ДИМЕРНЫЕ ДИПЕПТИДНЫЕ МИМЕТИКИ НЕЙРОТРОФИНА-3 Российский патент 2023 года по МПК A61K38/05 A61P25/00 

Область изобретения

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к новым биологически активным дипептидам формулы:

где R = НООС-(СН₂)₂- или НООС-(СН₂)₃- или НО-(СН₂)₃-;

AK = Glu или Asn;

Х = L или D конфигурация; Y = L или D конфигурация;

n = 6 или 7.

Новые соединения представляет собой димерные дипептидные миметики 4-й петли нейротрофина-3 (NT3) и обладают нейропротекторной, антидепрессантоподобной, анксиолитической, антидиабетической и антиаддиктивной активностями. Уровень техники

Нейротрофин-3 (NT3), наряду с фактором роста нервов (nerve growth factor, NGF) и мозговым нейротрофическим фактором (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), является членом семейства нейротрофинов - эндогенных структурно гомологичных белков, ответственных за регуляцию пролиферации, дифференцировки, миелинизации нейронов, поддерживающих их жизнеспособность и фенотипическую стабильность. Нейротрофины и их тирозинкиназные рецепторы TrkA, TrkB и TrkC привлекают большое внимание в качестве потенциальных терапевтических мишеней для лечения широкого спектра заболеваний, в частности, нейродегенеративных и психических. NT3, в отличие от других нейротрофинов, селективных по отношению к разным типам Trk рецепторов, взаимодействует со всеми этими рецепторами, связываясь преимущественно с TrkC, но также с TrkB и TrkA с меньшей аффинностью [Bothwell М. NGF, BDNF, NT3, and NT4. Handb Exp Pharmacol. 2014;220:3-15]. Показана вовлеченность NT3 в гиппокампальный нейрогенез и нейропластичность. В частности, у мутантных мышей, у которых NT3 не экспрессируется в головном мозге, нарушена дифференцировка нейрональных стволовых клеток в зубчатой извилине гиппокампа, а также долговременная потенциация (long-term potentiation), лежащая в основе клеточных механизмов памяти и обучения [Shimazu K, Zhao М, Sakata К, et al. NT-3 facilitates hippocampal plasticity and learning and memory by regulating neurogenesis. Learn Mem. 2006;13(3):307-315]. Во взрослом мозге NT3 и TrkC рецепторы экспрессируются в наибольших количествах в гиппокампе, коре и мозжечке [Ueyama Т, Kawai Y, Nemoto К, Sekimoto М, Tone S, Senba E. Immobilization stress reduced the expression of neurotrophins and their receptors in the rat brain. Neurosci Res. 1997;28(2):103-110; Zhang HT, Li LY, Zou XL, et al. Immunohistochemical distribution of NGF, BDNF, NT-3, and NT-4 in adult rhesus monkey brains. J Histochem Cytochem. 2007;55(1):1-19; Dwivedi Y et al. Neurotrophin receptor activation and expression in human postmortem brain: effect of suicide. Biol Psychiatry. 2009;65(4):319-328; Memo J.-P. et al. Molecular cloning of rat TrkC and distribution of cells expression RNAs for members of the Trk family in the rat central nervous system. 1992;51(3):513-532]. NT3 и TrkC рецепторы экспрессируются также в голубом пятне (locus coeruleus), которое играет важную роль в поведенческом и физиологическом ответе на стрессовые стимулы и вовлечено в патофизиологию расстройств настроения (mood disorders) [Smith М. A. et al. Stress and antidepressants differentially regulate neurotrophin 3 mRNA expression in the locus coeruleus. Neurobiology, v. 92, p. 8788-8792, 1995]. Интересно отметить, что TrkC - единственные Trk рецепторы, обнаруженные в голубом пятне с помощью in situ гибридизации [Memo J.-Р. et al. Molecular cloning of rat TrkC and distribution of cells expression RNAs for members of the Trk family in the rat central nervous system. 1992;51(3):513-532].

