Штамм бактерий Lactobacillus salivarius - продуцент ингибитора цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-17 Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A61K35/747 C12R1/225 

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Lactobacillus salivarius ICIS-540 может быть использован для получения ингибитора цитокинов интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-17 (IL-17).

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования ингибитора цитокинов IL-6 и IL-17.

Указанный технический результат, достигнут тем, что получен новый штамм Lactobacillus salivarius ICIS-540.

Штамм Lactobacillus salivarius ICIS-540 выделен из испражнений пациента с дисбактериозом кишечника при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2015 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.

Полученный штамм Lactobacillus salivarius ICIS-540 депонирован в Государственной коллекции нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» и имеет регистрационный номер 1272.

Штамм Lactobacillus salivarius ICIS-540 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые бесспоровые палочки, располагающиеся поодиночке или в виде цепочек из 2-4 и более клеток или поодиночке. Величина клеток 18-часовой культуры в молоке составляет 10-20 мкм. Клетки равномерно окрашиваются по Граму.

При выращивании на агаре с гидролизованным молоком через 48-72 ч роста штаммы образуют «локонообразные» колонии на поверхности агара и колонии в виде «паучков» в глубине агара. Диаметр колоний - 1-2 мм.

При культивировании на среде МРС-5 и Schaedler-arap в анаэробных или микроаэрофильных условиях через 48-72 ч штаммы образуют круглые без четких границ колонии.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, микроаэрофил; растет в присутствии азота и углекислого газа в атмосфере.

Температурный диапазон роста 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 24-48 ч. Оптимум рН 7,2-7,6.

Ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, лактозу, слабо - сорбит, мальтозу, салицин, магнит. Восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.

Условия хранения лиофильно высушенной культуры: в герметичной упаковке при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 70%. При соблюдении всех норм, срок хранения 12 месяцев.

Условия и состав сред для размножения:

- плотные среды: МРС-5, Schaedler-arap (48-72 часов, 38±1°С, анаэробные условия) и агар с гидролизованным молоком (48 часов 38±1°С, анаэробные условия);

- Schaedler - бульон (24-48 часов, 38±1°С, анаэробные условия).

При проведении полногеномного секвенирования, включая 16rRNA-типирование штамм Lactobacillus salivarius ICIS-540 идентифицирован как штамм вида Lactobacillus salivarius.

Уровень активности продуцируемого Lactobacillus salivarius ICIS-540 ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 определяют согласно известному способу определения антицитокиновой активности микроорганизмов (Бухарин О.В. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011 - №4, С. 56-61).

Уровень активности ингибитора цитокинов IL-6 и IL-17, продуцируемого штаммом Lactobacillus salivarius ICIS-540 выражают в процентах (%) инактивации цитокинов в опыте по сравнению с контролем.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1.

Бульонную культуру Lactobacillus salivarius ICIS-540 получают выращиванием данного штамма в пробирках в жидкой питательной среде следующего состава: гидролизат казеина - 5,67 г.; протеозопептон - 5,00 г.; папаиновый перевар соевой муки - 1,00 г.; дрожжевой экстракт - 5,00 г.; глюкоза - 5,83 г.; NaCl - 1,67 г.; калия гидрофосфат - 0,83 г.; трис - 3,00 г.; L-цистин - 0,40 г.; гемин - 0,01 г. рН=7,6±0,2. Температура 38±1°С, время инкубации 24-48 часа в анаэробных условиях. Полученную бульонную культуру Lactobacillus salivarius ICIS-540 центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 20 минут.

Культуральную жидкость отделяют от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость. Данная культуральная жидкость представляет собой неочищенный препарат ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17.

Наличие и уровень активности полученного неочищенного препарата ингибитора провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 (IL-6) и интер-лейкина-17 (IL-17) определяют следующим образом: супернатант Lactobacillus salivarius ICIS-540 соинкубируют с растворами рекомбинантных цитокинов («Sigma», IL-6 и IL-17) в соотношении 1:1 (опытные пробы).

В качестве контрольных проб используют растворы цитокинов IL-6 и IL-17, внесенные в Schaedler-бульон (BBL, США).

