СИСТЕМА ДОСТАВКИ НА ОСНОВЕ БОРТЕЗОМИБА Российский патент 2020 года по МПК C07F7/18 A61K31/695 A61P35/00 C07D241/12 

Область техники изобретения

Данное изобретение относится к системе выделения на основе Бортезомиба в форме микро- или наночастиц (или носителя), обеспеченным системами доставки лекарственных средств. Бортезомиб в носителе может присутствовать как таковой или в форме производного, как объясняется ниже.

Более конкретно, изобретение относится к классу производных, полученных взаимодействием молекулярной единицы (или линкера) с Бортезомибом через связь типа боронового диэфира.

Эти производные являются стабильными в нейтральной окружающей среде, но способны расщепляться в слегка кислой среде (pH=4,5-5,0), выделяя лекарственное средство Бортезомиб, и они также могут быть конъюгированы с носителем через линкер.

Производные в соответствии с данным изобретением представляют класс пролекарств Бортезомиба, относящихся к гидролизу боронового эфира, и могут применяться для переноса Бортезомиба и его выделения в среде со слегка кислым pH, такой как внутриклеточная среда, после прохождения через среду, имеющую нейтральный pH (такую как кровоток), в которой лекарственное средство остается стабильно конъюгированным в форме не биологически активного боронового эфира.

На практике производные в соответствии с данным изобретением могут применяться для внутриклеточного выделения Бортезомиба в том, что они позволяют переносить лекарственное средство в кровотоке, который характеризуется приблизительно нейтральным pH (7,4), в биологически неактивной форме, в то время как, попадая во внутриклеточную среду, которая характеризуется кислым pH (приблизительно 4,5-5,0), с ним происходит вызванное pH химическое расщепление, вызывая диффузию терапевтически эффективной формы Бортезомиба.

Если такие производные применяют в качестве составляющих системы доставки и выделения лекарственного средства, они могут быть прикреплены к ним линкерной единицей, и она (система доставки лекарственного средства), имеющая функцию доставки, способна достигать внутриклеточной среды при pH 4,5-5,0, где происходит расщепление пролекарства, к которому относится данное изобретение, вызывая диффузию Бортезомиба. Например, производные в соответствии с данным изобретением могут применяться для целей достижения внутриклеточного выделения (при pH 4,5-5,0) Бортезомиба после внутривенного введения (в среде с нейтральным pH).

Производные в соответствии с данным изобретением применяют для получения терапевтических систем, способных выделять Бортезомиб во внутриклеточной среде.

Уровень техники

Бортезомиб [3-метил-1-(3-фенил-2-(пиразин-2-карбоксамидо)-пропанамидо)бутилбороновая кислота] представлен формулой (I) и имеет в структуре функциональную группу бороновой кислоты, и как таковой обладает похожей реакционной способностью с бороновыми кислотами.

(I)

Бортезомиб является синтетическим соединением, принадлежащим к классу нового поколения противоопухолевых агентов, которые действуют через ингибирование хемотрипсиноподобной активности протеасомы 26S и, следовательно, расщепление белков клетки [Adams J, Palombella VJ, Sausville EA, Johnson J, Destree A, Lazarus DD, Maas J, Pien CS, Prakash S, Elliott PJ. Cancer Res (1999), 59:2615-2622; Pickart CM, Eddins MJ. Biochim Biophys Acta. 2004 Nov 29;1695(1-3):55-72.]

Его применяют клинически для лечения диагностированной впервые или не поддающейся лечению множественной миеломы (MM) и других форм опухолей, таких как мантийноклеточная лимфома [Jagannath S, Barlogie B, Berenson J, Siegel D, Irwin D, Richardson PG, et al. Brit J Haematol (2004) 127: 165-172; Orlowski RZ. Exp Rev Anticancer Ther (2004) 4:171-179]. Его также тестировали для лечения многих солидных опухолей, таких как опухоли простаты, молочной железы, легких, почек и яичников [Cusack JC. Cancer Treat Rev (2003) 29: 21-31]. Бортезомиб ингибирует путь убиквитин-протеасома. Такое ингибирование вызывает различное действие на опухолевые клетки, включая изменения в пролиферации клеток [King RW, Deshaies RJ, Peters JM, Kirschner MW. Science (1996) 274: 1652-1659], адгезии клеток [Read MA, Neish AS, Luscinskas FW, Palombella VJ, Maniatis T, Collins T. Immunity (1995) 2: 493-506] и ангиогенезе [Dulic V, Kaufmann WK, Wilson SJ, Tlsty TD, Lees E, Harper JW, et al. Cell (1994) 76:1013-1023], что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу. Эти действия в основном применимы к опухолевым клеткам, но также могут задевать нормальные клетки [Adams J. Semin Oncol (2001), 28:613-619].

Основным побочным эффектом, вызываемым лечением Бортезомибом, является периферийная невропатия, которая часто является ограничивающим дозу фактором для клинического применения, а также может привести к прерыванию лечения. В частности, вызванная Бортезомибом периферийная невропатия -принимает форму дистальной парестезии и невропатической боли, распространяющейся на нижние и верхние конечности [Cata JP, Weng HR, Burton AW, Villareal H, Giralt S, Dougherty PM. J Pain (2007) 8: 296-306; Cavaletti G, Pezzoni G, Pisano C, Oggioni N, Sala, F, Zoia C, Ferrarese C, Marmiroli P, Tredici G. Neurosci. Lett. (2002) 322:103-106; Richardson PG, Briemberg H, Jagannath S, Wen PY, Barlogie B, Berenson J, et al. J Clin Oncol (2006) 24: 3113-3120; Meregalli C, Canta A, Carozzi VA, Chiorazzi A, Oggioni N, Gilardini A, Ceresa C, Avezza F, Crippa L, Marmiroli P, Cavaletti G. Eur J Pain. (2010) 14:343-350]. Эти симптомы увеличиваются во время лечения Бортезомибом, но часто также продолжается после прерывания лечения, что приводит к существенной безрезультатности у пациентов с тяжелыми последствиями в отношении качества жизни [Jagannath S, Barlogie B, Berenson J, Siegel D, Irwin D, Richardson PG, et al. Brit J Haematol (2004) 127: 165-172]. Однако, до сих пор не ясно, какие специфические морфологические изменения в волокнах периферийных нервов связаны с различными болезненными компонентами вызванной Бортезомибом невропатии.

Системы, сконструированные с применением мезопористых частиц двуокиси кремния, которые потенциально могут применяться для выделения/доставки лекарственных средств или генов, описаны в перечисленных ниже документах: WO2007108016, WO201209448, US20090311332.

В документе WO2007108016 описаны микро- и наносистемы доставки лекарственных средств, созданные с применением мезопористых частиц двуокиси кремния, и отличающиеся присутствием рецептор-специфического лиганда на внешней поверхности частицы, и лекарственного средства, введенного в или преимущественно связанного с порами. Рецептор-специфический лиганд, рецепторы которого сверхэкспрессируются в опухолевых клетках, распознается и поглощается опухолевыми клетками и втягивает в них всю наносистему, которая выделяет лекарственное средство во внутриклеточную среду в ответ на определенные стимулы. Рецептор-специфический лиганд и лекарственное средство могут быть различных типов. Указанные выше системы делают возможным эффективное целевое лечение при низких дозах лекарственных средств и низкой токсичности и побочных эффектах.

В документе WO201209448 описаны субмикронные системы на основе пористой двуокиси кремния с поверхностями, покрытыми катионным полимером. Они могут включать олигонуклеотидный и терапевтический агент. Применение Бортезомиба указано среди заявленных терапевтических агентов, однако предложенные системы не дают механизмы для выделения pH-чувствительных лекарственных средств.

В документе US 200903110332 описан способ синтеза мезопористых наночастиц двуокиси кремния и их применение. Способ включает отделение частиц на основе их размера.

Доставляемый материал вводят в полученные частицы, и контролируемое выделение достигается снижением pH на поверхности мезопористых частиц двуокиси кремния. Бортезомиб или пролекарства Бортезомиба не упомянуты.

