Дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина, обладающая антиагрегантной и антитромботической активностью Российский патент 2020 года по МПК C07C301/00 C07C303/32 C07C309/15 A61K31/167 A61K31/185 A61P7/02 

Тромбообразованию принадлежит одна из важнейших ролей в патогенезе инсульта, ишемической болезни сердца и осложнений сахарного диабета. В пожилом и старческом возрасте частота тромбозов увеличивается в несколько раз и достигает 200 случаев на 100000 человек в год [Чазов, Е.И., 2008; Мирзоян, Р.С., 2009; Тюренков, И.Н., 2013; Спасов, А.А., 2013; Дедов, И.И., 2013, (1, 2018)]. С каждым годом число пациентов с сосудистыми поражениями постоянно увеличивается, так отмечается около 1 млн. случаев ишемического инсульта в экономически развитых странах ежегодно, а к 2030 году прогнозируется увеличение данного показателя до 3,4 млн. [Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилова И.Ю., и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов. // Лабораторное дело. - 1989. - №10 - С. 15-18.; Габриэлян Э.С., Акопов С.Э. Клетки крови и кровообращение. - Ереван: Айастан, 1985. - С. 326-330.234]. В России по состоянию на 2017 год зарегистрированных и взятых на учет свыше 1,7 млн человек с сахарным диабетом и осложнениями, связанными с тромбооразованием [Федеральная служба государственной статистики Обновление от 24.09.2018]. Приведенные данные о распространенности тромбозов и их влиянии на показатели здоровья и смертности населения обосновывают актуальность исследований, изучающих причинные факторы внутрисосудистого тромбообразования. Очевидно, что идентификация значимых факторов риска тромбозов сосудов разных типов (венозных, артериальных, артериовенозного сосудистого доступа) способствует выработке более действенных дифференцированных подходов к их профилактике и лечению, что неизбежно приводит к поиску новых эффективных лекарственных средств.

Известны средства, обладающие антиагрегантной [Носаль Р. Современное состояние и перспективы антитромбоцитарной терапии // Словакофарма ревю. - 2000. - №1-2. - С. 14-19] и антитромбогенной активностью [Танашян М.М., Домашенко М.А. Трентал при ишемических цереброваскулярных заболеваниях (обзор литературы) // Нервные болезни. - 2005. - №4 - С. 21-24]. По этим видам активности наиболее близким (прототипом) является ацетилсалициловая кислота (АСК), обладающая, аниагрегантной и антитромботической активностью.

Цель изобретения заключается в получении высокоэффективного водорастворимого производного дикалиевой соли N-(4-гидроксибензоил)таурина, сочетающего основные эффекты, присущие антиагрегантным и антитромботическим средствам не уступающие или превосходящие АСК.

Сущность изобретения заключается в синтезе дикалиевой соли N-(4-гидроксибензоил)таурина формулы

и использования его в качестве антиагрегантного и антитромботического средства.

Пример 1. Дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина

В реактор, снабженный мешалкой, помещают раствор 2-аминоэтансульфоновой кислоты (таурина) в 25.00 мл воды и приливают 6 н. раствор гидроксида натрия. По каплям, в раствор глицина прикапывают хлорангидрид 4-гидроксибензойной кислоты в течение 1.5 ч при охлаждении. Затем реакционную смесь перемешивают еще 1.5 ч (при охлаждении), контролируя рН среды (рН>7). Полученную смесь выливают в лед и подкисляют хлороводородной кислотой до рН=5, выпавшие кристаллы N-(4-гидроксибензоил)таурина перекристаллизовывают из изопропанола, отфильтровывают и сушат. Выход 34.2%. Тпл.=204-206°С, R_f=0.753 (н-бутанол - этанол - вода = 5:2:1). ЯМР ¹Н, м. д. (ДМСО): 6.76-7.75 (4Н, м, ароматические Н), 7.96-8.23 (1Н, м, NH), 10.185 (1H, с, Ph-OH и SO₂-OH), 2.23-3.34 (4Н, м, С₂Н₄). Для C₉H₁₁NO₅S найдено, %: С (44.08), Н (4.56), N (5.68); S (13.06); вычислено, %: С (44.08), Н (4.52), N (5.71), S (13.07).

Затем в реактор загружают 4.60 г (100 ммоль) этилата калия, 100 мл бензола, 12.26 г (50 ммоль) N-(4-гидроксибензоил)таурина и перемешивают при температуре 100°С в течение 30 мин. После охлаждения продукт, дикалиевую соль N-(4-гидроксибензоил)таурина, отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством спиртового раствора щелочи и сушат. Выход - 94%. Т.разл.=260°С

Найдено, %: С 33.60; Н 2.80; К 24.30; N 4.34; О 24.85; S 9.96. Вычислено, %: С 33.63; Н 2.82; К 24.33; N 4.36; О 24.89; S 9.98.