В экспериментах in vivo были выявлены нейропротекторные и нейрорегенеративные свойства NT3 на моделях церебральной ишемии [Galvin K.А, Oorschot D.E, Continuous low-dose treatment with brain-derived neurotrophic factor or neurotrophin-3 protects striatal medium spiny neurons from mild neonatal hypoxia/ischemia: a stereological study. Neuroscience.2003;118(4): 1023-1032; Zhang J et al. Neuroprotection of neurotrophin-3 against focal cerebral ischemia/reperfusion injury is regulated by hypoxia-responsive element in rats. Neuroscience. 2012;222:1-9], повреждения спинного мозга [Cong Y et al. NT-3 Promotes Oligodendrocyte Proliferation and Nerve Function Recovery After Spinal Cord Injury by Inhibiting Autophagy Pathway. J Surg Res. 2020;247:128-135] и периферических нервов [Wang H et al. The Promotion of Neural Regeneration in A Rat Facial Nerve Crush Injury Model Using Collagen-Binding NT-3. Ann Clin Lab Sci. 2016;46(6):578-585]; анальгетическая [Wilson-Gerwing TD et al. Neurotrophin-3 suppresses thermal hyperalgesia associated with neuropathic pain and attenuates transient receptor potential vanilloid receptor-1 expression in adult sensory neurons. J Neurosci. 2005;25(3):758-767; Gandhi R. et al. Neurotrophin-3 reverses chronic mechanical hyperalgesia induced by intramuscular acid injection. J Neurosci. 2004;24(42):9405-9413] и когнитотропная активности [Liu DB, Yang JS, Lu QB, Zhu ZF, Fang Q. Effect of NT-3 on infection-induced memory impairment of neonatal rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(5):2182-2187]. NT3, наряду с BDNF, рассматривается как потенциальная мишень для разработки новых терапевтических стратегий для лечения депрессии. Помимо участия в гиппокампальной нейропластичности, антидепрессантоподобный потенциал NT3 обусловлен его способностью модулировать моноаминовую нейротрансмиссию, а также стимулировать экспрессию BDNF [de Miranda AS et al. Is neurotrophin-3 (NT-3): a potential therapeutic target for depression and anxiety?. Expert Opin Ther Targets. 2020;24(12): 1225-1238]. Содержание NT3 снижено в крови людей, страдающих депрессией, причем тем сильнее, чем больше выраженность депрессии [ ЕА et al. Melatonin and neurotrophins NT-3, BDNF, NGF in patients with varying levels of depression severity. Pharmacol Rep.2016;68(5):945-951]. Значительное снижение экспрессии белка и mRNA NT3 выявлено в гиппокампе и коре головного мозга крыс, подвергнутых хроническому непредсказуемому стрессу [Мао QQ. et al. Herbal formula SYJN increases neurotrophin-3 and nerve growth factor expression in brain regions of rats exposed to chronic unpredictable stress. J Ethnopharmacol. 2010;131(1):182-186]. Нейротрофин NT3 при введении в зубчатую извилину гиппокампа крыс оказывал антидепрессантоподобный эффект на модели выученной беспомощности и в тесте вынужденного плавания [Shirayama Y et al. Brain-derived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression. J Neurosci. 2002;22(8):3251-3261].

Способность NT3 стимулировать моноаминергическую передачу, участвовать в регуляции синаптической пластичности и нейрогенеза, а также стимулировать экспрессию BDNF [de Miranda AS et al. Is neurotrophin-3 (NT-3): a potential therapeutic target for depression and anxiety?. Expert Opin Ther Targets. 2020;24(12): 1225-1238; Shimazu K. et al. NT-3 facilitates hippocampal plasticity and learning and memory by regulating neurogenesis. Learn Mem. 2006;13(3):307-315], свидетельствует в пользу вовлеченности нейротрофина и в патогенез тревожных расстройств. Это подтверждается экспериментальными и клиническими данными. Так, трансгенные мыши TgNTRK3 с увеличенной экспрессией в головном мозге полноразмерного рецептора TrkC (TgNTRK.3) используются в качестве модели панических расстройств [Dierssen М. et al. Transgenic mice overexpressing the full-length neurotrophin receptor TrkC exhibit increased catecholaminergic neuron density in specific brain areas and increased anxiety-like behavior and panic reaction. Neurobiol Dis. 2006;24(2):403-418]. У мышей линии TgNTRK3 нарушено угасание условно-рефлекторного страха и наблюдается дефицит долговременной потенциации в инфралимбической коре, при этом введение этим мышам NT3 в инфралимбическую кору восстанавливает процесс угасания страха [D'Amico D. et al. Infralimbic Neurotrophin-3 Infusion Rescues Fear Extinction Impairment in a Mouse Model of Pathological Fear. Neuropsychopharmacology. 2017;42(2):462-472]. Генетические исследования у людей подтверждают участие NT3/TrkC-сигналинга в развитии панических и обсессивно-компульсивных расстройств [et al. Allele variants in functional MicroRNA target sites of the neurotrophin-3 receptor gene (NTRK3) as susceptibility factors for anxiety disorders. Hum Mutat. 2009;30(7):1062-1071].

Существуют данные, свидетельствующие в пользу вовлеченности NT3 в патогенез сахарного диабета. На модели стрептозотоцинового диабета было показано, что NT3 корректирует дефицит проводимости седалищного нерва у крыс [Mizisin АР. et al. Neurotrophin-3 reverses nerve conduction velocity deficits in streptozotocin-diabetic rats. J Peripher Nerv Syst. 1999;4(3-4):211-221], предотвращает атрофию аксонов, улучшает нарушенный гомеостаз кальция, предотвращает митохондриальную дисфункцию в сенсорных нейронах крыс при подкожном хроническом введении [Huang TJ. et al. Neurotrophin-3 prevents mitochondrial dysfunction in sensory neurons of streptozotocin-diabetic rats. Exp Neurol. 2005;194(1):279-283]. Установлено, что в условиях экспериментального диабета наблюдается снижение выработки NT3 в Шванновских клетках [Dey I. et al. Diabetic Schwann cells suffer from nerve growth factor and neurotrophin-3 underproduction and poor associability with axons. Glia. 2013;61(12): 1990-1999].

