СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПЕЛЛЕТ, СОДЕРЖАЩИХ ФАКТОР VIII Российский патент 2020 года по МПК A61K9/19 A61K38/37 F26B5/06 

Настоящее изобретение относится к способу получения лиофилизированных пеллет, содержащих фактор VIII, причем способ включает стадии: а) замораживания капель раствора, содержащего фактор VIII, с образованием пеллет; и b) лиофилизации пеллет.

Фактор VIII (FVIII) представляет собой белок, обнаруженный в плазме крови, который действует как кофактор в каскаде реакций, ведущих к свертыванию крови. Дефицит количества активности FVIII в крови приводит к нарушению свертывания крови, известному как гемофилия А, наследственное состояние, в первую очередь поражающее мужчин. В настоящее время гемофилию А лечат терапевтическими препаратами FVIII, полученными из плазмы человека или полученными с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Такие препараты вводят либо в ответ на эпизод кровотечения (терапия по требованию), либо с частыми регулярными интервалами для предотвращения неконтролируемого кровотечения (профилактика).

Обычный способ получения и упаковки парентеральных биофармацевтических препаратов включает получение нерасфасованного раствора в соответствии с измеренной биологической активностью промежуточного вещества, используемого для приготовления нерасфасованного раствора. Во многих случаях, особенно в конце процесса, нерасфасованный раствор замораживают и хранят для проведения анализа. Для этой цели замороженный раствор может храниться в течение нескольких дней или даже в течение нескольких недель. Для последующего заполнения конечных упаковок, таких как флаконы, для распространения среди конечных пользователей, замороженный промежуточный раствор обычно оттаивают, собирают и заполняют в флаконы, а затем лиофилизируют внутри флаконов.

Количество оттаивавшего нерасфасованного раствора, которое заполняется в окончательные упаковочные флаконы, рассчитывается на основе анализа промежуточного раствора. Этот расчет обычно включает большой запас безопасности из-за (1) больших вариаций биологического анализа и (2) потери выхода при последующем стерильном заполнении и процессе лиофилизации. Потеря выхода происходит из-за напряжения продукта во время этой первой стадии замораживания, хранения и оттаивания и последующего второго процесса наполнения, замораживания и сушки. Этот расчет, конечно, очень сложный и основан на зависимых от продукта эмпирических знаниях о полном процессе.

В обычных процессах лиофилизация обычно выполняется в стандартных лиофилизационных сушильных камерах, которые не имеют стенки с контролируемой температурой. К сожалению, эти сушилки обеспечивают неоднородную передачу тепла в флаконы, помещенные в сушильную камеру. Особенно те флаконы, которые расположены на краях, обмениваются энергией более интенсивно, чем те, которые расположены в центре полок, благодаря радиационному теплообмену и естественной конвекции в зазоре между стенкой камеры и стопкой пластин/полок. Эта неравномерность распределения энергии приводит к изменению кинетики замораживания и сушки между флаконами по краях и флаконами в центре и может приводить к изменению активности активного содержимого соответствующих флаконов. Для обеспечения однородности конечного продукта необходимо провести обширную работу по разработке и валидации как в лабораторных, так и в производственных масштабах.

В публикации Wang, D.Q., MacLean, D. and Ma, X. (2010) entitled Process Robustness in Freeze Drying of Biopharmaceuticals, in Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals (eds F. Jameel and S. Hershenson), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA раскрываются специфические циклы лиофилизации для рекомбинантного FVIII, но все же подтверждаются изменения эффективности в зависимости от положения флакона в лиофилизационной камере.

В WO 2010/054238 А1 раскрывается стабильная лиофилизированная фармацевтическая композиция фактора VIII (FVIII), содержащая: (a) FVIII; (b) одно или более буферизующих средств; (с) один или более антиоксидантов; (d) один или более стабилизирующих агентов; и (е) одно или более поверхностно-активных веществ; причем указанный FVIII содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из: а) рекомбинантного полипептида FVIII; b) биологически активного аналога, фрагмента или варианта а); указанный буфер содержит рН буферизующее средством в диапазоне от около 0,1 мМ до около 500 мМ, и указанное значение рН находится в диапазоне от около 2,0 до около 12,0; указанный антиоксидант находится при концентрации от около 0,005 до примерно 1,0 мг / мл; указанный стабилизирующий агент находится при концентрации от примерно 0,005 до около 20%; указанное поверхностно-активное вещество находится при концентрации от около 0,001% до около 1,0%; и причем указанная композиция не содержит хлорид натрия (NaCl) или содержит только следовое количество NaCl.

В WO 2006/008006 А1 раскрывается способ стерильного получения, включающий лиофилизацию, хранение, анализ и наполнение гранулированных биофармацевтических продуктов в конечные контейнеры, такие как флаконы. Описывается способ получения контейнеров из лиофилизированного продукта, причем способ включает стадии замораживания капель продукта с образованием пеллет, лиофилизацию пеллет, анализ лиофилизированных пеллет и загрузку лиофилизированных пеллет в контейнеры. Более конкретно, способ включает стадии: а) замораживания капель продукта с образованием пеллет, причем капли образуются путем пропускания раствора продукта через сопла с частотной характеристикой, и пеллеты образуются из указанных капель посредством пропускания их через противоток криогенного газа; b) лиофилизации пеллет; с) хранения и гомогенизации лиофилизированных пеллет; d) анализа лиофилизированных пеллет при их хранении и гомогенизации; и е) загрузку лиофилизированных пеллет в указанные контейнеры.