Объектом этого изобретения является разработка производных Бортезомиба, которые позволяют более эффективную доставку при снижении побочных эффектов по сравнению с Бортезомибом при введении в соответствии с известным уровнем техники. В частности, объектом изобретения является ингибирование периферийных невропатий, которые возникают в виде нежелательных побочных эффектов, связанных с введением Бортезомиба.

Сущность изобретения

Объектом данного изобретения, следовательно, является система выделения, содержащая ассоциацию носитель/линкер/Бортезомиб, как это определено ниже.

Другим объектом изобретения является класс производных Бортезомиба, способных выделять Бортезомиб в результате их разложения, которое имеет место при pH 4,0-5,5, предпочтительно, pH 4,5-5,0.

Эти производные имеют общую формулу (II), которая описана ниже. Они могут применяться для тех же терапевтических целей, что и Бортезомиб, и могут быть введены в известные микро- и наночастичные системы (такие как, например, описаны в WO2007108016), водя лиганд для доставки лекарственных средств.

Производные в соответствии с данным изобретением позволяют снижать побочные эффекты, обычно связанные с высокими дозами противоопухолевых лекарственных средств, которые необходимы при обычном лечении, благодаря прямому введению в опухолевые клетки исключительно непосредственно во внутриклеточную среду.

Еще одним объектом изобретения является конъюгат, содержащий производные Бортезомиба, определенные выше, с микро- и наночастицами. Предпочтительны субмикронные частицы на основе двуокиси кремния, имеющие морфологию, включающую полости, способные принимать терапевтический агент или агенты или пролекарство, которые должны быть доставлены. Особенно предпочтительны микро- и наночастицы, описанные в WO2007/108016.

Еще одним объектом являются фармацевтические композиции, содержащие пролекарство или систему доставки для лечения опухолей в общем или для облегчения побочных эффектов, связанных с введением Бортезомиба.

Другие объекты изобретения будут понятны из следующего подробного описания.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Диаграмма конъюгата, содержащего мезопористую двуокись кремния в сочетании с фолиевой кислотой на внешней поверхности и содержащего производное Бортезомиба (показанное на диаграмме как овал), химически закрепленное в порах.

Фигура 2. Микроснимок мезопористой двуокиси кремния типа MSU, полученный с применением сканирующего электронного микроскопа.

Фигура 3. ¹³C-ЯМР спектр боронового эфира.

Фигура 4. Хроматограмма Бортезомиба в концентрации 70 ч./млн. в стимулированной биологической жидкости при pH 5.

Фигура 5. Калибровочная прямая, относящаяся ко второму пику хроматограммы раствора при pH 5.

Фигура 6. Калибровочная прямая, относящаяся к третьему пику хроматограммы раствора при pH 5.

Фигура 7. Хроматограмма SBA-BORT образца во время тестирования выделения в стимулированной биологической жидкости при pH 5.

Фигура 8. Хроматограмма Бортезомиба в концентрации 50 ч./млн. в стимулированной биологической жидкости pH 7.

Фигура 9. Калибровочная прямая, относящаяся к 1 пику хроматограммы раствора при pH 7.

Фигура 10. Хроматограмма, полученная из раствора, буферированного до pH 7, в котором образец конъюгата двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб суспендирован в течение 0,5 часа.

Фигура 11. Хроматограмма, полученная из раствора, буферированного до pH 7, в котором образец конъюгата двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб суспендирован в течение 9,0 часов.

Фигура 12. Выделение Бортезомиба из стимулированной биологической жидкости при pH 5 и рH 7 ко времени.

Фигура 13. Изображения ТЭМ, иллюстрирующие поглощение MSN-FOL клетками HeLa, экспрессирующими FR через 1 час инкубирования (см. раздел Материалы и способы). Изображение (A) получают при увеличении ×8000, в то время как площадь, ограниченная квадратом, получают при увеличении ×25000 (B).

Фигура 14. MSN-FOL/GPS-BTZ ингибирует рост в FR-положительных клетках шейки матки HeLa (фигура 14A), но ни в клетках маммарной карциномы MCF-7 (фигура 14B), ни в нормальных клетках HEK293 (C), которые являются FR-отрицательными. Клетки обрабатывают MSN-FOL/GPS-BTZ или оставляют не обработанными (контроль C). MSN-FOL и MSN-FOL/GPS применяют в качестве отрицательного контроля (см. Материалы и способы). Жизнеспособность клеток оценивают через 1, 2 или 3 дня обработки. Представленные значения являются средними ± стандартное отклонение для четырех независимых экспериментов, проводимых трижды для каждого состояния.

Подробное описание изобретения

Следующие определения применяют в контексте данного изобретения:

- под системой доставки понимают конъюгат носитель/линкер/Бортезомиб;

- под пролекарством производного Бортезомиба понимают соединение общей формулы (II), полученное взаимодействием между линкером и Бортезомибом на функциональной группе бороновой кислоты;

- под линкером или молекулярной единицей или бидентатным лигандом понимают молекулу общей формулы (III), один конец которой способен взаимодействовать с функциональной группой бороновой кислоты Бортезомиба, и другой конец способен связываться с носителем;

- под лигандом или агентом, имеющим функцию доставки, понимают соединение, отвечающее за доставку и распознавание молекул, с избытком экспрессированных на поверхности опухолевых клеток, тем самым обеспечивая селективную доставку в целевую ткань;

- под носителем понимают частицу, например, частицу пористой двуокиси кремния, имеющую размеры от микро- до нанометрических, которая может связываться с борным производным Бортезомиба (определенное выше пролекарство) на ее поверхности, например, ей может быть частица пористой двуокиси кремния или матрица на основе неорганических оксидов, имеющих контролируемую пористость, которые, например, получают способом ʺмолекулярного импринтаʺ или с применением поверхностно-активных веществ (Katz, A.; Davis, M. E. Molecular Imprinting of Bulk, Microporous Silica, Nature, 2000, 403, 286-289.);

- под микро- или наносистемой доставки лекарственного средства понимают носитель, определенный выше, который несет на поверхности соединение, созданное для распознавания молекул, избыточно экспрессированных на поверхности опухолевых клеток, тем самым обеспечивая селективную доставку к целевым тканям, выбранный из, например: фолиевой кислоты, биотина, пептидов, антител, гликозидов, углеводородов или белков, все которые известны сами по себе.

Производные Бортезомиба в соответствии с данным изобретением представлены общей формулой (II) и могут быть получены химической реакцией Бортезомиба общей формулы (I) с бидентатным лигандом, который может быть представлен общей формулой (III), которые взаимодействуют с образованием циклического борного производного на конце лиганда R4.

(II)

В соединении формулы (II) Y и Z являются, независимо друг от друга, -NH, -O-, -S-, и A является заместителем, полученным после реакции между соединением формулы (I) (Бортезомиб) и соединением формулы (III).

В частности, A имеет следующее значение

Бидентатные лиганды (или линкеры) в соответствии с данным изобретением представлены общей формулой (III):

(III)

где:

R1, R2, R3, независимо друг от друга, выбирают из CH₃, C₂H₅, OCH₃, OC₂H₅, OC₃H₇, OC₄H₉, OC₅H₁₁;

X является одинарной связью или S, O, NH;

R4 выбирают из NH₂, SH, эпоксида, галогена, CN, тиоцианата, -CH=CH₂;

n и m равны положительным целым числам, так, чтобы n=0-5 и m=0-3, где n+m≥1.

Производные Бортезомиба выделяют его при pH 4,5-5,0 через раскрытие боронового кольца, в то время как другой конец может быть свободен или, более предпочтительно, связан с известной микро- или наночастичной системой.

Производные Бортезомиба в соответствии с данным изобретением могут быть получены способом, включающим следующие основные стадии.