Хорошо известно о ноцицептивных эффектах NT3. Так, при внутримозговом введении NT3 увеличивал болевой порог крыс в тесте отдергивания хвоста [Siuciak JA. et al. Antinociceptive effect of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3. Brain Res. 1994;633(1-2):326-330]. Острое внутрибрюшинное введение NT3 крысам приводило к развитию механической гипоальгезии, ассоциированной со снижением высвобождения субстанции Р в спинном мозге [Malcangio М. et al. Nerve growth factor- and neurotrophin-3-induced changes in nociceptive threshold and the release of substance P from the rat isolated spinal cord. J Neurosci. 1997;17(21):8459-8467]. Рекомбинантный NT3 при однократной подкожной инъекции устранял воспалительную гипералгезию у крыс [Watanabe М et al. Inhibition of adjuvant-induced inflammatory hyperalgesia in rats by local injection of neurotrophin-3. Neurosci Lett. 2000;282(1-2):61-64]. На модели периферической нейропатии NT3 при интратекальном введении снижал повышенную экспрессию капсаициновых рецепторов TRPV1 в задних корешках спинного мозга и предотвращал развитие термической гиперчувствительности [Wilson-Gerwing TD et al. Neurotrophin-3 suppresses thermal hyperalgesia associated with neuropathic pain and attenuates transient receptor potential vanilloid receptor-1 expression in adult sensory neurons. J Neurosci. 2005;25(3):758-767].

Исследования Эрика Нестлера и его коллег выявили роль нейротрофических факторов в механизме действия психоактивных веществ (ПАВ), вызывающих привыкание [Nestler EJ, Aghajanian GK. Molecular and cellular basis of addiction. Science. 1997;278(5335):58-63; Nestler EJ. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat Rev Neurosci. 2001;2(2):119-128; Nestler EJ. From neurobiology to treatment: progress against addiction. Nat Neurosci. 2002;5 Suppl: 1076-1079]. Активность дофаминергических нейронов, имеющих проекции из вентральной тегментальной области (VTA) в прилежащее ядро (мезолимбический путь), считается центральной в формировании подкрепляющих эффектов, определяющих развитие зависимостей от ПАВ. Хроническое употребление опиатов и/или опиоидов вызывает длительные изменения в синаптической функции и передаче сигналов в дофаминергических нейронах мезолимбического пути, а также норадренергических нейронах голубого пятна [Nestler EJ, Aghajanian GK. Molecular and cellular basis of addiction. Science. 1997;278(5335):58-63; Williams JT. et al. Cellular and synaptic adaptations mediating opioid dependence. Physiol Rev. 2001;81(l):299-343]. Установлено, что NT3 и TrkC экспрессируются в голубом пятне [Smith MA. et al. Stress and antidepressants differentially regulate neurotrophin 3 mRNA expression in the locus coeruleus. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92(19):8788-8792] и вентральной тегментальной области [Numan S, Seroogy KB. Expression of trkB and trkC mRNAs by adult midbrain dopamine neurons: a double-label in situ hybridization study. J Comp Neurol. 1999; 403(3):295-308]. В экспериментах in vitro NT3 оказывал трофическое действие в отношении норадренергических нейронов голубого пятна [Friedman WJ et al. Differential actions of neurotrophins in the locus coeruleus and basal forebrain. Exp Neurol. 1993;119(1):72-78]. В экспериметах in vivo установлена вовлеченность NT3 в развитие состояний зависимости. Так, морфин при длительном введении крысам вызывал увеличение уровней мРНК BDNF и NT3 в норадренергических нейронах голубого пятна, а отмена морфина приводила к значительному увеличению экспрессии мРНК BDNF через 2, 6, 20 и 70 ч, но снижению уровней мРНК NT3 через 20 и 70 ч после последнего предъявления опиата, при этом уровни мРНК TrkC были также ниже контрольных значений через 20 и 70 ч после отмены морфина [Numan S. et al. Differential regulation of neurotrophin and trk receptor mRNAs in catecholaminergic nuclei during chronic opiate treatment and withdrawal. J Neurosci. 1998; 18(24):10700-10708]. Обработка нейронов голубого пятна морфином приводила к снижению поглощения норадреналина на 20% и уменьшению на 12% количества тирозингидроксилазных-иммунореактивных (ТН+) клеток, а при введении в культуру клеток NT3 отмечалось увеличение захвата норадреналина и числа ТН+ клеток, хотя при совместном введении в культуру LC нейронов морфина и NT3 регистрировали ослабление эффектов нейротрофина на указанные выше показатели [Sklair-Tavron L, Nestler EJ. Opposing effects of morphine and the neurotrophins, NT-3, NT-4, and BDNF, on locus coeruleus neurons in vitro. Brain Res. 1995;702(1-2):117-125]. Инфузия NT3 непосредственно в вентральную тегментальную область крысам предотвращала биохимические изменения в мезолимбической дофаминергической системе, возникающие при продолжительном действии морфина [Berhow МТ. et al. Influence of neurotrophic factors on morphine- and cocaine-induced biochemical changes in the mesolimbic dopamine system. Neuroscience. 1995;68(4):969-979].

В связи с трудностями доставки нейротрофинов в ЦНС, обусловленными плохим проникновением через гематоэнцефалический барьер, коротким периодом полужизни и быстрой деградацией, во всем мире разрабатываются их низкомолекулярные миметики, обладающие приемлемыми фармакокинетическими свойствами. В отличие от низкомолекулярных миметиков NGF и BDNF, которым посвящено большое количество литературы начиная с начала 1990-х годов прошлого века, существует лишь небольшое количество публикаций, в которых описываются миметики NT3.

