Способ получения D-псикозы с использованием микроорганизма рода kaistia Российский патент 2020 года по МПК C12P19/02 C12N1/20 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее раскрытие изобретения относится к способу получения D-псикозы с использованием микроорганизма рода Kaistia.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

D-псикоза (далее именуемая «псикоза») представляет собой моносахарид, известный как редкий сахар, присутствующий в очень небольшом количестве в природе. Он имеет практически ноль калорий при наличии почти 70% сладости сахара и привлек много внимания в качестве нового пищевого ингредиента из-за его функциональных свойств, таких как ингибирование содержания глюкозы в крови, ингибирование синтеза липидов и т.д.

Благодаря указанным свойствам псикоза рассматривается для применения в качестве заменителя сахара в разных пищевых продуктах. Однако существует возрастающая потребность в способе эффективного получения псикозы, так как она имеется в природе в очень небольшом количестве.

Известный способ получения псикозы включает способ применения катализа молибдатными ионами (Bilik, V., Tihlarik, K., 1973, Reaction of Saccharides Catalyzed by Molybdate Ions. IX. Epimerization of Ketohexoses. Chem. Zvesti. 28:106-109), химический способ получения псикозы из D-фруктозы посредством совместного нагревания этанола и триэтиламина (Doner, L.W., 1979, Isomerization of D-Fructose by Base: Liquid-Chromatographic Evaluation and The Isolation of D-Psicose. Carbohydr. Res. 70:209-216) и биологический способ получения псикозы из D-фруктозы с использованием микроорганизма, который продуцирует D-псикозо-3-эпимеразу (выложенная в открытый доступ публикация корейского патента №10-2011-0035805). Получение псикозы химическим способом имеет недостатки в том, что образуется большое количество побочных продуктов, и, таким образом, требуется проводить сложную очистку. Кроме того, биологический способ также имеет недостатки в том, что термостабильность является низкой, а стоимость получения высокой, и, таким образом, имеется потребность в предложении нового микроорганизма, способного продуцировать псикозу из D-фруктозы.

В данных условиях авторы настоящего изобретения приложили много усилий для разработки нового микроорганизма, способного продуцировать псикозу, и, в результате, подтвердили, что при использовании микроорганизма рода Kaistia псикоза может быть получена из D-фруктозы, и осуществили настоящее изобретение.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

В одном воплощении настоящего изобретения предложена композиции для получения D-псикозы, содержащей микроорганизм рода Kaistia.

В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ получения псикозы, включающий приведение микроорганизма рода Kaistia или композиции для получения псикозы, содержащей микроорганизм рода Kaistia, в контакт с D-фруктозой.

В другом воплощении настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Kaistia, полезный для получения псикозы.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Согласно типичному воплощению настоящего изобретения предложена композиция для получения псикозы, содержащая микроорганизм рода Kaistia.

Микроорганизм рода Kaistia по настоящему изобретению может включать любой микроорганизм, без ограничения, при условии, что он имеет способность превращать D-фруктозу в D-псикозу. В типичном воплощении настоящего изобретения микроорганизм рода Kaistia по настоящему изобретению может представлять собой по меньшей мере один микроорганизм рода Kaistia, выбранный из группы, состоящей из Kaistia granuli, Kaistia defluvii, Kaistia adipata, Kaistia geumhonensis, Kaistia dalseonensis, Kaistia hirudinis, Kaistia soli и Kaistia terrae. В частности, микроорганизм рода Kaistia по настоящему изобретению может представлять собой по меньшей мере один микроорганизм рода Kaistia, выбранный из группы, состоящей из Kaistia granuli LIS1 (номер доступа KCCM11916P), Kaistia defluvii LIS2 (номер доступа KCCM12020P), Kaistia granuli KCTC12575, Kaistia defluvii KCTC23766, Kaistia adipata KCTC12095, Kaistia geumhonensis KCTC12849, Kaistia dalseonensis KCTC12850, Kaistia hirudinis DSM25966, Kaistia soli DSM19436 и Kaistia terrae DSM21341.

