ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫЕ НАНОМОТОРЫ С ФЕРМЕНТНЫМ ДВИГАТЕЛЕМ Российский патент 2025 года по МПК B82B1/00 

Эта заявка испрашивает приоритет по заявке на европейский патент EP18382896, поданной 5 декабря 2018 г.

Область техники

Данное изобретение относится к области нанотехнологий. В частности, изобретение относится к наномоторам с ферментным приводом, функционализированным извне. Наномоторы по изобретению особенно пригодны для терапии и биочувствительности.

Уровень техники

Каталитические микропловцы - это искусственные системы, способные двигаться самостоятельно благодаря преобразованию химической энергии в механическую силу, которая в конечном итоге переводится в активное движение.

Хотя микро- и наномоторы с химическим двигателем показали многообещающую применимость во многих областях, таких как восстановление среды, транспортировка и доставка грузов, проникновение в ткани и клетки и активная доставка лекарств в желудок in vivo, их применение в биомедицине часто ограничивается либо присущей токсичностью топлива или его ограниченной доступностью в организме.

В последнее время применение ферментного катализа стало привлекательной альтернативой для замены обычно используемых токсичных видов топлива, поскольку он предлагает уникальные особенности, включая биосовместимость, универсальность и биодоступность топлива. В связи с этим было показано, что применение уреазы, каталазы и глюкозооксидазы увеличивает диффузию наноразмерных частиц при физиологически значимых концентрациях ферментного субстрата.

Кроме того, направленное движение может быть достигнуто при прменении уреазы для приведения в действие полых частиц кварца Янус - то есть частиц с двумя полушариями, в которых только одна из них связана с ферментом. Их движение можно включать и выключать добавлением солей, ингибирующих ферменты, а траектории можно изменять по требованию с помощью приложения магнитного поля, что обеспечивает высокую степень управляемости (Xing MA et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano., 2016, vol. 10(3), pp. 3597-605).

Также было описано применение наномоторов приводимых в двидение ферментом для увеличения эффективности доставки доксорубицина в раковые клетки in vitro (Ana C. et al., “Enzyme-Powered Nanobots Enhance Anticancer Drug Delivery”, Advanced Functional Materials, 2017, vol. 28(25)).

Однако производство сферических частиц Януса включает в себя дорогостоящие и трудоемкие методы, которые могут поставить под угрозу их масштабируемость и, следовательно, их применимость.

Совсем недавно, несмотря на тот факт, что асимметричная структура и распределение катализатора традиционно считались необходимыми для генерации активного движения, было показано самодвижение сферических двигателей, не относящихся к Янус, приводимых в движение ферментным катализом, происходящим на всей поверхность частицы (Patino T. et al., “Influence of Enzyme Quantity and Distribution on the Self-Propulsion of Non-Janus Urease-Powered Micromotors”, J. Am. Chem. Soc., 2018, vol. 140(25), pp. 7896-7903). Однако было показано, что движение наномоторов этого типа чрезвычайно чувствительно к покрытию ферментами. Фактически было обнаружено, что для достижения желаемого движения необходимо большое количество молекул ферментов на наномотор. Это сильно затрудняет применение и применимость этих наномоторов из-за ограничений, которые они накладывают на внешнюю функционализацию.

Таким образом, несмотря на предпринятые до сих пор усилия, все еще существует потребность в наномоторах с ферментным приводом, которые легко производить и адаптировать к различным применениям, сохраняя при этом высокую подвижность.

Краткое описание сущности изобретения

Авторы данного изобретения разработали новые функционализированные наномоторы, приводимые в движение ферментами, которые применимы во множестве биомедицинских, химических и экологических применений.

Неожиданно изобретатели обнаружили, что путем внешнего присоединения молекулы к наномоторам с ферментным двигателем, не относящимся к Янус, они могут поддерживать или даже увеличивать скорость и характер движения частиц (см. Фиг. 2D и Фиг. 7B).

Это было в высшей степени неожиданным, поскольку ранее было показано, что наномоторы, в которых движущие ферменты прикреплены по всей поверхности частицы, имеют движение, сильно зависящее от покрытия ферментами. Следовательно, когда количество ферментов падает ниже заданного порога, было показано, что движение частицы полностью прекращается (Patiño T. et al., выше). Следовательно, было очевидно, что любая модификация, выполненная на поверхности этих частиц, которая обязательно уменьшает доступную поверхность для прикрепления фермента, должна была снизить способность наномотора к перемещению и, следовательно, его применимость.

Как показано в приведенных ниже примерах, изобретатели обнаружили, что внешнее присоединение различных типов объемных молекул, таких как антитела или структуры ДНК, не только не влияет на движение наномоторов, но также увеличивает их способность проникать в клетки, стабильность и препятствует их агрегации. На Фиг. 4 показана более высокая способность наномоторов, функционализированных антителами, проникать в опухолевые клетки, несмотря на отсутствие каких-либо пептидов для проникновения в клетки.

Кроме того, изобретатели неожиданно обнаружили, что представленные в данном документе функционализированные наномоторы, приводимые в действие ферментом, обладают такой сильной активностью, что они способны увеличивать гибель раковых клеток, даже когда они не загружены каким-либо цитотоксическим лекарственным средством (см. Фиг. 4). Это является большим преимуществом, поскольку позволяет разрабатывать противоопухолевые способы лечения с более высокой специфичностью и меньшими побочными эффектами.

Важным преимуществом наномоторов по изобретению является их универсальность - они могут быть сконструированы с применением различных ферментов, чтобы сделать их активными только в тех местах, где присутствует субстрат. Это также дает преимущество, позволяющее разрабатывать способы лечения с высокими специфическими и низкими побочными эффектами.

Ввиду вышеизложенного, наномоторы по изобретению представляют собой очень ценный инструмент, применимый во множестве областей, таких как лечение заболеваний и биодатчики.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к наномотору с ферментным двигателем, содержащим частицу с поверхностью; фермент; и гетерологичную молекулу; отличающемуся тем, что фермент и гетерологичная молекула прикрепляются дискретно по всей поверхности частицы. Изобретение также относится к наномотору с ферментным двигателем, содержащим частицу с поверхностью; фермент; и гетерологичную молекулу; при этом фермент и гетерологичная молекула прикрепляются дискретно по всей поверхности частицы.

Во втором аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество наномотора, как определено в первом аспекте, и фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель.

В третьем аспекте изобретение относится к наномотору, как определено в первом аспекте, или фармацевтической композиции, как определено во втором аспекте, для применения в терапии, диагностике или прогнозировании.

В четвертом аспекте изобретение относится к набору деталей, содержащий наномотор, как определено в первом аспекте, или фармацевтической композиции, как определено во втором аспекте, и, необязательно, инструкции по его применению. Изобретение также относится к набору частей, включающих наномотор, как определено в первом аспекте, или фармацевтической композиции, как определено во втором аспекте, и инструкции по его применению. Набор по изобретению может дополнительно содержать буфер, подходящий для разбавления наномоторов по изобретению, или буфер для ресуспендирования высушенных или лиофилизированных наномоторов по изобретению.

В пятом аспекте изобретение относится к способу обнаружения аналита в изолированном образце in vitro, который включает приведение в контакт наномотора, как определено в первом аспекте, с образцом.

В шестом аспекте изобретение относится к применению наномотора, как определено в первом аспекте, в способе обнаружения аналита в изолированном образце in vitro.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1, относящейся к примеру 1, показано изготовление и характеристика наномоторов уреазы/ПЭГ (MSNP-Ur/ПЭГ) и антитело-модифицированных наномоторов уреазы (MSNP-Ur/ПЭГ-Ат). A) Схема, иллюстрирующая поэтапный процесс изготовления наномоторов.

На Фиг. 2, относящейся к примеру 1, показан анализ движения MSNP-Ur/ПЭГ и MSNP-Ur/ПЭГ-Ат. Типичные отслеживаемые траектории A) наномоторов MSNP-Ur/ПЭГ и B) наномоторов MSNP-Ur/ПЭГ-Ат при 0 мМ, 50 мМ и 100 мМ мочевины и C) Типичные среднеквадратичные смещения (MSD - mean-squared displacements) обоих типов наномоторов при 0 мМ, 50 мМ и 100 мМ. D) Эффективные коэффициенты диффузии, полученные с помощью анализа MSD при различных концентрациях мочевины (N = 20, столбцы ошибок представляют собой SE, p < 0,001).

На Фиг. 3, относящейся к примеру 1, показано влияние наномоторов с антителом и без него на жизнеспособность сфероидов в присутствии различных концентраций мочевины. Количественная оценка жизнеспособности сфероидов после 4-часовой инкубации с MSNP-Ur /ПЭГ (первоначально отмечено синим цветом) и MSNP-Ur/ПЭГ-Ат (первоначально отмечено красным цветом) при различных концентрациях мочевины (N = 3, столбцы ошибок представляют SE).

На Фиг. 4, относящейся к примеру 1, показаны возможности нацеливания и проникновения антитело-модифицированных наномоторов в сфероиды рака мочевого пузыря. Количественная оценка интернализации антитело-модифицированных наномоторов в сфероиды рака мочевого пузыря в присутствии (40 мМ) и в отсутствие мочевины после 4-часовой инкубации и количественная оценка пролиферации сфероидов, инкубированных с MSNP-Ur/ПЭГ и MSNP-Ur/ПЭГ-Ат в течение 4 часов, в присутствии (40 мМ) и отсутствии мочевины в момент после измерения после 48-часового периода покоя.

На Фиг. 5, относящейся к примеру 2, показан подход к изготовлению и характеристика микромоторов ДНК. A) Схематическое изображение изготовления микромоторов, где слой диоксида кремния выращивают на коммерческом шаблоне полистирола путем добавления предшественников диоксида кремния APTES и TEOS. Затем ядро из полистирола удаляют с помощью DMF, а микрокапсулы функционализируют уреазой и каркасом ДНК за счет использования линкера глутаральдегида (GA). B) pH-чувствительный ДНК нанопереключатель гибридизуется с комплементарным каркасом ДНК, которая ковалентно связана с микромотором. Самодвижение достигается за счет преобразования мочевины в аммиак и диоксид углерода, опосредованного ферментом уреазой. C) pH-зависимый переход триплекс-к-дуплекс мономолекулярного ДНК нанопереключателя приводит к изменению эффективности FRET. D) Сканирующая электронная микрофотография микрокапсул SiO_2. На вставке показано увеличение выделенной области. Масштабная шкала = 2 мкм. E) Топографическое изображение, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Калибровочная шкала указывает высоту в мкм. F) Измерения Z-потенциала поверхности микрочастиц в процессе функционализации (NH2 = частицы, покрытые амином, полученные в результате синтеза; GA = микрочастицы после инкубации с глутаральдегидом, UR = функционализированные уреазой микрочастицы; UR + ДНКоц = микрочастицы, функционализированные обеими уреазами и каркасом ДНК; Switch = функционализированные микрочастицы уреазы и каркаса ДНК после их гибридизации с ДНК переключателем в течение 30 мин.)

На Фиг. 6, относящейся к примеру 2, показано, что основанный на триплексе pH-чувствительный ДНК нанопереключатель способен обнаруживать изменения pH в растворе и конъюгирован с микромоторной структурой. A) Триплексный ДНК нанопереключатель образует внутримолекулярную двойную шпилечную структуру за счет образования рН-нечувствительных взаимодействий Уотсона-Крика (пунктирная линия) и рН-чувствительных взаимодействий Хугстина (точки). Триплексный нанопереключатель, содержащий триплеты CGC и TAT, разворачивается в дуплексную конформацию за счет увеличения pH раствора. Ратиометрическое излучение FRET (слева), показывающее переход триплекс-к-дуплекс ДНК нанопереключателя в зависимости от изменений pH в растворе. B) CSLM-анализ эффекта FRET функционализированных микрочастиц ДНК нанопереключателем, показывающий справа налево канал Cy3, канал FRET и значение отношения FRET/Cy3, указанное на калибровочной шкале. Шкала = 2 мкм. Белые стрелки указывают функционализированные микрочастицы (первоначально отмечено красным для канала Cy3, зеленым для канала FRET и желтым для слияния Cy3/FRET). Количественное измерение pH с помощью ДНК-функционализированных микромоторов для pH-чувствительных (C) и неспецифических (D) значений pH, показанных как средние значения эмиссии FRET/Cy3, показанные как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Фиг. 7, относящаяся к примеру 2. А) MSD микромоторов с ДНК переключателем. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. B) Скорость рассчитывается по MSD. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего.

