ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ 2-[3-(2-ХЛОРЭТИЛ)-3-НИТРОЗОУРЕИДО]-1,3-ПРОПАНДИОЛ ПЕРОРАЛЬНО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМЫ В16, ОПУХОЛИ ЭРЛИХА, САРКОМЫ 180, САРКОМЫ 37, ЛИМФОСАРКОМЫ ЛИО-1 И КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256 В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА МЫШАХ И КРЫСАХ Российский патент 2020 года по МПК A61K31/175 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для применения соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол перорально для лечения меланомы В16, опухоли Эрлиха, саркомы 180, саркомы 37, лимфосаркомы ЛИО-1 и карциносаркомы Walker 256 в эксперименте на мышах и крысах.

Известен способ лечения злокачественных опухолей в эксперименте посредством парентерального введения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола, обладающего противоопухолевой активностью (патент РФ №2068843).

Известно применение соединения 2-[3-(2-[хлорэтил)-3-нитрозруреидо]-1,3-пропандиол для лечения HER2-положительных опухолей в эксперименте посредством его парентерального введения (патент РФ №2695787).

Недостатком является недоказанность возможности перорального применения соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол при злокачественных опухолях различной локализации.

Вместе с тем, пероральное введение при условии, если оно не уступает по терапевтической активности парентеральному или близко к нему, имеет целый ряд преимуществ, выражающихся прежде всего в значительном фармако-экономическом эффекте, простоте применения, отсутствии локальных осложнений, имеющих место в случае экстравазации при парентеральном введении, и в улучшении качества жизни больного.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для лечения злокачественных опухолей и возможность перорального введения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола.

Указанный технический результат достигается в применении соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол перорально для лечения меланомы В16, опухоли Эрлиха, саркомы 180, саркомы 37, лимфосаркомы ЛИО-1 и карциносаркомы Walker 256 в эксперименте на мышах и крысах.

Сущность изобретения заключается в противоопухолевой активности перорального применения соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол в эксперименте, сопоставимой с активностью его парентерального применения и в значительной степени превосходящей активность используемого в клинической практике в лекарственной форме для перорального введения ближайшего структурного аналога заявляемого соединения - препарата ломустин, синтезированного в США (Broder L.E., Carter S. CCNU, Clinical Brochure, Bethesda, MD, NCI, 1971), представляющего собой 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевину, применяемого в лечении первичных и метастатических опухолей головного мозга, меланомы, злокачественных лимфом, рака желудка и кишечника, мелкоклеточного рака легкого, почечноклеточного рака, множественной миеломы.

Способ иллюстрируется фиг. 1-14, где:

на фиг. 1 - влияние перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения на рост меланомы В16;

на фиг. 2 - влияние перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения на рост перевитой подкожно опухоли Эрлиха;

на фиг. 3-влияние перорального введения ломустина и заявляемого соединения на рост подкожной опухоли Эрлиха.

на фиг. 4 - влияние перорального введения ломустина и заявляемого соединения на выживаемость мышей с трансплантированной интракраниально опухолью Эрлиха;

на фиг. 5 - влияние перорального введения заявляемого соединения на рост саркомы 180 у мышей;

на фиг. 6 - влияние перорального введения заявляемого соединения на выживаемость мышей с саркомой 180;

на фиг. 7 - влияние ломустина и заявляемого соединения на массу тела у мышей с саркомой 37;

на фиг. 8 - влияние перорального введения ломустина и заявляемого соединения на рост саркомы 37 у мышей BALB/c;

на фиг. 9 - влияние перорального введения ломустина и заявляемого соединения на выживаемость мышей с трансплантированной внутримышечно саркомой 37;

на фиг. 10 - влияние перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения на рост трансплантированной подкожно лимфосаркомы ЛИО-1;

на фиг. 11 - влияние перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения на выживаемость мышей с трансплантированной подкожно лимфосаркомой ЛИО-1;

на фиг. 12 - влияние перорального и внутривенного введения заявляемого соединения на выживаемость мышей с трансплантированной интракраниально лимфосаркомой ЛИО-1;

на фиг. 13 - влияние перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения на рост трансплантированной подкожно карциносаркомой Walker 256 у крыс;

на фиг. 14 - влияние перорального и внутрибрюшинного ведения заявляемого соединения на выживаемость крыс с трансплантированной подкожно карциносаркомой Walker 256.