В WO 2013/050156 А1 описана технологическая линия для получения лиофилизированных частиц в закрытых условиях, включающая по меньшей мере распылительную камеру для образования капель и сгущение замораживанием капель жидкости с образованием частиц и устройство для лиофилизации навалом для лиофилизации частиц, причем устройство для лиофилизации содержит вращающийся барабан для приема частиц. Кроме того, предусмотрена секция переноса для передачи продукта из распылительной камеры в устройство для лиофилизации. Для получения частиц в непрерывных закрытых условиях каждое из устройств и секции переноса отдельно приспособлено для эксплуатации, сохраняя стерильность продукта, подлежащего лиофилизации и/или помещению в контейнер.

В WO 2013/050161 А1 раскрывается технологическая линия для получения лиофилизированных частиц в закрытых условиях, причем технологическая линия содержит устройство для лиофилизации для основного товарного производства навалом лиофилизированных частиц в закрытых условиях, причем устройство для лиофилизации содержит вращающийся барабан для приема замороженных частиц и стационарную вакуумную камеру, содержащую вращающийся барабан, причем для получения частиц в закрытых условиях вакуумная камера адаптирована для закрытой работы во время обработки частиц. Барабан находится в открытом контакте с вакуумной камерой, и предусмотрена по меньшей мере одна секция переноса для передачи продукта между отдельным устройством технологической линии и устройством для лиофилизации, причем устройство для лиофилизации и секция переноса по отдельности адаптированы для закрытой работы, где секция переноса содержит внутреннюю поверхность стенок с контролируемой температурой.

Было бы желательно получать лиофилизированные пеллеты фактора VIII с незначительными изменениями активности для отдельных пеллет в условиях строгого отделения извне - это включает любой криогенный газ, такой как жидкий азот. Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении такого способа.

Эта задача решается согласно настоящему изобретению посредством способа получения лиофилизированных пеллет, содержащих фактор VIII, причем способ включает стадии:

a) замораживания капель раствора, содержащих фактор VIII, с образованием пеллет;

b) лиофилизации пеллет;

где на стадии а) капли образуются посредством образования капель раствора, содержащего фактор VIII, в башне для охлаждения, которая имеет внутреннюю поверхность стенок с контролируемой температурой и внутреннюю температуру ниже температуры замерзания раствора, и на стадии b) пеллеты лиофилизируют во вращающемся приемнике, который находится внутри вакуумной камеры.

Принцип осуществления способа согласно настоящему изобретению имеет три различных преимущества. Во-первых, следует отметить, что в способе согласно настоящему изобретению распыленные капли раствора, содержащего фактор VIII, не контактируют с криогенным газом противоточным образом, как описано в WO 2006/008006 А1. Нет необходимости вводить криогенный газ во внутреннее пространство башни для охлаждения, и поэтому все стадии обработки и стерилизации для криогенного газа можно опустить.

Во-вторых, проведя стадию лиофилизации во вращающемся приемнике внутри вакуумной камеры, пространственное положение каждой отдельной пеллеты равномерно распределено во времени. Это обеспечивает равномерные условия сушки и поэтому устраняет пространственные изменения активности фактора VIII, как это было бы в случае лиофилизированных ампул на полке.

В-третьих, экспериментально было обнаружено, что пеллеты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, проявляют меньшие микроколлапсы, благодаря тому, что условия процесса в общем, которым полипептиды FVIII подвергаются, в среднем являются более мягкими, чем в предшествующем уровне техники. Упомянутое снижение появления микроколлапсов пеллет видно на REM-изображениях таких пеллет, которые показывают более однородную поверхность, что так же приводит к улучшенным свойствам обработки на более поздних стадиях процесса для этих пеллет.

Прямое сравнение со способом, описанным в WO 2006/008006 А1, неожиданно показало, что морфология поверхности полученных пеллет согласно настоящему изобретению значительно более гомогенна, чем морфология поверхности пеллет, полученных способом согласно WO 2006/008006 А1, и способ согласно настоящему изобретению обеспечивает пеллеты с дополнительной повышенной удельной поверхностью (по БЭТ), тогда как пеллеты, полученные способом согласно WO 2006/008006 А1, уже имели улучшенную однородность и удельную поверхность по сравнению с любыми процессами лиофилизации, известными из уровня техники.

Экспериментально установлено, что фактические эффективности пеллет после лиофилизации составляют от 86,2% до 89,9% от целевых эффективностей для фактора VIII.

Все стадии способа согласно настоящему изобретению могут быть выполнены в стерильных условиях и без потери стерильности между отдельными стадиями.

Создание замороженных пеллет может быть осуществлено с помощью любой известной методики, как например, с помощью "Encapsulator Research" от Inotech Encapsulation, Switzerland, или "Kryogen Rapid Pelletizer" от Messer-Griesheim, Germany или "CRYOGENIC PELLETIZER" от IQFCRYOGRAN, Canada. Однако эти методики, известные из уровня техники, в основном основаны на падении капель в жидкий азот, чтобы они образовывали пеллеты после сушки.

Благодаря последующей стадии лиофилизации замороженные пеллеты, как ожидается, будут иметь узкое распределение частиц по размеру. Впоследствии замороженные пеллеты могут транспортироваться в стерильных и холодных условиях в устройство для лиофилизации. Затем пеллеты распределяются по несущим поверхностям внутри сушильной камеры путем вращения приемника.

Сублимационная сушка в принципе возможна в устройствах для лиофилизации любого вида, подходящих для пеллет. Предпочтительны устройства для лиофилизации, обеспечивающие пространство для потока сублимационного пара, контролируемые температуры стенок и подходящие площади поперечного сечения между сушильной камерой и конденсатором.