Подробное описание изобретения

Все термины, используемые в данной заявке, если не указано иное, следует понимать в их обычном значении, известном в данной области техники. Другие более конкретные определения некоторых терминов, используемых в данной заявке, изложены ниже и предназначены для единообразного применения во всем описании и формуле изобретения, если иное четко сформулированное определение не обеспечивает более широкое определение.

Используемые в данном документе формы единственного числа являются синонимами «по меньшей мере один» или «один или несколько». Если не указано иное, определенные артикли, используемые в данном документе, включают также формы множественного числа.

Термин «наномотор, приводимы в движение ферментом» или «наномотор с ферментным двигателем» относится к молекулярному устройству в микро- или наномасштабе, способному преобразовывать химическую энергию в движение за счет действия фермента, расположенного на поверхности устройства. Другими словами, наномотор - это наночастица или микрочастица, внешне функционализированная ферментами. Не будучи связанными теорией, ферменты генерируют движение за счет асимметричного высвобождения продуктов, участвующих в каталитической реакции, создавая межфазные силы в зависимости от осмотических градиентов, зарядов или других свойств. Термины «наномотор» и «микромотор» используются в данной заявке взаимозаменяемо.

Используемый в данном документе термин «гетерологичная молекула» относится к любой молекуле, отличной от фермента(ов), указанного фермента(ов), отвечающего за движение наномотора, и которая прикрепляется дискретно по всей поверхности частицы. Таким образом, варианты осуществления данного изобретения позволяют иммобилизовать практически любой тип молекулы, которая может быть связана с частицей, на поверхности посредством ее прямого или косвенного соединения с частицей.

Приведенный ниже список гетерологичных молекул следует рассматривать просто как иллюстративный и неограничивающий список молекул, которые могут быть применены в наномоторах по изобретению. Однако варианты осуществления данного изобретения не ограничиваются этим и охватывают любую гетерологичную молекулу, которая может быть связана прямо или косвенно с наномотором согласно вариантам осуществления данного изобретения.

Представляющая интерес гетерологичная молекула может быть выбрана среди маркеров, таких как флуоресцентные маркеры, т.е. флуорофор, например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC) и другие изотиоцианаты; N-гидроксисукцинимид (NHS) флуоресцеин и другие сукцинимидиловые эфиры; флуоресцеин-5-малеимид и другие активируемые малеимидом флуорофоры; цианиновые флуорофоры; флуорофоры флуроэсцеина; флуорофоры родамина; красители ATTO; красители DyLight Fluor; красители Alexa Fluor; и бор-дипиррометеновые (BODIPY) красители. Дополнительные примеры включают изотопные метки или маркеры, хемилюминесцентные маркеры, рентгеноконтрастные маркеры и т. д. В таком случае наномотор можно применять в качестве тестовой молекулы, чтобы обеспечить обнаружение с помощью маркера наномотора на поверхности.

Дополнительные примеры гетерологичных молекул включают молекулы клеточной адгезии и прикрепления клеток, такие молекулы клеточной адгезии (CAM), включая суперсемейство иммуноглобулинов (Ig), интегрины, кадгерины и селектины.

Еще одним примером гетерологичной молекулы являются молекулы внеклеточного матрикса (ЕСМ), включая, например, протеогликаны (PG), гликозаминогликаны (ГАГ), гепарансульфат (HS), хондроитинсульфаты, кератинсульфаты, коллаген, эластины и т. д.

Родственный тип представляющих интерес молекул - это молекулы базальной мембраны, которые включают молекулы базальной мембраны, которая представляет собой слой ECM, секретируемый эпителиальными клетками. Неограничивающие примеры таких молекул базальной мембраны включают ламинин, коллаген IV типа, энтактин и перлекан.

Еще одним примером интересующей гетерологичной молекулы является противовоспалительная молекула, такая как кортикостероиды; глюкокортикоиды; нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), такие как ацетилсалициловая кислота, изобутилпропановая фенольная кислота и напроксен натрия (INN); липоксины; антагонист рецептора интерлейкина-1 (ИЛ-1RA); и т.п.

Антибиотики также можно применять в качестве представляющих интерес гетерологичных молекул для подавления роста бактерий или уничтожения бактерий. Неограничивающие примеры антибиотиков включают пенициллины; цефалоспорины; полимиксины; рифамицины; липиармицины; хинолоны; сульфаниламиды; макролиды; линкозамиды; тетрацилины; бактерицидные аминогликозиды; циклические липопептиды, такие как даптомицин; глицилцилины, такие как тигециклин; оксазолидоны, такие как линезолид; и липиармицины, такие как фидаксомицин.

Подобным образом молекулы, нацеленные на другие типы микробов, такие как противогрибковые молекулы, например, полиеновые противогрибковые средства, такие как амфотерицин B, кандицидин, филипин, хамицин, натамицин, нистатин и римоцидин; азольные противогрибковые средства, такие как имидазолы, например, бифоназол, бутоконазол, клотримазол, эконазол, фентиконазол, изоконазол, миконазол, омоконазол, оксиконазол, сертаконазол, сульконазол и тиоконазол; триазолы, например, албаконазол, флуконазол, изавуконазол, итраконазол, позаконазол, равуконазол, терконазол и вориконазол; и тиазолы, например, абафунгин; аллиламины, такие как аморолфин, бутенафин, нафтифин и тербинафин; эхинокандины, такие как анидулафунгин, каспофунгин и микафунгин; бензойная кислота; циклопироксоламин; флуцитозин; гризеофульвин; толнафтат и ундециленовая кислота. Также противовирусные молекулы, например, антиидиотипические антитела к белку, поддерживаемому вирусом (VAP); амантадин; римантадин; плеконарил; ацикловир; зидовудин (AZT); ламивудин; интеграза; фомивирсен; рифампицин; занамивир и осельтамивир, а также антипаразитарные молекулы, такие как мебендазол; пирантела памоат; тиабендазол; диэтилкарбамазин; ивермектрин; никлозамид; празиквантел; альбендазол; празиквантел; рифампицин; амфотерицин B; мелароспрол; эльфорнитин; метронидазол; тинидазол и милтефозин могут быть применены в качестве представляющих интерес гетерологичных молекул.

Другой пример гетерологичных молекул включает факторы роста, такие как аденомедуллин (AM), ангиопоэтин (Ang), фактор аутокринной подвижности, костные морфогенетические белки (BMP), нейтрофический фактор головного мозга (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), эритропоэтин (EPO), фактор роста фибробластов (FGF), нейтрофический фактор линии глиальных клеток (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор дифференцировки роста-9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста гепатомы (HDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), мистатин (GDF-8), фактор роста нервов (NGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), тромбопоэтин (TPO), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста плаценты (PIGF) и т. д. Наномотор с фактором роста, связанным с пептидом, связывающимся с поверхностью, можно применять для обеспечения поверхности, например, со способностью стимулировать рост, пролиферацию и/или дифференцировку клеток.

Дополнительные примеры представляющих интерес гетерологичных молекул включают ингибиторы роста клеток и химиотерапевтические агенты. Такой тип гетерологичных молекул при включении в наномотор будет обеспечивать эффект локального ингибирования роста клеток. Неограничивающие примеры таких представляющих интерес гетерологичных молекул включают ингибиторы фарнезилтрансферазы; алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты, например, мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид и бусульфан; нитрозомочевины, например, N-нитрозо-N-метилмочевина (MNU), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (MeCCNU), фотемустин и стрептозотоцин; тетразины, например, дакарбазин, митозоломид и темозоломид, и азиридины, например, тиотепа, митомицин, диазиквон (AZQ); и цисплатины, например, цисплатин, карбоплатин и оксаплатин; антиметаболиты, такие как антифолаты, например, метотрексат и пеметрексед; флуропиримидины, например, фторурацил и капецитабин; аналоги деоцинуклеозидов, такие как цитарабин, гемцитабин, децитабин, видаза, флударабин, неларабин, кладрибин, клофарабин и пентостатин; и тиопурины, например, тигуанин и меркаптопурин; антимикротрубочковые агенты, такие как алкалоиды барвинка, например, винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин и винфлунин; и таксаны, например, паклитаксел и доцетаксел; и подофиллотксин; ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, каптотецин, этопозид, доксорубицин, митоксантрон, тенипозид, новобиоцин, мербарон и акларубицин; цитотоксические антибиотики, такие как антрациклины, например, доксорубицин, дауморубицин, эпирубицин, идарубицин, пирарубицин, акларубицин, митоксантрон, актиномицин, блеомицин, пликамицин и митомицин.

Другие группы представляющих интерес гетерологичных молекул включают полинуклеотиды, такие как молекулы ДНК или РНК. Гетерологичная молекула также может быть наносенсором или молекулярными воротами.

«Дискретно прикрепляется по всей поверхности» относится к дискретному распределению, которое не ограничивается одной гранью или полусферой частицы, то есть относится к неполярному распределению. Однако это не означает, что молекула покрывает всю поверхность частицы однородным образом. Частицы по данному изобретению могут представлять молекулы, присоединенные извне, образующие дискретные участки по всей поверхности частицы, или, что то же самое, представлять собой промежутки, в которых молекулы не прикреплены.

Используемый в данном документе термин «нацеливающая молекула» относится к молекуле, обладающей специфичностью в отношении конкретной клетки, ткани или органа. Предпочтительные примеры нацеливающих молекул включают, но не ограничиваются ими, антитела, факторы роста и полисахариды.

Используемый в данном документе термин «наносенсор» относится к любому нано- или микромасштабному чувствительному устройству. Наносенсоры по данному изобретению способны обнаруживать изменения в окружающей среде, в которой они расположены, и реагировать на них. В частности, наносенсоры по изобретению могут быть нанопереключателями, которые представляют собой наносенсоры, способные переключаться между двумя различными формами. ДНК нанопереключатели содержат одноцепочечную молекулу ДНК с конформацией, которая изменяется в ответ на изменение окружающей среды, например, изменение pH. Молекула ДНК может быть связана с флуоресцентными молекулами, которые позволяют обнаруживать конформационные изменения.

Используемый в данном документе термин «меченая молекула» относится к молекуле, которая может быть химически связана с наномотором, и которая излучает обнаруживаемый сигнал, позволяющий обнаруживать наномотор. Особенно предпочтительные примеры мечения молекул включают, но не ограничиваются ими, хемилюминесцентные молекулы, флуоресцентные молекулы и изотопы.

Используемый в данном документе термин «молекулярные ворота» или «наноклапан» относится к молекулярной системе в нано- или микромасштабе, которая переключается между первой закрытой формой и второй открытой формой в ответ на выбранный триггер, такой как свет, температура, магнитные поля и pH. Закрытая форма предназначена для блокирования высвобождения груза, содержащегося в частице, к которой прикреплены молекулярные ворота. При нажатии на спусковой крючок ворота принимают открытую форму, позволяющую выпускать груз.

«Противораковое антитело» относится к антителу, способному останавливать или устранять раковые клетки.

Как упоминалось выше, первый аспект изобретения относится к наномотору с ферментным двигателем, внешне функционализированному гетерологичной молекулой.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, частица представляет собой наночастицу или микрочастицу. Используемый в данном документе термин «наночастица» относится к частице, имеющей по меньшей мере два измерения в наномасштабе, в частности, со всеми тремя измерениями в наномасштабе. По аналогии, термин «микрочастица», используемый в данном документе, относится к частице, имеющей по меньшей мере два измерения в микромасштабе, в частности, со всеми тремя измерениями в микромасштабе. В конкретном варианте осуществления данного изобретения размер частицы составляет от 1 нм до 100 мкм. В частности, от 30 нм до 2 мкм. Более конкретно, от 100 нм до 1 мкм. Даже более конкретно, от 400 нм до 600 нм.

Что касается формы наночастиц или микрочастиц, описанных в данном документе, они включают сферы, многогранные и стержневые формы. В частности, когда наночастица или микрочастица, по существу, имеет форму стержня с по существу круглым поперечным сечением, например, нанопроволока или нанотрубка, микропровод или микротрубка, «наночастица» или «микрочастица» относится к частице, имеющей по меньшей мере два измерения в наномасштабе или микромасштабе, эти два измерения являются поперечным сечением наночастицы или микрочастицы.

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, частица является сферической.