Производные Бортезомиба в соответствии с данным изобретением могут быть получены сначала взаимодействием Бортезомиба с линкером формулы (III) с получением соединения формулы (II), которое потом связывается с носителем. В качестве альтернативы, линкер формулы (III) взаимодействует с носителем через R1, R2 и R3 заместители, и полученный продукт взаимодействует с Бортезомибом с получением системы носитель/линкер/Бортезомиб в соответствии с данным изобретением. Все реакции являются органическими реакциями, которые входят в объем знаний специалиста в данной области техники. Типовые условия реакции, например, иллюстрированы в разделе примеров.

Производные Бортезомиба могут применяться для внутриклеточного выделения Бортезомиба, так как они позволяют транспортировать лекарственное средство в биологически неактивной форме через кровоток, но как только они достигают внутриклеточной среды, с ними происходит химическое расщепление, вызванное характеристиками среды (pH), с выделением свободного Бортезомиба.

Если производное применяют в качестве составляющего системы доставки лекарственных средств, оно прикрепляется к ней и, так как вся система имеет функцию доставки, она способна достигать внутриклеточной среды при pH 4,5-5,0 где происходит расщепление пролекарства с выделением свободного Бортезомиба.

Производное расщепляется, выделяя Бортезомиб при pH 4,5-5,0 (типовой pH внутриклеточной среды). Общее описание микро-наносистем, представленных здесь, где их применяют для переноса пролекарств Бортезомиба, являющихся объектом изобретения, дано в документе WO2007108016.

Показанная ниже диаграмма описывает потенциальное применение описанного изобретения. В частности, показано потенциальное применение в качестве компонента микро- или наносистемы для внутриклеточного выделения Бортезомиба. Система содержит матрицу на основе неорганических оксидов с правильной и контролируемой пористостью (в конкретном случае, показаны частицы мезопористой двуокиси кремния), отличающуюся тем, что вещество, ответственное за доставку и молекулярное распознавание (показано на диаграмме звездочками; например, на фигуре 1 выбрана фолиевая кислота), селективно сочетается, предпочтительно, на внешней поверхности и, предпочтительно, в порах, с молекулой, принадлежащей к классу молекул, которые являются объектом изобретения (пролекарство Бортезомиба, представленное на диаграмме как овал), химически прикрепляется к системе.

В другом варианте изобретения неорганическая матрица содержит, в дополнение к или в качестве замены веществ, отвечающих за доставку и молекулярное распознавание, другие молекулы, имеющие функцию маркера, в частности, флуоресцентные маркеры. Эти молекулы могут быть объединены на внешней поверхности неорганической матрицы в сочетании с доставляющими веществами. Предпочтительны родамин и флуоресцеин. Способ получения описан у Morelli, C. et al. L. PEG-templated mesoporous silica nanoparticles exclusively target cancer cells. Nanoscale. 2011 Aug;3(8):3198-207, где описано получение мезопористой двуокиси кремния, связанной с флуоресцеином и фолиевой кислотой.

Производные Бортезомиба в соответствии с данным изобретением представляют класс пролекарств Бортезомиба, относящийся к гидролизу боронового эфира, и также могут быть конъюгированы на поверхности микро-наносистемы для доставки лекарственного средства так, чтобы стать ее составляющей.

Они химически стабильны при нейтральном pH, но они расщепляются с выделением Бортезомиба при слегка кислом pH (4,5-5,0). Они могут применяться для переноса и выделения Бортезомиба при необходимости его диффузии в среды, имеющие слегка кислый pH после прохождения через среду, имеющую нейтральный pH, в которой лекарственное средство остается стабильно конъюгированным в форме не биологически активного боронового производного.

Эти производные также могут быть связаны с микро- и наночастичными системами, применяемыми для переноса Бортезомиба когда необходима его диффузия в средах, имеющих слегка кислый pH после прохождения через среду, имеющую нейтральный pH, в которой лекарственное средство остается стабильно конъюгированным в форме не биологически активного боронового эфира, в условиях, которые возникают, если указанные выше микро- и наносистемы доставки лекарственных средств применяют для внутривенной инъекции.

Производное Бортезомиба в соответствии с данным изобретением имеет в структуре функциональную группу боронового эфира и, как таковое, обладает реакционной способностью, подобной реакционной способности бороновых эфиров.

Молекулы (бидентатные лиганды), которые предназначены для взаимодействия с Бортезомибом для получения пролекарств, имеющих описанные выше свойства, иллюстрированы общей формулой (III).

Особенно предпочтительной молекулой является 3-глицидоксипропилтриметоксисилан формулы 2.1:

2.1

Другие особенно предпочтительные молекулы включают:

3-аминопропилтриэтоксисилан

3-аминопропилтриметоксисилан

4-аминобутилдиметилметоксисилан

3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилан (N-[3-(триметоксисилил)пропил]этилендиамин)

3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриметоксисилан; (CH₃O)₃Si(CH₂)₃NHCH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂

3-(2-аминоэтиламино)пропилметилдиметоксисилан

3-меркаптопропилтриметоксисилан

3-глицидоксипропилдиметоксиметилсилан

3-глицидоксипропилдиметилэтоксисилан

3-глицидоксипропилтриметоксисилан

Аллилтриэтоксисилан

Аллилтриметоксисилан

3-цианопропилтриэтоксисилан

Хлорметил(метил)диметоксисилан

Хлорметилтриметоксисилан

Хлорметилтриэтоксисилан

(3-хлорпропил)диметоксиметилсилан

(3-хлорпропил)триметоксисилан

3-тиоцианатопропилтриэтоксисилан

3-тиоцианатопропилтриметоксисилан

Введение фармацевтических композиций

Данное изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие производные Бортезомиба формулы (II) и конъюгаты на основе Бортезомиба, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

В соответствии с данным изобретением производные и конъюгаты в соответствии с данным изобретением могут быть составлены для однократного или одновременного, последовательного или отложенного введения с другими активными ингредиентами или пролекарствами, такими как, например, противоопухолевые лекарственные средства, генетический материал, радионуклеиды или флуоресцентные маркеры, и поэтому могут быть введены в единую композицию или в отдельные композиции.

Для применения в области терапевтики фармацевтические композиции получают в виде композиций, подходящих для предполагаемого назначения и носителей для пациентов, требующих лечения, как известно специалистам в данной области техники.

Композиция может быть, например, получена с применением солей и буферных веществ или других наполнителей, которые известны специалистам в данной области техники и фармацевтически приемлемы.

Введение производных и конъюгатов в соответствии с данным изобретением, например, может происходить назально, буккально, перорально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, подоболочечно, внутричерепно, парентерально или внутрибрюшинно.

Фармацевтические формы, которые могут применяться для инъекций, например, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии, такие как стерильные порошки для получения экстемпоральных дисперсий, и все наполнители, носители и буферы, известные специалистам в данной области техники для приготовления инъекций. Стерильные порошки предпочтительно получают методами сушки, известными специалистам в данной области техники, например, сушкой в вакууме и сушкой вымораживанием.

Терапевтически приемлемые дозы устанавливаются специалистом в данной области техники, отвечающим за лечение, на основе тяжести состояния пациента, требующего лечения, и выбранного способа введения.

Любые композиции в соответствии с данным изобретением могут быть включены в набор для введения. В качестве не ограничивающего примера, набор в соответствии с данным изобретением может содержать производное Бортезомиба или систему доставки носитель/линкер/Бортезомиб, составленную подходящим образом для конкретного введения, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, например, водой для инъекций, или фармацевтически приемлемым носителем для перорального введения, если применяется.

Компоненты набора в соответствии с данным изобретением могут быть в жидкой форме или лиофилизированной форме и, предпочтительно, упакованы в подходящие стерильные контейнеры, такие как, например, бутылки, пробирки или шприцы, по-отдельности или уже смешанными.

Наборы в соответствии с данным изобретением также могут включать инструменты или устройства для введения наноносителей в соответствии с данным изобретением различными возможными путями введения, например, парентеральным, внутримышечным или внутривенным введением.

Наборы в соответствии с данным изобретением также включают инструкции для применения компонентов и любых других реагентов, не включенных в сами наборы.