Подробное описание вариантов фактора VIII, которые могут быть использованы в способе согласно настоящему изобретению, описаны ниже. Предпочтительно используют рекомбинантный фактор VIII, полученный из клеток почки новорожденного хомяка без дополнительных белков.

В контексте настоящего изобретения термин «фактор VIII» или «FVIII» или «rAHF» относится к любой молекуле FVIII, которая имеет по меньшей мере часть домена В интактной и которая проявляет биологическую активность, которая связана с нативным FVIII. В одном варианте выполнения настоящего изобретения молекула FVIII представляет собой FVIII полной длины. Молекула FVIII представляет собой белок, который кодируется последовательностями ДНК, способными гибридизоваться с ДНК, кодирующей FVIILC. Такой белок может содержать делеции аминокислот в различных положениях между или внутри доменов А1-А2-В-А3-С1-С2 (патент США 4868112). Молекула FVIII также может быть аналогом нативного FVIII, где один или более аминокислотных остатков были заменены посредством сайт-направленного мутагенеза.

В соответствии с настоящим изобретением термин «рекомбинантный фактор VIII» (rFVIII) может включать любой rFVIII, гетерологичный или природного происхождения, полученный посредством технологии рекомбинантной ДНК, или его биологически активное производное. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения этот термин охватывает белки, как описано выше, и нуклеиновые кислоты, кодирующие rFVIII согласно настоящему изобретению. Такие нуклеиновые кислоты включают, например, и без ограничения, гены, пре-мРНК, мРНК, полиморфные варианты, аллели, синтетические мутанты и мутанты природного происхождения. Белки, охватываемые термином rFVIII, включают, например, и без ограничения, те белки и полипептиды, описанные выше, белки, кодированные описанной выше нуклеиновой кислотой, межвидовые гомологи и другие полипептиды, которые: (1) имеют аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность аминокислотной последовательности более чем около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98% или около 99% или более, в области из по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 200, около 300, около 400, или более аминокислот (вплоть до последовательности полной длины из 2332 аминокислот для зрелого нативного белка), с полипептидом, кодируемым ссылочной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью, описанной в настоящей заявке; и/или (2) специфически связываются с антителами, например поликлональными или моноклональными антителами, генерируемыми против иммуногена, содержащего ссылочную аминокислотную последовательность, как описано в настоящей заявке, их иммуногенным фрагментом и/или их консервативно модифицированным вариантом.

Как применяется в настоящей заявке, термин «эндогенный FVIII» включает FVIII, который происходит из млекопитающего, подлежащего лечению. Термин также включает FVIII, транскрибированный из трансгена или любой другой чужеродной ДНК, присутствующей у указанного млекопитающего. Как применяется в настоящей заявке, термин «экзогенный FVIII» включает FVIII, который не происходит из указанного млекопитающего.

Молекула FVIII существует в природе и в терапевтических препаратах в виде гетерогенного распределения полипептидов, происходящих из единого генного продукта (смотрите, например, Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2979 2983, May 1986). Как применяется в настоящей заявке, термин «фактор VIII» относится ко всем таким полипептидам, независимо от того, получены они из плазмы крови или продуцируются с использованием технологий рекомбинантной ДНК, и включает, но не ограничивается ими, миметики FVIII, конъюгаты fc-FVIII, FVIII, химически модифицированные растворимыми в воде полимерами, и другие формы или производные FVIII. Коммерчески доступные примеры терапевтических препаратов, содержащих FVIII, включают те, которые продаются под торговыми наименованиями HEMOFIL М и RECOMB INATE (доступны от Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, 111., U.S.A.). Другие препараты состоят в основном из одной субпопуляции молекул FVIII, у которых отсутствует часть домена В молекулы.

Исходным веществом согласно настоящему изобретению является FVIII, который может быть получен из плазмы человека, или производится посредством рекомбинантной инженерной методики, как описано в патентах: Патент США №4,757,006; Патент США №5,733,873; Патент США №5,198,349; Патент США №5,250,421; Патент США №5,919,766; ЕР 306 968.

Молекулы FVIII, применяемые согласно настоящему изобретению, включают белок полной длины, предшественники белка, биологически активные или функциональные субъединицы или фрагменты белка и их функциональные производные, а также их варианты, как описано далее. Ссылка на FVIII означает включающую все потенциальные формы таких белков, и где каждая из форм FVIII имеет по меньшей мере часть или всю последовательность нативного В-домена неизменной.

Полинуклеотиды, кодирующие rFVIII согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, те, которые (1) специфически гибридизуются при строгих условиях гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей ссылочную аминокислотную последовательность, как описано в настоящей заявке, и их консервативно модифицированные варианты; (2) имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет идентичность нуклеотидной последовательности более около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или выше, в области из по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 150, около 200, около 250, около 500, около 1000, или более нуклеотидов (до последовательности полной длины из 6996 нуклеотидов зрелого белка), с ссылочной последовательностью нуклеиновой кислоты, как описано в настоящей заявке.

Вариантные (или аналоговые) полипептиды включают варианты, образованные посредством вставки, где один или более аминокислотных остатков добавляют к аминокислотной последовательности FVIII согласно настоящему изобретению. Вставки могут быть расположены на любом или на обоих концах белка и/или могут быть расположены во внутренних областях аминокислотной последовательности FVIII. Варианты, образованные посредством вставки, с дополнительными остатками на одном или обоих концах включают, например, слитые белки и белки, включающие аминокислотные метки или другие аминокислотные метки. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, молекула FVIII может необязательно содержать N-концевой Met, особенно когда молекула экспрессируется рекомбинантно в бактериальной клетке, такой как Е. coli.

