Способ диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12N1/04 C12M1/42 

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий после выращивания перед приготовлением готовой формы препарата.

Известен (1) способ обработки 18-часовых культур штаммов бифидобактерий B.bifidum 791 и B.longum 379 после последовательного трехкратного пассирования на гидролизатно-молочной среде с целью снижения вязкости в микробных культурах бифидобактерий за счет разрушения межклеточного матрикса в клеточных ассоциациях путем ферментативного гидролиза ферментами мацеробациллином Г20х или целловиридином, обладающими полисахаридгидролизующим действием. Авторами установлено, что целловиридин не оказывал действия ни на гетерополисахарид капсул, ни на декапсулированные клетки, ни на их количество в ростовой среде. В то же время обработка мацеробациллином сопровождалась снижением вязкости культуральной жидкости и увеличением числа жизнеспособных бактерий на порядок.

Основным недостатком данного способа является неизбежное присутствие не прореагировавших ферментов в культуральной жидкости, что крайне нежелательно при приготовлении лекарственных форм биопрепаратов.

Из этого же источника (1) известен способ обработки с той же целью культур штаммов бифидобактерий B.bifidum 791 и B.longum 379 после последовательного трехкратного пассирования на гидролизатно-молочной среде ультразвуком с частотой 10 Вт/см в течение 20 мин при температуре 37°С. Такое воздействие приводило к снижению вязкости культуральной жидкости (КЖ) на 28% и увеличению числа колониеобразующих единиц (КОЕ) почти на один порядок, не оказывая на декапсулированные клетки бифидобактерий видимого эффекта.

Данный способ сложно реализовать в промышленных условиях. Кроме того, авторами не приведены данные по выживаемости бифидобактерий после ультразвукового воздействия при кратковременном хранении культуральной жидкости перед дальнейшей переработкой.

В работе (2), в которой авторы исследовали возможность получения устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis sp. kurstaki шт. Z-52 в электромагнитном диспергаторе посредством воздействия на культуральную жидкость ферромагнитных тел (ФМТ) цилиндрической формы различного диаметра, было показано, что при диспергировании модельной культуры В. subtilis ФМТ диаметром 5 мм и длиной 10 мм выживаемость клеток остается на уровне контроля, но устойчивой суспензии не образуется. При диспергировании той же КЖ, но с добавками минерального масла, ФМТ диаметром 0,15 мм и длиной 5 мм происходит инактивация микроорганизмов, а в результате диспергирования ФМТ диаметром 0,5 мм и длиной 10 мм в течение 5 мин образование устойчивой суспензии сопровождается повышением выживаемости бацилл в 1,05-1,31 раза. На культуре В. thuringiensis получен аналогичный результат, но с выживаемостью бацилл в суспензии 122%. Указанное возможно только за счет разрушения агломератов клеток.

Этот способ обработки является наиболее близким по технической сущности к заявляемому. К сожалению, он обеспечивает недостаточную степень повышения концентрации микроорганизмов в ростовой среде. К тому же авторы не приводят данных по выживаемости микроорганизмов при краткосрочном промежуточном хранении.

Общим признаком заявляемого изобретения и прототипа является диспергирование культуральной жидкости микроорганизмов ферромагнитными телами в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором.

Технической проблемой, решаемой при создании изобретения, является разработка способа диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий после культивирования, позволяющего увеличить концентрацию микробных клеток в ростовой среде, а также повысить выживаемость бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости перед приготовлением готовой формы препарата.

Техническим результатом изобретения является тот факт, что заявленный способ диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий после культивирования позволяет повысить выживаемость бактериальных клеток в ростовой среде в процессе краткосрочного промежуточного хранения в 2 раза по сравнению с прототипом, а культуральная жидкость, полученная при реализации заявленного способа, обладает в 2,0-2,5 раза большей концентрацией бактериальных клеток по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом.

Сущность изобретения заключается в том, что диспергирование культуральной жидкости бифидобактерий ферромагнитными телами в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором осуществляют в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,25 мм.