Системы доставки и пролекарства на основе Бортезомиба в соответствии с данным изобретением предпочтительно применяют для лечения опухолей, в частности, их применяют для облегчения побочных эффектов и улучшения клинических состояний пациентов, больных раком, в частности, карциномами, множественной миеломой, лимфомами, такими как мантийноклеточная лимфома, опухолями простаты, молочной железы, легких, почек и яичников, более конкретно, карциномами яичников, почек, мозга, легких и молочной железы.

Системы доставки и пролекарства в соответствии с данным изобретением предпочтительно могут применяться для всех заболеваний, для которых применяют Бортезомиб, для снижения его дозы и для облегчения побочных эффектов, таких как, например, морфологические изменения периферийных нервных волокон, периферийные невропатии, периферийные парестезии и невропатическая боль в верхних и нижних конечностях.

Следующие примеры, вместе с чертежами, представлены только для иллюстрации изобретения и не должны считаться ограничивающими объем.

Примеры

Связывание линкера формулы (III) с наноносителем и последующая реакция с Бортезомибом

Синтез двуокиси кремния, функционализированной 3-глицидоксипропилом

Методика

Высушенную двуокись кремния (SBA-15 0,55 г) подвергают взаимодействию в инертной атмосфере азота с 3-глицидоксипропилсиланом (0,74 мл) в безводном толуоле. Реакцию проводят при кипении с обратным холодильником при магнитном перемешивании в течение восьми часов. Функционализированную двуокись кремния отфильтровывают и промывают тетрагидрофураном на полиамидных фильтрах и затем сушат. Таким образом, восстанавливают двуокись кремния, функционализированную глицидоксипропильным линкером (1,1 г).

[N-2(-аминоэтил)-3-аминопропилсилан)] (AEAPS)

(3-триметоксисилилпропил)диэтилентриамин (SiDETA)

Мезопористую двуокись кремния (SBA-15 или другую) предварительно активируют при приблизительно 120°C в сушильной печи в течение ночи и затем охлаждают и обрабатывают аминосиланом (AEAPS или SiDETA).

Смесь нагревают при кипении с обратным холодильником с безводным толуолом (30 мл/г подложки) в течение 24 часов в атмосфере N₂. Реакционную смесь охлаждают до температуры окружающей среды, толуол и избыток диамина удаляют фильтрацией в вакууме.

Восстановленный продукт промывают несколько раз дихлорметаном и сушат в вакууме при 40°C.

Альтернатива A

Альтернативно, реакция функционализации с 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом может проводиться в сухом диоксане.

Реакция прививки в сухом диоксане в течение 18 часов при температуре окружающей среды

Способ синтеза включает суспендирование 400 мг мезопористого* материала и растворение 0,80 мл 3-глицидоксипропилтриметоксисилана в 12 мл сухого диоксана при температуре окружающей среды. Смесь выдерживают при магнитном перемешивании при температуре окружающей среды в течение 18 часов. Смесь затем фильтруют и промывают в диоксане и сухом ТГФ и сушат при 45°C.

Альтернатива B

Альтернативно, данная реакция может проводиться в этаноле при температуре окружающей среды в течение большего периода времени реакции.

В типовом методе получения раствор, полученный растворением 8,11 г 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES, C₉H₂₃NO₃Si) в 17,13 мл этанола, вводят в суспензию, полученную суспендированием 4 г мезопористой двуокиси кремния MSU* типа, соответствующе высушенной, в 14,3 этанола. Полученную суспензию перемешивают при температуре окружающей среды в течение 18 часов, затем промывают, фильтруют и сушат.

3,50 г продукта восстанавливают (необходимо иметь в виду, что следующая методика может относиться к материалу, поры которого пропитаны поверхностно-активным веществом синтеза, и к материалу без поверхностно-активного вещества. В приведенном выше случае, применяют материал, поры которого пропитаны поверхностно-активным веществом синтеза, и он при суспендировании в этаноле выделяет поверхностно-активное вещество или его часть, что делает расчетные данные качества продукта, восстановленного в конце, незначительными).

*Любая методика функционализации действительна для всех типов мезопористой двуокиси кремния, однако предложенные альтернативы (прежде всего, альтернатива A, в которой применяют диоксан, который является не протонным растворителем) подходят для функционализации микро-наносистем, к которым были ранее привязаны рецептор-специфические лиганды, такие как фолиевая кислота или другие, при условии, что их проводят при температуре окружающей среды и в условиях реакции, которые сохраняют их биологическую активность.

Представленные выше реакции функционализации могут применяться для всех линкеров общей формулы (III), с изменением времени реакции в зависимости от желаемой степени функционализации.

Синтез двуокиси кремния функционализированной 3-пропоксипропил-1,2-диолом

Методика

Двуокись кремния, функционализированную глицидоксипропилом, подвергают взаимодействию с 0,001N раствором HCl. Реакцию проводят при магнитном перемешивании в течение семи часов при температуре окружающей среды.

Проводят фильтрацию и промывание дистиллированной водой и ацетоном, чистым для анализов, на полиамидных фильтрах. Восстанавливают двуокись кремния, функционализированную диольной функциональной группой.

Прикрепление Бортезомиба к функционализированной двуокиси кремния

В инертной атмосфере азота Бортезомиб подвергают взаимодействию с двуокисью кремния, функционализированной диольной функциональной группой в безводном дихлорметане. Реакцию проводят при магнитном перемешивании в течение девяноста минут.

Фильтрацию и несколько промывок проводят на полиамидных фильтрах с применением безводного дихлорметана. Восстанавливают двуокись кремния с Бортезомибом, связанным в виде циклического боронового эфира.

Альтернативный способ получения

Эквимолярные количества Бортезомиба и функциональной группы мезопористой двуокиси кремния (SBA-15 или другой) функционализированной AEAPS и SiDETA лигандов нагревают до 40°C в безводном толуоле в присутствии молекулярных сит в течение 7 часов. Восстановленный продукт (диазаборолидин) промывают несколько раз дихлорметаном и сушат в вакууме.

Диазаборолидины гидролизуются быстро в разбавленных кислых растворах, но в нейтральных растворах гидролиз происходит очень медленно (J. Am. Chem. Soc., 1958, 80 (20), pp 5411-5413).

Получение производного Бортезомиба формулы (II) и последующее связывание с наноносителем

Соединение II

3-Глицидоксипропилсилан подвергают взаимодействию с 0,001N раствором HCl в ТГФ (тетрагидрофуране).

Реакционную смесь выдерживают в течение 3 часов при магнитном перемешивании.

Продукт с примесями восстанавливают удалением растворителя при пониженном давлении и затем обрабатывают водой и затем экстрагируют дихлорметаном. 3-(Силилпропокси)пропан-1,2-диол восстанавливают таким образом и затем подвергают взаимодействию с Бортезомибом в дихлорметане в течение приблизительно 2 часов. Полученный бороновый эфир обрабатывают двуокисью кремния (SBA-15 или другой) в этаноле в течение 48 часов при температуре окружающей среды.

Продукт фильтруют и промывают несколько раз на полиамидных фильтрах с применением этанола и безводного дихлорметана. Восстанавливают двуокись кремния с Бортезомибом, связанным в виде циклического боронового эфира.

С помощью AEAPS и SiDETA лигандов связь с Бортезомибом получают с применением тех же условий, которые применяют для связывания Бортезомиба с двуокисью кремния, функционализированной AEAPS и SiDETA. Полученное производное формулы (II) затем связывают с двуокисью кремния в виде производного формулы (II), полученного с глицидокси.

1-амино-3-(3-силил)пропокси)пропан-2-ол

Газообразный аммиак при температуре окружающей среды барботируют через раствор 3-глицидоксипропилсилана в этаноле в течение 10 часов. Растворитель удаляют при пониженном давлении, и восстанавливают 1-амино-3-[(3-силил)пропокси]пропан-2-ол (C), и затем обрабатывают Бортезомибом в эквимолярных количествах в толуоле при 40°C в присутствии молекулярных сит.

Полученный оксаазаборолидин обрабатывают двуокисью кремния (SBA-15 или другой) в этаноле в течение 48 часов при температуре окружающей среды.

