную жидкость подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию. В процессе этого проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой 199 в разведении 1:10 в камере Горяева. При последнем оттаивании в осадке обнаруживается гомогенная масса. Содержимое центрифужных пробирок вновь фильтруют через капроновые фильтры. Белки осаждают из раствора 10% трихлоруксусной кислоты из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли трихлоруксусной кислоты, оставляют отстаиваться на 12 ч. Осадок от раствора отделяют центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга поросят, составляет 200±0,26 мг. Белок представляет собой сухой аморфный порошок серо-коричневого цвета.

Пример 2.

Трубчатые кости от 3-х щенков лисиц отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают трихлоруксусной кислотой (10% раствор) из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли трихлоруксусной кислоты.

Содержимого колбы нагревают до температуры около 60°С, оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°С. На следующий день в колбе наблюдаются обильные хлопья осажденного белка. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из мозгового вещества щенков лисиц, выделенных данным способом, составляет 136,6±8,9 мг. Белок представляет собой аморфный порошок буро-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Трубчатые кости от 3-х соболей отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка из костного мозга соболя составляет 50,0±2,8 мг. Сухой кристаллический белок костного мозга соболя переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подвергают диализу, поместив в емкость с целлофановой мембраной. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде протекает сутки (рН 3,5-4,0). Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение 1 ч (нейтральная реакция индикатора). Содержание общего белка определяют с использованием рефрактометра типа ИРФ-22 по общепринятой методике. Количество общего белка в костном мозге соболя составляет 6,77%.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из трубчатых костей костного мозга является доступность, начиная от использования капроновых фильтров, реактивов и включая легкость технических операций, что позволяет более эффективно провести фильтрацию и упростить способ.

Похожие патенты RU2298939C2

название год авторы номер документа
Способ выделения белков из костного мозга животных 2019
  • Литвинова Зоя Александровна
  • Мандро Николай Михайлович
RU2726615C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА 2013
  • Мандро Николай Михайлович
  • Федоренко Татьяна Валериевна
RU2553334C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ 2006
  • Калашников Владимир Васильевич
  • Самсонов Алексей Яковлевич
  • Калашников Дмитрий Владимирович
  • Фалалеева Дина Муратовна
  • Самсонова Елена Александровна
  • Самсонов Павел Алексеевич
RU2332423C2
Способ выделения пептидов из гидролизата отходов от фармацевтической переработки пантов оленей 2023
  • Литвинова Зоя Александровна
  • Мандро Николай Михайлович
RU2802057C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ, ПРОТИВОВИРУСНОЙ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ВЕЩЕСТВО, ПОЛУЧЕНОЕ ЭТИМ СПОСОБОМ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ 2001
  • Атауллаханов Р.И.
  • Пичугин А.В.
  • Хаитов Р.М.
RU2195308C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИМИКРОБНОЙ, ПРОТИВОВИРУСНОЙ И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, В ЧАСТНОСТИ, В ОТНОШЕНИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ВЕЩЕСТВО, ПОЛУЧЕННОЕ ЭТИМ СПОСОБОМ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ 2013
  • Атауллаханов Равшан Иноятович
  • Пичугин Алексей Васильевич
  • Мельникова Татьяна Михайловна
  • Хаитов Рахим Мусаевич
RU2563818C2
СРЕДСТВО ДЛЯ АКТИВАЦИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПОВРЕЖДЕННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ 2004
  • Кравец Василий Николаевич
  • Ругаль Виктор Иванович
  • Гончар Владимир Александрович
RU2283666C2
Способ определения тимидина в биологической пробе 1986
  • Казакова Татьяна Борисовна
  • Вербина Ирина Адольфовна
  • Шатов Владимир Алексеевич
SU1364990A1
ПОЛИПЕПТИДНЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ БУРСЫ КУР, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ 2000
  • Хлябич Г.Н.
  • Пак Т.В.
  • Пак М.Ф.
  • Бондарева Л.Н.
  • Новохатский А.С.
  • Кондратьев В.С.
  • Рябцев М.Н.
RU2180592C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА 2003
  • Битуева А.В.
  • Бубеева Н.Б.
  • Жамсаранова С.Д.
RU2257904C2

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для выделения белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных. Способ предусматривает извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, затем фильтруют через капроновые фильтры и осаждают с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты при нагревании до 60°С, отстаивают 12 часов при температуре 4°С и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 5 минут, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 суток и дистиллированной водой в течение 1 часа. Изобретение обеспечивает упрощение способа выделения общего белка из костного мозга трубчатых костей, повышение чистоты целевого продукта.

Формула изобретения RU 2 298 939 C2

Способ выделения белков из клеток костного мозга, предусматривающий извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, отличающийся тем, что после центрифугирования осадки, вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры, белки из раствора осаждают с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°С и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 5 мин, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 суток и дистиллированной водой в течение 1 ч.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2298939C2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА 1993
  • Петров Рэм Викторович
  • Михайлова Августа Алексеевна
  • Захарова Людмила Алексеевна
  • Степаненко Родион Николаевич
  • Сорокин Сергей Викторович
  • Красильников Игорь Викторович
  • Буданов Михаил Валентинович
RU2041716C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЕВОГО ПРОДУКТА 1998
  • Доценко С.М.
  • Михайленко О.В.
  • Парфенова С.Н.
  • Туманова И.А.
RU2142717C1
Большая медицинская энциклопедия./Под ред
Б.В
ПЕТРОВСКОГО, т.3, издание третье
- М.: Советская энциклопедия, 1976, с.22.

RU 2 298 939 C2

Авторы

Мандро Николай Михайлович

Зарицкая Виктория Викторовна

Даты

2007-05-20Публикация

2005-06-27Подача