Сущность изобретения подтверждается экспериментальными примерами.

Пример 1. Сравнительное изучение острой токсичности 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) при пероральном и парентеральном (внутривенном и внутрибрюшинном) введениях.

Острая токсичность заявляемого соединения исследовалась на мышах и крысах самцах. Непосредственно перед введением хлонизол растворяли в изотоническом растворе натрия хлорида и вводили перорально зондом в желудок или внутривенно в боковую вену хвоста, или внутрибрюшинно.

LD₅₀ заявляемого соединения при однократном пероральном введении составила у мышей 35 мг/кг, при внутривенном - также 35 мг/кг, при внутрибрюшинном - 36 мг/кг. У крыс при пероральном введении LD₅₀ равнялась 31 мг/кг, при внутрибрюшинном - 30 мг/кг.

Максимально переносимой дозой (МПД₁)) у мышей при однократном как пероральном, так и внутривенном и внутрибрюшинном введении была доза 20 мг/кг.

У крыс МПД1 при пероральном и внутрибрюшинном введении также была доза 20 мг/кг.

В таблицах 1 и 2 представлены результаты определения DL₅₀ у мышей (табл. 1) и крыс (табл. 2) при пероральном и других способах введения.

Обращает на себя внимание, что параметры острой токсичности заявляемого соединения были практически одинаковыми при различных способах введения, что может указывать на его высокую биодоступность, и как следствие этого, противоопухолевая активность заявляемого соединения при пероральном введении не должна иметь существенных отличий от активности при парентеральном введении.

Пример 2. Исследование активности перорального

и внутрибрюшинного введения 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) у мышей F1(C57BlxCBA) с меланомой В16.

Исследование было проведено на 30 мышах-самцах F1(C57BlxCBA) с перевитой под кожу правой боковой поверхности туловища меланомы В16. После перевивки опухоли мыши были рандомизированы на 3 группы по 10 мышей в группе.

I. Контроль (n=10)

II. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг внутрибрюшинно (n=10)

Заявляемое соединение было введено однократно в максимально переносимой дозе 20 мг/кг на 3 день после перевивки опухоли.

Оба способа введения проявили значительную противоопухолевую активность. И хотя эффективность перорального пути введения была несколько меньше парентерального, противоопухолевая активность перорального введения заявляемого соединения у мышей с меланомой В16 была очень высокой (фиг. 1).

Влияние перорального и внутрибрюшиного введения 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола на рост меланомы В16 у мышей F1(C57BlxCBA) представлено в табл. 3.

Как видно из табл.3 при обоих способах введения торможение роста опухоли достигало 100% (табл. 3).

Интегральным показателем противоопухолевой активности препарата, учитывающим как выраженность противоопухолевого эффекта, так и его продолжительность, могут служить площадь под кинетической кривой роста опухоли и индекс роста опухоли (отношение площади под кинетической кривой роста опухоли в исследуемой группе к контрольной) (табл. 4).

Судя по площади под кинетической кривой роста опухоли и индексу роста опухоли, противоопухолевый эффект заявляемого соединения при пероральном введении был очень значительным, хотя и менее выраженным, чем при парентеральном введении.

Пример 3. Исследование активности перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола у мышей с солидной опухолью Эрлиха.

Исследование проведено на 30 мышах самцах линии BALB/c. Всем мышам была трансплантирована опухоль Эрлиха подкожно. После перевивки мыши были рандомизированы на 3 группы:

I. Контроль (n=10)

II. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг внутрибрюшинно (n=10)

Заявляемое соединение было введено однократно на 3 день после перевивки опухоли в дозе 20 мг/кг, являющейся максимально переносимой как при парентеральном, так и при пероральном введении заявляемого соединения.

При обоих способах введения заявляемое соединение проявило практически одинаковую противоопухолевую активность (фиг. 2).

Торможение роста опухоли при пероральном введении составило в разные сроки после перевивки от 55 до 79%, а под влиянием внутрибрюшинного - от 69 до 81% (табл. 5).

Практически одинаковыми при обоих способах введения оказались площади под кинетическими кривыми роста опухоли и индексы роста опухоли (табл. 6).

Пример 4. Сравнение противоопухолевой активности перорального введения ломустина и 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) на рост солидной опухоли Эрлиха.