Используемый в данном документе термин «размер» относится к характерному физическому размеру. Например, в случае наночастицы/микрочастицы, которая является по существу сферической, размер наночастицы/микрочастицы соответствует диаметру наночастицы/микрочастицы. Когда говорят о наборе наночастиц/микрочастиц как имеющем конкретный размер, предполагается, что набор может иметь распределение размеров около указанного размера. Таким образом, как используется в данном документе, размер набора наночастиц/микрочастиц может относиться к режиму распределения размеров, например, к размеру пика распределения размеров. Кроме того, если диаметр не является идеально сферическим, это эквивалентный диаметр сферического тела, включая объект. Этот диаметр обычно называют «гидродинамическим диаметром», измерения которого можно проводить с помощью прибора Wyatt Mobius, соединенного с системой повышения давления в ячейках Atlas или Malvern. Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM - Transmission Electron Microscopy) или сканирующей электронной микроскопии (SEM - Scanning Electron Microscopy), также дают информацию о диаметрах.

Специалисту доступны самые разные материалы частиц, и он поймет, что выбор материала будет зависеть от предполагаемого применения наномотора, например, наномоторы для терапевтического применения должны быть изготовлены с биосовместимыми частицами.

Таким образом, в конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, частица изготовлена из материала, выбранного из группы, состоящей из металла, оксида металла, полимера, липида, белка, клеточной мембраны, тела клетки, углеродистого материала и их смесей. В конкретном варианте осуществления данного изобретения, металл представляет собой алюминий (Al), платину (Pt), палладий (Pd) или магний (Mg). В конкретном варианте осуществления данного изобретения, оксид металла выбран из диоксида кремния (SiO₂), оксида марганца (MnO₂) и оксида титана (TiO₂). В конкретном варианте осуществления данного изобретения, полимер представляет собой каркас из полистирола или органических органических соединений. В конкретном варианте осуществления данного изобретения, углеродный материал выбран из углерода, графена и фуллерена. В варианте осуществления данного изобретения, материал частицы представляет собой полимерсому. В варианте осуществления частицы, частица представляет собой частицу на основе белка (протеиносома). В конкретном варианте осуществления данного изобретения, тело клетки представляет собой тромбоцит или эритроцит (RBC - red blood cell).

Термин «металлический органический каркас» или «MOF» относится к соединениям, содержащим ионы металлов или кластеры, координированные с органическими лигандами. Центральный элемент металла может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из цинка (Zn), кобальта (Co), кадмия (Cd), никеля (Ni), марганца (Mn), хрома (Cr), меди (Cu), лантана (La), железа (Fe), платина (Pt), палладия (Pd), серебра (Ag), золота (Au), родия (Rh), иридия (Ir), рутения (Ru), свинеца (Pb), олова (Sn), алюминия (Al), титана (Ti), молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V), ниобия (Nb), тантала (Ta), скандия (Sc), иттрия (Y), галлия (Ga), германия (Ge), индия (In), висмута (Bi), селена (Se) и сурьмы (Sb). Органический лиганд может включать функциональную группу, которая может связываться по меньшей мере с двумя ионами металла.

«Клеточная мембрана» относится к липидному бислою, который образует непрерывный барьер вокруг клеток. Частицы по данному изобретению могут быть образованы мембранами прокариотических или эукариотических клеток.

Используемый в данном документе термин «тело клетки» относится к части клетки, которая содержит генетический материал, окруженный цитоплазмой и плазматической мембраной.

Термин «полимерсома» относится к искусственным везикулам, сделанным из амфифильных синтетических блок-сополимеров,

Термин «протеиносома» относится к частицам, состоящим из самоорганизующихся белков или конъюгатов белок-полимер.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, частица изготовлена из мезопористого диоксида кремния. Используемый в данном документе термин «мезопористый диоксид кремния» относится к пористому диоксиду кремния, имеющему регулярно расположенные поры среднего размера, в частности, размер пор составляет от 2 нм до 50 нм, а более конкретно, от 4 нм до около 40 нм.

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, фермент выбран из группы, состоящей из оксидоредуктазы, гидролазы и лиазы. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, фермент выбран из группы, состоящей из глюкозооксидазы, уреазы, каталазы, глутаматоксидазы, ксантиноксидазы, пероксидазы, билирубиноксидазы, липазы, протеазы и их комбинаций. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, фермент представляет собой уреазу. Термин уреаза (EC 3.5.1.5) относится к группе ферментов, которые катализируют гидролиз мочевины до диоксида углерода и аммиака. В конкретном варианте осуществления данного изобретения уреаза происходит из Canavalia ensiformis (номер CAS 9002-13-5). В более конкретном варианте осуществления данного изобретения это уреаза типа IX из Canavalia ensiformis (номер CAS 9002-13-5). Последовательность фермента можно найти в различных базах данных, например в Uniprot (P07374 UREA_CANEN, обновление 01/02/1994).

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, гетерологичная молекула выбрана из группы, состоящей из нацеливающей молекулы, меченной молекулы, наносенсора и молекулярных ворот.

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, гетерологичная молекула представляет собой антитело. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, антитело представляет собой противораковое антитело. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, противораковое антитело связывает мембранный рецептор. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, мембранный рецептор представляет собой FGFR (рецептор фактора роста фибробластов), выбранный из группы, состоящей из FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, FGFR представляет собой FGFR3.

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, гетерологичная молекула представляет собой наносенсор. Существует множество наносенсоров, доступных для специалистов в данной области техники (Campuzano S. et al., “Motion-driven sensing and biosensing using electrochemically propelled nanomotors”, Analyst. 2011, vol. 36(22), pp. 4621-30). В конкретном варианте осуществления данного изобретения, наносенсор представляет собой ДНК нанопереключатель. ДНК нанопереключатели представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из одноцепочечной молекулы ДНК, связанной с парой флуорофор-гаситель. В конкретном варианте осуществления данного изобретения, последовательность молекулы ДНК нанопереключателя составляет по меньшей мере 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % или 100 % идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, наносенсор представляет собой наночастицу. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, наносенсор представляет собой наночастицу металла. В частности, наночастица металла представляет собой наночастицу золота (Au). Специалисты в данной области техники поймут, что наночастица, образующая наносенсор, должна быть меньше наночастицы или микрочастицы, образующей наномотор.

В данном изобретении термин «идентичность» относится к проценту остатков, которые идентичны в двух последовательностях, когда последовательности оптимально выровнены. Если при оптимальном выравнивании положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, последовательности проявляют идентичность по отношению к этому положению. Уровень идентичности между двумя последовательностями (или «процент идентичности последовательностей») измеряется как отношение количества идентичных положений, разделяемых последовательностями, по отношению к размеру последовательностей (т. е. процент идентичности последовательностей = (количество идентичных положений / общее количество положений) х 100).

Известен ряд математических алгоритмов для быстрого получения оптимального выравнивания и вычисления идентичности между двумя или более последовательностями, которые включены в ряд доступных программ. Примеры таких программ включают, среди прочего, программы MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA и ROBUST для анализа аминокислотной последовательности. Предпочтительные программы анализа программного обеспечения включают программы ALIGN, CLUSTAL W и BLAST (например, BLAST 2.1, BL2SEQ и их более поздние версии).

Для анализа аминокислотной последовательности весовая матрица, такая как матрицы BLOSUM (например, матрицы BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62 и BLOSUM80), матрицы Гонне или матрицы PAM (например, PAM30, PAM70, PAM120, PAM160, PAM250, и матрицы PAM350), используются для определения идентичности.

Программы BLAST обеспечивают анализ по меньшей мере двух аминокислотных последовательностей либо путем выравнивания выбранной последовательности с несколькими последовательностями в базе данных (например, GenSeq), либо, с помощью BL2SEQ, между двумя выбранными последовательностями. Программы BLAST предпочтительно модифицируются программами фильтрации низкой сложности, такими как программы DUST или SEG, которые предпочтительно интегрированы в операции программы BLAST. Если используются издержки существования гэпа (или оценки гэпа), стоимость существования гэпа предпочтительно устанавливается в диапазоне между около -5 до -15. Аналогичные параметры гэпа могут быть использованы с другими программами по мере необходимости. Программы BLAST и лежащие в их основе принципы дополнительно описаны, например, в Altschul et al., “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410.

Для анализа множественных последовательностей можно использовать программу CLUSTAL W. Желательно, чтобы программа CLUSTAL W запускалась с использованием «динамических» (а не «быстрых») настроек. Аминокислотные последовательности оценивают с использованием переменного набора матриц BLOSUM в зависимости от уровня идентичности между последовательностями. Программа CLUSTAL W и основные принципы работы дополнительно описаны, например, в работе Higgins et al., “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8(2), pages 189-191.

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, наномотор дополнительно содержит груз. В конкретном варианте осуществления данного изобретения, груз выбран из списка, состоящего из лекарства, при этом лекарство выбрано из группы, состоящей из небольшой молекулы, нуклеиновой кислоты, терапевтического фермента, пептида, белка или гормона. Под «грузом» понимается любая молекула, транспортируемая внутри наномотора, для доставки к желаемой цели. В зависимости от материала поверхности и пористости частицы груз может находиться внутри частицы или адсорбироваться на ее поверхности.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, лекарственное средство представляет собой цитотоксическое лекарственное средство. Более конкретно, это противоопухолевый препарат.

В конкретном варианте осуществления первого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, фермент и гетерологичная молекула прикреплены к поверхности частицы непосредственно или через линкер. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения, линкер выбран из группы, состоящей из ангидридов, спиртов, кислот, аминов, эпоксидов, изоцианатов, силанов, галогенированных групп и полимеризуемых групп, предпочтительно 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES). В еще более конкретном варианте осуществления данного изобретения, линкер представляет собой глутаральдегид.

В таком аспекте одна часть линкера связана с поверхностью частицы, а другая часть линкера связана с ферментом или гетерологичной молекулой, тем самым образуя ковалентную связь между ферментом или гетерологичной молекулой и поверхностью. Связь между линкером и указанной поверхностью и указанным ферментом или гетерологичной молекулой осуществляется химическими реакциями, происходящими между линкером и ферментом или гетерологичной молекулой, тем самым обеспечивая ковалентную связь между поверхностью и указанным ферментом или гетерологичной молекулой. В одном варианте осуществления данного изобретения, фермент и/или гетерологичная молекула прикрепляется к поверхности частицы после химической предварительной обработки указанной поверхности частицы.

Как упомянуто выше, во втором аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество наномотора первого аспекта и фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель.

Выражение «терапевтически эффективное количество», используемое в данном документе, относится к количеству наномотора, которое при введении является достаточным для предотвращения развития или облегчения до некоторой степени одного или более симптомов заболевания или расстройства, на которые направлено лечение. Конкретная доза агента, вводимого в соответствии с данным изобретением, конечно, будет определяться конкретными обстоятельствами, окружающими случай, включая вводимый наномотор, путь введения, конкретное состояние, которое лечат, и подобные соображения.

Выражение «фармацевтическая композиция» охватывает как композиции, предназначенные для человека, так и для животных, не относящихся к человеку (т.е. ветеринарные композиции).

Выражение «фармацевтически приемлемые носители или наполнители» относится к фармацевтически приемлемым материалам, композициям или носителям. Каждый компонент должен быть фармацевтически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами фармацевтической композиции. Он также должен подходить для применения в контакте с тканями или органами людей и животных, отличных от человека, без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции, иммуногенности или других проблем или осложнений, соизмеримых с разумным соотношением польза/риск.

Примерами подходящих фармацевтически приемлемых наполнителей являются растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие носители, дисперсионные или суспензионные добавки, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загустители или эмульгирующие агенты, консерванты, твердые связующие, смазывающие вещества и тому подобное. За исключением случаев, когда любая обычная среда наполнителя несовместима с веществом или его производными, например, вызывая какой-либо нежелательный биологический эффект или иным образом отрицательно взаимодействуя с любым другим компонентом(ами) фармацевтической композиции, предполагается, что ее применение находится в пределах объем данного изобретения.

Относительные количества наномотора, фармацевтически приемлемых наполнителей и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции по изобретению будут варьироваться в зависимости от идентичности, размера и/или состояния субъекта, подлежащего лечению, и, кроме того, в зависимости от пути введения, при помощи которого композиция должна быть введена.

Фармацевтически приемлемые наполнители, применяемые при производстве фармацевтических композиций, включают, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие агенты, поверхностно-активные агенты и/или эмульгаторы, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, консерванты, буферные агенты, смазывающие агенты, и/или масла. Согласно суждению специалиста, в композиции могут присутствовать наполнители, такие как красители, покрывающие вещества, подсластители и ароматизаторы.

Фармацевтические композиции, содержащие наномотор по изобретению, могут быть представлены в любой лекарственной форме, например, твердой или жидкой, и могут вводиться любым подходящим путем, например, пероральным, парентеральным, ректальным, местным, интраназальным или сублингвальным путем, для которых они будут содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, необходимые для приготовления желаемой лекарственной формы, например, составов для местного применения (мази, кремы, липогель, гидрогель и т.д.), глазные капли, аэрозольные спреи, растворы для инъекций, осмотические насосы и т. д.