Из данных литературы (3) известно, что некоторые штаммы бифидобактерий в поздней экспоненциальной и стационарной фазах роста обладают способностью к почкованию и дихотомическому 2-4-6-8-латеральному ветвлению. Происходит мультисептация ветвящихся филаментов, блокирование отделения образовавшихся клеток, в результате чего формируются конгломераты, которые могут включать десятки микробных тел. Мицелиальные конгломераты образуются при помощи межклеточных связей преимущественно за счет слияния клеточных стенок, посредством капсулярных структур, в том числе синтезируемого клеткой органического макромолекулярного матрикса. Образование клеточных ассоциаций в культуральной жидкости сопровождается истощением питательных веществ, накоплением метаболических «ядов», увеличением активной кислотности и т.д.

Нашими собственными исследованиями установлено, что наибольшая концентрация бифидобактерий в среде культивирования в процессе диспергирования ее в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором достигается в течение 3-5 мин ферромагнитными телами цилиндрической формы диаметром 0,25 мм.

Результаты проведенных исследований показывают, что диспергирование в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором суспензий бифидобактерий после культивирования обеспечивает два преимущества. Первое - за счет лучшей выживаемости клеток бифидобактерий в процессе краткосрочного хранения при низкой положительной температуре повышается гибкость всей технологии приготовления сухих препаратов за счет исключения необходимости немедленного сублимационного высушивания выращенных микроорганизмов. Второе - вследствие существенного увеличения (до 10 раз) содержания в культуральной жидкости жизнеспособных клеток повышается экономическая эффективность производства бифидосодержащих пробиотических и пребиотических сухих препаратов, т.к. пропорционально увеличивается количество доз препарата, которое может быть получено из единицы веса (г, кг) высушенной биомассы требуемого штамма бифидобактерий.

Согласно изобретению увеличение концентрации микробных клеток в ростовой среде, а также повышение выживаемости бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости обеспечивается тем, что диспергирование осуществляют в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,25 мм.

В серии экспериментов по диспергированиию межклеточного матрикса культуральную жидкость бифидобактерий В. adolescentis МС-42 обрабатывали в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором, аналогичном описанному в (2). Объем рабочей камеры аппарата составлял 220 мл, а обрабатываемой суспензии - 100 мл. Загрузка ферромагнитных тел (ФМТ) в рабочую камеру - 10 г. Во всех опытах обрабатывали КЖ 3-й генерации бактерий, выращенных на казеиново-дрожжевой (КД-5) среде.

В экспериментах по изучению кинетики процесса КЖ бифидобактерий диспергировали ФМТ диаметром (d) 0,25 мм и длиной (l) 4,5 мм (концентрация бифидобактерий в КЖ - 1,0×10⁷ КОЕ/мл) и d=0,5 мм и l=6,5 мм (концентрация бифидобактерий в КЖ - 6,0×10⁷ КОЕ/мл). Максимальная продолжительность воздействия на КЖ составляла 5 мин, как в прототипе (2).

Было показано (таблица 1), что время достижения максимальной концентрации бифидобактерий в КЖ для ФМТ d=0,25 мм сместилось к 3 минутам процесса и при дальнейшей обработке количество бактерий почти не менялось. При этом содержание бифидобактерий увеличилось на порядок. Для ФМТ d=0,5 мм максимальное количество клеток в КЖ также было достигнуто за 3 мин процесса и при последующем диспергировании (4-5 мин) пошло на убыль и уменьшилось в 1,7 раза. В этом случае максимальное количество бактерий в КЖ в результате обработки увеличилось лишь в два раза.

Из анализа данных таблицы 1 следует, что диспергирование в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором КЖ исследованных микробов более 5 мин не целесообразно, так как не приводит к увеличению концентрации бифидобактерий.

Факт того, что увеличение времени диспергирования, как единственный варьируемый параметр, не всегда приводит к повышению концентрации клеток, следует также из анализа данных таблицы 2. В ней представлены результаты по обработке КЖ культуры В. adolescentis МС-42, выращенной на КД-5, в лабораторном гомогенизаторе MLW при 1500 об/мин. Объем обрабатываемой суспензии 100 мл.

В данном устройстве максимальная концентрация клеток достигается к 1-2 минуте процесса, и к третьей минуте прирост клеток идет на убыль. То есть, дальнейшее диспергирование на таких оборотах ротора уже не приводит к увеличению количества бифидобактерий в КЖ. Поэтому увеличение времени воздействия для достижения желаемого результата не имеет смысла, а повышение оборотов ротора для интенсификации процесса невозможно из-за обильного пенообразования.