В типичном воплощении сам микроорганизм рода Kaistia по настоящему изобретению может представлять собой штамм, его культуру или продукт разрушения данного микроорганизма. Культура или продукт разрушения микроорганизма рода Kaistia по настоящему изобретению может содержать D-псикозо-3-эпимеразу, полученную из микроорганизма рода Kaistia. Кроме того, культура микроорганизма рода Kaistia по настоящему изобретению может включать или может не включать микроорганизм. Кроме того, продукт разрушения микроорганизма рода Kaistia по настоящему изобретению может представлять собой продукт разрушения, полученный посредством разрушения микроорганизма рода Kaistia или его культуры, или супернатант, полученный посредством центрифугирования продукта разрушения.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения композиция для получения псикозы по настоящему изобретению может дополнительно содержать D-фруктозу.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения микроорганизм рода Kaistia по настоящему изобретению может быть иммобилизован на носителе, подлежащем применению. Пример носителя, который можно использовать в настоящем изобретении, включает агар, агарозу, k-каррагенан, альгинат или хитозан, но не ограничивается ими.

Композиция для получения D-псикозы по настоящему изобретению может дополнительно содержать металл. Более конкретно, металл по настоящему изобретению может представлять собой по меньшей мере один металл, выбранный из группы, состоящей из марганца, кальция, магния, железа, лития и натрия. Более конкретно, данный металл может представлять собой ион металла или соль металла, и, более конкретно, данная соль металла может представлять собой по меньшей мере одну соль металла, выбранную из группы, состоящей из LiCl, Na₂SO₄, MgCl₂, NaCl, FeSO₄, MgSO₄, MnCl₂, MnSO₄ и CaCl₂. Ион металла или соль металла по настоящему изобретению может иметь концентрацию от 0,1 мМ до 10 мМ, от 0,1 мМ до 7 мМ, от 0,1 мМ до 4 мМ, от 0,5 мМ до 10 мМ, от 0,5 мМ до 7 мМ, от 0,5 мМ до 4 мМ, от 1 мМ до 10 мМ, от 1 мМ до 7 мМ, от 1 мМ до 4 мМ, от 2 мМ до 10 мМ, от 2 мМ до 7 мМ или от 2 мМ до 4 мМ.

Согласно другому типичному воплощению настоящего изобретения предложен способ получения псикозы, включающий: приведение микроорганизма рода Kaistia или композиции для получения псикозы, описанной в настоящем изобретении, в контакт с D-фруктозой.

В типичном воплощении приведение в контакт по настоящему изобретению можно осуществлять при рН от 5,0 до 9,0, при 40-90°С и/или в течение 0,5-48 часов.

В частности, приведение в контакт по настоящему изобретению можно проводить при рН от 6,0 до 9,0; рН от 7,0 до 9,0; рН от 7,5 до 9,0; рН от 6,0 до 8,5; рН от 7,0 до 8,5 или рН от 7,5 до 8,5.

Кроме того, приведение в контакт по настоящему изобретению также можно проводить при температуре от 40°С до 80°С, от 40°С до 75°С, от 40°С до 65°С, от 50°С до 90°С, от 50°С до 80°С, от 50°С до 75°С, от 50°С до 65°С, от 55°С до 90°С, от 55°С до 80°С, от 55°С до 75°С, от 55°С до 65°С, от 60°С до 90°С, от 60°С до 80°С, от 60°С до 75°С, от 60°С до 65°С, от 65°С до 90°С, от 65°С до 80°С или от 65°С до 75°С.