Примеры разбавителей включают, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, дикальцийфосфат, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, фосфат натрия, лактозу, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозит, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, сахарная пудра и их комбинации.

Примеры гранулирующих и/или диспергирующих агентов включают, но не ограничиваются ими, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, крахмал тапиоки, натрия крахмалагликолят, глины, альгиновую кислоту, гуаровую камедь, целлюлозу цитрусовых, агар, бентонит, целлюлозу и изделия из древесины, натуральную губку, катионообменные смолы, карбонат кальция, силикаты, карбонат натрия, поперечно-сшитый поливинилпирролидон) (кросповидон), карбоксиметилкрахмал натрия (натрийгликолят крахмала), карбоксиметилцеллюлоза, поперечно-сшитая натрий карбоксиметилцеллюлоза (кроскармеллоза), метилцеллюлоза, прежелатинизированный крахмал (крахмал 1500), микрокристаллический крахмал, водонерастворимый крахмал, карбоксиметилцеллюлоза кальция, силикат магния и алюминия (Veegum), лаурилсульфат натрия, соединения четвертичного аммония и их комбинации.

Примеры связывающих наполнителей включают, но не ограничиваются ими, крахмал (например, кукурузный крахмал и крахмальную пасту); желатин; сахара (например, сахароза, глюкоза, декстроза, декстрин, патока, лактоза, лактит, маннит); натуральные и синтетические камеди (например, гуммиарабик, альгинат натрия, экстракт ирландского мха, панварская камедь, камедь гхатти, слизь из шелухи изапола, карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, ацетат целлюлозы, поливинилпирролидон), алюмосиликат магния (Veegum) и арабогалактан лиственницы); альгинаты; полиэтиленоксид; полиэтиленгликоль; неорганические соли кальция; кремниевая кислота; полиметакрилаты; воски; вода; алкоголь; и их комбинации.

Примеры консервантов могут включать антиоксиданты, хелатирующие агенты, противомикробные консерванты, противогрибковые консерванты, спиртовые консерванты, кислые консерванты и другие консерванты. Примеры антиоксидантов включают, но не ограничиваются ими, альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, аскорбилстеарат, аскорбилолеат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, монотиоглицерин, метабисульфит калия, пропионовую кислоту, пропилгаллат, аскорбинат натрия, бисульфит натрия, метабисульфит натрия и сульфит натрия. Примеры хелатирующих агентов включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), моногидрат лимонной кислоты, динатрий эдетат, дикалия эдетат, эдетовую кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, фосфорную кислоту, эдетат натрия, винную кислоту и тринатрийэдетат.

Примеры буферных агентов включают, но не ограничиваются ими, цитратные буферные растворы, ацетатные буферные растворы, фосфатные буферные растворы, хлорид аммония, карбонат кальция, хлорид кальция, цитрат кальция, глубионат кальция, глюцепат кальция, глюконат кальция, D-глюконовая кислота, кальций глицерофосфат, лактат кальция, пропановая кислота, левулинат кальция, пентановая кислота, двухосновный фосфат кальция, фосфорная кислота, трехосновный фосфат кальция, фосфат гидроксида кальция, ацетат калия, хлорид калия, глюконат калия, смеси калия, двухосновный фосфат калия, одноосновный фосфат калия, смеси фосфата калия, ацетат натрия, бикарбонат натрия, хлорид натрия, цитрат натрия, лактат натрия, двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, смеси фосфата натрия, трометамин, гидроксид магния, гидроксид алюминия, альгиновая кислота, апирогенная вода, изотонический солевой раствор, раствор Рингера раствор, этиловый спирт и их комбинации.

Примеры смазывающих агентов включают, но не ограничиваются ими, стеарат магния, стеарат кальция, стеариновую кислоту, диоксид кремния, тальк, солод, глицерилбеганат, гидрогенизированные растительные масла, полиэтиленгликоль, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, лаурилсульфат магния, лаурилсульфат натрия и их комбинации.

Как упоминалось ранее, изобретение также относится к третьему аспекту наномотора или фармацевтической композиции по изобретению для применения в терапии, диагностике или прогнозировании.

Наномоторы, приводимые в движение уреазой, способны перемещаться не только в жидких средах, таких как моча, но также и в вязких средах, таких как гиалуроновая кислота. Более того, они также активны в слизистых выделениях. Следовательно, наномоторы по изобретению можно применять как в жидких, так и в вязких тканях, например, в водянистой влаге глаза.

В конкретном варианте осуществления третьего аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, наномотор первого аспекта или фармацевтическая композиция второго аспекта предназначены для применения при лечении рака.

Этот вариант осуществления данного изобретения также может быть сформулирован как применение наномотора первого аспекта или фармацевтической композиции второго аспекта для производства лекарственного средства для лечения и/или предотвращения рака. Этот аспект также может быть сформулирован как способ лечения и/или профилактики рака, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества наномотора первого аспекта или фармацевтической композиции второго аспекта нуждающемуся в этом субъекту.

Иллюстративные неограничивающие примеры рака, который можно подвергаются лечению с помощью наномотора или фармацевтической композиции по изобретению, включают, хотя они не ограничиваются ими, папилломы, аденомы, липомы, остеомы, миомы, ангиомы, невусы, зрелые тератомы, карциномы, саркомы, незрелые тератомы, меланому, миелому, лейкемию, лимфому Ходжкина, базалиому, спиналиому, рак груди, рак яичников, рак матки, рак мочевого пузыря, рак легких, рак бронхов, рак простаты, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак почки, рак пищевода, гепатокарциному, рак головы и шеи и т.д. В конкретном варианте осуществления третьего аспекта рак представляет собой рак мочевого пузыря.

Из предоставленных в данном документе данных специалистам в данной области техники должно быть понятно, что наномоторы и фармацевтические композиции по изобретению также могут быть пригодны при лечении других заболеваний, таких как метаболические, неврологические и воспалительные заболевания.

Как упомянуто выше, в пятом аспекте изобретение относится к способу обнаружения аналита в выделенном образце in vitro, который включает приведение в контакт наномотора, как определено в первом аспекте, с образцом. Специалисты в данной области техники поймут, что наномоторы по изобретению могут быть адаптированы для обнаружения различных аналитов посредством их функционализации с помощью датчиков указанных аналитов.

В конкретном варианте осуществления пятого аспекта, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, образец представляет собой биологически выделенный образец. Более конкретно, биологически выделенный образец представляет собой кровь, плазму или сыворотку.

Как упомянуто выше, в шестом аспекте изобретение относится к применению наномотора, как определено в первом аспекте, в способе обнаружения аналита в выделенном образце in vitro.

В конкретном варианте осуществления пятого или шестого аспектов, необязательно в комбинации с любым из вариантов осуществления данного изобретения, приведенных выше или ниже, образец представляет собой жидкий образец. Как упоминалось ранее, наномоторы изобретателей способны перемещаться в жидкостях с различной степенью вязкости. Например, они могут перемещаться в моче, кинематическая вязкость которой составляет: 1,0700 сСт при 20 °C (измерено Inman et al., “The impact of temperature and urinary constituents on urine viscosity and its relevance to bladder hyperthermia treatment”, Int J Hyperthermia, 2013, vol. 29(3), pp. 206-10), и гиалуроновой кислоте в концентрации, обнаруженной в синовиальной жидкости (1 мг/мл, около 10-2 Па*с для диапазона от 1 до 10 Гц скорости сдвига, измеренной реометром).

Наномоторы по изобретению особенно полезны для обнаружения широкого спектра аналитов, таких как загрязнители или биомаркеры.

В описании и формуле изобретения слово «содержать» и варианты этого слова не предназначены для исключения других технических характеристик, добавок, компонентов или этапов. Кроме того, слово «содержать» охватывает случай «состоящий из». Дополнительные цели, преимущества и особенности изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после изучения описания или могут быть изучены при практическом применении изобретения. Следующие ниже примеры и графические материалы предоставлены для иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения. Обозначения, относящиеся к графическим материалам и помещенные в скобки в формуле изобретения, предназначены исключительно для попытки повысить понятность формулы изобретения и не должны толковаться как ограничивающие объем формулы изобретения. Кроме того, данное изобретение охватывает все возможные комбинации конкретных и предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения, описанных в данном документе.

Примеры

1. Нацеливание на 3D сфероиды рака мочевого пузыря с помощью наномоторов, с уреазным двигателем

1.1. Способы

Материалы

Этанол (EtOH, 99 %), метанол (MeOH, 99 %), соляная кислота (37 % в воде), гидроксид аммония (25 % в воде), тетраэтилортосиликат (TEOS, 99 %), триэтаноламин (TEOA, 99 %), бромид цетилтриметиламмония (CTAB, 99 %), 3-аминопропилтриэтоксисилан (APTES, 99 %), глутаральдегид (GA - glutaraldehyde, 25 % в воде), уреаза (из Canavalia ensiformis, тип IX, порошок, 50000 - 100000 единиц/г твердого вещества), Набор для определения активности уреазы (Sigma-Aldrich), мочевина (99,9 %), глицерин (99 %), порошок боргидрида натрия (NaBH₄, 98,0 %), раствор формальдегида (37 % в воде), бычий сывороточный альбумин (лиофилизированный порошок), раствор 4-нитрофенола (10 мМ), хлорид натрия Puriss. (NaCl), безводный хлорид калия (KCI), одноосновный фосфат натрия (NaH₂PO₄), бикарбонат натрия BioXtra (99,5-100,5 %, NaHCO₃), диметилсульфоксид (DMSO - dimethyl sulfoxide, 99,9 %) и HS-PEG5K-NH₂ (HCl соль) были приобретены у Sigma-Aldrich. Pierce™. Набор для анализа белка BCA, агглютинин зародышей пшеницы (конъюгат WGA AlexaFluor™ 647), конъюгат козьих антител против мышиного IgG (H+L) Alexa FluorTM 488, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT) и фосфатный буферный раствор (PBS - phosphate buffer saline) были приобретены у Thermo Fisher Scientific. Основная матрица Matrigel™ была приобретена у Corning. Анти-FGFR3 антитело (ab89660) было приобретено у Abcam. Hoechst 33342 было приобретено у Life Sciences. Предварительно обработанные диализные трубки Spectra/Por® 7 Standard RC (3,5 кДа) были приобретены у Spectrum. Сложный эфир Cyanine3 NHS был приобретен у Lumiprobe. Среда МакКоя (McCoy) 5A (модифицированная), раствор пенициллина и стрептомицина, фетальная бычья сыворотка (FBS - Fetal Bovine Serum) и трипсин 0,5 % EDTA были приобретены у Gibco. Набор жизнеспособность/цитотоксичность LIVE/DEAD™ был приобретен у Invitrogen. Клетки RT4 папилломы переходных клеток мочевого пузыря человека были получены от ATCC (Роквиль, Массачусетс).

Инструменты

Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM), получали с помощью микроскопа JEOL JEM-2100. Изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), получали с помощью FEI NOVA NanoSEM 230 при 10 кВ. Измерения гидродинамических радиусов и электрофоретической подвижности выполнялись с применением прибора Wyatt Möbius, соединенного с системой повышения давления в ячейке Atlas. Анализ Брунауэра-Эммета-Теллера (BET - Brunauer-Emmett-Teller analysis) проводили с применением автоматического анализатора Micromeritics Tristar II Plus. Оптическое видео, а также формирования изображение для культивирования клеток проводили с применением инвертированного оптический микроскопа (Leica DMi8), оснащенным иммерсионным объективом 63^х, гальваническим столиком и фильтрующими блоками для FITC, родамина, DAPI и Cy5. Количественный анализ белка и анализ ферментативной активности проводили с применением многомодового микропланшетного ридера Infinite M200 PRO. Конфокальный микроскопический анализ был выполнен с применением LSM 800 - Zeiss, оснащенного иммерсионным масляным объективом 63^x.

