КОМБИНИРОВАННЫЕ ПОКРЫТИЯ НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ RGD-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ БИФОСФОНАТОВ АМИНОКИСЛОТ И ПЭО-ПОДСЛОЯ ДЛЯ ТИТАНА Российский патент 2020 года по МПК C07K7/06 A61L27/06 

Изобретение относится к области получения комбинированных покрытий для титана на основе биологически активных RGD-функционализированных бифосфонатных производных Arg-Gly-Asp-Cys-(RGDC)- замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидроксиалкан- 1,1- диил)бисфосфоновых кислот общей формулы (1a-h) в сочетании с неорганическим оксидированным пористым подслоем, полученным в ходе плазменно-электролитического оксидирования (ПЭО) металла:

Полученные покрытия могут найти применение для создания биологически активных биомиметических поверхностей для металлических имплантатов, улучшающих их остеоинтеграцию ([1] Queffelec С., Petit М., Janvier P., Knight D. A., Bujoli В. Chem. Rev. 2012, 112, 3777-3807; [2] Meyers S.R., Grinstaff M.W. Chem. Rev. 2012, 112, 1615-1632).

В работах ([3] Auernheimer J., Zukowski D., Dahmen C., Kantlehner M, Enderle A., Goodman S.L., Kessler H. ChemBioChem. 2005, 6(11), 2034-2040; [4] Mas-Moruno C., Dorfher P.M., Manzenrieder F., Neubauer S., Reuning U., Burgkart R., Kessler H. J. Biomed. Mater. Res. 2013, 101 A, P. 87-97) разработаны покрытия для титановых имплантатов, в которых цикло(-RGDfK-) пептид связан с якорным блоком из четырех фосфонопропионовых кислот через спейсеры, состоящие из одного или трех фрагментов аминогексановых кислот.

Вещества наносили на титановые диски (Ti6A14V) путем их вымачивания в буферных растворах с концентрацией действующего вещества 100-0,1 μМ при комнатной температуре в течение ночи. Адгезию клеток оценивали после 1 ч высевания клеток в планшеты с металлическими образцами. Показано увеличение степени адгезии мышиных остеобластов МС3Т3-Е1 на обработанной поверхности титана до 62% [3]. Иммобилизация пептидов на дисках Ti6A14V привела к более высоким значениям клеточной адгезии по сравнению с нефункционализированными образцами, как на механически отрезанных, так и полученных после пескоструйной обработки поверхностях [4]. В качестве недостатков данного метода следует указать многостадийность синтеза целевых соединений (~ 16 стадий), дороговизну цикло(-RGDfK-) пептидов, длительность обработки и возможную относительно более низкую степень химической адгезии полученных фосфонатов к неокисленной поверхности титана.

Известен синтез RGDC- замещенной (6-{[6-(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)гексаноил]амино}-1-гидроксигексан-1,1-диил)бисфосфоновой кислоты (1f) в реакции 4-N-(6-малеоимидогексаноил)аминобутан-1-гидрокси-1,1-бифосфоновой кислоты с RGDC-тетрапептидом в воде при рН=7 ([5] Beuvelot J., et al, 2009, J. Biomed. Mater. Res., 90B, 873-881). Полученное соединение наносили на стерилизованную и окисленную термически (15 ч при 200°С) поверхность титана путем физико-химической адсорбции из растворов (выдержка 3 ч) с концентрацией 10^-4 и 10^-10 М/л. Фиксация молекул на поверхности происходила путем дегидратации при 50°С, 0,3 мбар в течение 15 часов. Такая обработка поверхности металла улучшала адгезию, степень распределения и минерализацию остеобластоподобных клеток Saos-2.

В качестве недостатка данного метода можно отметить длительность обработки поверхности металла при нанесении покрытий.

Наиболее близким к изобретению является способ [Parfenov E.V. et al, Surface & Coatings Technology, 2019, 357, 669-683], в котором RGDC-замещенную (3-{[6-(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)гексаноил]амино}-1-гидроксигексан-1,1-диил)бисфосфоновую кислоту (1d) наносили на поверхность наноструктурированного титана (Grade 4), модифицированную с помощью плазменно-электролитического оксидирования, путем физико-химической адсорбции из растворов с концентрацией 10^-3 М/л (время выдержки 3 ч с последующим высушиванием).

Испытания in vitro, проведенные с использованием фибробластов, показали, что данный вариант комбинированного покрытия обеспечивает усиление пролиферации адгезированых клеток на 45% по сравнению с необработанным наноструктурированным титаном. К недостаткам метода следует отнести меньшую доступность и дороговизну наноструктурированного титана, отсутствие информации по влиянию структуры линкера и аминобифосфоната на жизнедеятельность клеток различной природы, а также содержание в целевых продуктах примеси продуктов трансформации диоксана, образующихся на стадии синтеза прекурсоров - коньюгатов аминобисфосфоновых кислот с малеимидосукцинимидными линкерами.