Конечная концентрация цитокинов IL-6 и IL-17 в опытных и контрольных пробах составляла - 25, 75, 150, 300 пг/мл.

Опытные и контрольные пробы инкубируют в течение 2 часов (37°С), реакцию останавливают на холоду, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин (+4°С) и отбирают супернатант.

Определение концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводят общепринятым иммуноферментным анализом с использованием реагентов «Цитокин» (СП-б, Россия).

Учет результатов проводили на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм.

О наличии продуцируемого штаммом Lactobacillus salivarius ICIS-540 ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 судили по способности его супернатанта снижать концентрацию рекомбинантных цитокинов в опыте по сравнению с контролем.

Уровень активности продуцируемого Lactobacillus salivarius ICIS-540 ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 определяли согласно известному способу определения антицитокиновой активности микроорганизмов (Бухарин О.В. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011 - №4, С. 56-61).

Уровень активности ингибитора провоспалительных цитокинов, продуцируемого штаммом Lactobacillus salivarius ICIS-540, составил в отношении цитокина IL-6 при концентрации цитокина в среде 20-75 пг/мл - 100%, 150 пг/мл - 65% и при 300 пг/мл - 50%, а в отношении цитокина IL-17 при концентрации цитокина в среде 20-75 пг/мл - 100%, 150 пг/мл - 70% и при 300 пг/мл - 50%.

Пример 2.

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению наличия и уровня активности ингибитора провоспалительных цитокинов ин-терлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-17 (IL-17), продуцируемого штаммом Lactobacillus salivarius ICIS-540 и клиническими изолятами Lactobacillus spp. (L. salivarius 1-9), выделенных из кишечного биотопа.

Результаты исследований приведены в таблице.

Как видно из таблицы, штамм бактерий Lactobacillus salivarius ICIS-540 имеет 100% уровень активности ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 при концентрации цитокинов в среде от 25 до 75 пг/мл, как в отношении цитокина IL-6, так и цитокина IL-17.

У клинических изолятов лактобактерий (L. salivarius 1-9) уровень активности ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 в отношении цитокина IL-6 в среднем составлял при концентрации цитокина в среде 25 пг/мл - 63,3±1,1%, при 75 пг/мл - 15,8±1,0. При создании концентрации цитокина в среде 150 пг/мл среди клинических изолятов лактобактерий только два штамма (L. salivarius 4 и 7) ингибировали в среднем 10,0±1,2% цитокина, при 300 пг/мл активность наблюдалась только у L. salivarius 7-10%, а в отношении цитокина IL-17 в среднем составлял при концентрации цитокина в среде 25 пг/мл - 67,22±3,2%, при 75 пг/мл - 30,8±1,6%. При создании концентрации цитокина в среде 150 пг/мл среди клинических изолятов лактобактерий только три штамма (L. salivarius 2, 4 и 7) ингибировали в среднем 13,3±1,1% цитокина, при 300 пг/мл активность наблюдалась только у L. salivarius 7-5%.

Высокий уровень активности ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17, продуцируемого штаммом Lactobacillus salivarius ICIS-540, сохранялся и при более высоких концентрациях цитокинов: при 150 пг/мл его активность составляла 65 и 75%, соответственно, а при 300 пг/мл уровень активности был равен 50% в отношении обоих цитокинов IL-6 и IL-17, что свидетельствует о большей продуктивности ингибитора провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 заявляемым штаммом Lactobacillus salivarius ICIS-540 по сравнению с клиническими изолятами Lactobacillus spp.

Таким образом, заявляемый штамм бактерий Lactobacillus salivarius ICIS-540 может быть использован в качестве продуцента ингибитора провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-17 (IL-17).

Изобретение относится к микробиологии. Предлагается штамм бактерий Lactobacillus salivarius, обладающий способностью продуцировать ингибитор цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-17, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1272. Изобретение направлено на получение нового штамма, обеспечивающего повышение продуктивности ингибитора цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-17. 1 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Lactobacillus salivarius ICIS-540 - продуцент ингибитора цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-17, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1272.