Первый низкомолекулярный миметик NT3 (соединение 2b), созданный под руководством Burgess K. и Saragovi U.H. на основе бета поворотного скэффолда, был описан в 2002 году. Соединение 2b представляло собой макроциклический бета-повортный пептидомиметик, содержащий в структуре дипептидный фрагмент Lys-Ser NT3. Было установлено, что 2b в концентрациях 0.4-50 мкМ потенцирует выживаемость экспрессирующих TrkC клеток линии NIH-3T3 при инкубации в бессывороточной среде в присутствии NT3 в субоптимальных концентрациях (0,1 нМ). Методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACScan assay) было показано прямое связывание соединения 2b с TrkC рецепторами в концентрации 20 мкМ, а методом Вестерн-блот анализа показано, что 2b в концентрации 50 мкМ вызывает фосфорилирование тирозиновых остатков TrkC (антитело mAb 4G10). В дальнейшем этой же научной группой были созданы другие низкомолекулярные миметики NT3, на основе азот-, сера- и кислородсодержащих бета-поворотных темплетов с внедренной дипептидной последовательностью β-изгибов нейротрофина. Из них ряд соединений связывались с TrkC рецепторами, что было показано FACScan методом. Наиболее интересным соединием являлся миметик NT3, который активировал специфичный для нейротрофина рецептор TrkC, не активируя при этом TrkA (1Аа). Для данного пептидомиметика 1Аа была показана активность на in vitro модели нейросенсорной тугоухости [Kempfle JS. et al. A Novel Small Molecule Neurotrophin-3 Analogue Promotes Inner Ear Neurite Outgrowth and Synaptogenesis In vitro. Front Cell Neurosci. 2021;15:666706], характерная для полноразмерного NT3 [Wan G. et al. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 2014;3:е03564]. В концентрации 400 нМ 1Aa усиливал рост нейритов в культуре нейронов спирального ганглия, а также в культуре эксплантов кортиева органа защищал ленточные синапсы внутренних волосковых клеток и способствовал их регенерации в условиях повреждения киановой кислотой [Kempfle JS. et al. A novel small molecule neurotrophin-3 analogue promotes inner ear neurite outgrowth and synaptogenesis in vitro. Front Cell Neurosci. 2021;15:666706].

Кроме того, был сконструирован ряд симметричных и смешанных бивалентных миметиков NT3, в структуре которых содержалось по два дипептидных фрагмента р-изгиба, связанных линкером. Конформация р-изгиба воспроизведена с помощью триазольного темплета [Chen D. et al. Bivalent peptidomimetic ligands of TrkC are biased agonists and selectively induce neuritogenesis or potentiate neurotrophin-3 trophic signals. ACS Chem Biol. 2009;4(9):769-781]. FACScan методом с использованием биотиновой и флуорисцеиновой меток было показано прямое связывание бивалентных миметиков (в концентрации 50 мкМ) с TrkA и TrkC рецепторами. С помощью Вестерн-блот анализа показана активация TrkA и TrkC и их пострецепторных сигнальных путей PI3K/AKT и MAPK/ERK. В экспериментах in vitro некоторые миметики обладали нейропротекторной, а другие только дифференцирующей активностью. Так, симметричный бивалентный миметик 6С, в условиях в концентрации 20 мкМ обладал собственной нейропротекторной активностью, а также потенцировал нейропротекторные эффекты NT3 и NGF в их субоптимальных концентрациях. Миметик 6С не обладал дифференцирующей активностью, тогда как его несимметричный аналог 6F, в структуре которого воспроизведены боковые радикалы ако Tyr, Trp, Leu и Lys, демонстрировал нейритогенный эффект, но не проявлял нейропротекторного эффекта.

Научной группой из University of Catania, (Catania, Italy) под руководством Enrico Rizzarelli был синтезирован пептид, содержащий 13 аминокислотных остатков (1-13) N-концевого участка NT3 [Naletova I. et al. Copper complexes of synthetic peptides mimicking neurotrophin-3 enhance neurite outgrowth and CREB phosphorylation. Metallomics. 2019;11(9):1567-1578]. В экспериментах in vitro на клетках нейробластомы человека линии SH-SY5Y было показано, что пептид, подобно полноразмерному нейротрофину, стимулирует дифференцировку нейронов и рост нейритов, причем эти эффекты ингибировались при блокировании Trk рецепторов, а также вызывает фосфорилирование CREB. В комплексе с ионами меди пептид проявлял более выраженную активность, что предположительно можно объяснить улучшением интернализации пептида.

Ниже представлены моновалентные (2b, 1Аа) и бивалентный (6С) миметики NT3, содержащие в структуре его дипептидные последовательности [Pattarawarapan М. et al. New templates for syntheses of ring-fused, C(10) beta-turn peptidomimetics leading to the first reported small-molecule mimic of neurotrophin-3. J Med Chem. 2002; 45(20):4387-4390; D. Chen et al. Bivalent peptidomimetic ligands of TrkC are biased agonists and selectively induce neuritogenesis or potentiate neurotrophin-3 trophic signals. ACS Chem Biol. 2009; 4(9):769-781; Zaccaro MC et al. Selective small molecule peptidomimetic ligands of TrkC and TrkA receptors afford discrete or complete neurotrophic activities. Chem Biol. 2005; 12(9): 1015-1028].

Сущность изобретения

Целью нашей работы было получение низкомолекулярных миметиков нейротрофина-3 (NT3) с нейропротекторной, антидепрессантоподобной, анксиолитической, антидиабетической и антиаддиктивной активностями. Мы нашли, что эта цель может быть достигнута с помощью соединений общей формулы:

где R = НООС-(СН₂)₂- или НООС-(СН₂)₃- или НО-(СН₂)₃-;

AK = Glu или Asn;

Х = L или D конфигурация; Y = L или D конфигурация; n = 6 или 7.