Задачей изобретения является разработка комбинированных биологически активных покрытий на основе гибридных молекул, полученных путем химической сшивки бифосфонатов аминокислот (β-аланина, γ^_аминомасляной и ε-аминокапроновой кислот) с линейным рипептидом RGD - фрагментом белков межклеточного матрикса через линкеры, различающиеся длиной и структурой ((2,5-диоксопирролидин-1-ил)-3-(2,5-диоксопиррол-1-ил)пропаноата (BMPS), (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -6- (2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноата (EMCS), (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -4- [(2,5-диоксопиррол-1-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (SMCC)), в сочетании с неорганическим оксидированным пористым подслоем, полученным в ходе плазменно-электролитического оксидирования металла, а также in vitro исследование адгезии, пролиферативной активности, жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов и остеобластоподобных клеток для выявления наиболее перспективных вариантов создаваемых покрытий.

Получение заявленных покрытий осуществляли следующим образом: 1 экв. аминобифосфонатов аминокислот (β-аланина, γ-аминомасляной и ε-аминокапроновой кислот) вовлекали во взаимодействие с 1 экв. N-гидрокисукцинимидомалеоимидных линкеров (BMPS, EMCS, SMCC), предварительно растворенных в ацетоне. Полученные производные после выделения и осушки смешивали с олигопептидом RGDC в соотношении 1:1 в водной среде при рН=7, в результате чего получали соединения 1a-h, структура которых установлена с помощью 1D и 2D спектроскопии ЯМР ¹Н, ¹³C, ³¹P и MALDI-TOF/TOF спектрометрии. ПЭО покрытие получали на титане (Grade 2) в биполярном импульсном режиме в водном растворе, содержащем Na₃PO₄⋅12H₂O и Са(СН₃СОО)₂. Образцы Ti с нанесенным ПЭО-покрытием выдерживали в водных растворах 1a-h с концентрацией ~10^-3 М/л в течение 1 часа, а затем высушивали.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами: 1. Способ обеспечивает получение целевых продуктов - (RGDC)-замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидрокси-алкан- 1,1- диил)бисфосфоновых кислот, обладающих большей чистотой в сравнении с известным способом, в котором получаемые продукты содержат побочные продукты трансформации диоксана, используемого на этапе синтеза прекурсоров - коньюгатов аминобисфосфоновых кислот с малеимидосукцинимидными линкерами.

2. Полученные соединения могут быть применены к ПЭО-модифицированному титану (Grade 2), когда как в известном способе использован более дорогой и менее доступный наноструктурированный титан.

3. Показана перспективность применения новых производных 1a, 1c, 1g, 1h в сочетании с ПЭО - покрытием на Ti марки Grade 2 в качестве покрытий, улучшающих адгезию и пролиферацию фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток и остеобластоподобных MG63, тогда как в известном способе показана применимость 1d в сочетании с ПЭО- покрытием на наноструктурированном титане марки Grade 4 с использованием фибробластов в качестве модели.

Способ поясняется следующими примерами:

Общая методика синтеза RGD-замещенных бифосфонатов. Бифосфонаты аминокислот (β-аланина, γ-аминомасляной и ε-аминокапроновой кислот) (0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют эквимольное количество линкера ((2,5-диоксопирролидин-1-ил)-3-(2,5-диоксопиррол-1-ил)пропаноата (BMPS), (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -6- (2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноата (EMCS) или (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -4 - [(2,5-диоксопиррол-1-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (SMCC)) (0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгаты аминобисфосфоновых кислот с малеимидосукцинимидными линкерами 2a-g в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют эквивалентное количество соединений 2a-g (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении.

Пример 1. Синтез соединения 1а.

Бифосфонат (3-аланина (9.4 мг, 0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют 10.7 мг линкера BMPS (0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгат аминобисфосфоновой кислоты с малеимидосукцинимидным линкером 2а в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (4.5 мг, 0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют 3.9 мг соединения 2а (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении. Получают вещество в виде белого порошка с выходом 8.1 мг, 96%.

Пример 2. Синтез соединения 1с.

Бифосфонат γ-аминомасляной кислоты (10 мг, 0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют 10.7 мг линкера BMPS (0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгат аминобисфосфоновой кислоты с малеимидосукцинимидным линкером 2с в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (4.5 мг, 0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют 4 мг соединения 2с (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении. Получают вещество в виде белого порошка с выходом 8.3 мг, 97%.

Пример 3. Синтез соединения 1h.

Бифосфонат ε-аминокапроновой кислоты (11.1 мг, 0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют 13.4 мг линкера SMCC (, 0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгат аминобисфосфоновой кислоты с малеимидосукцинимидным линкером 2h в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (4.5 мг, 0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют 5.0 мг соединения 2h (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении. Получают вещество в виде белого порошка с выходом 9.3 мг, 98%. Спектральные характеристики 2a-g, 1a-g.

Соединение 2а (BMPS-β). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.93-2.09 (м, 2Н, С²Н₂), 2.42 (т, ³J=6.5 Гц, 2Н, С⁵Н₂), 3.35 (т, ³J=7.8 Гц, 2Н, C³H₂), 3.71 (т, ³J=6.0 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 6.78 (с, НС=СН). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 32.61 (С²), 34.37 (С⁶), 34.77 (С⁵), 35.57 (т, ³J_C-P=7.8 Гц, С⁶), 72.87 (т, ¹J_C-P=133.7 Гц, С¹), 134.43 (C⁸), 172.65 (С⁴), 173.01 (С⁷). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 17.68. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 446.093 [M+Na+K]⁺, 468.063 [M+2Na+K]⁺, расч. для C₁₀H₁₆N₂O₁₀P₂ 386.189.