Кроме того, приведение в контакт по настоящему изобретению можно проводить в течение 0,5 часа или более, 1 часа или более, 3 часов или более, 4 часов или более, 5 часов или более, или 6 часов или более, и/или 48 часов или менее, 36 часов или менее, 24 часов или менее, 18 часов или менее, 12 часов или менее, 9 часов или менее.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения массовое отношение микроорганизма рода Kaistia к D-фруктозе по настоящему изобретению может составлять от 1:1 до 1:5. В частности, массовое отношение может составлять от 1:1 до 1:4, от 1:1 до 1:3, от 1:2 до 1:5, от 1:2 до 1:4, от 1:2 до 1:3 или 1:2,5.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать добавление металла до, после или одновременно с приведением в контакт с D-фруктозой.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать выделение и/или очистку псикозы после приведения в контакт с D-фруктозой или добавления металла. Выделение и/или очистка по настоящему изобретению не ограничены особым образом, и их можно проводить с использованием способа, обычно используемого в области техники по настоящему изобретению. Например, выделение и/или очистку можно проводить одним или более чем одним известным способом, таким как диализ, осаждение, адсорбция, электрофорез, ионообменная хроматография, фракционная кристаллизация и т.д., но не ограничиваясь ими.

Кроме того, способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать проведение обесцвечивания и/или обессоливания до или после выделения и/или очистки. Посредством проведения обесцвечивания и/или обессоливания можно получать более очищенную псикозу без примесей.

В другом типичном воплощении настоящего изобретения способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать, после приведения в контакт с D-фруктозой, добавления металла, выделения и/или очистки, или проведения обесцвечивания и/или обессоливания, кристаллизацию D-псикозы. Кристаллизацию можно проводить с использованием способа кристаллизации, который традиционно используется. Например, кристаллизацию можно проводить с использованием способа кристаллизации охлаждением.

В еще одном другом типичном воплощении настоящего изобретения способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать, перед кристаллизацией, концентрирование псикозы. Концентрирование может увеличивать эффективность кристаллизации.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать, после выделения и/или очистки, приведение в контакт непрореагировавшей D-фруктозы с микроорганизмом рода Kaistia, или может дополнительно включать, после кристаллизации, повторное использование в выделении и/или очистке маточного раствора, из которого осуществляется выделение кристаллизацией, или их комбинацию. Посредством данных дополнительных стадий псикозу можно получать с более высоким выходом, и может быть уменьшено количество D-фруктозы, подлежащей отбрасыванию, что обеспечивает экономическую выгоду.

Показатель превращения D-фруктозы в псикозу согласно способу получения по настоящему изобретению может составлять от 5% до 50%, от 10% до 50%, от 20% до 50%, от 25% до 50%, от 30% до 50%, от 5% до 40%, от 10% до 40%, от 20% до 40%, от 25% до 40%, от 30% до 40%, от 5% до 35%, от 10% до 35%, от 20% до 35%, от 25% до 35% или от 30% до 35% по массе.

Микроорганизм рода Kaistia, D-фруктоза, псикоза, металл и носитель, описанные в способе получения псикозы по настоящему изобретению, являются такими же, как описано в вышеописанных типичных воплощениях.

Согласно еще одному другому типичному воплощению настоящего изобретения предложен штамм Kaistia granuli LIS1, депонированный с номером доступа KCCM11916P.

Согласно еще одному другому типичному воплощению настоящего изобретения предложен штамм Kaistia granuli LIS2, депонированный с номером доступа KCCM12020P.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Микроорганизм рода Kaistia по настоящему изобретению может превращать D-фруктозу в псикозу, в то же самое время является термостабильным при температуре 50°С или выше, тем самым обеспечивая возможность получение псикозы в промышленном масштабе.

Следовательно, в случае, когда микроорганизм рода Kaistia используется в получении псикозы, способ получения псикозы может быть рентабельным способом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 представлены аналитические данные ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia granuli LIS1 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 2 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia granuli LIS2 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 3 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia granuli KCTC12575 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 4 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia defluvili KCTC23766 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 5 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia geumhonensis KCTC12849 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 6 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia adipata KCTC12095 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 7 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia dalseonensis KCTC12850 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 8 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia hirudinis DSM25966 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 9 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia soli DSM19436 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

На ФИГ. 10 представлены аналитические данные ВЭЖХ, показывающие возможность получения псикозы из D-фруктозы с использованием Kaistia terrae DSM21341 согласно типичному воплощению настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ

Далее настоящее изобретение будет более подробно описано посредством следующих Примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается Примерами, приведенными ниже, и следует понимать, что специалистами в данной области могут быть сделаны разные модификации и изменения в пределах объема и сущности настоящего изобретения.