Синтез мезопористых наночастиц диоксида кремния (MSNP - Mesoporous Silica Nanoparticles): MSNP получали с примеением золь-гель метода. Вкратце, раствор, содержащий CTAB (570 мг), TEOA (35 г) и воду (20 мл), нагревали до 95 °C на бане с силиконовым маслом. Эту смесь перемешивали в течение 30 минут, а затем по каплям добавляли TEOS (1,5 мл). Смесь дополнительно перемешивали при 95 °C в течение 2 часов. Полученные частицы собирали центрифугированием и промывали этанолом (3 раза, 1350 g, 10 минут). Затем частицы суспендировали в смеси MeOH:HCl (30 мл, 10:0,6) и кипятили с обратным холодильником при 80 °C в течение 24 часов для удаления CTAB из пор MSNP. Наконец, частицы собирают центрифугированием и промывают этанолом (3 раза, 1350 g, 10 минут), обрабатывают ультразвуком 20 минут между каждым центрифугированием. Аликвоты (0,5 мл) собирали, центрифугировали и сушили на воздухе для определения концентрации суспензии MSNP.

Функционализация MSNP амином (MSNP-NH2): синтезированные ранее MSNP суспендировали в EtOH (2 мг/мл). Затем к суспензии добавляли APTES (10 мкл/мг MSNP) и встряхивали в течение 24 часов при комнатной температуре с помощью встряхивающего устройства для встряхивания. Наконец, частицы собирали центрифугированием и промывали этанолом (3 раза, 1350 g 10 минут) и водой (3 раза, 1928 g 10 минут), обрабатывали ультразвуком 20 минут между каждым центрифугированием. Аликвоты (0,5 мл) собирали, центрифугировали и сушили на воздухе для определения концентрации суспензии MSNP. Функционализация MSNP-NH₂ уреазой и гетеробифункциональным H₂ N-PEG-SH (MSNP-Ur/ПЕГ): MSNP-NH2 центрифугировали при 1340 g в течение 10 минут, суспендировали в 900 мкл PBS (2 мг/мл) и обработали ультразвуком в течение 20 минут. После этого добавляли 100 мкл глутаральдегида и смесь встряхивали в течение 30 секунд для получения хорошей дисперсии. Смесь помещали на непрерывный роторный встряхиватель для встряхивания на 2,5 часа при комнатной температуре. Затем наночастицы собирали и трижды промывали PBS (1340 g, 10 минут) и обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут между каждой промывкой. Затем GA-активированные наночастицы суспендировали в растворе PBS, содержащем уреазу (3 мг/мл) и H₂ N-PEG-SH (1 мкг/мг MSNP-NH2). Затем смесь помещали на непрерывный роторный встряхиватель для встряхивания на ночь при комнатной температуре. Полученные наномоторы трижды промывали PBS центрифугированием (1340 g, 10 минут), интеркалируя промывки с 3-минутной обработкой ультразвуком.

Функционализация наномоторов ПЕГилированной уреазы анти-FGFR3 антителом (MSNP-Ur/ПЕГ-Ат): наномоторы суспендировали в PBS (2 мг/мл) и добавляли анти-FGFR3 антитело (30 мкг антитела на мг наномоторов). Затем смесь инкубировали в течение ночи на роторном шейкере при комнатной температуре. Наконец, наномоторы, модифицированные антителами, собирали центрифугированием (1340 g, 10 минут) и трижды промывали PBS, интеркалируя промывки с 3-минутной обработкой ультразвуком. Анализ гидродинамических радиусов и поверхностного заряда: для определения распределения размеров и поверхностного заряда MSNP, MSNP-NH2, MSNP-Ur/ПЕГ и MSNP-Ur/ПЕГ-Ат применяли DLS Wyatt Mobius, соединенный с компенсатором давления ATLAS. В оборудовании используется лазер с длиной волны 532 нм и угол обнаружения 163,5°. Проанализированные образцы разбавляли до концентрации 0,3 мг/мл и анализировали на светорассеяние и электрофоретическую подвижность одновременно, со временем сбора данных 5 секунд, выполняя 3 цикла на измерение. Для получения релевантных статистических данных было выполнено 9 измерений.

Количественная оценка количества уреазы и антител на MSNP: Концентрацию уреазы, присутствующей на MSNP-Ur/ПЕГ, измеряли с помощью набора для анализа белков BCA от Thermo Fisher Scientific в соответствии с инструкциями производителя. Этот набор коррелирует количество белков с восстановлением меди пептидными связями. Эту же процедуру повторяли для MSNP-Ur/ПЕГ-Ат, чтобы количественно определить количество антитела, связанного с наномоторами.

Анализ уреазной активности: ферментативную активность уреазы, связанной с MSNP, оценивали с применением коммерческого набора, который определяет концентрацию аммиака, генерируемого способом Бертло (Patton, C. J. et al., “Spectrophotometric and Kinetics Investigation of the Berthelot Reaction for the Determination of Ammonia”, Anal. Chem., 1977, vol. 49, pp. 464-469). Концентрация наномоторов составляла 0,5 мг/мл, и эксперимент проводился в соответствии с инструкциями производителя.

Мечение уреазы с помощью Cy3: уреазу (22 мг) растворяли в 1 мл буфера бикарбоната натрия (100 мМ). Затем к раствору уреазы добавляли 7 мкл раствора Cy 3 в DMSO (5 мМ) и смесь инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре и встряхивании в темноте. Затем раствор меченой уреазы подвергали диализу (мембрана с размером пор 3,5 кДа) в течение 24 часов для удаления непрореагировавших молекул Cy3.

Количественная оценка производства аммиака с помощью MSNP-Ur/ПЕГ: Количество аммиака, производимого наномоторами, определяли с применением способа титрования. Для этого наномоторы инкубировали с различными концентрациями мочевины (12,5, 25, 50, 100, 200 и 300 мМ), и образцы анализировали в разные моменты времени (5, 15, 60, 120, 240 минут и через 24 часа). В каждый момент времени суспензии наномоторов центрифугировали и супернатант титровали HCl (10 мМ), используя p- нитрофенол в качестве индикатора.

Оптическая Видеозапись наномоторов и MSD анализ: инверсионный микроскоп оснащенный иммерсинным объективом 63^х был использован для наблюдения и записи видео движения наномоторов. Образцы водных растворов моделированной мочи, содержащие наномоторы, помещали на предметное стекло и хорошо перемешивали с моделированной мочой в диапазоне концентраций мочевины (12,5, 25, 50, 100, 200 и 300 мМ). Затем образцы покрывали предметным стеклом, чтобы избежать артефактов, вызванных смещением, и записывали видео продолжительностью 30 секунд. Видео были сняты с помощью камеры Hamamatsu с частотой кадров 50 кадров в секунду в ярком поле. Для каждого условия анализируется не менее 20 наномоторов. Видео были проанализированы с использованием кода на основе Python для получения траекторий наномоторов и вычисления среднего квадрата смещения (MSD) следующим образом:

После этого был получен коэффициент диффузии (D_e) путем подгонки данных MSD к уравнению 2, которое справедливо для коротких интервалов времени для малых частиц с низкой вращательной диффузией. 3D-культура клеток: клетки переходной клеточной папилломы мочевого пузыря человека RT4 культивировали в среде МакКоя 5A (модифицированная), дополненной FBS (10 %) и раствором пенициллина-стрептомицина (1 %), при 37 °C и в атмосфере 5 % CO₂. Клетки разделяли каждые 4 дня в соотношении 1:2. Для получения 3D культур клеток RT4 8-луночные чашки ibidi были предварительно покрыты 23 мкл Matrigel™ (5 мг/мл) и инкубированы при 37 °C в течение 30 минут, давая возможность гелю сформироваться. Затем 30 мкл суспензии клеток RT4 с плотностью 5 × 10⁶ клеток/мл равномерно распределяли в каждой лунке, и чашки инкубировали в течение 30 минут при 37 °C. Наконец, добавляли 150 мкл среды RT4 МакКоя, содержащей 10 % Matrigel™. Перед экспериментами культурам позволяли расти в течение 7 дней, меняя среду каждые 2 дня.

Иммуноокрашивание трансмембранного белка FGFR3 в 3D культурах клеток RT4: 3D культуры, описанные выше, промывали 3 раза с помощью PBS 1x. Затем поверхность лунок осторожно царапали кончиком пипетки и культуру суспендировали в среде МакКоя в пробирке. Пробирки недолго вращали и супернатант удаляли. Затем клетки суспендировали в формальдегиде (3,7 %), помещали в 8-луночный планшет и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого культуру промывали 1 раз PBS, добавляли раствор PBS-BSA (5 %) и чашку инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре. Затем к культуре добавляли анти-FGFR3 в пропорции 1:50, и чашку инкубировали в течение 24 часов при 37 °C в атмосфере 5 % CO_2. После этого культуру промывали 3 раза PBS 1x, добавляли вторичное антитело (меченное AlexaFluor 488) в пропорции 1:500 и инкубировали чашку в течение 40 минут при комнатной температуре в темноте. Наконец, культуру промывали 3 раза PBS 1x, ядра метили Hoescht и добавляли раствор глицерина в PBS (70 %). Культуру наблюдали с помощью конфокальной микроскопии.

Анализы цитотоксичности: Жизнеспособность 3D культур RT4 количественно оценивали с помощью анализа Alamar Blue и визуализировали с помощью набора для определения жизнеспособности LIVE/DEAD в соответствии с инструкциями производителя. Для этого клетки RT4 культивировали, как указано выше, и на 7 день инкубировали с каждой обработкой - аммиак (1 мМ, 1,5 мМ, 3 мМ, 5 мМ, 10 мМ и 20 мМ, в течение 24 часов), мочевина (25 мМ, 30 мМ, 40 мМ и 50 мМ, в течение 24 часов), MSNP-Ur/ПЕГ (12,5 мкг/мл, в диапазоне концентраций мочевины - 25 мМ, 30 мМ, 40 мМ и 50 мМ, для 1, 2 и 4 часов). После этого культуры промывали средой, оставляли в покое в течение 24 часов и исследовали жизнеспособность в соответствии с инструкциями производителя.

Кроме того, жизнеспособность также оценивалась через 48 часов.

Визуализация 3D культур RT4 и наномоторов: на 7 день 3D культуры клеток инкубировали с каждой обработкой (MSNP-Ur/ПЕГ или MSNP-Ur/ПЕГ-Ат, 12,5 мкг/мл) в течение 4 часов. В каждый момент времени культуры промывали и выдерживали при 37 °C и в атмосфере 5 % CO₂ в течение 24 часов. Затем культуры были помечены WGA 647 (мембраны) и визуализированы с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа, оборудованного объективом 63x и гальваническим столиком, а также фильтрующими блоками для родамина, FITC, DAPI и Cy5.

1.2. Результаты и обсуждение

Полностью мезопористые наночастицы диоксида кремния (MSNP - mesoporous silica nanoparticles) были получены с применением золь-гелевой химии, где бромид цетилтриметиламмония (CTAB - cetyltrimethylammonium bromide) использовался в качестве порогенного агента, а триэтаноламин (TEOA - triethanolamine) использовался в качестве основного катализатора. Полученные MSNP были охарактеризованы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). SEM анализ показал хорошую монодисперсность образца (индекс полидисперсности = 0,114) и средний диаметр 481 ± 2 нм (N = 150, средний размер ± стандартная ошибка среднего (SE)). Кроме того, пористая структура MSNP была оценена с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Явная радиальная пористость была подтверждена TEM. Эта кристаллическая конфигурация была дополнительно подтверждена с помощью быстрого преобразования Фурье, которое указывало на периодичность пористого паттерна. Площадь поверхности наночастиц изучалась путем адсорбции/десорбции азота с применением метода анализа Брунауэра-Эммета-Теллера (BET). MSNP показали изотерму типа IV, типичную для мезопористых структур диоксида кремния, и удельную поверхность по BET 1184,8 м²/г со средним размером пор 2 нм.

Затем полученные частицы функционализировали аминогруппами с применением аминопропилтриэтоксисилана (APTES). Аминогруппы на поверхности MSNP позже активируются глутаральдегидом (GA), который действует как линкер между частицей и молекулами уреазы и гетеробифункционального полиэтиленгликоля (ПЕГ) (Фиг. 1A). Концевая тиоловая группа ПЭГ позволяет связывать нацеливающий фрагмент, антифибробластный фактор роста 3 (анти-FGFR3).

За этапами функционализации следовали динамическое рассеяние света (DLS - dynamic light scattering) и анализ электрофоретической подвижности для получения гидродинамических радиусов и поверхностного заряда, соответственно. DLS-анализ как синтезированных MSNP показал широкий пик, свидетельствующий о наличии агрегатов в суспензии. Анализ электрофоретической подвижности MSNP показал поверхностный заряд -26,81 ± 0,35 мВ (N = 9, среднее ± SE), типичный для наночастиц диоксида кремния. Об успешной функционализации аминами свидетельствует выраженное изменение заряда поверхности до строго положительного значения (33,6 ± 1,0 мМ, N = 9, среднее ± SE), характерного для присутствия свободных аминогрупп на поверхности. Гидродинамические радиусы функционализированных амином MSNP (MSNP-NH2) указывают на более острый пик, который может быть следствием стабилизации частиц как поверхностным зарядом, так и химией поверхности.