Соединение 2b (EMCS-β). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.13-1.24 (м, 2Н, С⁷Н₂), 1.43-1.57 (м, 4Н, С⁶Н₂, С⁸Н₂), 1.98-2.13 (м, 2Н, С²Н₂), 2.14 (т, ³J=7.4 Гц, 2Н, С⁵Н₂), 3.35-3.44 (м, 2Н, С³Н₂), 3.42 (т, ³J=7.0 Гц, 2Н, С⁹Н₂), 6.75 (с, 2Н, НС=СН). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 24.81 (С⁶), 25.41 (С⁷), 27.28 (С⁸), 32.76 (С²), 35.49 (С³), 35.74 (С⁵), 37.43 (С⁹), 72.93 (С¹), 134.27 (С¹¹), 173.42 (С¹⁰), 176.46 (С⁴). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 17.74. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 428.086 [М]⁺, расч. для C₁₃H₂₂N₂O₁₀P₂ 428.269.

Соединение 2с (BMPS-γ). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.63-1.76 (м, 2Н, С³Н₂), 1.77-1.89 (м, 2Н, С²Н₂), 2.42 (т, ³J=6.4 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.06 (т, ³J=6.8 Гц, 2Н, С⁴Н₂), 3.71 (т, ³J=6.6 Гц, 2Н, С⁷Н₂), 6.78 (с, НС=СН). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.18 (т, ³J_C-P=6.8 Гц, С³), 31.03 (С²), 34.46 (С⁶), 34.70 (С⁷), 40.14 (С⁴), 73.78 (т, ¹J_C-P=134.8 Гц, С¹), 134.47 (С⁹), 172.66 (С⁸), 173.37 (С⁵). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.20. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 400.080 [М]⁺, расч. для C₁₁H₁₈N₂O₁₀P₂ 400.215.

Соединение 2d (EMCS-γ). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.12-1.28 (м, 2Н, С⁸Н₂), 1.41-1.58 (м, 4Н, С⁷Н₂, С⁹Н₂), 1.66-1.80 (м, 2Н, С³Н₂), 1.80-1.95 (м, 2Н, С²Н₂), 2.14 (т, ³J=7.5 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.11 (т, ³J=6.8 Гц, 2Н, С⁴Н₂), 3.42 (т, ³J=6.9 Гц, 2Н, С¹⁰Н₂), 6.76 (с, 2Н, НС=СН). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.36 (С³), 24.87 (С⁷), 25.26 (С⁸), 27.43 (С⁹), 31.06 (С²), 35.61 (С⁶), 37.34 (С¹⁰), 39.98 (С⁴), 73.81 (т, ¹J_C-P=134.1 Гц, С¹), 134.26 (С¹²), 173.41 (С¹¹), 176.80 (С⁵). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.21. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 440.322 [М-2Н]⁺, расч. для C₁₄H₂₄N₂O₁₀P₂ 442.295.

Соединение 2е (BMPS-ε). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.11-1.22 (м, 2Н, С⁴Н₂), 1.32-1.43 (м, 2Н, С⁵Н₂), 1.42-1.56 (м, 2Н, С³Н₂), 1.76-1.91 (м, 2Н, С²Н₂), 2.41 (т, ³J=6.0 Гц, 2Н, C⁸H₂), 3.04 (т, ³J=6.8 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.71 (т, ³J=6.4 Гц, 2Н, С⁹Н₂), 6.82 (с, 2Н, С¹¹Н₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.23 (т, ³J_C-P=5.8 Гц, С³), 27.00 (С⁴), 27.97 (С⁵), 33.56 (С²), 34.55 (С⁹), 34.83 (C⁸), 39.41 (С⁶), 74.18 (с, ¹J_C-P=134.5 Гц, С¹), 134.53 (С¹¹), 172.60 (С¹⁰), 173.21 (С⁷). Спектр ЯМР ³¹P (D₂O): 18.50. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 428.086 [М]⁺, расч. для C₁₃H₂₂N₂O₁₀P₂ 442.295.

Соединение 2f (EMCS-ε). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.13-1.21 (м, 2Н, С¹⁰Н₂), 1.20-1.31 (м, 2Н, С⁴Н₂), 1.38-1.52 (м, 2Н, С⁵Н₂), 1.44-1.57 (м, 6Н, С³Н₂, С⁹Н₂, С¹¹Н₂), 1.78-1.92 (м, 2Н, С²Н₂), 2.13 (т, ³J=7.2 Гц, 2Н, С⁸Н₂), 3.09 (т, ³J=6.7 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.42 (т, ³J=6.8 Гц, 2Н, С¹²Н₂), 6.76 (с, 2Н, С¹⁴Н₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.23 (т, ³J_C-P=6.0 Гц, C³), 24.90 (С⁹), 25.33 (С¹⁰), 26.92 (С⁴), 27.26 (С¹¹), 28.12 (С⁵), 33.55 (С²), 35.57 (С⁸), 37.46 (С¹²), 39.29 (С⁶), 74.21 (т, ¹J_C-P=133.6 Гц, С¹), 134.27 (С¹⁴), 173.41(С¹³), 176.66 (С⁷). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.52. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z: 470.391 [М]⁺, расч. для C₁₆H₂₈N₂O₁₀P₂ 470.348.