Во всем описании настоящего изобретения, если не отмечено иное, «%», используемый для обозначения концентрации конкретного вещества, относится к % твердое вещество/твердое вещество (масс./масс.), % твердое вещество/жидкость (масс./об.) и % жидкость/жидкость (об./об.).

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Выделение почвенного микроорганизма, который превращает D-фруктозу до псикозы

Для выделения микроорганизма, который превращает D-фруктозу в псикозу, использовали минимальную среду (2,4 г/л KH₂PO₄, 5,6 г/л K₂HPO₄, 2,6 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,1 г/л 3 мМ MnSO₄⋅7H₂O, 1 г/л дрожжевого экстракта), в которую добавляли 1% (масс./об.) псикозы. 1 г ризосферной почвы суспендировали в 10 мл 0,85% (масс./об.) NaCl, и 100 мкл суспензии переносили на чашку с агаризованной средой и культивировали при 30°С. Среди колоний, образовавшихся на агаризованной среде, выбирали колонии, имеющие разные формы и размеры, каждую колонию инокулировали в минимальную среду (2,4 г/л KH₂PO₄, 5,6 г/л K₂HPO₄, 2,6 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,1 г/л 3 мМ MnSO₄⋅7H₂O, 1 г/л дрожжевого экстракта) и осуществляли культивирование при встряхивании при 30°С в течение 24 часов, с последующим центрифугированием для выделения только клеток. Выделенные клетки промывали 0,85% (масс./об.) NaCl, и затем давали им плавать посредством добавления 50 мМ буфера Tris-HCl (рН 8,0), в который были добавлены 50% (масс./масс.) D-фруктозы и 3 мМ MnSO₄ при 20%-ной (масс./масс.) концентрации клеток, с последующей реакцией с клетками при 55°С в течение 2 часов. Реакционный продукт центрифугировали для удаления клеток из реакционного раствора, и получение псикозы подтверждали ВЭЖХ супернатанта. Анализ ВЭЖХ проводили с использованием ВЭЖХ (Agilent, США) с детектором показателя преломления (Agilent 1260 RID), оснащенного колонкой Aminex НРХ-87С (BIO-RAD), где растворитель подвижной фазы представлял собой воду, температура составляла 80°С, и скорость тока составляла 0,6 мл/мин. Посредством анализа ВЭЖХ были выбраны два вида штаммов (LIS1 и LIS2), которые получали больше всего псикозы из D-фруктозы (ФИГ. 1 и 2).

Последовательности оснований (от 5' до 3') 16s рибосомной ДНК выбранных штаммов LIS1 и LIS2 являются такими, как показано в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. В результате анализа гомологии последовательностей SEQ ID NO: 1 демонстрировала примерно 99%-ную гомологию с последовательностью 16s рибосомной ДНК (SEQ ID NO: 3) Kaistia granuli Ko04, и SEQ ID NO: 2 демонстрировала примерно 99%-ную гомологию с последовательностью 16s рибосомной ДНК (SEQ ID NO: 4) Kaistia defluvii B6-12. Соответственно, штамм LIS1 был идентифицирован как Kaistia granuli, а штамм LIS2 был идентифицирован как Kaistia defluvii, соответственно, и названы Kaistia granuli LIS1 и Kaistia defluvii LIS2 соответственно. Два данных штамма были депонированы в Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), который представляет собой международный депозиторий, работающий согласно Будапештскому соглашению, где Kaistia granuli LIS1 был депонирован 20 октября 2016 г., и ему был присвоен номер доступа KCCM11916P, и штамм Kaistia defluvii LIS2 был депонирован 24 апреля 2017 г., и ему был присвоен номер доступа KCCM12020P.