Продукт фильтруют и промывают несколько раз на полиамидных фильтрах с применением этанола и безводного дихлорметана. В восстановленном продукте Бортезомиб связан с двуокисью кремния через циклическую оксаазаборолидиновую структуру.

Что касается лигандов общей формулы (III), в которых R4 является двойной связью (аллилтриэтоксисилан, аллилтриметоксисилан, и т.д.), двойная связь может быть превращена в эпоксид через реакцию эпоксидирования с надкислотами или через образование галогидрина и последующее внутримолекулярное нуклеофильное замещение. Полученный эпоксид затем обрабатывают так же, как глицидоксипропил.

В случае, если R4 является галогеном ((3-хлор-пропил)триметоксисилан), лиганд может быть превращен в соответствующий алкен через реакцию дегидрогалогенирования (β-отщепления) и затем обработан так же, как производные, в которых R4 является двойной связью.

Синтез боронового эфира

Бортезомиб может взаимодействовать с диолами, полученными раскрытием эпоксигруппы, присутствующей в молекуле, с получением циклического боронового эфира.

Предварительные эксперименты проводят с применением моделей бороновой кислоты для изучения и определения оптимальных условий реакции для образования бороновых эфиров, начиная с 3-глицидоксипропилтриметоксисилана. 3-Метилбутилбороновую кислоту и фенилбороновую кислоту применяют в качестве моделей субстратов для этой цели.

Присутствие триметоксисилильных групп позволяет связываться с поверхностью мезопористой двуокиси кремния. Образованная сложная эфирная связь может быть гидролизована в слегка кислой среде (pH 4,5-5,0) и позволяет выделять лекарственное средство в эндосомах и, следовательно, в мишени, ограничивая выделения вне клеточной среды.

Наночастицы, функционализированные производным бора в предыдущем примере

Функционализация

Пролекарства Бортезомиба могут применяться в качестве составляющих микро- или наносистем для доставки лекарственных средств.

Представленный ниже экспериментальный подход разработан для функционализации наночастиц мезопористой двуокиси кремния и последующего конъюгирования с функциональной группой, введенной бороновой кислотой. Мезопористый материал функционализируют с помощью 3-глицидоксипропилтриметоксисилана; эпоксидную функциональную группу затем гидролизуют для прикрепления Бортезомиб.

Молекула 3-глицидоксипропилтриметоксисилана способна связывать Бортезомиб и одновременно прикрепляться к поверхности мезопористой двуокиси кремния.

Мезопористый материал типа SBA-15 синтезируют модификацией способа получения, описанного в литературе (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng Aspects 229 (2003)1-8). Применяемые стадии получения получают масштабированием оригинальной методики и модификацией ее в отношении молярного отношения EtOH/H₂O. Получение образца SBA-15: 4,2 г Pluronic P-123 (Sigma Aldrich) и затем 0,7 г CTAB (Alfa Aesar) растворяют в растворе, содержащем 56,6 мл ультрачистой H₂O, 35 мл 99+% EtOH (Sigma Aldrich) и 84 мл 2M HCl. Когда растворение завершается, добавляют 14 мл TEOS (Sigma Aldrich), полученную смесь выдерживают при перемешивании при температуре окружающей среды в течение 30 минут и затем переносят в тефлоновый автоклав, где ее оставляют созревать в течение 5 часов при 80°C и затем при температуре 120°C в течение 12 часов. Полученный белый осадок восстанавливают фильтрацией с применением полиамидных фильтров с пористостью 0,2 мкм.

Альтернативно, мезопористую двуокись кремния типа MSU получают согласно следующему протоколу синтеза или подобному (полученному из методов, заявленных в WO2007108016): раствор, содержащий 150 г дистиллированной H₂O и 13,80 г Triton X-100 (Sigma-Aldrich), получают в 500 мл пластиковом химическом стакане. Как только поверхностно-активное вещество полностью растворится, получают раствор, содержащий 10 г н-декана (99+% C₁₀H₂₂, Carlo Erba) и 14,50 г TEOS (Si(OC₂H₅)₄, Sigma-Aldrich). Раствор медленно выливают по стенкам стакана, в котором растворено поверхностно-активное вещество, при очень осторожном перемешивании. Полученную двухфазную эмульсию выдерживают при осторожном перемешивании при температуре окружающей среды в течение 8 дней. После удаления верхней органической фазы, эмульсию фильтруют с применением полиамидных фильтров, имеющих пористость 0,2 мкм.

Другие типы мезопористой двуокиси кремния могут применяться в качестве альтернативы.

SBA-15 мезопористый материал обрабатывают 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом (5) в безводном толуоле при кипении с обратным холодильником в течение 8 часов (диаграмма 1.1).ⁱ

Диаграмма 1.1

После фильтрации и промывания тетрагидрофураном функционализированную мезопористую двуокись кремния восстанавливают и характеризуют инфракрасной (ИК) спектроскопией, термогравиметрическим анализом (ТГФА) и дифференциальной калориметрией (ДСК).

Сильное снижение абсорбции при 3450 см^-1 связано с растягиванием O-H связи в силанольных группах двуокиси кремния и присутствием растягивающих полос C-H связей при 2951 и 2853 см^-1, соответствующих цепи атомов углерода глицидоксипропильной группы, которые вместо этого отсутствуют в ИК спектре не функционализированного продукта, но были получены в ИК спектре.

Характеристики органического лиганда также включают полосы при 910 и 816 см^-1, относящиеся к асимметричному растягиванию эпоксидного кольца.

ДСК и ТГФ анализ проводят для SBA-15 мезопористого материала после кальцинирования и для продукта (8), функционализированного 3-глицидоксипропилом.

Значительное различие видно на графиках (не показаны) ДСК и ТГФ анализов двух образцов. В случае функционализированного материала, ТГА кривая показывает потерю массы на приблизительно 11,3% (выражена в терминах массового отношения органической массы/(SiO₂+органической) 0,113). В ДСК кривой экзотермический пик при температуре 248°C является доказательством реакции горения глицидоксипропильной группы.

Для синтеза бороновых эфиров из функционализированной мезопористой двуокиси кремния (8), эпоксидное кольцо превращают в соответствующий диол гидролизом в кислой среде.

Диаграмма 2.1

Реакцию гидролиза проводят обработкой мезопористой двуокиси кремния 8 водным раствором 0,001N хлористоводородной кислоты в течение 7 часов при температуре окружающей среды (диаграмма 2,1).

Гидролизованный продукт 9, восстановленный фильтрацией, сушат и характеризуют ИК спектроскопией и ДСК и ТГФ анализами. Повышенная интенсивность в полосе, относящейся к растягиванию O-H связи при приблизительно 3443 см^-1, объясняется присутствием диольной функциональной группы, и исчезновение полосы при 910 см^-1, соответствующей асимметричному растягиванию эпоксидного кольца, видно в ИК спектре продукта 9.

Эксперименты проводят на образовании бороновых эфиров, начиная с функционализированной мезопористой двуокиси кремния 9 с применением 3-метилбутилбороновой кислоты (6) в качестве модели субстрата. Соединение 9 обрабатывают бороновой кислотой 6 (аналог Бортезомиба. Молекулы, подобные Бортезомибу, применяют для более прямого связывания реакционноспособности молекулы со структурой функциональной группы в поддержку исследования, чтобы сделать его более полноценным, в условиях, подобных тем, в которых происходит реакция Бортезомиба) в безводном толуоле при кипении с обратным холодильником в течение 24 часов (диаграмма 3.1).

Диаграмма 3.1

Продукт (10), восстановленный фильтрацией реакционной смеси, промывают ТГФ, в котором растворим растворитель 3-метилбутилбороновая кислоты, сушат и характеризуют ИК спектроскопией и ДСК и ТГФ анализами.