Последующий этап функционализации касался связывания как фермента уреазы, так и гетеробифункционального ПЭГ. Обычно ПЕГ используется как спейсер или как средство предотвращения агрегации в суспензии, создавая стерические препятствия между частицами. Мы подтвердили это влияние на коллоидную стабильность MSNP-Ur/ПЕГ с помощью DLS-анализа, где наблюдался резкий одиночный пик популяции. Кроме того, молекулы ПЭГ обеспечивали конъюгацию антител с наночастицами за счет связывания свободной тиоловой группы на внешнем конце ПЭГ с остатками цистеина антител. Этот подход обеспечивает большую специфичность связывания антител IgG из-за высокого содержания остатков цистеина, присутствующих в константном участке тяжелой цепи (Фиг. 1 A). Конъюгация MSNP-Ur/ПЕГ с анти-FGFR3 антителом (MSNP-Ur/ПЕГ-Ат) также была проанализирована с помощью DLS, и наблюдаемый одиночный пик показал, что присутствие антитела не влияет на стабильность частиц в растворе. Мы подтвердили присутствие уреазы, а также антитела на поверхности MSNP, используя набор, который определяет количество белков на основе восстановления меди пептидными связями белков, и оценили ферментативную активность уреазы при связывании с наномоторами.

Уреаза, присутствующая на поверхности MSNP-Ur/ПЕГ и MSNP-Ur/ПЕГ-Ат, обеспечивает биокаталитическое превращение мочевины в аммиак и диоксид углерода, следуя уравнению:

(NH₂)₂CO + H₂O → CO₂ + 2 NH₃

Обычно геометрическая асимметрия индуцируется на микро-/наноструктурах (например, частицах Януса) для достижения асимметричной генерации сил, что является важным требованием для создания движения при низком числе Рейнольдса. Однако недавно было сообщено, что для двигателей, приводимых в движение посредством биокаталитического преобразования, молекулярное несбалансированное распределение ферментов является достаточным для создания асимметрии, необходимой для создания чистого движения. Тем не менее, это предыдущее исследование проводилось для двигателей микронного размера. Наномоторы MSNP-Ur/ПЕГ и MSNP-Ur/ПЕГ-Ат, о которых сообщалось в этой работе, основаны на такой внутренней асимметрии для самодвижения в наномасштабных двигателях. Профили движения MSNP-Ur/ПЕГ и MSNP-Ur/ПЕГ-Ат оценивали в присутствии диапазона концентраций мочевины (0 мМ, 12,5 мМ, 25 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 200 мМ и 300 мМ) в смоделированной моче. Был использован метод оптического отслеживания для получения отслеживаемых траекторий наномоторов (Фиг. 2A и B), которые затем использовались для расчета среднеквадратичного смещения (MSD). На Фиг. 2C показаны типичные MSD наномоторов уреазы/ПЭГ и наномоторов, модифицированных антителами, в моделируемой моче. Мы заметили, что MSD линейно увеличивается со временем, что характерно для диффузионного движения, и получили эффективный коэффициент диффузии для каждого данного условия, подгоняя MSD к следующему уравнению:

MSD (Δt) = 4 D_e Δt,

где D_e представляет собой эффективный коэффициент диффузии, а Δt представляет собой временной интервал.

На Фиг. 2D показаны рассчитанные эффективные коэффициенты диффузии как для MSNP-Ur/ПЕГ, так и для MSNP-Ur/ПЕГ-Ат, что свидетельствует о том, что значительное увеличение диффузии было достигнуто при концентрации мочевины 50 мМ (p <0,001). Коэффициент диффузии дополнительно увеличивался с увеличением концентрации мочевины в смоделированной моче, достигая плато. Увеличение диффузии по сравнению с увеличением концентрации мочевины может быть связано с кинетикой Михаэлиса-Ментен фермента уреазы, которая подчиняется следующему уравнению:

где V_max представляет собой максимальную скорость реакции, S представляет собой концентрацию субстрата, а K_m представляет собой константу Михаэлиса-Ментен. Как показано на Фиг. 2D, не было обнаружено значительных различий между профилями движения MSNP-Ur/ПЕГ и MSNP-Ur/ПЕГ-Ат, что указывает на то, что присутствие этого нацеленного фрагмента не препятствует движению наномоторов.

Мы изучали in vitro биосовместимость субстрата, необходимого для движения наномоторов (мочевина), и побочного продукта биокатализа (аммиак) с применением 3D (сфероидов) клеток переходной клеточной папилломы мочевого пузыря человека RT4. Сфероиды были получены путем посева клеток RT4 в чашки, покрытые Matrigel™, который напоминает внеклеточный матрикс и обеспечивает 3D для роста клеток. Затем культурам давали возможность размножаться в течение 7 дней, и каждый день контролировали рост сфероидов. Затем было исследовано влияние диапазона концентраций мочевины (0 мМ, 25 мМ, 50 мМ и 100 мМ) и аммиака (0 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ и 50 мМ), инкубируя сфероиды в течение 24 часов в каждом состоянии. После этого культуры промывали средой и оценивали жизнеспособность и пролиферацию клеток с помощью анализа Alamar Blue. Этот анализ основан на восстановлении резазурина во флуоресцентное соединение резоруфина с помощью метаболически активных клеток.

Мочевина продемонстрировала хорошую биосовместимость, не влияя на жизнеспособность сфероидов даже при самых высоких концентрациях, которые мы исследовали, в то время как аммиак показал тенденцию к увеличению цитотоксичности с увеличением концентрации. Тем не менее сфероиды оставались жизнеспособными (> 70% жизнеспособности) при всех протестированных концентрациях аммиака.

Далее была исследована жизнеспособность сфероидов при воздействии наномоторов (MSNP-Ur/ПЕГ) при различных концентрациях мочевины и в различные периоды инкубации. Сфероиды инкубировали с 12,5 мкг/мл наномоторов без покрытия или наномоторов, модифицированных антителами, при 0 мМ, 25 мМ, 30 мМ и 40 мМ мочевины в течение 1,2 и 4 часов. Затем культуры тщательно промывали средой для удаления наномоторов и некатализированной мочевины и выдерживали в течение 24 часов перед анализом. Влияние наномоторов на жизнеспособность сфероидов рака мочевого пузыря было визуализировано с помощью набора для определения жизнеспособности LIVE/DEAD® и количественно определено с помощью анализа Alamar Blue (Фиг. 3). Было замечено, что наномоторы не были токсичными в отсутствие мочевины, что указывает на хорошую биосовместимость шасси наномоторов (мезопористый диоксид кремния, тип MCM-41), а также ПЕГ и фермента. При наличии возрастающих концентраций мочевины цитотоксический эффект отмечается для обоих наномоторов, он более выражен для наномоторов, модифицированных антителами (Фиг. 3). Токсичность, наблюдаемая для наномоторов без покрытия, связана с образованием аммиака в результате биокаталитического преобразования мочевины. Однако более высокий цитотоксический эффект, подтвержденный для наномоторов, несущих антитело, может быть результатом взаимодействия между анти-FGFR3 и антигеном, присутствующим на мембранах сфероидов. Сообщалось, что взаимодействие между этими частями блокирует путь передачи сигналов FGF, который участвует в росте и пролиферации клеток.

Чтобы лучше понять вклад аммиака в цитотоксический эффект, наблюдаемый на сфероидах, была изучена эффективная концентрация аммиака, производимого наномоторами в течение определенных периодов времени при различных концентрациях мочевины. 12,5 мкг/мл наномоторов инкубировали с диапазоном концентраций мочевины (0 мМ, 12,5 мМ, 25 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 200 мМ и 300 мМ) и использовали p- нитрофенол в качестве индикатора pH. Поскольку преобразование мочевины в аммиак и диоксид углерода с помощью наномоторов вызывает резкое повышение pH, раствор, содержащий наномоторы, становится желтым из-за присутствия p-нитрофенола и может быть титрован HCI для количественного определения количества присутствующего аммиака в соответствии со следующим уравнением:

NH₃ + HCI → NH₄CI

Было обнаружено, что при этой концентрации наномоторов максимальный выход аммиака составил 17 мМ, что оказалось биосовместимым со сфероидами рака мочевого пузыря (жизнеспособность > 70 % для 20 мМ аммиака). Тем не менее, при инкубации с наномоторами и мочевиной наблюдаемый цитотоксический эффект сильнее, чем со свободным аммиаком. Этот результат может быть результатом производства локально более высокой концентрации аммиака наномоторами в непосредственной близости от сфероидов, что приводит к более высокой цитотоксичности.

Принимая во внимание улучшенные диффузионные возможности и биосовместимость наномоторов, впоследствии была исследована их способность нацеливаться и проникать в сфероиды рака мочевого пузыря (Фиг. 4). Во-первых, была подтверждена экспрессия целевого антигена (FGFR3) на поверхности сфероидов рака мочевого пузыря с помощью иммуноцитохимии, метода, используемого для визуального определения местоположения определенных белков в образце с помощью флуоресцентно меченых антител. Иммуноцитохимия сфероида рака мочевого пузыря показала зеленую флуоресценцию на клеточных мембранах, подтверждающую присутствие трансмембранного белка FGFR3, а синий цвет представляет собой ядра клеток, меченные Hoechst.

Затем была исследована способность наномоторов проникать в сфероиды рака мочевого пузыря и влияние присутствия нацеливающего фрагмента на эффективность интернализации. Кроме того, было оценено влияние активного движения на эффективность интернализации путем инкубации сфероидов с наномоторами без покрытия или наномоторами, модифицированными антителами, в присутствии 40 мМ мочевины. Для этого уреаза была помечена флуоресцентным маркером Cyanine3 (Cy3) перед ее функционализацией на MSNP-NH2, чтобы точно локализовать наномоторы с помощью флуоресцентной микроскопии. Затем наномоторы были функционализированы как чистой уреазой, так и меченой уреазой (5 %), и было подтверждено, что способность к движению сохраняется, несмотря на присутствие меченого фермента. Затем 3D-культуры инкубировали с 12,5 мкг/мл MSNP-Ur/ПЕГ-АТ или MSNP-Ur/ПЕГ в качестве отрицательного контроля для нацеливания в течение 4 часов в отсутствие и в присутствии мочевины (40 мМ). После этого культуры промывали, клеточные мембраны метили агглютинином зародышей пшеницы (WGA - wheat germ agglutinin). Количественная оценка интенсивности флуоресценции Cy3 в сфероидах (50-100 пм в диаметре) показала, что активные моторы демонстрируют в три раза более высокую эффективность интернализации, чем в отсутствие мочевины, что может быть связано с движущей силой, создаваемой активным движением. Кроме того, в присутствии мочевины наномоторы, модифицированные антителами, демонстрируют в четыре раза более высокую эффективность интернализации, чем наномоторы без антител (Фиг. 4). Это может быть связано с тем, что, когда наномотор активно движется, вероятность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью выше, чем когда имеет место только броуновская диффузия. В нашем случае наномотор с 40 мМ мочевины покрывает на 53 % больше площади за одну секунду, чем наномотор, просто испытывающий броуновскую диффузию, о чем свидетельствуют MSD, что увеличивает шансы антитела приводить в контакт с антигеном и проникать в сфероид.

Учитывая, что используемое антитело блокирует сигнальный путь клеток FGF при связывании с антигеном, было дополнительно исследовано потенциальное терапевтическое действие наномоторов, модифицированных антителами, путем анализа пролиферации клеток (вставка на Фиг. 4). Для этого сфероиды рака мочевого пузыря инкубировали с MSNP-Ur/ПЕГ-АТ в течение 4 часов с мочевиной и без нее, используя наномоторы без антител в качестве контроля. После этого сфероиды промывали для удаления некатализированной мочевины и неинтернализованных наномоторов, и после 48-часового периода покоя измеряли пролиферацию с применением анализа Alamar Blue. Было замечено, что сфероиды, инкубированные с наномоторами без покрытия (без антител), сохраняли уровни жизнеспособности, наблюдаемые через 24 часа, тогда как сфероиды, инкубированные с наномоторами, модифицированными антителами, снижали жизнеспособность, указывая на то, что пролиферация клеток была остановлена. Эти результаты указывают на применимость наномоторов, несущих анти-FGFR3 антитело, в качестве инструментов для направленной терапии рака мочевого пузыря.