Исследование было проведено на 30 мышах-самках BALB/c.

Всем мышам была перевита под кожу опухоль Эрлиха. После перевивки мыши были рандомизированы на 3 группы по 10 мышей в группе:

I. Контроль(n=10)

II. Ломустин 50 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=10)

Ломустин, являющийся применяемым перорально ближайшим структурным аналогом заявляемого соединения, и заявляемое соединение были введены перорально однократно в максимально переносимых дозах (соответственно 50 и 20 мг/кг) через 48 часов после перевивки опухоли.

Противоопухолевый эффект заявляемого соединения со статистической достоверностью превосходил эффект ломустина (фиг. 4).

В различные сроки после перевивки торможение роста опухоли под влиянием заявляемого соединения составляло 89-94%, а под влиянием ломустина - лишь 40-76% (табл. 7). Площадь под кинетической кривой роста опухоли при лечении заявляемым соединением была почти в 4 раза меньше, чем при лечении ломустином (р<0,01). Индексы роста опухоли при лечении заявляемым соединением и ломустином составили соответственно 10,41% и 40,22% (табл. 8).

Полученные результаты свидетельствуют о значительном преимуществе в противоопухолевой активности перорального введения заявляемого соединения перед его ближайшим структурным аналогом ломустином у мышей с перевитой под кожу опухолью Эрлиха.

Пример 5. Сравнение противоопухолевой активности перорального введения ломустина и 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) у мышей с трансплантированной интракраниально опухолью Эрлиха.

Исследование было проведено на 32 мышах-самках BALB/c Всем мышам была интракраниально трансплантирована опухоль Эрлиха.

После перевивки опухоли мыши были рандомизированы на 3 группы:

I. Контроль (n=12)

II. Ломустин 50 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=10)

Ломустин и заявляемое соединение были введены мышам однократно перорально в максимально переносимых дозах (соответственно 50 и 20 мг/кг) через 24 часа после трансплантации опухоли.

Продолжительность жизни мышей с внутримозговой опухолью при лечении заявляемым соединением оказалась со статистической достоверностью больше как по сравнению с контрольными мышами (р<0,001), так и с мышами, леченными ломустином (р<0,001) (фиг. 5, табл. 9).

Анализ выживаемости по log-rank (Mantel-Cox) тесту показал статистически достоверное увеличение выживаемости в группе заявляемого соединения в сравнении с контролем (р<0,00001, χ²=20,00) и заявляемого соединения в сравнении с ломустином (р<0,00001, χ²=18,00) и отсутствие статистически достоверного увеличения выживаемости в группе ломустина в сравнении с контролем (р=0,3642, χ²=0,8233).

Медиана продолжительности жизни у мышей с интракраниальной опухолью, получивших заявляемое соединение, была выше (р<0,001), как по сравнению с контролем, так и по сравнению с мышами, получившими ломустин (табл. 9).

Таким образом, заявляемое соединение значительно превосходит по терапевтической активности ломустин у мышей с опухолью Эрлиха, трансплантированной интракраниально.

Пример 5. Исследование активности перорального введения 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) у мышей с перевитой под кожу саркомой 180.

Исследование проведено на 20 мышах самках BALB/c с перевитой подкожно саркомой 180. После перевивки мыши были рандомизированы на 2 группы:

I. Контроль (n=11)

II. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=9)

Заявляемое соединение было введено однократно на 3 день после перевивки опухоли.

Под влиянием однократного перорального введения заявляемого соединения торможение роста саркомы 180 достигало 99%, отмечались не только замедление роста опухолей, но и их регрессия (фиг. 6, табл. 10).

Площадь под кинетической кривой роста опухоли была меньше, чем в контроле почти в 15 раз (табл. 11).

Вызванное заявляемым соединением угнетение роста опухоли обусловило значительное увеличение продолжительности жизни животных (фиг. 7).

Согласно log-rank TecTy(Mantel-Cox), наблюдалось статистически достоверное увеличение выживаемости в группе заявляемого соединения в сравнении с контролем (р<0,0001, χ²=18,79).

По сравнению с контролем медиана продолжительности жизни у мышей с саркомой 180, получивших хлонизол, возросла на 181% (табл. 12).

Пример 6. Сравнительное изучение перорального введения ломустина и 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) у мышей с трансплантированной внутримышечно саркомой 37.