Соединение 2g (SMCC-γ). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 0.86-1.00, 1.60-1.71 (м, 4Н, С⁸Н₂), 1.16-1.34, 1.71-1.81 (м, 4Н, С⁷Н₂), 1.48-1.65 (м, 1Н, С⁹Н), 1.64-1.78 (м, 2Н, С³Н₂), 1.80-1.92 (м, 2Н, С²Н₂), 2.06-2.16 (м, 1Н, С⁶Н), 3.10 (т, ³J=6.7 Гц, 2Н, С⁴Н₂), 3.28 (д, ³J=7.0 Гц, 2Н, С¹⁰Н₂), 6.75 (с, 2Н, СН=СН). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.46 (т, ³J_C-P=6.2 Гц, С³), 28.33 (С⁷), 29.14 (С⁸), 31.15 (С²), 36.05 (С⁹), 39.95 (С⁴), 43.47 (С¹⁰), 44.86 (С⁶), 73.83 (т, ¹J_C-P=132.3, С¹), 134.17 (С¹²), 173.58 (С¹¹), 179.68 (С⁵). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.25.

Соединение 2h (SMCC-ε). Спектр ЯМР ¹H (D₂O): 0.86-1.00, 1.61-1.70 (м, 4Н, С¹⁰Н₂), 1.20-1.30 (м, 2Н, С⁴Н₂), 1.23-1.34, 1.70-1.80 (м, 2Н, С⁹Н₂), 1.38-1.52 (м, 2Н, С⁵Н₂), 1.44-1.56 (м, 2Н, С³Н₂), 1.48-1.64 (м, 1Н, С⁸Н), 1.77-1.90 (м, 2Н, С²Н₂), 2.04-2.16 (м, 1Н, С⁸Н), 3.09 (т, ³J=6.8 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.28 (д, ³J=7.3 Гц, 2Н, С¹²Н₂), 6.75 (с, 2Н, СН=СН). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.40 (т, ³J_C-P=5.8 Гц, С³), 26.90 (С⁴), 28.20 (С⁹), 28.34 (С⁵), 29.14 (С¹⁰), 33.73 (С²), 36.04 (С¹¹), 39.18 (С⁶), 43.46 (С¹²), 44.78 (С⁸), 74.26 (т, ¹J_C-P=131.3 Гц, С¹), 134.18 (С¹⁴), 173.58 (С¹³), 179.56 (С⁷). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O) 18.60. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z: 499.066 [М+3Н]⁺, расч. для C₁₈H₃₀N₂O₁₀P₂ 496.137.

Соединение 1a (RGDC-BMPS-β). Спектр ЯМР ¹H (D₂O): 1.55-1.68 (м, 2Н, С²³Н₂), 1.74-1.84 (м, 2Н, С²²Н₂), 1.96-2.10 (м, 2Н, С²Н₂), 2.38-2.45 (м, 2Н, С⁵Н₂), 2.52 (дд, ³J=8.4 Гц, ²J=16.0 Гц, 1Н, С¹⁶НН), 2.66 (дд, ³J=4.9 Гц, ²J=16.0 Гц, 1Н, C¹⁶HH), 2.94 (дд, ³J=8.5 Гц, ²J=14.0 Гц, 2Н, С¹¹Н₂), 3.11-3.20 (м, 3Н, С²⁴Н₂, C¹¹HH), 3.31-3.43 (м, 2Н, С³Н₂), 3.70 (т, ³J=7.0 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.70-3.80 (м, 1H, С²¹Н), 3.87 (д, 1Н, ²J=16.9 Гц, C¹⁹HH), 4.02 (д, ²J=16.9 Гц, 1Н, С¹⁹НН), 4.40 (дд, ³J=4.1 Гц, ³J=8.5 Гц, 1Н, С¹²Н), 4.58-4.70 (м, 1Н, С¹⁵Н). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.77 (C²³), 29.49 (С²²), 32.97 (С²), 34.79 (С⁵), 35.84 (С⁶), 36.07 (С³), 38.21 (С¹⁶), 39.95 (С¹¹), 40.59 (С²⁴), 42.48 (¹⁹), 51.39 (С¹⁵), 53.20 (С²¹), 54.39 (С¹²), 156.76 (С²⁵), 170.81 (C¹⁸), 172.54 (С¹⁴), 172.64 (С⁴), 173.82 (С²⁰), 176.43 (С¹³), 178.03 (С¹⁷), 178.91 (С⁷, С¹⁰). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 17.93. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 836.169 [M+H], расч. для C₂₅H₄₃N₉O₁₇P₂S 835.671.