Получение боронового диэфира

Бороновый диэфир образуют с применением другой модели системы: фенилбороновой кислоты (аналога Бортезомиба). Реакцию соединения 9 с фенилбороновой кислотой проводят в других условиях: реакцию проводят при температуре окружающей среды в течение более короткого периода времени с применением дихлорметана в качестве растворителя. Мезопористый продукт 9 обрабатывают фенилбороновой кислотой (11) в безводном дихлорметане при температуре окружающей среды в течение 90 минут (диаграмма 4.1).

Диаграмма 4.1

Характеризация продукта 12, восстановленного после фильтрации и промывания дихлорметаном, с применением ИК спектроскопии и ДСК И ТГА анализов, подтверждает получение бороната. ИК спектр показал, в качестве характеристик структуры 12, полосу, соответствующую растягиванию ароматических C-H связей при 3015 см^-1, соответствующую фенилборонату, полосу абсорбции при 1368 см^-1, присущую асимметрической вибрации B-O связи бороната, и две полосы при 804 и 707 см^-1, относящиеся к складыванию перпендикулярно плоскости Ar-H связей.

Бортезомиб затем прикрепляют к SBA-15 мезопористой двуокиси кремния с применением условий, таких же как в экспериментах с фенилбороновой кислотой (диаграмма 5.1).

Диаграмма 5.1

Анализ восстановленного продукта (14) ИК спектроскопией выявил присутствие полосы, соответствующей растягиванию амидной связи, присутствующей в молекуле Бортезомиба, при 1680 см^-1, и полосы при 1533 см^-1, которая может быть присуща складыванию NH группы. Также типовыми для молекулы Бортезомиба являются полосы при 1446 см^-1, относящиеся к растягиванию C-N связи, и при 744 и 701 см^-1, соответствующие изгибу вне плоскости ароматического кольца. Эти полосы отсутствуют в ИК спектре исходного диола (9).

Прикрепление Бортезомиба к функционализированному мезопористому материалу 9 также подтверждается ЯМР анализом соединения 14 в твердом состоянии.

Все сигналы, присущие и органическому лиганду и молекуле Бортезомиба, наблюдаются в ¹³C-ЯМР спектре соединения 14 (фигура 3).

Сигнал при 7,52 ч./млн. возникает из-за карбония метиленовой группы, связанной с двуокисью кремния (Si-CH₂), в то время как два сигнала при 21,49 и 23,50 соответствуют, соответственно, метилам в боковой цепи аминокислотного остатка лейцина и центрального метилен углерода пропильной цепи, связанной с кремнием.

Сигналы, относящиеся к атомам углерода двух CH₂ групп, связанных с атомом кислорода простого эфира органического линкера (CH₂-O-CH₂), также присутствуют при 70,50 и 71,56 ч./млн. В интервале 122,56-154,76 ч./млн. показаны сигналы, относящиеся к ароматическим атомам углерода молекулы Бортезомиба, и сигналы, которые могут быть присущи амидным карбонилам этой молекулы между 162,76 и 171,45 ч./млн.

В ²⁹Si-ЯМР спектре в твердом состоянии (не показан) два очень сильных пика наблюдаются при -110,6 и -105,5 ч./млн., соответствующих структурам Q⁴[Si(OSi)₄] и Q³[Si(OSi)₃OH], соответственно. Два пика также присутствуют в нижних областях, -66,2 и -56,1 ч./млн., которые могут быть присущи кремнию из структур T³[RSi(OSi)₃] и T²[RSi(OSi)₂OH]. Присутствие T видов в спектре подтверждает, что органический лиганд присоединен к неорганической структуре двуокиси кремния. ¹¹B-ЯМР анализ соединения 14 также показывает сигналы, которые могут быть присущи трикоординированному и тетракоординированному бору.

Пролекарства Бортезомиба как составляющие микро- и наносистем доставки лекарственных средств: оценка стабильности пролекарства при различном pH

Линкерным агентом для прикрепления лекарственного средства к матрице, как показано выше, является 3-глицидоксипропилтриметоксисилан, который способен взаимодействовать с функциональной группой бороновой кислоты лекарственного средства и, одновременно, с мезопористым материалом.

Согласно этому подходу, лекарственное средство ковалентно связывается на поверхности двуокиси кремния мезопористого материала. Связь является стабильной при нейтральном pH и становится лабильной при слегка кислом pH (4,5-5,0), который обычно находят в клетке в эндосомах и лизосомах.

Эти характеристики (вместе с возможностью конъюгирования рецептор-специфического лиганда с системой) представляют систему как полностью потенциально способную к диффузии в кровотоке (без значительных потерь Бортезомиба), распознаваемую и поглощаемую опухолевыми клетками, которые сверхэкспрессируют рецепторы рецептор-специфического лиганда, с выделением лекарственного средства после кислотного гидролиза ковалентной связи.

Поведение описанной выше системы оценивается ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) в буферных растворах при pH 5,0 и pH 7,0, которая имитирует внутриклеточную среду и кровоток, соответственно.

Выделение Бортезомиба системой доставки лекарственного средства, содержащей пролекарство Бортезомиба (конъюгат двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб).

Профиль выделения лекарственного средства из всей системы изучают через воспроизведение физиологических сред, с которыми она контактирует, ʺin vitroʺ. Поэтому выделение имитируют в растворе при нейтральном pH (ИЖТ) для имитации пути системы матрица-лекарственное средство в кровотоке до ее попадания в целевую клетку, и в кислом растворе при pH=5, который имитирует среду, присутствующую в эндосомах, внутриклеточных пузырьках, которые образуются после поглощения системы лекарственное средство-матрица эндоцитами.

Получение c-ИЖТ (искусственной жидкости тела)

c-ИЖТ представляет собой растворы, буферированные до различных значений pH, которые имитируют среду жидкостей тела.

В частности, применяют:

1) буферный раствор с pH 7, полученный из дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и гидроксида натрия (NaOH), воспроизводящий нейтральную среду плазмы крови.

2) буферный раствор с pH 4,4 на основе ацетата натрия и уксусной кислоты, который воспроизводит кислую среду лизосом, с которыми контактирует лекарственное средство после эндоцитоза.

Условия анализа ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии)

Профиль выделения лекарственного средства оценивают ВЭЖХ с применением ацетонитрила/воды (30/70 об./об.) с 0,1% муравьиной кислоты в качестве элюента, и со скоростью потока 1,0 мл/мин. КФ датчик установлен на 270 нм.

Применяют колонку Lichrosorb RP18 TEKNOKROMA 10 мкм 25×0,46.

Объем вспрыскиваемых растворов составляет 1 микролитр, и образцы раствора в физиологических условиях получают с интервалом 30 минут в течение 12 часов.

Калибровочные кривые строят с применением трех буферных растворов, имеющих различные концентрации Бортезомиба. Лекарственное средство показало три различных пика при pH 5 в ВЭЖХ хроматограмме.

Второй и третий пики рассматриваются для целей оценки выделения лекарственного средства, так как их площадь линейно коррелируется с концентрацией стандартных растворов.

Присутствие двух различных пиков объясняется существованием двух форм Бортезомиба при рассматриваемых pH, которые имеют разное время элюирования, как показано на фигуре 4.

Значения, полученные при анализе растворов Бортезомиба в различных концентрациях, показаны в таблицах 1.1 и 2.1 для пиков, идентифицированных под номерами 2 и 3, соответственно, в хроматограмме, полученной при pH 5, показанной на фигуре 4. Калибровочные кривые, полученные из пиков 2 и 3, показаны на фигурах 5 и 6, соответственно.

