СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА Российский патент 2007 года по МПК A23J1/10 A61K35/28 

Изобретение относится к биохимии, а именно, к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Известен способ синтеза белка, описанный в RU 2041716 С1, А61К 35/28, 20.08.1995.

Недостатки данного способа заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Упрощение способа выделения общего белка из трубчатых костей костного мозга и повышение чистоты целевого продукта достигается тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. Трубчатые кости отделяют от плоти. У лабораторных животных и птиц создают отверстия в верхней и нижней части кости, у крупных животных производят распил костей. Клетки костного мозга из бедренной кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой 199 в колбу. Тщательно перемешивают содержимое колбы до однородного состава пипетированием. Полученные клеточные суспензии пропускают через капроновые фильтры d 10 см для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывают 3 раза охлажденной средой 199 (либо Игла). Фильтры готовят из капроновых изделий текстильной промышленности. Перед употреблением фильтры кипятят в дистиллированной воде 3 раза по 15 мин. Фильтрат подвергают центрифугированию в течение 5-7 мин при 3 тыс. об/мин. Осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, в результате которого достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга (который затем отбрасывают) и происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток, содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор.

Выделение общего белка проводят следующим образом.

В стаканы для центрифугирования с раствором белков добавляют 10% раствор трихлоруксусной кислоты из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли раствора кислоты. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревают до температуры 40-60°С (в том случае, если белки осаждаются плохо). Экстракты для полного осаждения оставляют на 12 ч в холодильнике при температуре +4°С. Осадок белков отделяют от раствора центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин - все перечисленные приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. более полное осаждение и отделение белка костного мозга от раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью полного удаления кислоты и восстановления гидратных оболочек пептида. Для этого раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) целлофановой мембраной. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 сут при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1-2 ч. Отсутствие кислоты контролируют нейтральной реакцией с индикатором.

Пример 1.

Бедренные кости от 5 поросят отделяют от плоти, затем проводят распил кости с двух сторон в центре и вымывают костное содержимое средой 199 в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры d 10 см, которые предварительно стерилизуют. Фильтрат центрифугируют в течение 7 минут при 3 тыс. об/мин. Осадок и надосадочную жидкость подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию. В процессе этого проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой 199 в разведении 1:10 в камере Горяева. При последнем оттаивании в осадке обнаруживается гомогенная масса. Содержимое центрифужных пробирок вновь фильтруют через капроновые фильтры. Белки осаждают из раствора 10% трихлоруксусной кислоты из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли трихлоруксусной кислоты, оставляют отстаиваться на 12 ч. Осадок от раствора отделяют центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга поросят, составляет 200±0,26 мг. Белок представляет собой сухой аморфный порошок серо-коричневого цвета.

Пример 2.

Трубчатые кости от 3-х щенков лисиц отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают трихлоруксусной кислотой (10% раствор) из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли трихлоруксусной кислоты.

Содержимого колбы нагревают до температуры около 60°С, оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°С. На следующий день в колбе наблюдаются обильные хлопья осажденного белка. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из мозгового вещества щенков лисиц, выделенных данным способом, составляет 136,6±8,9 мг. Белок представляет собой аморфный порошок буро-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Трубчатые кости от 3-х соболей отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка из костного мозга соболя составляет 50,0±2,8 мг. Сухой кристаллический белок костного мозга соболя переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подвергают диализу, поместив в емкость с целлофановой мембраной. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде протекает сутки (рН 3,5-4,0). Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение 1 ч (нейтральная реакция индикатора). Содержание общего белка определяют с использованием рефрактометра типа ИРФ-22 по общепринятой методике. Количество общего белка в костном мозге соболя составляет 6,77%.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из трубчатых костей костного мозга является доступность, начиная от использования капроновых фильтров, реактивов и включая легкость технических операций, что позволяет более эффективно провести фильтрацию и упростить способ.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для выделения белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных. Способ предусматривает извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, затем фильтруют через капроновые фильтры и осаждают с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты при нагревании до 60°С, отстаивают 12 часов при температуре 4°С и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 5 минут, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 суток и дистиллированной водой в течение 1 часа. Изобретение обеспечивает упрощение способа выделения общего белка из костного мозга трубчатых костей, повышение чистоты целевого продукта.

Способ выделения белков из клеток костного мозга, предусматривающий извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, отличающийся тем, что после центрифугирования осадки, вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры, белки из раствора осаждают с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°С и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 5 мин, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 суток и дистиллированной водой в течение 1 ч.