Примерами осуществления изобретения могут служить следующие соединения:

I гексаметилендиамид бмс-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина)

II гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-L-аспарагина)

III гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-D-аспарагина)

IV гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-D-аспарагина)

V гексаметилендиамид бмс-(N-γ-оксибутирил-L-глутамил-L-аспарагина)

VI гексаметилендиамид бмс-(N-моноглутарил-L-аспарагинил-L-аспарагина)

VII гептаметилендиамид бмс-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина)

Представляемые в изобретении соединения дополнительно иллюстрирует табл.1.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных средств для лечения заболеваний, состояний и расстройств нерной системы, требующих применения средств обладающих нейропротекторной, антидепрессантоподобной, анксиолитической и антиаддиктивной активностями, а также для лечения гипергликемии, и не вызывающих гиперальгезии, характерной для полноразмерных нейротрофинов.

Дизайн димерных дипептидных миметиков NT3

Дизайн миметиков основывался на кристаллической структуре NT3 (pdb ID: lnt3), где 1, 2, 3, 4 - петли гомодимера [Butte, M.J., Hwang, Р.К., Mobley, W.C., Fletterick, R.J. // 1998. Biochemistry. 37. P. 16846-16852]:

Подобно другим членам нейротрофинового семейства, NT3 представляет собой симметричный гомодимер, мономерные единицы которого содержат 7 бета-тяжей, образующих три антипараллельных β-листа. β-Тяжи связаны четырьмя экспонированными наружу нерегулярными участками, называемыми петлями: 1-я (остатки 29-33), 2-я (42-47), 3-я (остатки 58-75) и 4-я (91-97). Наиболее экспонированной является 4-я петля, фрагмент которой - Ser⁹¹-Glu⁹²-Asn⁹³-Asn⁹⁴-Lys⁹⁵-Leu⁹⁶-, содержащий в своей структуре поворотные участки, предположительно занимает геометрически наиболее выгодное для взаимодействия с рецептором положение. При конструировании мы сохраняли дипептидный фрагмент -Asn⁹³-Asn⁹⁴- как центральный фрагмент бета-поворот-подобного участка, а предшествующий а.о. Glu⁹² заменяли на его биоизостер -остаток янтарной кислоты (ГТС-301 и ГТС-306) или остаток глутаровой кислоты (ГТС-304). Димерную структуру нейротрофина воспроизводили с помощью гексаметилендиаминового или гептаметилендиаминового спейсеров по С-концу. Кроме того, был сконструирован миметик NT3 на основе этого же фрагмента 4-й петли, но со сдвигом на один а.о. влево относительно Asn⁹³-Asn⁹⁴. При этом сохраняли дипептидный участок -Glu⁹²-Asn⁹³, предшествующий а.о. Ser⁹¹ заменяли его биоизостером, остатком гамма-оксимасляной кислоты, димеризацию вели с помощью гексаметилендиамина. Получали ГТС-302.

Для изучения стереоспецифичности фармакологического эффекта на примере ГТС-301 были получены его диастереомеры ITC-301LD, TTC-301DL, TTC-301DD.

Таким образом, были сконструированы димерные дипептидные миметики 4-й петли NT3:

гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-301)

гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-D-аспарагина) (ГТС-301LD)

гексаметилендиамид бмс-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-301DL)

гексаметилендиамид бмс-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-D-аспарагина) (ГТС-301DD)

гексаметилендиамид бмс-(N-γ-оксибутирил-L-глутамил-L-аспарагина) (ГТС-302)

гексаметилендиамид бмс-(N-моноглутарил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-304)

гептаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-306)

Синтез миметиков NT3

Миметики NT3 являются соединениями пептидной природы и могут быть получены методами классического пептидного синтеза в гомогенной фазе.

Конденсация в гомогенной фазе может быть выполнена следующим образом:

а) конденсация аминокислоты, имеющей свободную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, которая имеет свободную аминогруппу и защищенные другие реакционоспособные группы, в присутствии конденсирующего агента такого как карбодиимид;

б) конденсация аминокислоты, имеющей активированную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, которая имеет свободную аминогруппу и защищенные другие реакционноспособные группы;

в) конденсация аминокислоты, имеющей свободную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, имеющей активированную аминогруппу и защищенные другие реакционносособные группы.

Карбоксильная группа может быть активирована превращением ее в азидную, ангидридную группы или активированный эфир, такой как N-оксисукцинимидный, N-оксибензотриазольный, пентахлорфениловый, пентафторфениловый или паранитрофениловый эфиры. Аминогруппа может быть активирована превращением ее в фосфитамид или «фосфоразным» методом.

Наиболее общими для рассмотренных выше реакций конденсации являются: карбодиимидный метод; азидный метод; метод смешанных ангидридов; метод активированных эфиров, описанные в "The Peptides". Vol.1. 1965 (Academic Press), E. Schroeder, K. Lubke, или в "The Peptides", Vol.1, 1979 (Academic Press) E. Cross, L. Meinhofen.

Предпочтительными методами конденсации при получении пептидов формулы (1) является метод активации карбоксильной группы, который проводят преимущественно с применением пентафторфениловых эфиров защищенных по аминогруппе аминокислот. Лучшим растворителем для получения активированного эфира защищенной аминокислоты является этилацетат, а для конденсации а.к.о. - диметилформамид.