В вариантах, образованных посредством делеции, одна или более аминокислотных остатков в полипептиде FVIII, как описано в настоящей заявке, удаляются. Делеции могут быть осуществлены на одном или на обоих концах полипептида FVIII и/или посредством удаления одного или более остатков внутри аминокислотной последовательности FVIII. Поэтому варианты, образованные посредством делеции, включают все фрагменты полипептидной последовательности FVIII.

В вариантах, образованных посредством замещения, один или более аминокислотных остатков полипептида FVIII удаляются и заменяются альтернативными остатками. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, замещения являются консервативными по своей природе, и консервативные замещения этого типа хорошо известны в данной области техники. Альтернативно, настоящее изобретение включает в себя замещения, которые также являются неконсервативными. Примерные консервативные замещения описаны в Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp. 71-77] и изложены непосредственно ниже.

Варианты выполнения настоящего изобретения и дополнительные аспекты настоящего изобретения будут описаны ниже. Их можно свободно комбинировать, если из контекста настоящего изобретения явно не указывает на другое.

Для настоящего изобретения любая делеция, замещение и/или другая вариация полипептида FVIII может быть осуществлена без необходимости дальнейшего изменения самого процесса. Однако это имеет значение для процесса, в котором полипептид FVIII обрабатывается, поскольку это является специфическим для полученных композиций FVIII, что они содержат только незначительную часть фактического полипептида FVIII по сравнению с общим количеством составляющих в них.

Из этого следует, что способ должен быть таким, чтобы избежать любого потенциального повреждения полипептида FVIII, лиофилизированного как часть композиции, поскольку небольшое снижение активности полипептида FVIII в полученной лиофилизированной композиции приводит к огромному в процентном отношении влиянию активности в конечном продукте.

В одном варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению способ дополнительно включает стадии с), d) и е) после стадии b):

c) хранения и гомогенизации лиофилизированных пеллет

d) анализа лиофилизированных пеллет при их хранении и гомогенизации;

e) загрузки лиофилизированных пеллет в контейнеры.

Стадия хранения и гомогенизации с) также может быть выполнена во вращающемся приемнике внутри вакуумной камеры, применяемой для лиофилизации. Для проведения анализа извлекается статистически значимое количество образцов. После этого опциональный отдельный контейнер для хранения упаковывается в стерильную защитную оболочку. После анализа содержимого каждого контейнера для хранения все необходимые свойства, такие как, например, содержание активных веществ известно. Затем может начаться процесс заполнения в конечные контейнеры с определенными пользователем количествами пеллет. Контейнеры для хранения переносятся на изолированную линию розлива и направляются на станцию разлива. Содержимое контейнеров переносится внутри изолятора в хранилище наполняющей машины.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению на стадии а) капли образуются посредством образования капель раствора посредством пропускания через сопла с частотной характеристикой. Предпочтительно частота колебаний составляет от ≥1000 Гц до ≤2000 Гц.

Независимо от того используется ли сопло с частотной характеристикой, диаметр сопла может находиться в интервале от 100 мкм до 500 мкм, предпочтительно в интервале от 200 мкм до 400 мкм, особенно предпочтительно в интервале от 350 мкм до 450 мкм. Указанные диаметры сопла приводят к размерам капель в интервале от около 200 мкм до около 1000 мкм, предпочтительно в интервале от около 400 мкм до около 900 мкм, особенно предпочтительно в интервале от около 700 мкм до 900 мкм

В этом контексте размер с использованием признака "около" означает размеры полученных капель, не отклоняющиеся более чем на ±30% от размера, упомянутого в зависимости от значения d₉₀ распределения. Например, полученный размер капли около 400 мкм понимается как капли, которые производятся с размером, варьирующимся от 280 мкм до 520 мкм в зависимости от значения d₉₀ распределения.

Образующиеся капли отображают определенное распределение капель по размеру около среднего значения, которое должно быть около того, на которое ссылаются выше.

В вариантах выполнения настоящего изобретения, где сопло использует частоту, вариация вокруг среднего значения меньше. В этих вариантах значение «около» может быть ограничено каплями, не отклоняющимися на более ±30% от указанного размера.

В приведенном выше примере полученный размер капли около 400 мкм можно затем пониматься как капли, получаемые с размером варьирующимся от 280 мкм до 520 мкм в зависимости от значения d₉₀ распределения. В связи с описанными ниже эффектами, пропускание капель через сопло с частотной характеристикой, таким образом, является еще одним преимуществом для дальнейшего снижения потенциального отрицательного воздействия на конечные лиофилизированные пеллеты.

Обычно капли указанных выше размеров имеют преимущество, поскольку было обнаружено, что последующие стадии b) - е) могут быть выполнены с более высоким выходом с точки зрения активности FVIII.

Не ограничиваясь этим, предполагается, что более мелкие капли слишком быстро замерзают на стадии лиофилизации b) из-за гораздо большего отношения поверхности к объему, и что, таким образом, фрагильный полипептид FVIII частично разрушается. Кроме того, более мелкие капли приводят к меньшим пеллетам, которые имеют повышенную склонность становиться электростатически заряженными, в то время как последнее ухудшает последующую обработку таких пеллет. Большие капли не замерзают гомогенно, что приводит к частичной деструкции полипептида FVIII во внешней оболочке лиофилизированной пеллеты и неполной лиофилизации внутреннего компартамента капель с последующей частичной деструкцией полипептида FVIII во время хранения.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению на стадии а) внутренняя поверхности башни для охлаждения имеет температуру не выше -120°С, предпочтительно от ≥-150°С до ≤-120°С. Предпочтительно температура составляет от ≥-140°С до ≤-130°С.