1.3. Выводы

Были разработаны наномоторы, приводимые в движение уреазой, содержащие ПЭГ, в которых ПЭГ действует как стерическое препятствие для предотвращения агрегации, и как линкер для соединения специфических антител к раку мочевого пузыря на поверхности наномоторов (анти-FGFR3). Наномоторы, с антителами и без них, обеспечивают усиленную диффузию в смоделированной моче при различных концентрациях мочевины, обнаруженной в мочевом пузыре, что позволяет применять их в биомедицинских приложениях в этом органе. I была продемонстрирована субстрат-зависимая индуцированная токсичность этих ферментных наномоторов с применением сфероидов, полученных из клеток рака мочевого пузыря (3D-культуры), которые, как считается, лучше имитируют среду опухоли по сравнению с обычными 2D-культурами. Явления интернализации наблюдались в период времени, аналогичный интервалам опорожнения мочевого пузыря, и наблюдалось, что активное движение увеличивает в 3 раза проникновение наномоторов. Более того, активные наномоторы, модифицированные антителами, показали в 4 раза более высокую эффективность интернализации, чем активные наномоторы без антитела, что отражает влияние на самодвижение и нацеливание на способность активных частиц проникать в сфероиды. Исследования пролиферации клеток на сфероидах показали, что наномоторы-мишени вызывают более высокую потерю жизнеспособности, чем наномоторы без покрытия (без антител), что указывает на терапевтический эффект анти-FGFR3, который может возникать как в результате подавления пролиферации клеток, так и в результате более высокой скорости интернализации наномотора. Эти результаты указывают на потенциал таких наномоторов, модифицированных антителами, в качестве инструментов в целевой терапии рака мочевого пузыря, поскольку нацеливающие способности частиц усиливаются при активном движении, что приводит к улучшению терапевтического эффекта анти-FGFR3 антитела.

2. Микромоторы с ферментным двигателем, модифицированные ДНК нанопереключателями для локального мониторинга pH

2.1. Материалы и методы

Химические реактивы

Немодифицированные и меченные флуорофором ДНК-олигонуклеотиды были синтезированы и очищены (очистка ВЭЖХ (HPLC)) с помощью IBA GmBH (Геттинген, Германия) и применены без дополнительной очистки. Последовательности конструкций ДНК представлены ниже.

Последовательности ДНК

pH-чувствительный ДНК нанопереключатель

5’-TCCTTGTCTGTCTGTCTGTC TTTTTT GAAGAAGGAA TTT (Cy3) A TTCCTTCTTC GTTTG CTTCTTCCTT (Cy5) - 3’

Аминомодифицированный ДНК-каркас

5’-GACAGACAGACAGACAAGGA - NH₂ - 3’

Переключатель управления

5’-TCC TTG TCTGTC TGT CTG TC T(Cy3) GAACG TTTTT CGTTC (Cy5)

Имя SEQ ID Последовательность нанопереключатель SEQ ID NO: 1 TCCTTGTCTGTCTGTCTGTCTTTTTTGAAGAAGGAATT TATTCCTTCTTCGTTTGCTTCTTCCTT каркас SEQ ID NO: 2 GACAGACAGACAGACAAGGA - NH₂ Переключатель управления SEQ ID NO: 3 TCCTTGTCTGTCTGTCTGTCTGAACGTTTTTCGTTC

Для всех вышеперечисленных последовательностей основания, выделенные жирным шрифтом, представляют петлю для дуплексной части, а подчеркнутые основания представляют петлю для параллельного триплексного участка. И pH-чувствительный ДНК нанопереключатель, и переключатель контроля имеют часть (здесь выделена курсивом), которая полностью комплементарна (20 оснований) амино-модифицированному каркасу ДНК.

Условия буфера

Все олигомеры ДНК хранили (100 мкл) в 1x PBS.

Измерения флуоресценции

Измерения флуоресценции проводили на флуориметре Cary Eclipse (Varian), задавая длину волны возбуждения λ_ex = 530 нм (щель_ex = 5 нм) и собирая данные между 540 и 700 нм (щель_em = 5 нм) с применением кварцевых кювет уменьшенного объема (100 мкл). Все измерения проводились при Т = 25 °C в 10 мМ HEPES. Переключатели сначала разводили в HEPES 10 мМ в концентрации 1 мкМ. Этот исходный раствор затем разбавляли до 20 нМ в том же буфере, pH которого был доведен до желаемого значения (pH от 5,0 до 9,0).

Анализ данных флуоресценции

Логометрический FRET рассчитывается следующим образом:

Где F_Cy5 представляет собой максимальное флуоресцентное излучение Cy5 (λ_em = 670 нм), а F_Cy3 представляет собой максимальное флуоресцентное излучение Cy3 (λ_em = 570 нм). Кривые рН титрования получали путем построения графика Rat. FRET в сравнении концентрации ионов гидроксония и подгонка данных следующим уравнением типа Ленгмюра:

Где Rat.FRET_{триплекс} и Rat.FRET_{дуплекс} представляют собой сигнал FRET переключателя в триплексном состоянии (закрытом) и дуплексном состоянии (открытом), соответственно, и где [H ⁺] представляет общую концентрацию ионов водорода, а K_A^app наблюдаемая кислотная константа переключателя.

Изготовление микрокапсул

Коммерческие частицы размером 2 мкм на основе полистирола (PS - polystyrene) (Sigma-Aldrich, кат. № 78452) были использованы для изготовления оболочки из диоксида кремния с помощью ранее описанного метода совместной конденсации (Ref. Ma Xing ACS Nano 2016). Вкратце, 250 мкл частиц полистирола (исходный раствор, 10 % твердых веществ) смешивали с 0,5 мл 99 % этанола (Panreac Applichem, кат. № 131086-1214), 0,4 мл воды Milli-Q и 25 мкл гидроксида аммония (Sigma-Aldrich, кат. № 221228). Смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ) в течение 5 минут. Затем к раствору добавляли 2,5 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) 99 % (Sigma-Aldrich, кат. № 440140), который инкубировали в течение 6 часов при перемешивании и при КТ. Затем добавляли 7,5 мкл тетраэтилортосиликата (TEOS) ≥99 % (Sigma-Aldrich, кат. № 86578), и полученной смеси давали прореагировать в течение ночи при КТ при магнитном перемешивании. Полученные микрочастицы, состоящие из полистирола, покрытого оболочкой из диоксида кремния, трижды промывали в этаноле центрифугированием при 3500 об/мин в течение 3,5 мин. Затем полистирольную сердцевину удаляли путем инкубации частиц путем проведения 4 промывок в диметилформамиде (DMF) ≥99,8 % (№ по кат. Acros Organics 423640010) в течение 15 минут. Полученные микрокапсулы трижды промывали этанолом и хранили при комнатной температуре до применения. Для определения размера и морфологии микрокапсул были выполнены сканирующая электронная микроскопия (SEM) (FEI NOVA NanoSEM 230) и просвечивающая электронная микроскопия.

Функционализация уреазы и ДНК нанопереключателя

Полые микрокапсулы из диоксида кремния функционализировали уреазой, чтобы обеспечить им самодвижение. Для этого микрокапсулы SiO2 трижды промывали Milli-Q путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 3,5 мин. После этого были выполнены еще три промывки в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH = 7,4) (№ по кат. Thermo Fischer Scientific 70011-036). Затем микрокапсулы суспендировали в 2,5 % (мас.) растворе глутаральдегида в PBS (Sigma-Aldrich, кат. № G6257) и оставляли при КТ на 3 часа при перемешивание с перемещением смеси от одного конца барабана к другому. GA-функционализированные частицы промывали 3 раза в PBS 1x и суспендировали в растворе, содержащем 200 мкг/мл уреазы из Canavalia ensiformis (Jack bean) (Sigma-Aldrich, кат. № U4002) и 1 мкМ ДНК-каркаса в PBS. Полученный раствор выдерживали при перемещении смеси от одного конца барабана к другому в течение 2 часов. Затем проводили три промывки в PBS и функционализированные частицы хранили при 4 °C до их применения.

Анализ движения

Микромоторы регистрировались в течение 20 с со скоростью 25 кадров в секунду под инвертированным оптическим микроскопом (Leica DMi8), оснащенным водно-иммерсионным объективом 63x и камерой Hammamatsu. Для каждого условия было зарегистрировано не менее 15 частиц. Траектории микромоторов были проанализированы с помощью специального кода на основе Phyton, который позволил рассчитать MSD и скорость моторов, применив следующее уравнение:

MSD(∆t) =< (x_i(t + ∆t) - x_i(t))² >. (1)

Подгоняя MSD к уравнению 1, была получена скорость.

Измерение активности уреазы

Ферментативную активность измеряли с помощью набора для определения активности уреазы (Sigma-Aldrich), который основан на методе Бартелота, колориметрическом анализе для измерения выработки аммиака по активности уреазы в соответствии с инструкциями производителя. Сначала микромоторы инкубировали со 100 мМ мочевины. Затем в разные моменты времени ферментативная реакция останавливалась в соответствии с инструкциями производителя. Впоследствии, чтобы избежать вмешательства частиц в измерения, образцы центрифугировали в течение 3,5 мин при 3500 об/мин. От каждого образца собирали супернатанты и измеряли оптическую плотность при 670 нм для определения активности уреазы.

2.2. Результаты и обсуждение

Полые микрокапсулы из диоксида кремния с аминогруппами на поверхности были синтезированы в соответствии с ранее описанным методом совместной конденсации (Ma, X. et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano, 2016, vol. 10(3), pp. 3597-3605), основанный на выращивании оболочки SiO₂ на коммерческих микрочастицах полистирола Ø 2 мкм с использованием 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) и тетраэтилортосиликата (TEOS) в качестве предшественников диоксида кремния с последующим удалением полистирольного ядра диметилформамидом, как показано на Фиг. 5A.

Уреазу ковалентно конъюгировали с поверхностью микромотора с применением глутаральдегида (GA) в качестве линкера, как описано в Примере 1. На этом этапе также была конъюгирована амино-модифицированная одноцепочечная ДНК (ДНКоц, 20 оснований), которая служила якорным фрагментом для pH-чувствительного ДНК нанопереключателя (Фиг. 5B). На Фиг. 5C схематически представлена стратегия измерения pH, основанная на открытом/закрытом состояниях ДНК нанопереключателя, что приводит к низкой или высокой эффективности FRET, соответственно. Полученные полые микрокапсулы исследовали с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (SEM и TEM, соответственно). На Фиг. 5D показана микрофотография, сделанная с помощью SEM, на которой можно наблюдать микрокапсулы с очень монодисперсным размером (2,04 ± 0,06 мкм, среднее ± стандартная ошибка среднего) и шероховатой поверхностью. Микрокапсулы имели отверстие на своей поверхности, вероятно, из-за близости частиц во время роста оболочки диоксида кремния, как сообщалось ранее, что обеспечивает структурную асимметрию. На Фиг. 5E показано топографическое изображение, полученное с помощью TEM, где различные псевдо-цвета указывают высоту в мкм.

Процесс функционализации характеризовался измерением ζ-потенциала микрочастиц после каждого этапа (Фиг. 5F). Во-первых, микрокапсулы имели положительно заряженную поверхность из-за присутствия аминогрупп, которая затем была сдвинута на отрицательно заряженную из-за модификации с GA. После добавления уреазы поверхностные заряды немного уменьшились. Функционализация как уреазой, так и ДНКоц (UR + ДНКоц) также приводила к снижению ζ-потенциала по отношению к GA.

Наконец, микрочастицы инкубировали в фосфатно-солевом буфере (PBS - phosphate buffered saline), содержащем ДНК нанопереключатель (т.е. 1 мкМ). 15-минутной инкубации нанопереключателя с двигателями, конъюгированными с ферментом/якорной цепью, было достаточно для функционализации частиц диоксида кремния с помощью чувствительного к pH нанопереключателя. Следует отметить, что переключатель представляет собой фланкирующий хвост длиной 20 оснований на 5'-конце последовательности, комплементарной ДНК, ковалентно конъюгированной с микрокапсулой диоксида кремния. В результате конъюгации было измерено дальнейшее уменьшение поверхностных зарядов, и подтверждает эффективную функционализацию мотора с помощью переключателя. Также примечательно, что применяемый в данном документе pH-чувствительной ДНК нанопереключатель представляет собой образующую триплекс одноцепочечную ДНК, содержащую внутримолекулярную шпильку ДНК, стабилизированную как взаимодействиями Уотсона-Крика, так и параллельными взаимодействиями Хугстина. В то время как взаимодействия Уотсона-Крика (W-C) фактически нечувствительны к рН, взаимодействия Хугстина демонстрируют сильную и программируемую зависимость от рН (Фиг. 6А). Помечая нанопереключатель парой FRET, мы можем контролировать pH-зависимый переход триплекса в дуплекс, который можно применять для определения pH раствора в непосредственной близости от микромоторов. Более конкретно, флуорофор Cyanine-3 (Cy3) является внутренне конъюгированным в петле дуплекса ДНК шпильки, а флуорофор Cyanine-5 (Cy5) связан с 3'-концом части ДНК, образующей триплекс.