Соединение 1b (RGDC-EMCS-β). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.15-1.30 (м, 2Н, С⁷Н₂), 1.43-1.53 (м, 4Н, С⁶Н₂, С⁸Н₂), 1.55-1.63 (м, 2Н, С²⁶Н₂), 1.60-1.76 (м, 2Н, С²⁵Н₂), 1.98-2.03 (м, 2Н, С²Н₂), 2.05-2.25 (м, 2Н, С⁵Н₂), 2.53 (дд, ³J=8.3 Гц, ²J=15.9 Гц, 1H, C¹⁹HH), 2.66 (дд, ³J=4.9 Гц, ²J=15.9 Гц, 1Н, С¹⁹НН), 2.93 (дд, ³J=8.6 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, С¹⁴НН), 3.17 (дд, ³J=4.1 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, C¹⁴HH), 3.11-3.18 (м, 2Н, С²⁷Н₂), 3.36-3.46 (м, 4Н, С³Н₂, С⁹Н₂), 3.47-3.57 (м, 1Н, С²⁴Н), 3.86 (д, ²J=16.8 Гц, 1Н, С²²НН), 4.00 (д, ²J=16.8 Гц, 1Н, C²²HH), 4.40 (дд, ³J=4.1 Гц, ³J=8.6 Гц, 1Н, С¹⁵Н), 4.58-4.76 (м, 1Н, C¹⁸H). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 24.00 (С²⁶), 25.55 (С⁷), 25.83 (С⁶), 26.78 (С⁸), 30.72 (С²⁵), 33.66 (С²), 35.64 (С⁵), 35.88 (С³), 38.23 (С¹⁹), 39.11 (С⁹), 39.79 (С¹⁴), 40.76 (С²⁷), 42.45 (С²²), 51.37 (С¹⁸), 53.84 (С²⁴), 54.34 (С¹⁵), 156.75 (С²⁸), 170.02 (С²²), 172.59 (С¹⁷), 176.46 (С⁴, С¹⁶, С²³), 178.03 (С²⁰), 179.50 (С¹⁰, С¹³). Спектр ЯМР ³¹P(D₂O): 17.95.

Соединение 1c (RGDC-BMPS-γ). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.58-1.70 (м, 2Н, С²⁴Н₂), 1.66-1.77 (м, 2Н, С³Н₂), 1.80-1.91 (м, 2Н, С²Н₂), 1.85-1.94 (м, 2Н, С²³Н₂), 2.40-2.46 (м, 2Н, С⁶Н₂), 2.62-2.84 (м, 2Н, С¹⁷Н₂), 2.98 (дд, ³J=8.3 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, C¹²HH), 3.01-3.12 (м, 2Н, С⁴Н₂), 3.10-3.20 (м, 1Н, С¹²НН), 3.14-3.20 (м, 2Н, С²⁵Н₂), 3.68-3.75 (м, 2Н, С⁷Н₂), 3.85-3.97 (м, 1Н, С²⁰НН), 3.98-4.08 (м, 2Н, С²⁰НН), 3.99-4.09 (м, 1Н, С²²Н), 4.39-4.46 (м, 1Н, С¹³Н), 4.66-4.73 (м, 1Н, С¹⁶Н). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.22 (С³), 23.46 (С²⁴), 27.84 (С²³), 31.01 (С²), 33.62 (С⁶), 35.82 (С⁷), 36.60 (С¹⁷), 40.14 (С¹²), 40.32 (С⁴, С²⁵), 42.31 (С²⁰), 50.53 (С¹⁶), 52.82 (С²²), 54.21 (С¹³), 156.76 (С²⁶), 169.98 (С¹⁹), 172.01 (С¹⁵, С²¹), 172.89 (С⁵), 175.97 (С¹⁴), 176.14 (С¹⁸), 178.31 (C⁸, С¹¹). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.17. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 849.15 [М]⁺, расч. для C₂₆H₄₅N₉O₁₇P₂S 849.698.

Соединение 1d (RGDC-EMCS-γ). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.16-1.31 (м, 2Н, С⁸Н₂), 1.38-1.55 (м, 4Н, С⁷Н₂, С⁹Н₂), 1.53-1.67 (м, 2Н, С²⁷Н₂), 1.61-1.77 (м, 2Н, С^2бН₂), 1.66-1.77 (м, 2Н, С³Н₂), 1.77-1.90 (м, 2Н, С²Н₂), 2.05-2.20 (м, 2Н, С⁶Н₂), 2.52 (дд, ³J=8.4 Гц, ²J=16.2 Гц, 1Н, С²⁰НН), 2.65 (дд, ³J=4.8 Гц, ²J=16.2 Гц, 1Н, С²⁰НН), 2.93 (дд, ³J=8.5 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, C¹⁵HH), 3.16 (дд, ³J=4.0 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, С¹⁵НН), 3.08-3.15 (м, 2Н, С⁴Н₂), 3.10-3.18 (м, 2Н, С²⁸Н₂), 3.42 (т, ³J=7.0 Гц, 2Н, С¹⁰Н₂), 3.54 (т, ³J=6.1 Гц, 1Н, С²⁵Н), 3.86 (д, ³J=16.8 Гц, 1Н, C²³HH), 4.01 (д, ³J=16.8 Гц, 1Н, C²³HH), 4.40 (дд, ³J=4.0 Гц, ³J=8.5 Гц, 1Н, С¹⁶Н), 4.59-1.68 (м, 1Н, С¹⁹Н). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.73 (С³), 23.98 (С²⁷), 25.45 (С⁸), 25.67 (С⁷), 27.73 (С⁹), 30.53 (С²⁶), 31.48 (С²), 35.70 (С⁶), 38.20 (С²⁰), 38.72 (С¹⁰), 39.75 (С⁴), 39.82 (С¹⁵), 40.71 (С²⁸), 42.45 (С²³), 51.37 (С¹⁹), 53.79 (С²⁵), 54.32 (С¹⁶), 156.75 (С²⁹), 170.95 (С²²), 172.61 (С¹⁸), 175.85 (С¹⁷), 176.44 (С²⁴), 176.96 (С⁵), 178.01 (С²¹). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.24. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 910.533 [M-4H+Na]⁺, 926.498 [М-4Н+K]⁺, расч. для C₂₉H₅₁N₉O₁₇P₂S 891.778.