Упомянутые выше температуры от ≥-140°С до ≤-130°С являются оптимальными для размеров капель в интервале от около ≥700 мкм до около ≤900 мкм, которые замораживаются при падении на расстояние от 3 м до 4 м.

До тех пор пока температура сохраняется ниже -120°С на внутренней поверхности башни для охлаждения, предпочтительные результаты настоящего изобретения могут быть получены посредством регулировки расстояния падения и размера капель.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению внутреннюю поверхность башни для охлаждения охлаждают посредством пропускания охлаждающего агента через одну или более труб, которые находятся в термическом контакте с внутренней поверхностью. Охлаждающим средством может быть жидкий азот или пары азота желаемой температуры.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению целевую дозу устанавливается для фактора VIII, причем анализ на стадии d) определяет активное содержание фактора VIII в лиофилизированных пеллетах, и контейнеры загружаются количеством лиофилизированных пеллет, которое обеспечивает дозировку, которая равна целевой дозе или превышает целевую дозу на ≤25%. Предпочтительно целевая доза превышается на ≤10%, более предпочтительно на ≤5%.

Это прямой результат настоящего изобретения, позволяющий мягко замораживать полипептид FVIII, что позволяет не критично превышать целевую дозу при наполнении, поскольку этот способ не снижает активность полипептида FVIII.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению пеллеты, полученные на стадии а) имеют максимальное распределение частиц по размеру d50 от около ≥200 мкм до около ≤1500 мкм. Предпочтительным является максимальное распределение частиц по размеру d50 от около ≥700 мкм до около ≤900 мкм.

Пеллеты меньшего размера, чем 200 мкм, менее благоприятны, так как в этих пеллетах замораживание будет быстрее, что может привести к повреждению лиофилизированного полипептида и, следовательно, к потере эффективности, требуя более высокой целевой дозы. Кроме того, электростатическое воздействие полученного порошка резко возрастает при размерах ниже 200 мкм, что приводит к ухудшению управляемости свойствами продукта способа согласно настоящему изобретению, и можно ожидать потерь выхода из-за удерживания пеллет в водяном паре.

Увеличение размера пеллет до более 1500 мкм может поставить под угрозу полное замораживание пеллет в описанной установке и, таким образом, снизить общую эффективность последующего продукта.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению раствор, содержащие фактор VIII, на стадии а) имеет содержание растворенных твердых веществ от ≥8 мас. % до ≤12 мас. %. Предпочтительным является содержание растворенных твердых веществ от ≥9 мас. % до ≤11 мас. %.

На самом деле, более высокие загрузки растворенных твердых веществ от около 15 до 20 мас. %) будут считаться благоприятными в способах данного типа, поскольку, как правило, ожидается, что полученные пеллеты будут легче замораживаться и высушиваться более сильно.

Однако в данном случае указанные выше интервалы оказываются лучше, поскольку обрабатываемое твердое вещество (включающее FVIII) позднее необходимо восстанавливать и вводить в организм человека, что (при более высоких загрузках) либо приведет к несовместимой осмоляльности раствора для инъекций, что приводит к потенциальному повреждению тканей и/или боли при инъекции, либо иным образом потребует значительно более высоких объемов восстановления, чтобы избежать того, что фактически делает раствор практически неинъецируемым.

В другом варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению раствор, содержащие фактор VIII на стадии а), имеет следующий состав из расчета на 1 грамм раствора, причем остальным является вода:

Фактор VIII от ≥99 ME до ≤101 ME,

Сахароза от ≥68 мг до ≤72 мг, предпочтительно ≥70 мг до ≤71,8 мг

Гистидин от ≥2 мг до ≤4 мг, предпочтительно ≥3 мг до ≤3,8 мг

Глицин от ≥23 мг до ≤26 мг, предпочтительно ≥23,5 мг до ≤25,7 мг

NaCl от ≥1 мг до ≤3 мг, предпочтительно ≥1,5 мг до ≤2,5 мг

CaCl₂ от ≥0,2 мг до ≤0,4 мг, предпочтительно ≥0,25 мг до ≤0,35 мг

Полисорбат 80 от ≥0,07 мг до ≤0,1 мг, предпочтительно ≥0,075 мг до ≤0,095 мг

Настоящее изобретение далее дополнительно описано со ссылкой на следующие чертежи и примеры без ограничения настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей:

Фиг. 1 схематически показывает устройство для осуществления способа согласно настоящему изобретению

Фиг. 2 показывает температурный профиль в зависимости от времени в башне для охлаждения

Фиг. 3 показывает профиль температуры и давления в ходе стадии лиофилизации

Фиг. 4 показывает другой профиль температуры и давления в ходе стадии лиофилизации

Фиг. 5 показывает развитие активности образцов после различных периодов времени хранения при комнатной температуре (RT) или при 2-8°С

Фиг. 6 показывает распространение агрегации/фрагментации продукта образцов после различных периодов времени хранения при комнатной температуре (RT) или при 2-8°С

Фиг. 7 показывает изображение сканирующей электронной микроскопии (SEM) пеллеты, полученной согласно настоящему изображению, при 200-кратном увеличении

Фиг. 8 показывает изображение сканирующей электронной микроскопии (SEM) пеллеты, полученной согласно настоящему изображению, при 2000-кратном увеличении