Реакционноспособные группы, которые не должны участвовать в конденсации, могут быть защищены группами, которые легко удаляются, например, гидролизом или восстановлением. Так, карбоксильная группа может быть защищена этерификацией метанолом, этанолом, трет-бутанолом, бензиловым спиртом.

Аминогруппу обычно эффективно защищают кислотными группами, например остатками алифатических, ароматических, гетероциклических карбоновых кислот, такими как ацетил, бензоил, пиридинкарбоксил, кислотными группами, производными угольной кислоты, такими как этоксикарбонил, бензилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил; или кислотными группами, производными сульфокислоты, такой как пара-толуолсульфониловая.

Защитные группы удаляют в соответствии с природой этих групп. Карбобензокси-группу удаляют каталитическим гидрогенолизом в токе водорода в метаноле с добавкой 10%-ного палладия на угле; трет-бутилоксикарбонильную группу удаляют в присутствии безводной трифторуксусной кислоты в дихлорметане.

При синтезе заявляемых соединений N-ацильные производные получали, используя ангидриды янтарной и глутаровой кислот, бутиролактон. Димерную структуру дипептидов по формуле (1) воспроизводили взаимодействием активированного эфира защищенного аспарагина с гекса- или гептаметилендиамином.

Ниже представлены примеры осуществления изобретения.

Используемые сокращения:

Boc - трет-бутилоксикарбонил

DIEA - диизопропилэтиламин

DCC - дициклогексилкарбодиимид

DCM - дихлорметан

DCU - дициклогексилмочевина

DMF - диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

EtOAc - этилацетат

OPfp - пентафторфенил

Pd/C - наночастицы палладия на поверхности активированного угля

TFA - трифторуксусная кислота

Z - бензилоксикарбонил

ДЦГА - дициклогексиламин

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Исходные вещества и вспомогательные реагенты:

Реагенты: L-аспарагин (ООО «Диаэм», производство КНР), Z-L-Glu(OtBu)-ОН*ДЦГА (производство КНР), пентафторфенол и трифторуксусная кислота (AlfaAesar, США), дициклогексилкарбодиимид (Sigm - Aldrih, Германия), ди-трет-бутилпирокарбонат (ООО "Кемикал лайн», Россия), катализатор Pd/C (Acros organics, Германия).

Растворители: этилацетат, диметилформамид (ДМФА), диэтиловый эфир, дихлорметан, гексан, метанол были получены от ООО ТД «Химмед» (Россия). ДМФА очищали перегонкой в вакууме над нингидрином. Диэтиловый эфир выдерживали над NaOH, затем фильтровали через бумажный фильтр. Дихлорметан пропускали через колонку с Al₂O₃. Этилацетат и спирты использовали без дополнительной очистки.

Для определения физико-химических характеристик полученных веществ использовали следующую аппаратуру:

температуры плавления определяли на приборе Optimelt МРА100 (Stanford Research Systems, США) в открытых капиллярах без корректировки;

удельное оптическое вращение регистрировали на автоматическом поляриметре ADP 440 Polarimeter (Bellingham + Stanley Ltd., Великобритания).

Строение и диастереомерную чистоту целевых пептидов и промежуточных соединений устанавливали методами одномерной ¹Н-,¹³С- и двумерной (COSY - гомоядерная корреляция, HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция, НМВС - гетероядерная многосвязная корреляция) ЯМР-спектроскопии. Спектры ¹Н- и,³С-ЯМР регистрировали в шкале δ, м. д. на спектрометре Bruker FOURIER 300 HD (Bruker Corporation, Leipzig, Germany, 300 и 75 МГц для ядер ¹Н- и ¹³С соответственно) в растворах DMSO-d₆ и CDCl₃, внутренний стандарт тетраметилсилан (0 м.д.). Константа спин-спинового взаимодействия J, Гц. Для обозначения резонансных сигналов использовали следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет.

Масс-спектрометрия: спектры высокого разрешения регистрировали на приборе Bruker microTOF II методом электрораспылительной ионизации (ESI-MS). Измерения выполнены на положительных (напряжение на капилляре 4500 V) или отрицательных (напряжение на капилляре 3200 V) ионах. Диапазон сканирования масс (m/z) 50-3000 Да, калибровка - внешняя или внутренняя (Electrospray Solution, Fluka). Использован шприцевой ввод вещества. Скорость потока 3 мкл/мин. Газ-распылитель - азот (4 л/мин); температура интерфейса 180°С.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на стеклянных силикагелевых пластинах DC Kieselgel 60 G/F₂₅₄ (Merck, Германия) в системах растворителей: хлороформ - МеОН - вода - уксусная кислота, 15:10:2:3 (А);

н-бутанол - уксусная кислота - вода, 3:1:1 (В);

EtOAc (С);

гексан - EtOAc, 1:5 (D).

хлороформ - МеОН - вода - уксусная кислота, 8:10:2:3 (Е);

хлороформ - МеОН - уксусная кислота, 8:1:0,1 (F).

Аминосодержащие соединения обнаруживали нингидрином, соединения с амидными группами - с помощью хлор-толидиновой пробы, соединения с открытой карбоксильной группой - бромкрезоловым зеленым.