Соединение 1e (RGDC-BMPS-ε). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.18-1.32 (м, 2Н, С⁴Н₂), 1.38-1.46 (м, 2Н, С⁵Н₂), 1.46-1.58 (м, 2Н, С³Н₂), 1.57-1.72 (м, 2Н, С²⁶Н₂), 1.80-1.93 (м, 2Н, С²Н₂), 1.84-1.96 (м, 2Н, C²⁵H₂), 2.42 (т, ³J=6.7 Гц, 2Н, C⁸H₂), 2.72-2.89 (м, 2Н, С¹⁹Н₂), 2.94-3.02 (м, 1Н, C¹⁴HH), 3.00-3.10 (м, 2Н, С⁶Н₂), 3.10-3.20 (м, 1Н, С¹⁴НН), 3.14-3.20 (м, 2Н, С²⁷Н₂), 3.67-3.75 (м, 2Н, С⁹Н₂), 3.87-4.09 (м, 2Н, С²²Н₂), 3.98-4.08 (м, 1Н, С²⁴Н), 4.40-4.51 (м, 1Н, С¹⁵Н), 4.65-4.77 (м, 1Н, C¹⁸H). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.19 (С³), 23.42 (С²⁶), 26.99 (С⁴), 27.89 (С⁵, С²⁵), 33.58 (С²), 33.71 (С⁸), 35.75 (С⁹), 35.93 (С¹⁹), 39.50 (С⁶, С¹⁴), 40.35 (С²⁷), 42.29 (С²²), 50.32 (С¹⁸), 52.81 (С²⁴), 53.88 (С¹⁵), 156.76 (С²⁸), 170.08 (С²³), 170.74 (С²¹), 171.93 (С¹⁷), 172.75 (С⁷), 174.32 (С¹⁶), 174.80 (С²⁰), 177.71 (С¹⁰, С¹³). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.65. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 879.242 [М+2Н]⁺, расч. для C₂₈H₄₉N₉O₁₇P₂S 877.751.

Соединение 1f (RGDC-EMCS-ε). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 1.15-1.30 (м, 4Н, С⁴Н₂, С¹⁰Н₂), 1.41-1.53 (м, 2Н, С⁵Н₂), 1.42-1.50 (м, 2Н, С³Н₂), 1.45-1.61 (м, 4Н, С⁹Н₂, С¹¹Н₂), 1.54-1.65 (м, 2Н, С²⁹Н₂), 1.64-1.74 (м, 2Н, С²⁸Н₂), 1.74-1.90 (м, 2Н, С²Н₂), 2.13 (т, ³J=7.4 Гц, 2Н, С⁸Н₂), 2.48-2.72 (м, 2Н, С²²Н₂), 2.88-2.99 (м, 1Н, С¹⁷НН), 3.12-3.29 (м, 1Н, С¹⁷Н), 3.06-3.17 (м, 2Н, С⁶Н₂), 3.10-3.18 (м, 2Н, С³⁰Н₂), 3.42 (т, ³J=7.10 Гц, 2Н, С¹²Н₂), 3.45-3.52 (м, 1Н, С²⁷Н), 3.82-3.92(м, 1Н, C²⁵HH), 3.93-4.04 (м, 1Н, С²⁵НН), 4.40 (дд, ³J=4.0 Гц, ³J=8.6 Гц, 1Н, С¹⁸Н), 4.56-4.72 (м, 1Н, С²¹Н). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.55 (т, ³J_C-P=6.0 Гц, С³), 24.03 (С²⁹), 25.48 (С⁹), 26.15 (С⁷⁰), 26.36 (С⁴, С¹¹), 30.89 (С²⁸), 33.97 (С²), 35.61 (С⁸), 38.23 (С²²), 38.94 (С⁷²), 39.40 (С⁶, С¹⁷), 40.72 (С³⁰), 42.40 (С²⁵), 51.43 (С²¹), 53.93 (С²⁷), 54.64 (С¹⁸), 74.37 (С¹), 156.74 (С³¹), 171.03 (С²⁴), 172.61 (С²⁰), 177.92 (С²³), 176.46 (С¹⁹), 176.56 (С⁷, С²⁶), 180.08 (С¹³, С¹⁶). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.71. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 920.398 [М+Н]⁺, расч. для C₃₁H₅₅N₉O₁₇P₂S 919.831.