Исследование было проведено на 30 мышах BALB/c. Всем мышам была перевита внутримышечно саркома 37. После перевивки мыши были рандомизированы на 3 группы:

I. Контроль (n=10)

II. Ломустин 50 мг/кг перорально (n=8)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=8)

Ломустин и заявляемое соединение были введены перорально однократно на 3 день после перевивки опухоли.

Ломустин и заявляемое соединение в максимально переносимых дозах вызывали заметное, статистически значимое снижение массы тела у мышей (фиг. 8, табл. 13).

В группе мышей, которым был введен ломустин, снижение массы тела по сравнению с исходным достигло 21%, а в группе мышей, получивших заявляемое соединение, - 17% (табл. 13). То есть выраженность этого побочного эффекта при пероральном введении ломустина в дозе 50 мг/кг и пероральном введении заявляемого соединения в дозе 20 мг/кг была практически одинаковой. В то же время при введении в этих же самых дозах противоопухолевая активность заявляемого соединения значительно превосходила активность ломустина (фиг. 8).

Максимальное торможение роста опухоли под влиянием заявляемого соединения достигало - 99%, а под влиянием ломустина - лишь 78% (табл. 14).

О значительном преимуществе заявляемого соединения перед ломустином свидетельствовали площадь под кинетической кривой роста опухоли и индекс роста опухоли, которые в группе мышей, получивших заявляемое соединение, были почти на порядок меньше, чем у мышей, получивших ломустин (табл. 15).

Продолжительность жизни мышей, получивших заявляемое соединение, превышала продолжительность жизни как контрольных мышей, так и мышей, получивших ломустин (фиг. 9, табл. 16).

Согласно log-rank (Mantel-Cox) тесту, имелось статистически достоверное увеличение выживаемости в группе заявляемое соединение в сравнении с контролем (р=0,0043, χ²=8,136) и заявляемое соединение в сравнении с ломустином (р=0,0115, χ²=6,383) и не было статистически достоверного увеличения выживаемости в группе ломустин в сравнении с контролем (р=0,4220, χ²=0,6447).

Медиана продолжительности жизни у мышей, получивших хлонизол, была достоверно выше (р=0,012), чем у получивших ломустин (табл. 16).

Результаты эксперимента свидетельствуют, что у мышей с трансплантированной внутримышечно саркомой 37 противоопухолевый эффект заявляемого соединения значительно превосходил эффект ломустина при использовании обоих средств в дозах, эквивалентных по токсичности.

Пример 7. Сравнительное изучение противоопухолевой активности перорального и внутрибрюшинного введения 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) у мышей с трансплантированной подкожно лимфосаркомой ЛИО-1.

Исследование проведено на 30 мышах самках BALB/c с перевитой под кожу лимфосаркомой ЛИО-1. После трансплантации опухоли мыши были рандомизированы на 3 группы:

I. Контроль (n=10)

II. Заявляемое соединение 20 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг внутрибрюшинно (n=10)

Заявляемое соединение было введено однократно на 3 день после перевивки опухоли.

Как при пероральном, так и при внутрибрюшинном способе введения торможение роста опухоли достигало 100% (фиг. 10, табл. 17). Некоторое преимущество внутрибрюшинного введения перед пероральным не было статистически достоверным (табл. 17).

Площадь под кинетической кривой роста опухоли и индекс роста опухоли при пероральном введении заявляемого соединения были больше, чем при внутрибрюшинном введении, однако эта разница между эффектами двух способов введения не достигала статистической достоверности (табл. 18)

Увеличение продолжительности жизни мышей с перевитой под кожу лимфосаркомой ЛИО-1 было практически одинаковым при пероральном и внутрибрюшинном введении (фиг. 11).

Согласно log-rank (Mantel-Cox) тесту, имелось статистически достоверное увеличение выживаемости в группе заявляемое соединение при пероральном введении в сравнении с контролем (р<0,0001, χ²=20,39) и заявляемое соединение внутрибрюшинно в сравнении с контролем (р<0,0001? χ²=20,39) и не было статистически достоверного увеличения выживаемости в группе ломустина в сравнении с контролем (р=0,2289, χ²=0,6323).

Пероральное введение заявляемого соединения увеличило медиану продолжительности жизни мышей на 63%, внутрибрюшинное - на 60% (табл. 19).