Фиг. 9 показывает изображение сканирующей электронной микроскопии (SEM) пеллеты, полученной согласно способу, описанному в WO 2006/008006 А1, при 200-кратном увеличении

Фиг. 10 показывает изображение сканирующей электронной микроскопии (SEM) пеллеты, полученной согласно способу, описанному в WO 2006/008006 А1, при 2000-кратном увеличении

Фиг. 11 показывает изображение сканирующей электронной микроскопии (SEM) лиофилизата, полученного согласно стандартной лиофилизации, при 200-кратном увеличении

Фиг. 12 показывает изображение сканирующей электронной микроскопии (SEM) лиофилизата, полученного согласно стандартной лиофилизации, при 2000-кратном увеличении

На Фиг. 1 схематично изображено устройство для проведения способа согласно настоящему изобретению. Устройство содержит в качестве основных компонентов башню для охлаждения 100 и вакуумную сушильную камеру 200. Башня для охлаждения содержит внутреннюю стенку 110 и наружную стенку 120, тем самым определяя пространство 130 между внутренней стенкой 110 и наружной стенкой 120.

Это пространство 130 содержит охлаждающий узел 140 в виде трубопровода. Охлаждающее средство может входить и покидать охлаждающее средство 140, как показано стрелками на чертеже.

Охлаждающее средство, протекающая через охлаждающий узел 140, приводит к охлаждению внутренней стенки 110 и, таким образом, к охлаждению внутренней части башни для охлаждения 100. При получении замороженных пеллет (криопеллеты) жидкость распыляется в башню для охлаждения через сопло 150 Жидкие капли обозначены в соответствии со ссылочным номером 160.

Капельки жидкости в конечном итоге затвердевают (замораживаются) по их нисходящей траектории, что обозначено в соответствии со ссылочным номером 170. Замороженные пеллеты 170 перемещаются вниз по спуску 180, где клапан 190 позволяет войти в вакуумную сушильную камеру 200.

Хотя здесь и не изображено, конечно, также возможно и даже предпочтительно, чтобы спуск 180 контролировался в отношении температуры таким образом, чтобы держать пеллеты 170 в замороженном состоянии, пока они собираются перед закрытым клапаном 190.

Внутри вакуумной сушильной камеры 200 установлен вращающийся барабан 210 для размещения замороженных пеллет, подлежащих сушке. Вращение происходит вокруг горизонтальной оси, чтобы обеспечить эффективную передачу энергии пеллетам. Тепло можно вводить через барабан или через инкапсулированный инфракрасный нагреватель. В качестве конечного результата получены лиофилизированные пеллеты, обозначенные ссылочным номером 220.

Примеры:

Общее - определение эффективности лекарственного продукта rFVIII

Эффективность измеряли с помощью хромогенного анализа с использованием набора CoatestTM FVIII. Хромогенный метод анализа состоит из двух последовательных стадий, где интенсивность цвета пропорциональна активности фактора VIII. На первой стадии фактор X активируется до фактора Ха посредством фактора IXa с его кофактором, фактором Villa, в присутствии оптимальных количеств ионов кальция и фосфолипидов, с 5-минутной инкубацией при 37°С. Имеются избыточные количества фактора X, так что скорость активации фактора X зависит исключительно от количества фактора VIII. На второй стадии фактор Ха гидролизует хромогенный субстрат с получением хромофора, и интенсивность цвета считывается фотометрически при 405 нм. Справедливость анализа подтверждается с использованием статистического метода линейной регрессии относительно стандарта установленной эффективности, и рассчитывается эффективность неизвестного образца. Эффективность сообщается в международных единицах на мл (МЕ/мл). В случае, когда эффективность в дальнейшем упоминается как значение [%], такое значение следовательно следует понимать как процент от «целевой эффективности» в ME мл (нормализованные значения). Очевидно, что более высокие значения эффективности в % являются предпочтительными.

Общее - Эксклюзионная хроматография по размеру (SEC) для определения распределения фрагментов/агрегатов продукта

Основные компоненты препаратов rFVIII разделяются на области на основе их гидродинамического объема или молекулярного размера на колонке TSK гель G4000SWXL с размерами 7,8 мм ID × 30 см, размером частиц 8 мм, размером пор 450 Ангстрем.

Затем их количественно определяют исходя из их излучения флуоресценции при 340 нм после возбуждения при 276 нм. Количественные результаты выражаются как относительная площадь пиков в % для этих областей. Приводятся результаты методики для конкретных областей хроматограммы, и они используется для измерения агрегатов rFVIII и целостности цепей.

Три области (Область 1, Область 2, и Область 3) определены, тогда как Область 2 (в % от общего образца) желательно должна быть максимальной, так как в ней суммируются все молекулы rFVIII не агрегированные или не фрагментированные.

Общее - Удельная площадь поверхности по БЭТ

Определение удельной поверхности по БЭТ проводили в многоточечном измерении (адсорбция азота при 77 Кельвин), и для каждого образца, два независимых количества вещества были заполнены в контейнеры для БЭТ и проанализированы отдельно. Контейнеры плотно закрывали пробками, переносили на станцию подготовки образцов, вакуумировали и предварительно обрабатывали в течение 16 часов при 30°С в вакууме (<0,2, бар) для удаления летучих компонентов. Затем образцы продували азотом, взвешивали и измеряли в соответствии с DIN ISO 9277 с использованием азота.

Общее - Измерения сканирующей электронной микроскопии (SEM)

Получение образцов проводили в перчаточной камере в атмосфере азота, каждый образец готовили индивидуально. Образец помещали на держатель и напыляли золото. Впоследствии была выполнена сканирующая электронная микроскопия.