Соединение 1g (RGDC-SMCC-γ). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 0.83-0.99 (м, 2Н, С⁸НН), 1.19-1.30 (м, 2Н, C⁷HH), 1.37-1.50 (м, 1Н, С⁹Н), 1.52-1.65 (м, 2Н, С²⁷Н₂), 1.55-1.72 (м, 2Н, С²⁶Н₂), 1.67-1.77 (м, 2Н, С³Н₂), 1.68-1.77 (м, 2Н, C⁸HH), 1.77-1.85 (м, 2Н, C⁷HH), 1.78-1.87 (м, 2Н, С²Н₂), 1.96-2.06 (м, 1Н, С⁶Н), 2.53 (дд, ³J=8.2 Гц, ²J=16.0 Гц, 1Н, С²²НН), 2.66 (дд, ³J=4.8 Гц, ²J=16.0 Гц, 1Н, С²²НН), 2.99-3.05 (м, 2Н, С¹⁰Н₂), 2.93 (дд, ³J=8.6 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, С¹⁵НН), 3.17 (дд, ³J=4.1 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, С¹⁵НН), 3.08-3.12 (м, 2Н, С⁴Н₂), 3.11-3.16 (м, 2Н, С²⁸Н₂), 3.41 (т, ³J=6.0 Гц, 1Н, С²⁵Н), 3.85 (д, ²J=16.8 Гц, 1Н, C²³HH), 4.00 (д, ²J=16.8 Гц, 1H, C²³HH), 4.40 (дд, ³J=4.1 Гц, ³J=8.6 Гц, 1Н, С¹⁶Н), 4.63 (дд, ³J=4.8 Гц, ³J=8.2 Гц, 1H, С¹⁹Н). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.86 (С³), 24.13 (С²⁷), 29.25 (С⁷), 29.53 (С⁸), 29.56 (С²), 31.25 (С²⁶), 36.71 (С⁹), 38.27 (С²⁰), 39.71 (С¹⁵), 40.17 (С⁴), 40.83 (С²⁸), 42.45 (С²³), 45.41 (С¹⁰), 46.98 (С⁶), 51.36 (С¹⁹), 54.06 (С²⁵), 54.32 (С¹⁶), 156.74 (С²⁹), 171.11 (С²²), 172.63 (С¹⁸), 176.49 (С¹⁷), 177.91 (С²¹), 178.01 (С²⁴). Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 941.786 [M+H+Na]⁺, расч. для C₃₁H₅₃N₉O₁₇P₂S 917.275.

Соединение 1h (RGDC-SMCC-ε). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O): 0.84-1.00 (м, 2Н, С¹⁰НН), 1.18-1.32 (м, 2Н, С⁹НН), 1.20-1.30 (м, 2Н, С⁴Н₂), 1.37-1.52 (м, 1H, С¹¹Н), 1.41-1.52 (м, 2Н, С⁵Н₂), 1.48-1.56 (м, 2Н, С³Н₂), 1.55-1.66 (м, 2Н, С²⁹Н₂), 1.66-1.80 (м, 2Н, C¹⁰HH), 1.66-1.82 (м, 2Н, С²⁸Н₂), 1.79-1.85 (м, 2Н, C⁹HH), 1.77-1.87 (м, 2Н, С²Н₂), 1.96-2.06 (м, 1Н, С⁸Н), 2.53 (дд, ³J=8.4 Гц, ²J=16.0 Гц, 1Н, C²²HH), 2.67 (дд, ³J=5.0 Гц, ²J=16.0 Гц, 1Н, C²²HH), 2.99-3.05 (м, 2Н, С¹²Н₂), 2.94 (дд, ³J=8.5 Гц, ²J=14.0 Гц, Ш, С¹⁷НН), 3.18 (дд, ³J=4.1 Гц, ²J=14.0 Гц, 1Н, С¹⁷НН), 3.10 (т, ³J=6.7 Гц, 2Н, С⁶Н₂), 3.13-3.19 (м, 2Н, С³⁰Н₂), 3.58-3.66 (м, 1Н, С²⁷Н), 3.87 (д, ²J=16.9 Гц, 1Н, С²⁵НН), 4.02 (д, ²J=16.9 Гц, 1Н, С²⁵НН), 4.41 (дд, ³J=4.1 Гц, ³J=8.5 Гц, 1Н, C¹⁸H), 4.64 (дд, ³J=50 Гц, ³J=8.4 Гц, 1Н, С²¹Н). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O): 23.61 (С³), 23.92 (С²⁹), 27.01 (С⁴), 28.29 (С⁵), 29.26 (С⁹), 29.54 (С¹⁰), 30.19 (C²⁸), 34.22 (С²), 36.77 (С¹¹), 38.25 (С²²), 39.26 (С⁶), 39.86 (С¹⁷), 40.69 (С³⁰), 42.48 (С²⁵), 45.45 (С¹²), 46.92 (С⁸), 51.38 (С²¹), 53.67 (С²⁷), 54.36 (С¹⁸), 156.75 (С³¹), 172.59 (С²⁰), 175.44 (С²⁶), 176.46 (С¹⁹), 178.03 (С²³), 179.85 (С⁷). Спектр ЯМР ³¹Р (D₂O): 18.77.

Получение покрытия методом плазменно-электролитического оксидирования (ПЭО). ПЭО покрытие получали на титане (Grade 2) в биполярном импульсном режиме в водном растворе, содержащем 20 г/л Na₃PO₄⋅12H₂O и 25 г/л Са(СН₃СОО)₂ при температуре 20°С. Длительность обработки составляла 10 минут. Амплитуда положительного импульса напряжения составляла 470 В, отрицательного 40 В, частота 300 Гц. Длительность положительного импульса составляла 1,7 мс, отрицательного 0,87. Импульсы разделялись паузами в 0,38 мс. Образцы перед покрытием полировались до шероховатости Ra<0,15 мкм и промывались в изопропиловом спирте в ультразвуковой ванне в течение 3 минут. Полученное оксидное покрытие имеет толщину 20-30 мкм, пористость 8-10% и шероховатость поверхности Ra 0,8-1,2 мкм.