Таким образом, у мышей с трансплантированной под кожу лимфосаркомой ЛИО-1 заявляемое соединение было высоко активно как при парентеральном, так и при пероральном введении.

Пример 8. Сравнительное изучение перорального и внутривенного введения 2-[3-(2-хлорэтил)-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиола (заявляемого соединения) у мышей с трансплантированной интракраниально лимфосаркомой ЛИО-1.

Исследование проведено на 30 мышах самках линии BALB/c. Всем мышам была перевита интракраниально лимфосаркома ЛИО-1. После перевивки мыши были рандомизированы на 3 группы:

I. Контроль (n=10)

II. Заявляемое соединения 20 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 20 мг/кг внутривенно (n=10)

Заявляемое соединение было введено однократно через 24 часа после интракраниальной трансплантации опухоли.

Оба способа введения обусловили отчетливое увеличение выживаемости мышей с перевитой интракраниально лимфосаркомой ЛИО-1 (фиг. 12).

Согласно log-rank (Mantel-Cox) тесту, имелось статистически достоверное увеличение выживаемости в группе заявляемое соединение перорально по сравнению с контролем (р<0,0001, χ²=18,58) и в группе заявляемое соединение внутривенно по сравнению с контролем (р<0,0001, χ²=18,58) и не было статистически достоверной разницы в группе заявляемое соединение перорально по сравнению с группой заявляемое соединение внутривенно (р=0,14237, χ²=2,138).

Пероральное введение заявляемого соединения увеличило медиану продолжительности жизни мышей с внутримозговой лимфосаркомой ЛИО-1 на 50%, а внутривенное - на 62% (табл. 20). Некоторое преимущество внутривенного пути введения перед пероральным не было статистически достоверным.

Полученные результаты свидетельствуют о терапевтической активности перорального введения хлонизола, сопоставимой с его активностью при парентеральном (внутривенном) введении, у мышей

с трансплантированной интракраниально лимфосаркомой ЛИО-1.

Пример 9. Сравнительное изучение активности перорального и внутрибрюшинного введения заявляемого соединения у крыс с трансплантированной подкожно карциносаркомой Walker 256.

Карциносаркома Walker 256 была перевита подкожно крысам Вистар самцам. После перевивки крысы были рандомизированы на 3 группы.

I. Контроль (n=15)

II. Заявляемое соединение 15 мг/кг перорально (n=10)

III. Заявляемое соединение 15 мг/кг внутрибрюшинно (n=10)

Заявляемое соединение было введено однократно в дозе 15 мг/кг на 6 день после перевивки.

Как при пероральном, так и при внутрибрюшинном введении заявляемое соединение обусловило регрессию опухолевых узлов (фиг. 13). При обоих способах введения полная регрессия опухолей с излечением животных была достигнута у 50% крыс (табл. 21).

Судя по площади под кинетической кривой роста опухоли и индексу роста опухоли, эффект перорального введения заявляемого соединения практически не отличался от эффекта парентерального введения (табл. 22).

Оба способа введения заявляемого соединения значительно увеличили выживаемость крыс с карциносаркомой Walker 256 (фиг. 14).

Согласно log-rank (Mantel-Cox) тесту, имелось статистически достоверное увеличение выживаемости по сравнению с контролем в группе заявляемое соединение перорально (р<0,0001, χ²=23,77) и заявляемое соединение внутрибрюшинно (р<0,0001, χ²=23,77) и нет статистически достоверной разницы в группе заявляемое соединение перорально по сравнению с группой заявляемое соединение внутрибрюшинно (р=0,6027, χ²=0,2710).

Таким образом, заявляемое соединение обладает высокой терапевтической активностью у крыс с карциносаркомой Walker 256, практически одинаково выраженной при пероральном и парентеральном способах введения.

Изобретение относится к медицине и касается применения соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол перорально для лечения меланомы В16, опухоли Эрлиха, саркомы 180, саркомы 37, лимфосаркомы ЛИО-1 и карциносаркомы Walker 256 в эксперименте на мышах и крысах. Изобретение расширяет арсенал средств лечения злокачественных опухолей. 9 пр., 14 ил., 22 табл.

Применение соединения 2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол перорально для лечения меланомы В16, опухоли Эрлиха, саркомы 180, саркомы 37, лимфосаркомы ЛИО-1 и карциносаркомы Walker 256 в эксперименте на мышах и крысах.