Пример 1

Криопеллеты раствора Kogenate® PF получили. Kogenate® PF представляет собой свободный от белка плазмы рекомбинантный человеческий фактор VIII. Композиция из расчета на 1 г раствора приведена далее:

Объемный раствор распыляли в башню для охлаждения с охлажденными стенками в соответствии со способом согласно настоящему изобретению Распылительное сопло имело одно отверстие диаметром 400 мкм. Это соответствует целевому размеру капли 800 мкм. Частота колебаний составляла 1375 Гц, отклоняющее давление 0,2 бар, и насос работали со скоростью 22 оборота в минуту. После общей продолжительности 35 минут собирали 879,3 г замороженных пеллет (выход 96%).

Внутренние температуры башни для охлаждения контролировались, и их развитие с течением времени изображено на Фиг. 2. Кривая 1000 представляет собой показание датчика из верхней части градирни, кривая 1010 - показание датчика из центральной части башни для охлаждения, а кривая 1020 - показание датчика из нижней части башни для охлаждения. В 14:45 часов, когда температура достигла -126,0°С (верхний датчик), -129,7°С (центральный датчик) и -133,1°С (нижний датчик), была начата операция распыления. Это представлено номером 1030 на Фиг. 2. В 15:20 часов операция распыления была остановлена (отметка 1040) с зарегистрированными температурами -130,7°С (верхний датчик), -133,5°С (центральный датчик) и -135,2°С (нижний датчик). Замороженные пеллеты собирали в охлажденном контейнере с температурой от -5°С до -53°С.

Пример 2

Этот пример касается лиофилизации образца криопеллет, полученных в примере

1. Устройство для лиофилизации LyoMotion от Meridion применяли на этой стадии. Это устройство включает вращающийся барабан, в котором криопеллеты встряхиваются и подвергаются сушке.

В общем выделили 21,3 г лиофилизированных пеллет (выход 72,6%), имеющих остаточную влажность 0,95%.

Профили температуры и давления стадии лиофилизации показаны на Фиг. 3. Кривая 1050 показывает температуру продукта, кривая 1060 показывает температуру конденсатора устройства для лиофилизации, и кривая 1070 показывает внутреннее давление внутри вакуумной камеры устройства для лиофилизации.

Пример 3

Этот пример касается лиофилизации другого образца криопеллет, полученных в примере 1. Устройство для лиофилизации LyoMotion от Meridion применяли на этой стадии. Это устройство включает вращающийся барабан, в котором криопеллеты встряхиваются и подвергаются сушке.

В общем выделили 21,4 г лиофилизированных пеллет (выход 73,7%), имеющих остаточную влажность 0,70%.

Профили температуры и давления стадии лиофилизации показаны на Фиг. 4. Кривая 1080 показывает температуру продукта, кривая 1090 показывает температуру конденсатора устройства для лиофилизации, и кривая 1100 показывает внутреннее давление внутри вакуумной камеры устройства для лиофилизации.

Результаты

Анализы эффективности и анализы эксклюзионной хроматографии по размеру полученных продуктов приведены в Таблице ниже для образцов, взятых непосредственно из способа после получения.

Два образца из каждого примера анализировали на эффективность фактора VIII в нем. Целевые эффективности составляли 250,0 мг/флакон. Следует ожидать потери эффективности при обработке объемного раствора и лиофилизации. Определенные фактические эффективности между 86,2% и 89,9% были значительно ниже по вариации чем те, которые наблюдались при обычной лиофилизации во флаконе. Здесь можно наблюдать потенции от 80,9% до 91,2% в зависимости от положения отдельного флакона в сушильной камере.

Для ссылки в следующей таблице приведены аналитические данные для предшественников примеров 2 и 3 (значения IPC).

Кроме того, вышеуказанные свойства образцов оценивали на срок до 6 месяцев хранения при комнатной температуре (RT) и при 2-8°С.

Как видно из Фиг. 5 и 6 (образцы были получены из другого исходного вещества с более низкой активностью), не произошло никаких существенных изменений в активности или фрагментном/агрегатном составе образцов, что подчеркивает надежность способа в соответствии с настоящим изобретением в отношении свойств полученных таким образом пеллет.

Пример 4 - Прямое сравнение с уровнем техники

Растворы идентичной партии лекарственного вещества фактора VIII с тем же составом композиции, что и в примере 1, были получены и обработаны различными способами сушки. 3000 мл раствор замораживали в башне для охлаждения в соответствии с примером 1, и замороженные пеллеты лиофилизировали в двух разных вращающихся сушильных камерах (LyoMotion) с объемом партии 319 г и 2614 г.

Отдельную часть раствора обрабатывали в соответствии со способом, описанным в WO 2006/008006 А1. Всего 1200 мл раствора распыляли порциями по 200 мл через сопло 400 мкм и атомизировали при частоте 900 Гц со скоростью около 16,5 г/мин. Капли замораживали в изолированном сосуде, заполненном жидким азотом, который располагался на около 25 см ниже сопла и перемешивали в течение всего процесса. После завершения распыления каждой порции замороженные пеллеты удаляли путем заливки жидкого азота через предварительно охлажденное сито, и хранения их при низкой температуре. После того, как все порции были собраны, их помещали в 2 подставки, облицованные пластиковой пленкой, на предварительно охлажденную полку устройства для лиофилизации Virtis Advantage Pro и лиофилизировали. Первичная сушка проводилась при температуре полки -10°С в течение 60 часов с последующей вторичной сушкой в течение 8 часов при 25°С. После завершения сушки сухие пеллеты мгновенно переносили в стеклянные бутылки и плотно закрывали. Затем 250 мг пеллет отвешивали в стеклянных флаконах типа 10R в атмосфере азота.