Таким образом, на основании приведенных здесь результатов исследований по диспергированию в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором КЖ бифидобактерий установлено:

1. максимальная концентрация бифидобактерий в результате диспергирования КЖ достигается при продолжительности процесса 3-5 мин;

2. наибольшее содержание клеток в КЖ обеспечивает, при прочих равных условиях, использование ФМТ диаметром 0,25 мм.

Заявляемый способ диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий является новым и в литературе не описан.

Концентрацию бифидобактерий определяли методом предельных разведений в жидких питательных средах. Пробу анализируемой суспензии 1 мл переносили в пробирку с 9 мл ростовой среды и перемешивали путем прокачки. Получали разведение 10^-1. Далее по 1 мл каждого предыдущего разведения переносили в 9 мл среды следующего разведения, и так до 10-го. Пробирки инкубировали 3 суток при 37,5°С. Затем подсчитывали число колоний микроорганизмов. Количество жизнеспособных бактерий в пробе препарата рассчитывали, как произведение количества живых особей в последнем разведении на 10 в степени номера предпоследней пробирки, где отмечен рост микробов по формуле

БК=N×10^n-1,

где БК - биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/мл;

N - среднее арифметическое числа колоний в пробирках;

n - степень последнего разведения.

Выживаемость микроорганизмов в процессе хранения КЖ определяли по отношению концентрации живых клеток в хранившихся материалах к таковой свежеприготовленных.

Осуществление способа изобретения поясняется следующим примером, подтверждающим увеличение концентрации микробных клеток в ростовой среде, а также повышение выживаемости бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости перед дальнейшей переработкой при реализации способа.

Пример. В электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором диспергировали КЖ В. adolescentis МС-42 3-й генерации с содержанием бактерий 1,0×10⁸ КОЕ/мл, выращенной на среде КД-5. Объем рабочей камеры аппарата - 220 мл, а обрабатываемой суспензии - 100 мл. Загрузка ФМТ в рабочую камеру - 10 г. Диспергирование осуществляли ФМТ d=0,25 мм и l=4,5 мм в течение 3-х, 4-х и 5 мин. Для сравнения (по прототипу) КЖ обрабатывали ФМТ d=0,5 мм и l=6,5 мм в течение 5 мин. Результаты представлены в таблице 3.

Как следует из анализа данных, представленных в таблице 3, выживаемость В. adolescentis МС-42 в конце кратковременного хранения при низких положительных температурах КЖ в результате заявленного способа диспергирования возросла как минимум в 2 раза. Кроме того, культуральная жидкость, полученная при реализации заявленного способа диспергирования, содержит в 2,0-2,5 раза большее количество бифидобактерий по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом. Указанное обеспечивается тем, что диспергирование осуществляют в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,25 мм.

Источники информации

1. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков на основе бифидобактерий / Бандоян А.К., Амерханова A.M., Алешкин В.А. и др. // Сб. науч. тр. «Проблемы инфекционных болезней». - М., 2000. - с. 284-286.

2. Получение устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis в электромагнитном аппарате / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, И.Ю. Давыдкин, А.А. Воробьев, А.Г. Гаврин, В.М. Блинов, С.С. Афанасьев // Журнал микробиологии. - 2001. - №4. - С. 7-10.

3. Гончарова Г.И., Лянная A.M. Культуральная, морфологическая и биохимическая характеристика Bacterium bifidum // Тр. МНИИЭМ «Кишечные и воздушнокапельные инфекции». - Т. XIII. - М., 1969. - С. 415-426.. 5-6. - С. 51-58.

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности. Предложен способ диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий после выращивания перед приготовлением готовой формы препарата в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором в течение 3-5 мин с использованием ферромагнитных тел диаметром 0,25 мм. Изобретение обеспечивает увеличение концентрации микробных клеток в ростовой среде и повышение выживаемости бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости. 3 табл., 1 пр.

Способ диспергирования культуральной жидкости бифидобактерий ферромагнитными телами в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором, отличающийся тем, что диспергирование осуществляют в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,25 мм.