Исследование биологической активности соединений. Образцы Ti с ПЭО покрытием подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 мин в 95% этаноле и промывали деионизированной водой, сушили на воздухе и стерилизовали автоклавированием при 134°С. Для нанесения органического покрытия образцы помещали в чашку Петри с 10 М раствором RGD-производного, который предварительно стерилизовали пропусканием через фильтр СА 0,22 мкм. Через 1 час образцы высушивали на воздухе. Затем образцы помещали в 24-луночный планшет с обработанной для адгезии клеток поверхностью (SPL) для культивирования клеток. Фибробласты (ФЛЭЧ-104) из легких эмбриона человека, и МСК из жировой ткани человека (Биолот) и остеобластоподобные клетки остеосаркомы человека MG63 (ЦКП "Коллекция культур клеток позвоночных») культивировали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) (Sigma), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biowest), в культуральных флаконах 25 см (SPL) в увлажненной атмосфере 5% СО₂. Среда менялась два раза в неделю. После достижения монослоя клетки отделяли с использованием раствора трипсина/Версена 1:1(Биолот) и подсчитывали с использованием автоматического счетчика клеток ТС20 (BioRad). В каждую лунку планшета с образцами помещали 16-10 клеток в 0,8 мл культуральной среды. Клетки в лунках с образцами Ti без органического покрытия обрабатывали как отрицательные контрольные (NC). Лунки планшета без образцов использовали в качестве положительного контроля. Планшеты для культивирования инкубировали в течение 7 суток в стандартных условиях (37°С, 5% СО₂).

Пролиферативную активность клеток определяли с помощью набора EZ4U (Biomedica), модификации теста МТТ, который оценивает метаболическую активность клеток, коррелирующую с количеством живых клеток клеток. Три образца каждого типа переносили после инкубации в другой 24-луночный планшет с 0,8 мл свежей среды DMEM. Затем к каждой лунке добавляли 80 мкл активированного раствора EZ4U и инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 3,5 часов. После чего образцы извлекали и измеряли оптическое поглощение раствора с использованием микропланшетного ридера (Spark 10М, Tecan) при длине волны 450 нм с референсной длиной волны 620 нм. Вычисляли среднее значение и стандартное отклонение для оптической плотности относительно отрицательного контроля в %.

Результаты in vitro исследования представлены на рис. 1-3. Значительное снижение адгезии и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток наблюдалось при использовании длинноцепочечных производных, содержащих EMCS-линкер (1b,d,f), а также RGDC-BMPS-ε (производного бифосфоната аминокапроновой кислоты) (1е), тогда как SMCC-связанные продукты (1g,h) приводили к росту клеток на поверхности до 20% (рис. 1).

Значительное (на уровне 30%) увеличение степени пролиферации фибробластов наблюдалось в случае использования органических покрытий RGDC-BMPS-β (1а) и RGDC-BMPS-γ (1с) (рис. 2).

Образец с нанесенным органическим покрытием на основе бифосфоната β-аланина с коротким BMPS- линкером и RGD (1а) также показал наилучшую адгезию остеобластоподобных клеток MG-63 через 7 дней, по сравнению с другими образцами (рис. 3). Производные, содержащие EMCS-линкер, RGDC-EMCS-β (1b) и RGDC-EMCS-γ (1d), приводили к снижению степени адгезии и пролиферации данного сорта клеток на поверхности.

На основании исследования можно заключить, что RGD-функционализированные гибридные молекулы 1a, 1c, 1g, 1h могут быть перспективны в качестве органического покрытия для моделирования биологической активности ПЭО- модифицированной поверхности титановых имплантатов.

Изобретение относится к области получения комбинированных покрытий для титана на основе биологически активных RGD-функционализированных бифосфонатных производных Arg-Gly-Asp-Cys-(RGDC)-замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидроксиалкан-1,1-диил)бисфосфоновых кислот и применению указанных соединений в качестве органических покрытий для моделирования биологической активности ПЭО-модифицированной поверхности титановых имплантатов. RGD-функционализированные бифосфонатные производные Arg-Gly-Asp-Cys-(RGDC)-замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидроксиалкан-1,1-диил)бисфосфоновых кислот наносят путем физико-химической адсорбции из водных растворов с концентрацией ~10^-3 М/л в течение 1 часа на титан (Grade 2) с неорганическим оксидированным пористым подслоем, полученным в ходе плазменно-электролитического оксидирования. Технический результат – получение покрытий, улучшающих адгезию и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов и остеобластоподобных клеток. 2 н.п. ф-лы, 3 пр., 3 ил.

1. Способ получения Arg-Gly-Asp-Cys-(RGDC)-замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидроксиалкан-1,1-диил)бисфосфоновых кислот (1a-h):

которые наносят путем физико-химической адсорбции из водных растворов с концентрацией ~10^-3 М/л в течение 1 часа на титан (Grade 2) с неорганическим оксидированным пористым подслоем, полученным в ходе плазменно-электролитического оксидирования.

2. Применение соединений 1a, 1c, 1g или 1h, полученных по п. 1, в качестве органических покрытий для моделирования биологической активности ПЭО-модифицированной поверхности титановых имплантатов, увеличивающих адгезию и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов и остеобластоподобных клеток MG-63.