Анализы флуоресценции, выполняемые при фиксированной концентрации (например, 50 нМ) ДНК переключателя путем изменения pH буферного раствора во флуоресцентной микрокювете (100 мкл раствора), четко показывают изменения эффективности FRET в зависимости от pH. Как и ожидалось, при кислых значениях pH предпочтительна внутримолекулярная триплексная структура и наблюдается высокая эффективность FRET (Cy3 и Cy5 находятся в непосредственной близости). По мере увеличения pH раствора триплексная структура дестабилизируется, и наблюдается постепенное уменьшение сигнала FRET из-за перехода (разворачивания) из триплекса в дуплекс (Фиг. 6А). Следует отметить, что применяемые в данном документе флуорофоры нечувствительны к pH в исследованном диапазоне pH (от pH 5,0 до pH 9,5), чтобы избежать каких-либо помех сигналу. Важно отметить, что этот класс основанных на триплексе переключателей демонстрирует достаточно быструю кинетику открытия/закрытия, чтобы можно было контролировать изменение pH в реальном времени (средняя постоянная времени ~ 100 мс).

Чтобы проверить функциональность переключателя, когда он был соединен с микромоторами, эффективность FRET контролировалась с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica-SP5 (CSLM), оснащенного масляным иммерсионным объективом 63x (Фиг. 6B). Для этого микромоторы суспендировали в PBS при pH 5 или pH 9 и помещали в 8-луночную чашку со стеклянным дном для их анализа под CSLM. Эмиссию донора (Cy3) регистрировали с помощью диодного лазера с длиной волны 564 нм. Изображение FRET было получено путем возбуждения флуорофора Cy3 и регистрации эмиссии акцептора (Cy5). Используя специально созданный плагин ImageJ, количественная оценка эффективности FRET была определена путем расчета отношения FRET/Cy3.

Эти результаты показали, что микромоторы, модифицированные ДНК нанопереключателем, способны обнаруживать изменения pH в окружающей среде. Чтобы продемонстрировать специфичность определения pH и исключить любое влияние pH на интенсивность флуоресценции, микродвигатели были модифицированы с помощью переключателя контроля, который не реагировал на изменения pH. Фиг. 6C и 6D показывают количественную оценку эмиссии FRET/Cy3 от микромоторов, модифицированных либо чувствительным к pH ДНК нанопереключателем (Фиг. 6C), либо нечувствительным к pH ДНК нанопереключателем (Фиг. 6D). В частности, в качестве зонда нечувствительного к pH, была выбрана одноцепочечная ДНК, содержащая ту же шпильку внутримолекулярной ДНК, стабилизированную посредством WC-взаимодействий, и скремблируемый хвост ДНК, который не допускает триплексной укладки. Как и ожидалось, не было обнаружено значительных различий при применении нечувствительного к pH нанопереключателя, демонстрирующего высокую эффективность FRET при всех оцененных значениях pH.

Динамика движения полых микромоторов, дважды функционализированных уреазой и ДНК нанопереключателем, была проанализирована с помощью оптической записи либо в отсутствие, либо в присутствии 100 мМ мочевины, действующей в качестве топлива. Для этого использовался инвертированный флуоресцентный микроскоп Leica DMi8, оснащенный иммерсионным объективом 63x и камерой Hamamatsu. По крайней мере, 15 микрочастиц на одно условие были записаны в течение 20 секунд со скоростью 25 кадров в секунду (FPS - frames per second). Используя код на основе Python, траектории микромоторов отслеживались, и по траекториям рассчитывались MSD в соответствии со следующим уравнением:

MSD(∆t) =< (x_i(t + ∆t) - x_i(t))² > (1)

где i = 2 для 2D-анализа. После добавления субстрата из мочевины MSD приобретает параболическую форму, которая соответствует пропульсивному режиму активной микрочастицы.

Однако в отсутствие топлива наблюдается только броуновское движение, приводящее к подгонке направляющей, что указывает на то, что движение возникает в результате каталитической реакции на поверхности микромоторов. Скорость движущихся частиц составила 6,4 ± 0,6 мкм/с (среднее ± стандартная ошибка среднего), рассчитанная с использованием следующего уравнения:

MSD(t) = 4D_tt + v²t², (2)

где D_t = коэффициент диффузии, v = скорость и t = время.

Удивительно, но эта скорость сопоставима с асимметричными микрокапсулами Януса с ферментным двигателем, описанными ранее (Ma X. et al., выше), и немного выше, чем у микрочастиц не-Януса (Patiño T. et al., выше). Не ограничиваясь какой-либо теорией, этот эффект может быть вызван асимметрией, обеспеченной совместной иммобилизацией ДНК нанопереключателя и ферментов вокруг частиц случайным образом.

Способность микромоторов одновременно регистрировать локальные изменения pH, возникающие при их самодвижении, оценивалась путем сочетания оптического трекинга и визуализации FRET с использованием CSLM, где видео продолжительностью 25 секунд записывалось со скоростью 3FPS. В отсутствие топлива наблюдалось среднее FRET/Cy3 1,8 ± 0,09 (среднее ± стандартная ошибка среднего). Когда к раствору добавляли мочевину, соотношение FRET/Cy3 сразу же снижалось до 1,5 ± 0,05, что указывает на увеличение pH из-за активности микромоторов. Никаких существенных различий в соотношении FRET/Cy3 не наблюдалось в течение 25 секунд записи. В отсутствие топлива микродвигатели проявляли только броуновское движение и отношение FRET/Cy3, близкое к 2. Напротив, в случае микромоторов, подвергнутых воздействию мочевины, соотношение FRET/Cy3 уже уменьшилось в момент анализа (0 с), что указывает на то, что pH уже изменился, поскольку ферментативная реакция на основе уреазы происходит сразу после добавления субстрата мочевины, вызывая локальное изменение pH вокруг частиц, которое обнаруживается мгновенно.

Эти результаты демонстрируют способность активных ДНК-модифицированных микромоторов определять микросреду вокруг себя, обеспечивая непрерывную химическую реакцию для самодвижения.

Чтобы получить представление о мгновенном изменении pH вокруг микромоторов с начального момента реакции, микродвигатели были иммобилизованы на стеклянной поверхности с применением APTES в качестве покрывающего агента для обеспечения положительных поверхностных зарядов и стабилизации электростатических взаимодействий с отрицательно заряженными микромоторами. Иммобилизация микромоторов позволила визуализировать одни и те же микромоторы до и после добавления топлива, а также провести анализ в более длительные периоды времени (2 мин и 10 мин) до того, как они покинут интересующий участок.

На Фиг. 7A и 7B показаны соответственно средние MSD и скорости, полученные при оптическом слежении за моторами. Отчетливо видно непрерывное уменьшение MSD и скорости. Интересно, что хотя скорость со временем уменьшалась, pH продолжал расти до 10 мин., когда скорость оказалась близкой к 0.

Эти результаты предполагают, что снижение скорости не было напрямую связано со снижением активности фермента, и другие факторы, такие как образование ионных продуктов при разложении мочевины или высокий pH, не идеальный для ферментативной реакции, могли влиять на динамику движения.

Использование нанотехнологии ДНК переключателя позволяет определять pH в микроокружении моторов, а также может использоваться для мониторинга их собственной активности при использовании ферментов, которые вызывают изменения pH, таких как уреаза. Таким образом, интеграция инструментов биочувствительности в моторы с ферментным двигателем открывает новые возможности не только для их применения в качестве датчиков, но и для мониторинга внутренней активности микромоторов, чтобы понять их динамику и механизм их движения. Кроме того, высокая универсальность ДНК и ферментов позволяет настраивать свойства микромоторов для широкого спектра применений.

2.3. Выводы

Приведенные в данном документе данные демонстрируют потенциал комбинирования ДНК-технологии с биокаталитическими микропловцами для создания активных и интеллектуальных систем, способных одновременно самодвигаться и обнаруживать окружающую среду. Точный и количественный анализ изменений pH вокруг поверхности микромоторов после их активации в присутствии топлива был достигнут за счет использования pH-чувствительного ДНК нанопереключателя и визуализации FRET с помощью конфокальной микроскопии. Локальные изменения pH и динамика движения микромоторов одновременно анализировались в присутствии топлива через 30 с, 2 мин. и 10 мин. pH непрерывно увеличивался, в то время как скорость экспоненциально снижалась, что указывает на то, что другие факторы, а не активность фермента, могут влиять на самодвижение микромоторов.

Эти результаты подчеркивают важность одновременного определения микромоторами точным и количественным образом не только для отслеживания изменений микросреды, но и в качестве индикатора активности. Будущие направления приведут к обнаружению внутриклеточных или локализованных тканевых изменений pH и других аналитов. Кроме того, эта синергетическая технология откроет поле для многофункциональных микромоторов, в которых изменения pH будут вызывать высвобождение грузов с помощью приводимых в действие сенсорами платформ.

Список библиографических ссылок

Patiño T. et al., “Influence of Enzyme Quantity and Distribution on the Self-Propulsion of Non-Janus Urease-Powered Micromotors”, J. Am. Chem. Soc., 2018, vol. 140(25), pp. 7896-7903.

Ma, X. et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano, 2016, vol. 10(3), pp. 3597-3605.

Patton, C. J. et al., “Spectrophotometric and Kinetics Investigation of the Berthelot Reaction for the Determination of Ammonia”, Anal. Chem., 1977, vol. 49, pp. 464-469.

Campuzano S. et al., “Motion-driven sensing and biosensing using electrochemically propelled nanomotors”, Analyst. 2011, vol. 36(22), pp. 4621-30

Altschul et al., “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410

Higgins et al., “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, vol. 8(2), pp. 189-191

Inman et al., “The impact of temperature and urinary constituents on urine viscosity and its relevance to bladder hyperthermia treatment”, Int J Hyperthermia, 2013, vol. 29(3), pp. 206-10

Xing MA et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano., 2016, vol. 10(3), pp. 3597-605.

Ana C. et al., “Enzyme-Powered Nanobots Enhance Anticancer Drug Delivery”, Advanced Functional Materials, 2017, vol. 28(25).

Изобретение относится к биотехнологии, нанотехнологии и медицине, в частности к наномотору с ферментным двигателем, содержащим частицу с поверхностью, фермент и гетерологичную молекулу; согласно изобретению фермент и гетерологичная молекула прикрепляются дискретно по всей поверхности частицы. Изобретение также относится к наномотору для применения в терапии, диагностике и прогнозировании, в частности для лечения рака. Изобретение предлагает наномотор с ферментным приводом, который легко производить и адаптировать к различным применениям, сохраняя при этом высокую подвижность. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 пр.

1. Наномотор с ферментным двигателем для доставки гетерогенной молекулы, содержащий:

- наночастицу с поверхностью;

- уреазу; и

- гетерологичную молекулу, отличную от уреазы;

где уреаза и гетерологичная молекула прикреплены непрерывно по всей поверхности указанной частицы.

2. Наномотор по п. 1, где наночастица изготовлена из материала, выбранного из группы, состоящей из металла, оксида металла, полимера, липида, белка, клеточной мембраны, тела клетки, углеродистого материала и их смесей.

3. Наномотор по любому из пп. 1, 2, где наночастица изготовлена из мезопористого диоксида кремния.

4. Наномотор по любому из пп. 1-3, где указанная гетерологичная молекула выбрана из группы, состоящей из целевой молекулы, меченой молекулы, наносенсора и молекулярных ворот.

5. Наномотор по п. 4, где мишеневой молекулой является антитело.

6. Наномотор по п. 4, где наносенсор представляет собой ДНК нанопереключатель.

7. Наномотор по любому из пп. 1-6, где наномотор дополнительно содержит груз.

8. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество наномотора по любому из пп. 1-7, и фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель.

9. Применение наномотора по любому из пп. 1-7 или фармацевтической композиции по п. 8 для лечения рака мочевого пузыря, где наномотор содержит противоопухолевый препарат.

10. Набор частей для доставки гетерогенной молекулы, содержащий

- наномотор по любому из пп. 1-7 или фармацевтическую композицию по п. 8 и

- инструкцию по его применению.