Пример 2. Исследование антитромбоцитарной активности дикалиевой соли N-(4-гидроксибензоил)таурина

Изучение влияния соединения на агрегационную активность выполнялось по методу Born G. в модификации Габбасова В.А. (1989) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола» 220LA (Россия).

Исследования проводились на богатой тромбоцитами плазме крыс по способу, описанному Люсовым В.А., Белоусовым Ю.Б. (1971). Для данного исследования кровь забирали из брюшной аорты наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг в/б) крыс, стабилизировали 3.8% раствором цитрата натрия в соотношение с кровью 9:1, а затем центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин на центрифуге СМ-6м (ELMI, Латвия). Для получения бедной тромбоцитами плазму центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. В основе данного метода исследования лежит регистрация изменения светопропускания богатой тромбоцитами плазмы при добавлении к ней индукторов агрегации, а также анализе флюктуаций светопропускания образца суспензии, вызванных случайным изменением количества частиц в оптическом анализе прибора. Важным условием агрегации тромбоцитов является механическое перемешивание плазмы (800 об/мин), которое проводилось с помощью магнитной мешалки, прилагаемой к агрегометру. Предварительно, перед началом эксперимента, проводилась калибровка агрегометра по двум точкам с использования ЭДТА. При этом за 0% принималось светопропускания бедной тромбоцитами плазмы, а за 100% - богатой тромбоцитами плазмы. Для получения контрольных проб в ходе эксперимента в кювету анализатора вводили 300 мкл богатой тромбоцитами плазмы и 10 мкл индуктора агрегации тромбоцитов АДФ (Sigma Aldrich, USA), в конечной концентрации 5 мкМ.

При изучении антиагрегантной активности соединений in vitro в кювету с 300 мкл богатой тромбоцитами плазмой добавляли 10 мкл раствора патентуемого соединения в концентрациях от 10^-4 до 10^-8 М. Пробы инкубировали в термостатируемых ячейках агрегометра при 37°С в течение 5 мин. Затем, после включения агрегатограммы, в кювету добавляли АДФ на 10 секунде регистрации процесса. В качестве препарата сравнения использовали АСК. В ходе регистрации процесса агрегации тромбоцитов в течение 5 мин.

Патентуемое соединение - дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина - обладает антитромбоцитарной активностью на модели АДФ - индуцированной агрегации тромбоцитов у здоровых животных.

У животных контрольной группы степень агрегации тромбоцитов составляла 7.01±0.49%, тогда как этот показатель при добавлении АСК в концентрациях 10^-4 М составляла 4.5±0.2, 10^-5 М - 4.8±0.3, 10^-6 М - 5.4±0.3, 10^-7 М - 4.9±0.64, 10^-8 М - 4.3±0.7, что на 36.5%, 32%, 23%, 30% и 38% меньше референтных значений. При добавлении дикалиевой соль N-(4-гидроксибензоил)таурина были получены следующие значения степени агрегации в концентрации 10^-4 М составляла 3.8±0.6, 10^-5 М - 3.9±0.5, 10^-6 М - 3.7±0.7 10^-7 М - 3.54±0.47, 10^-8 М 4.7±0.4 что на 46.5%, 43.5%, 48%, 49.5%, 34%, меньше референтных значений (Рисунок 1А).

В крови полученной от животных с экспериментальным сахарным диабетом этот показатель агрегации тромбоцитов составил 6.7±0.8%, в то время как при добавление патентуемого соединения степень агрегации составила 10^-4 М - 6.1±0.7; 10^-5 М - 5.5±0.7; 10^-6 М - 5.5±0.1; 10^-7 М - 4.4±0.6, что на 12%, 20.5%, 19.5% и 36% меньше референтных значений. (Рисунок 1Б).

Таким образом, дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина обладает антитромбоцитарной активностью на модели АДФ - индуцированной агрегации тромбоцитов у здоровых животных и животных с экспериментальным сахарным диабетом.