Таблица 1.1 Значения площади под вторым пиком для раствора при pH 5

Концентрация (ч./млн.) Площадь пика (мка) 4 1550 10
70 1829
9650

Таблица 2.1 Значения площади под третьим пиком для раствора при pH 5

Концентрация (ч./млн.) Площадь пика (мка) 4 1674 10
70 1830
9173

Выделение Бортезомиба в кислой среде (буфер при pH=5)

Пролекарство, к которому относится изобретение (конъюгат двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб), как таковое или как составляющая микро- или наноситетмы доставки лекарственного средства (в этом случае носитель на фигуре 1), представляет собой молекулу, способную выделять активную форму Бортезомиба при слегка кислом pH. Слегка кислый pH является характеристикой внутриклеточной среды так, что лекарственное средство может диффундировать в среду клетки, если она является первой средой со слегка кислым pH, с которой контактирует пролекарство или система, частью которой оно является, после поглощения эндоцитом после прохождения через кровоток при нейтральном pH. Эндосомы (внутриклеточные органеллы) фактически характеризуются слегка кислым pH, близким к значению 5, поэтому выделение образца конъюгата двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб оценивают в растворе, воспроизводящем кислую среду эндосомы. Буфер уксусная кислота/ацетат натрия, полученный смешиванием 51 мл водного раствора 0,2 M уксусной кислоты, полученного из 99% уксусной кислоты (Carlo Erba), и 49 мл 0,2 M водного раствора ацетата натрия, применяют для этой цели. Последний получают добавлением 0,803 г ацетата натрия [CH₃COONa] (Sigma Aldrich) в 49 мл ультрачистой H₂O.

Образец, впрыскиваемый в хроматографическую колонку, получают растворением 4 мг материала SBA-BORT в 15 мл буферного раствора при pH, близком к значению 5, и перемешивают при температуре 37°C с получением наилучшего воспроизведения физиологических условий внутриклеточной среды.

В таблице 3.1 показаны концентрации Бортезомиб, показанные ВЭЖХ в буферном растворе при pH 5, относительные площади рассматриваемых пиков и количества, выраженные в граммах в различные интервалы времени.

На фигуре 7 показана ВЭЖХ хроматограмма во время тестирования выделения, проводимого в имитированной жидкости тела при pH 5.

Концентрации лекарственного средства в различные интервалы времени получают делением значения каждой площади под соответствующим пиком на значение градиента (y) калибровочной кривой.

В частности, концентрации, найденные во время первых 2,5 часов, получают исключительно из площадей под вторым пиком, так как третий начинает определяться только начиная с третьего часа. Оба пика, однако, рассматриваются в последующие моменты времени для того, чтобы получить конечное количество лекарственной формы из суммы концентраций, соответствующих всем отдельным площадям.

Как можно видеть из значений, показанных в таблице 3.1, концентрации лекарственного средства имеют тенденцию к постепенному увеличению в течение времени до приблизительно восьмого часа, и затем принимают примерно постоянные значения.

Выделение Бортезомиба в нейтральной среде (буфер при pH=7).

Чтобы продемонстрировать стабильность системы в среде с нейтральным pH, такой как кровоток, тестирование выделения проводят для образца SBA-BORT в среде, буферированной при pH 7 при температуре 37°C, имитируя кровоток.

KH₂PO₄/NaOH (дигидрофосфат калия/гидроксид натрия) буфер применяют для этой цели, полученный растворением 6,81 г дигидрофосфата калия в 291 мл 0,10M гидроксида натрия.

Таблица 3.1 Данные выделения SBA-BORT при pH=5 ко времени

Время (часы) Площадь (мка) 2-й пик Площадь (мка) 3-й пик Найденная концентрация BORT (ч./млн.) Количество БОРТЕЗОМИБА, выделенное 4 мг матрицы 1 6798 // 48,71 0,04871 мг 2 7647 // 54,79 0,05479 мг 3 6017 3500 69,42 0,06942 мг 5
6
8
9 5581
5726
5778
5754 5394
5768
6404
6545 80,54
84,39
89,55
90,43 0,08054 мг
0,08439 мг
0,08955 мг
0,09043 мг

Затем 4 мг образца SBA-BORT диспергируют в 15 мл буферного раствора. Смесь перемешивают в течение всего тестирования выделения при температуре 37°C.

Образцы указанной выше смеси берут каждые 30 минут для анализа ВЭЖХ. На фигуре 8 показана хроматограмма Бортезомиба в концентрации 50 ч./млн. в имитированной жидкости тела при pH 7.

Значения, полученные при анализе растворов Бортезомиба в разных концентрациях, показаны в таблице 4.1, относящейся к пику, идентифицированному под номером 1. Полученная калибровочная кривая показана на фигуре 9.

Таблица 4.1 Значения площади под пиком для раствора при pH 7

Концентрация (ч./млн.) Площадь пика (мка) 10 46392 20
50 93083
181493

Из двух хроматограмм, показанных на фигуре 10 и фигуре 11 видно, что пик, идентифицированный под номером 1 на фигуре 8, практически отсутствует даже через 9 часов суспендирования в жидкости при pH 7.

В частности, никаких потерь из конъюгированной системы двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб, которые могли бы быть определены ВЭЖХ, не наблюдается в течение приблизительно первых четырех часов.

В таблице 5.1 показаны данные выделения Бортезомиба при pH 7 ко времени

Количество Бортезомиба, выделенное из конъюгированной системы двуокись кремния (SBA-15)/линкер/Бортезомиб после ее нахождения в буферированном растворе в течение 9 часов, было приблизительно в 50 раз меньше, чем определялось в растворе, буферированном при pH 5 в течение того же периода времени.

На фигуре 12 показана динамика выделения Бортезомиба при двух разных значениях pH: в буфере при pH 5 и pH 7 ко времени.

Данные выделения, представленные на фигуре 12.1, позволяют сделать вывод, что система крайне стабильна в растворе, имитирующем плазму крови. В то время как система SBA-BORT оставалась в растворе вплоть до трех часов, применяемый метод не определил какое-либо присутствие лекарственного средства, после чего оно оставалось в значительной степени привязано к матрице мезопористой двуокиси кремния.

Данные экспериментов, относящихся к выделению Бортезомиба в кислой среде, показали, что значительные концентрации лекарственного средства присутствуют в растворе даже после того, как система SBA-BORT находилась в нем в течение незначительного времени, подтверждая лабильность связи боронового диэфира при слегка кислом pH.

Таблица 5.1 Данные выделения SBA-BORT при pH=7 ко времени

Время (часы) Площадь пика (мка) Найденная концентрация BORT (ч./млн.) Количество БОРТЕЗОМИБА, выделенное 4 мг матрицы 1 ~0 ~0 ~0 3 ~0 ~0 ~0 4 4693 1,43 0,00143 мг 6
7
9 5208
5365
5839 1,58
1,63
1,78 0,00158 мг
0,00163 мг
0,00178 мг

Эксперименты с жизнеспособностью клеток

Эксперименты с жизнеспособностью клеток проводят на системах, включающих матрицу на основе неорганических оксидов, имеющую равномерную и контролируемую пористость, отличающуюся тем, что фолиевая кислота селективно сочетается с матрицей в качестве вещества, отвечающего за попадание и распознавание молекулы, и пролекарство Бортезомиба, прикрепленное в порах.

Для этой цели наночастицы мезопористой двуокиси кремния (MSN, также обозначенные выше как SBA) функционализируют фолиевой кислотой (с получением частиц, обозначенных как MSN-FOL) или фолиевой кислотой и Бортезомибом (последние обозначены как MSN-FOL/GPS-BTZ), получая более ʺзавершенныйʺ продукт в соответствии с данным изобретением, то есть микро-наносистему доставки лекарственного средства. В этом конкретном варианте, который был протестирован, линкером является функциональная группа глицидоксипропила (GPS).

Проводят эксперименты с обновлением и жизнеспособностью клеток. Потенциальную токсичность наночастиц определяют в экспериментах с жизнеспособностью клеток, которые показали, что они не являются токсичными вплоть до концентраций 3 мкг/10⁵ клеток (не представленные результаты), и поэтому дальнейшие эксперименты проводились с соотношением MSN/количество клеток.

Наблюдения, проведенные с применением электронного микроскопа (ПЭМ), показали, что MSN-FOL успешно проникают в клетки HeLa, экспрессирующие высокие уровни FR даже через инкубирование в течение 1 часа, в основном расположенные в образованиях эндосом в цитоплазме (фигура 13).