Третью отдельную часть раствора заливали в стеклянные флаконы 10R типа I и лиофилизировали в обычном устройстве для лиофилизации во флаконе. В общей сложности 488 флаконов заполняли 2,5 мл раствора на флакон (всего 1241 г раствора), полузакрывали и загружали в устройство для лиофилизации HOF. Раствор замораживали до -45°С, а первичную сушку выполняли при -20°С с последующей вторичной стадией сушки при 25°С. Полный процесс лиофилиации требует около 65 часов. Флаконы закрывали внутри устройства для лиофилизации и запечатывали непосредственно после выгрузки.

Все три образца - образцы первой обработки в соответствии с примером 1, обработанные, как описано в WO 2006/008006 А1, и те из обычного процесса лиофилизации во флаконе, после этого подвергаются измерениям удельной площади поверхности по БЭТ и сканирующей электронной микроскопии (SEM).

Можно видеть, что пеллеты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, демонстрируют более высокую удельную площадь поверхности, что улучшает восстановление лиофилизированного твердого вещества в жидкость для введения, и более однородную морфологию, что улучшает управляемость свойствами этих пеллет на более поздних стадиях способа.

Соответствующие удельные площади по БЭТ приведены далее:

Очевидно, что удельная площадь поверхности пеллет, которые получают согласно настоящему изобретению, значительно больше, чем удельная площадь пеллет, полученных в соответствии с аналогичными известными способами (например, WO 2006/008006 А1) и особенно по сравнению со стандартной лиофилизацией.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способу получения лиофилизированных пеллет, содержащих фактор VIII, причем способ включает стадии: a) образования капель раствора, содержащего фактор VIII, и их замораживания с образованием пеллет, причем капли образуются посредством образования капель раствора, содержащего фактор VIII, в башне для охлаждения, которая имеет внутреннюю поверхность стенок с контролируемой температурой и внутреннюю температуру ниже температуры замерзания раствора; b) лиофилизации пеллет во вращающемся приемнике, который находится внутри вакуумной камеры. Способ дополнительно включает стадии c) хранения и гомогенизации лиофилизированных пеллет; d) анализа лиофилизированных пеллет при их хранении и гомогенизации; e) загрузки лиофилизированных пеллет в контейнеры. Технический результат заключается в более высокой удельной площади поверхности пеллет, что улучшает восстановление лиофилизированного твердого вещества в жидкость для введения, и более однородной морфологии пеллет, что улучшает управляемость их свойствами на более поздних стадиях способа. 8 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр., 12 ил.

1. Способ получения лиофилизированных пеллет, содержащих фактор VIII, причем способ включает стадии:

a) образования капель раствора, содержащего фактор VIII, и их замораживания с образованием пеллет;

b) лиофилизации пеллет;

отличающийся тем, что на стадии a) капли образуются посредством образования капель раствора, содержащего фактор VIII, в башне для охлаждения, которая имеет внутреннюю поверхность стенок с контролируемой температурой и внутреннюю температуру ниже температуры замерзания раствора

и тем, что на стадии b) пеллеты лиофилизируют во вращающемся приемнике, который находится внутри вакуумной камеры.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадии c), d) и e) после стадии b):

c) хранения и гомогенизации лиофилизированных пеллет;

d) анализа лиофилизированных пеллет при их хранении и гомогенизации;

e) загрузки лиофилизированных пеллет в контейнеры.

3. Способ по п. 1, в котором на стадии a) капли получают посредством образования капель посредством пропускания раствора через сопла с регулируемой частотой, причем частота колебаний составляет от больше или равно 1000 Гц до меньше или равно 2000 Гц.

4. Способ по п. 1, в котором на стадии a) внутренняя поверхность башни для охлаждения имеет температуру меньше или равно -120°C.

5. Способ по п. 1, в котором внутреннюю поверхность башни для охлаждения охлаждают посредством пропускания охлаждающего средства через одну или более труб, которые находятся в термическом контакте с внутренней поверхностью.

6. Способ по п. 2, в котором при анализе на стадии d) определяют активное содержание фактора VIII в лиофилизированных пеллетах и загружают контейнеры количеством лиофилизированных пеллет, обеспечивающим дозу фактора VIII, которая равна целевой дозе или превышает целевую дозу на меньше или равно 25%.

7. Способ по п. 1, в котором пеллеты, полученные на стадии a), имеют максимум распределения частиц по размеру d50 от больше или равно 200 мкм до меньше или равно 1500 мкм.

8. Способ по п. 1, в котором раствор, содержащий фактор VIII, на стадии a) имеет содержание растворенных твердых веществ от больше или равно 8 мас.% до меньше или равно 12 мас.%.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором раствор, содержащий фактор VIII, на стадии a) имеет следующий состав из расчета на 1 грамм раствора, причем остальным является вода для инъекции:

Фактор VIII от больше или равно 99 МЕ до меньше или равно 101 МЕ

Сахароза от больше или равно 68 мг до меньше или равно 72 мг

Гистидин от больше или равно 2 мг до меньше или равно 4 мг

Глицин от больше или равно 23 мг до меньше или равно 26 мг

NaCl от больше или равно 1 мг до меньше или равно 3 мг

CaCl₂ от больше или равно 0,2 мг до меньше или равно 0,4 мг

Полисорбат 80 от больше или равно 0,07 мг до меньше или равно 0,1 мг.