Пример 2. Подтверждение получения псикозы микроорганизмом рода Kaistia

Подтвердили, могла ли быть получена псикоза посредством Kaistia granuli LIS1, Kaistia defluvii LIS2, другими штаммами того же самого вида и другим видом штамма рода. Kaistia.

В частности, восемь дополнительных микроорганизмов (того же самого вида: K. granuli KCTC12575 и K. defluvii KCTC23766; другого вида: Kaistia geumhonensis KCTC12849; K. dalseonensis KCTC12850, K. hirudinis DSM25966, K. soli DSM19436 и K. terrae DSM21341) приобрели из Корейской коллекции типовых культур (КТСТ) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, инокулировали в нормальную среду (1 г/л глюкозы, 15 г/л пептона, 6 г/л NaCl, 3 г/л дрожжевого экстракта) и культивировали в культуре со встряхиванием при 30°С в течение 24 часов, с последующим центрифугированием для выделения только клеток. Выделенные клетки промывали 0,85% (масс./об.) NaCl и затем проводили взаимодействие с 50% (масс./масс.) D-фруктозы при тех же самых условиях, что и в Примере 1, в котором концентрация клеток составляла 20% (масс./масс). После завершения реакции супернатант реакции анализировали ВЭЖХ для подтверждения полученного количества псикозы. Анализ ВЭЖХ проводили таким же способом, что и в Примере 1. Показатель превращения псикозы рассчитывали по отношению количества полученной псикозы по массе после реакции к количеству D-фруктозы по массе до реакции.

В результате подтвердили, что все восемь штаммов рода Kaistia продуцировали псикозу из D-фруктозы, и это подтверждает, что все виды микроорганизма рода Kaistia могут продуцировать псикозу из D-фруктозы при высокой температуре (Таблица 1, ФИГ. 3-10).

Из приведенного выше описания специалистам в данной области будет понятно, что настоящее изобретение может быть выполнено в других конкретных формах без модификации его технической идеи или существенных характеристик. В данном отношении следует понимать, что описанные выше воплощения являются во всех аспектах иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего изобретения следует интерпретировать как охватывающий все модификации или вариации, происходящие из значения и объема приложенной формулы изобретения и ее эквивалентов, а не подробного описания.

Изобретение относится к области биотехнологии. Отражена композиция для получения D-псикозы, содержащая микроорганизмы рода Kaistia и D-фруктозу, способ получения D-псикозы с ее использованием, а также штаммы микроорганизмов рода Kaistia для получения D-псикозы. Изобретение позволяет получить моносахарид – D-псикозу из D-фруктозы с использованием различных микроорганизмов рода Kaistia. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Композиция для получения D-псикозы, содержащая микроорганизм рода Kaistia и D-фруктозу.

2. Композиция по п. 1, где микроорганизм рода Kaistia представляет собой по меньшей мере один микроорганизм рода Kaistia, выбранный из группы, состоящей из Kaistia granuli, Kaistia defluvii и Kaistia geumhonensis, Kaistia adipata, Kaistia dalseonensis, Kaistia hirudinis, Kaistia soli и Kaistia terrae.

3. Применение микроорганизма рода Kaistia для получения D-псикозы.

4. Способ получения D-псикозы, включающий приведение микроорганизма рода Kaistia в контакт с D-фруктозой.

5. Способ по п. 4, при котором приведение в контакт осуществляют при рН от 5,0 до 9,0, при температуре от 40 °С до 90 °С или в течение 0,5-48 часов.

6. Штамм Kaistia granuli LIS1, депонированный с номером доступа KCCM11916P, для применения в получении D-псикозы.

7. Штамм Kaistia defluvii LIS2, депонированный с номером доступа KCCM12020P, для применения в получении D-псикозы.