Для определения того, могут ли наночастицы являться надежным инструментом для целевой терапии, MSN-FOL конъюгируют с Бортезомибом с применением pH-чувствительной системы (MSN-FOL/GPS-BTZ). Эти частицы затем разрабатывают в попытке получить противоопухолевое устройство, в котором применяется фолиевая кислота в качестве рецептор-специфического лиганда, исключительно отвечающего за распознавание FR-положительных клеток, и после эндоцитоза рецептора, медиированного MSN, pH-чувствительная система способна выделять лекарственное средство только в кислую среду эндолизосомальных полостей.

Токсичность/эффективность MSN-FOL/GPS-BTZ оценивают в экспериментах жизнеспособности клеток с применением теста вытеснения триптанового синего (см. раздел Материалы и способы). Явная остановка роста наблюдается уже через 1 день в клетках HeLa (FR-положительных), обработанных MSN-FOL/GPS-BTZ, по сравнению с контролем. Цитостатический эффект затем переходит в цитотоксический эффект на второй и, прежде всего, третий день обработки (фигура 14A). В подтверждение того, что токсичность достигается исключительно за счет присутствия BTZ, синтетические промежуточные соединения MSN-FOL и MSN-FOL/GPS, применяемые в качестве других отрицательных контролей, не показали значительного действия на пролиферацию клеток в любой из рассматриваемых моментов времени (фигура 14A).

Наоборот, клетки карциномы молочной железы MCF-7 и нормальные клетки почек эмбриона HEK293, которые являются FR-отрицательными колониями, не показали ингибирование роста после обработки MSN-FOL/GPS-BTZ по сравнению с контролем или образцами, обработанными MSN-FOL и MSN-FOL/GPS (фигуры 14B и 14C) (Morelli C., Maris P, Sisci D, Perrotta E, Brunelli E, Perrotta I, Panno ML, Tagarelli A, Versace C, Casula MF, Testa F, Andò S, Nagy JB, Pasqua L. PEG-templated mesoporous silica nanoparticles exclusively target cancer cells. Nanoscale. 2011 Aug;3(8):3198-207).

Полученные данные показали, что наши наночастицы мезопористой двуокиси кремния являются потенциальным носителем в области контролируемого выделения лекарственных средств, так как они могут быть селективно распознаны и поглощены только опухолевыми клетками, экспрессирующими FR, но не FR-отрицательными клетками (например, большинством нормальных клеток). Это позволяет выделять лекарственное средство в лизосомах (pH 4-5) и действовать только в целевых клетках, что позволяет значительно снизить побочные эффекты, возникающие из-за не селективного системного распределения.

Материалы и способы

Колонии клеток и условия культивирования

Клетки аденокарциномы шейки матки человека HeLa (American Type Culture Collection, ATCC, USA) и нормальные клетки почек эмбриона HEK293 культивируют в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС); клетки карциномы молочной железы человека MCF-7 (Interlab Cell Line Collection, ICLC, Genoa, Italy) репродуцируют в DMEM:F12, содержащей 5% ФТС.

100 МЕ мл^-1 пенициллина, 100 мкг мл^-1 стрептомицина и 0,2 мМ L-глутамина добавляют в обе культуральные среды. Среды и реагенты получают из Gibco® (Thermo Fisher Scientific Inc.).

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Клетки высевают в чашки Петри диаметром 60 мм для культивирования клеток и инкубируют при 37°C с MSN-FOL. Через 1 час инкубирования клетки промывают и собирают в физиологический раствор с фосфатным буфером (ФРФБ, Invitrogen, Italy) и центрифугируют при 14000 об./мин. Полученную лепешку затем сразу же закрепляют в ФРФБ с 3% глутаровым альдегидом (pH 7,4) в течение 2 часов, затем переносят в 3% раствор тетроксида осмия в течение еще 2 часов, обезвоживают на ацетоновом градиенте и, наконец, заливают Аралдитом (Fluka, Buchs, Switzerland). Ультратонкие срезы получают с помощью микротома, стратифицируют на 300 меш медной сетке, контрастируют цитратом свинца и ацетатом уранила и затем исследуют с применением электронного микроскопа ʺZeiss EM 900ʺ.

Эксперименты с жизнеспособностью клеток

Действие MSN, конъюгированного с Бортезомибом (BTZ), на пролиферацию клеток оценивают с применением способа вытеснения триптанового синего, окрашивающего агента, способного проникать через мембраны поврежденных или мертвых клеток (которые исключены из подсчета), но который не проникает через мембрану неповрежденных клеток (которые, наоборот, принимаются в расчет). Клетки, в экпоненциальной фазе роста, затем инокулируют в культуральную среду в 12-луночные планшеты в количестве 10⁵ клеток/лунку, и выращивают в течение ночи. На следующий день клетки синхронизируют в безсывороточной питательной среде (SFM) для получения популяции клеток, которые находятся в одинаковой фазе цикла, тем самым избегая разницы в росте клеток. Через 24 часа 3 мкгg/10⁵ MSN-FOL, MSN-FOL/GPS и MSN-FOL/GPS-BTZ клетки добавляют к клетками в течение 1 часа; затем среду меняют на свежую среду, в которую добавляют 5% ФТС, и клетки собирают через 1, 2 или 3 дня трипсинизацией и инкубируют в 0,5% растворе триптанового синего при температуре окружающей среды в течение 10 минут. Жизнеспособность клеток определяют микроскопически подсчетом клеток, которые не окрасились (живых клеток) с применением проточного цитометра (Burker, Brand, Germany).

Изобретение относится к производным общей формулы (II)

,

где Y и Z представляют собой -O- и A является

,

где R1, R2, R3 независимо друг от друга представляют собой OCH₃; X представляет собой O; n равно 3 и m равно 1. Технический результат: получены новые производные с Бортезомибом через связи боронового диэфира, которые являются стабильными в нейтральной среде, но которые способны расщепляться в слегка кислой среде (pH=4,5-5,0), выделяя лекарственное средство Бортезомиб, для доставки лекарственных средств, которые могут применяться для переноса и выделения Бортезомиба. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 14 ил.

1. Производное общей формулы (II)

(II)

где Y и Z представляют собой -O-

и A является

где R1, R2, R3 независимо друг от друга представляют собой OCH₃;

X представляет собой O;

n равно 3 и m равно 1.

2. Производное по п.1, в котором А представляет собой бидентатный лиганд, который выбирают из:

3-глицидоксипропилтриметоксисилана;

3-аминопропилтриметоксисилана;

3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилана;

(N-[3-(триметоксисилил)пропил]этилендиамина);

3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриметоксисилана;

3-меркаптопропилтриметоксисилана;

3-глицидоксипропилтриметоксисилана;

аллилтриметоксисилана;

хлорметилтриметоксисилана;

(3-хлорпропил)триметоксисилана;

3-тиоцианатопропилтриметоксисилана.

3. Производное по любому из пп. 1-2, отличающееся тем, что оно химически стабильно при нейтральном pH, но расщепляется с выделением Бортезомиба при слегка кислом pH от 4,0 до 5,5, предпочтительно, 4,5-5,0.

4. Производное по любому из пп. 1-3 для применения в области фармацевтики для ингибирования хемотрипсиноподобной активности протеасомы 26S.

5. Система доставки для ингибирования хемотрипсиноподобной активности протеасомы 26S, содержащая производное формулы (II) по любому из пп. 1-4, прикрепленное к пористой неорганической матрице, причем неорганическая матрица представляет собой мезопористую двуокись кремния.

6. Система по п. 5, в которой неорганическая матрица содержит одну или более молекул, выбранных из веществ, отвечающих за доставку и молекулярное распознавание, и молекул, действующих как маркеры.

7. Система по п. 6, в которой вещество, отвечающее за доставку и молекулярное распознавание, выбирают из фолиевой кислоты, биотина, пептидов, антител, гликозидов, углеводородов, белков.

8. Система по п. 7, в которой маркером является флуоресцентный маркер, в частности, флуоресцеин или родамин.

9. Фармацевтическая композиция ингибирующая хемотрипсиноподобную активность протеасомы 26S, содержащая производное или систему по любому из пп. 1-8 вместе с фармацевтически приемлемым носителем.