Пример 3. Исследование антитромбогенной активности дикалиевой соли N-(4-гидроксибензоил)таурина

Данное исследование проводилось in vivo на модели артериального тромбоза, индуцированного аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) на сонную артерию крыс, согласно методу Kurz K.D (1990). Изучаемые соединения вводились животным интраперитонеально. Через 60 мин после этого, животных также интраперитонеально наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг). Для получения доступа к сонной артерии, послойно вскрывали кожу и ткани на шее животного, после чего, отделяя блуждающий и симпатические нервы, отпрепаровывали сонную артерию на 3 см в длину. На участок сосуда длиной примерно 1 см помещали ватный диск размером 2 мм × 8 мм, предварительно смоченный 50% раствором хлорида железа (III) (0,025 мл), и укладывали пленку Parafilm для изоляции окружающих тканей. Исследование проводили с использованием ультразвукового допплерографа («Мини-Макс Допплер», Санкт-Петербург, РФ). Ультразвуковой датчик прибора устанавливали на артерию на расстоянии от ватного диска ближе к голове.

Модель артериального тромбоза, индуцированного электрическим током была поставлена согласно методу Guglielmi G. et al (1991) на нелинейных крысах - самцах массой 350-400. На данной модели в механизм тромбообразования вовлечена АТФ. В результате повреждения эндотелия сосудистой стенки воздействием постоянного электрического тока активируется его выработка, что приводит к инициации процессов активации и агрегации тромбоцитов с формированием, в конечном итоге, тромбиновых сгустков крови.

Артериальный тромбоз, вызванный воздействием электрического тока на сонную артерию крыс, моделировали на наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/бр) животных. Затем проводили послойное вскрытие кожи и тканей, после чего отпрепаровывали сонную артерию на 3 см в длину. На участок сосуда длиной около 1 см были наложены золотые электроды, на места их контакта с артерией наносился акустический гель. Окружающие ткани изолировались пленкой Parafilm. На расстоянии 2 см от данного участка устанавливался датчик аппарата с рабочей частотой ультразвукового зондирования 25 МГц. Индукция тромбоза сонной артерии проводилась постоянным электрическим током напряжением 12 В, сила тока при этом соответствовала 50 мА. Воздействие на сосуд выполнялось до момента полной окклюзии. Регистрация артериального кровотока проводилась с помощью ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К («СП Минимакс», Санкт-Петербург, Россия). В качестве параметра, характеризующего антитромботические свойства исследуемых веществ, использовался интервал времени от момента начала стимуляции до полной окклюзии каротидной артерии.

Обработка данных производилась с помощью пакетов программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США), Excel из пакета Office ХР (Microsoft, США) и Graph.Pad.Prism 6.0 (США).

Уровень кровотока в сонной артерии крыс контрольной группы составлял 7.6±1.16 мл/мин. После аппликации хлорида железа на поверхность сонной артерии у всех животных происходило полное прекращение кровотока по сосуду. Среднее время полной остановки кровотока до нуля составило 1074.5±41 секунд. Значение исходного кровотока у крыс получавших АСК 7.5±0.7 мл/сек, время полной окклюзии 1335.8±208.1, что на 24% больше чем у животных в контрольной группе. Патентуемое соединение дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина исходный кровоток составлял 7.7±0.7 мл/мин, время полной окклюзии 1346.3±100.4 сек, что на 25% больше чем у животных в контрольной группе (таблица 1). Таким образом, дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина вызывает увеличение времени образования тромба по сравнению с группой контрольных животных и обладает антитромбогенной активностью (Таблица 1).

В модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током исходное значение кровотока у крыс контрольной группы составило 9±1.8 мл/сек, среднее время полной остановки кровотока до нуля составило 908.8±155.9 сек. При введение соединения дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина исходный кровоток составлял 9.8±1.1 мл/сек, время полной окклюзии 1425.4±140.7 сек, что на 57% больше чем у животных в контрольной группе (Таблица 2).

Использование дикалиевой соли N-(4-гидроксибензоил)таурина вызывает увеличение времени образования тромба по сравнению с группой контрольных животных и обладает выраженной антитромбогенной активностью.

Пример 4. Определение острой токсичности

Острую суточную токсичность при однократном введении изучали на мышах-самках массой 30-40 г. Соединение в дистиллированной воде вводили животным (в/бр и per os) в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение суток, отмечая количество погибших животных. Расчет LD₅₀ проводили методом пробит анализа.

Исследования острой токсичности показали, что по классификации токсичности веществ при их введении под кожу и в брюшную полость животных (К.К. Сидорова, 1973) заявляемое вещество относится к классу малотоксичных (таблица 3).

Изобретение относится к области органической химии, а именно к водорастворимому соединению формулы

. Технический результат: получено новое производное на основе таурина и 4-гидроксибензойной кислоты, которое обладает антиагрегантным и антитромботическим действием. 1 ил., 3 табл., 4 пр.

Водорастворимое соединение дикалиевая соль N-(4-гидроксибензоил)таурина формулы

,

обладающее антиагрегантной и антитромботической активностью.