Приготовление раствора для хлор-толидиновой пробы: в емкость темного стекла объемом 1 л помещали навеску 160 мг о-толидина, 1 г KI, приливали 30 мл лед. уксусной кислоты и 500 мл дистиллированной воды, перемешивали. Проявление хроматограммы: пластинку помещали в атмосферу хлора (свежеприготовленного из 1.5% раствора KMnO₄ и 10% раствора HCl) на 2-3 мин. Затем пластинку оставляли на 3-5 мин под током воздуха для удаления избытка хлора, далее опускали в раствор толидина на 5 с, промывали пластину водой.

Аналитическую ВЭЖХ дипептида ГТС-301 проводили с использованием хроматографической системы Wellchrom 2001 (KNAUER, Германия) на колонке LUNA-C18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм) в градиенте концентраций ацетонитрила в 0.1% TFA (5-50%, 20 мин). Скорость потока 1 мл/мин, детектирование при длине волны 214 нм.

ПРИМЕР 1. Получение гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-301)

а) N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина, Boc-L-Asn-OH

К раствору 56.75 г (0.378 моль) моногидрата H-L-Asn-OH в 380 мл 1М NaOH при перемешивании последовательно приливали раствор 18.9 г (0.225 моль) NaHCO₃ в 190 мл воды и 380 мл i-PrOH. Далее при комнатной температуре к реакционной массе порционно прибавляли 113 мл (0,491 моль) ди-трет-бутилпирокарбоната в течение 40 мин и перемешивали 20 ч. Реакционную массу упаривали до 1/3 объема и разбавляли 400 мл воды, избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали гексаном (2×150 мл). Водный раствор охлаждали до +10°С и подкисляли 1М HCl до рН 2.5. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали 100 мл холодной воды (+10°С), i-PrOH (100 мл), гексаном (50 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Выход продукта Boc-L-Asn-OH 79.5 г (91%) в виде белого порошка. R_ƒ 0.84 (Е), R_ƒ 0.71 (В); т.пл. 176-176.4°С (с разложением); [α]_D²¹⁵ - 11.2° (с = 1, DMF), [α]_D²¹ - 9.6° (с = 2, DMF). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.38 (с, 9Н, -ОС(СН₃)₃ Вос), 2.37-2.53 (м, 2Н, С^βН₂ Asn), 4.27 (м, 1Н, C^αH Asn), 6.60 (д, минорный конформер NH Asn), 6.88 (д, 1Н, мажорный конформер, ³J=8.5 Гц, NH Asn), 6.91 and 7.32 (два с, 2Н, -C(О)NH₂ Asn), 12.52 (с, 1Н, СООН), и 4.14 (м, 1Н, С^αН Asn). Лит. [Keller О, Keller WE, Look G van, Wersin G. tert -Butoxycarbonylation of Amino Acids and their Derivatives: N-tert -Butoxycarbonyl-l-phenylalanine. In: Organic Syntheses. Coll; Vol.7 (1990), 70]: T пл. 176°С (decomp); [α]_D²⁰ - 7.2° (c = 2, DMF). Лит. [Т. Munegumi, K. Akao, Y. Kawatu, T. Yamada and K. Harada //Asian Journal of Chemistry; Vol.26, No. 19 (2014), 6541-6548 Heating Reactions of N-t-Butyloxycarbonyl-Asparagine and Related Compounds]: T. пл. 177-179°C (EtOH); [α]_D²⁰ - 7.8° (c=1, DMF).

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина, Boc-L-Asn-OPfp

К суспензии 10.0 г (43 ммоль) Boc-L-Asn-OH в 150 мл EtOAc при комнатной температуре и перемешивании приливали раствор 12.01 г (52 ммоль) PfpOH в 60 мл EtOAc. Раствор охлаждали до 10°С и порционно приливали раствор 10.73 г (52 ммоль) DCC в 50 мл EtOAc. Реакционную массу перемешивали 7 ч при 10-12°С и оставляли при этой температуре на 12 ч без перемешивания. Выпавший осадок DCU отфильтровывали (фильтрацию проводили при 10°С), промывали 60 мл EtOAc (10°С). Объединенные фильтраты упаривали, полученный твердый остаток затирали под петролейным эфиром (75 мл) и оставляли в холодильнике на 12 ч. Осадок отфильтровывали, промывали петролейным эфиром (50 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Выход продукта Boc-L-Asn-OPfp 16,53 г (96%) в виде белого порошка. R_ƒ 0.73 (С), R_ƒ 0.66 (D), R_ƒ 0.63 (F); т.пл. 120-123°С; [α]_D²³ - 17.9° (с = 1, EtOAc). ¹Н-ЯМР (CDCl₃): 1.47 (с, 9Н, - ОС(СН₃)₃ Boc), 2.90 (дд, 1Н, ²J=16.5 Гц; ³J=4.1 Гц, С^βН₂ Asn), 3.15 (дд, 1Н, ²J=16.5 Гц; ³J=4.7 Гц С^βН₂ Asn), 4.91 (м, 1Н, C^αH Asn), 5.92 (д, ³J=6.15 Гц, 1Н, NH Asn), 5.94 и 6.03 (два уш с, 2Н, -C(О)NH₂ Asn).

Лит. [Kisfaludy L, Low M, Nyeki О, Szirtes T, Schon I. Die Verwendung von Pentafluorphenylestern bei Peptidsynthesen. Justus Liebigs Ann Chem. 1973; 1973(9): 1421-1429]: Т. пл. 124-126°C (диэтиловый эфир/гексан); [α]_D²⁵ - 16.7° (с=1, EtOAc).

в) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина), (Boc-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

К раствору 3.87 г (9,73 ммоль) Boc-L-Asn-OPfp в 20 мл DMF, при перемешивании приливали раствор 0.51 г (4,40 ммоль) гексаметилендиамина в 15 мл DMF. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (40°С), к остатку приливали 200 мл дистиллированной воды (43-45°С) и оставляли при комнатной температуре до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), петролейным эфиром (2×40 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.90 г (79%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ 0.91 (Е), R_ƒ 0.75 (В); т.пл. 206-211°С (с разложением); [α]_D²¹ - 2.0° (с=1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.20 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.37 (м, 22Н, 2 С²Н₂ спейсер, 2 -ОС(СН₃)₃), 2.36 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 3.02 (м, 4Н, 2 С ¹Н₂ спейсер), 4.16 (м, 2Н, C^αH Asn), 6.82 (д, ³J=8.1 Гц, 2Н, NH Asn) 6.88 и 7.26 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 7.67 (т, ³J=5.3 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-).

г) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(L-аспарагина), (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Раствор 1.20 г (46.45 ммоль) (Boc-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали при комнатной температуре 2 ч, затем упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 2.00 г (87%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.36 (Е), R_ƒ0.17 (В); т.пл. 160-178°С (с разложением); [α]_D²⁵+4.7° (с=1, МеОН), [α]_D²⁵+1.0° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.26 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.40 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 2.62 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 3.09 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 3.98 (м, 2Н, 2 С^αН Asn), 7.23 и 7.66 (два с, 4Н, 2 -C(O)NH₂ Asn), 8.09 (уш с, 6Н, 2 N⁺H₃ Asn), 8.33 (т, ³J 5.5 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-).

д) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагинил-L-аспарагина), (Boc-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

К раствору 1.68 г (2,90 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл DMF приливали 1.12 мл (6.45 ммоль) DIEA и при перемешивании присыпали 2.57 г (6.45 ммоль) Boc-L-Asn-OPfp. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 50 мл дистиллированной воды (45°С) и оставляли до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), гексаном (20 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.50 г (66%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.89 (Е), R_ƒ0.36 (В); т.пл. 200-227°С (с разложением); [α]_D²⁴ - 9.2° (с=1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.19 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.38 (м, 22Н, 2 С²Н₂ спейсер, 2 -ОС(СН₃)₃ Вос), 2.39-2.55 (м, 8Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.17 (м, 2Н, С^αН ²Asn), 4.41 (м, 2Н, С^αН ¹Asn), 6.88 и 6.96, 7.33 и 7.38 (четыре с, 8Н, 4 -C(O)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.00 (д, 2Н, ³J=7.3 Гц, 2 NH ²Asn), 7.61 (т, ³J=4.8 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.11 (д, 2Н, ³J=7.9 Гц, 2 NH ¹Asn).

е) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(2,-аспарагинил-2,-аспарагина), (CF₃COOH*H-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ (6)

Суспензию 1.047 г (1.35 ммоль) (Boc-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали 2.5 ч, затем реакционную массу упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.96 г (88%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.25 (A), R_ƒ0.03 (В), R_ƒ0.28 (Е); т.пл. 197-21 ГС (с разложением); [α]_D²⁴ - 5.0° (с = 1, DMSO), [α]_D²⁴ - 7.5° (с = 0.66, МеОН:Н₂О = 2:1). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.20 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, -2 С²Н₂ спейсер), 2.41 и 2.52 (два дд, ²J=15.7 Гц, ³J=8.0 Гц, ³J=5.3 Гц, 4Н, 2 C^βH₂ ²Asn), 2.63 и 2.74 (два дд, ²J=17 Гц, ³J=7.5 Гц, ³J=5.0 Гц, 4Н, 2 С^βН₂ ¹Asn), 3.02 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.05 (м, 2Н, 2 C^αH ²Asn), 4.53 (м, 2Н, 2 C^αH ¹Asn), 6.91 и 7.37; 7.29 и 7.75 (четыре с, 8Н, 4 -C(O)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.84 (т, ³J=5.6 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.15 (уш с, 6Н, 2 N⁺H₃ ²Asn), 8.61 (д, 2Н, ³J=7.7 Гц, 2 NH ¹Asn).

ж) Гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина), (HOOC-(CH₂)₂-CO-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, ГТС-301

К раствору 0.90 г (1.12 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)6 в 20 мл DMF приливали 0.46 мл (2.60 ммоль) DIEA, затем при перемешивании присыпали 0.30 г (2.60 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 4 ч, далее оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 40 мл ацетона и оставляли на 2 ч при перемешивании, сформировавшийся осадок отфильтровывали, промывали горячим МеОН (3×10 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.80 г (93%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.24 (A), R_ƒ0.08 (В), R_ƒ0.42 (Е); т = 10.15 мин; т.пл. 214-229°С (из метанола, с разложением); [α]_D²² - 20.2° (с = 1, DMSO); Найдено, m/z: 71334 [М+Н]⁺; m/z: 771.33 [М-Н]^-. C₃₀H₄₈N₁₀O₁₄. Вычислено, m/z: 772.77.

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.21 (с, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 2.37-2.60 (м, 16Н, 4 C^βH₂ ¹Asn и ²Asn; 2 -СН₂СН₂-СООН Suc), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.42 (м, 4Н, 4 С^αН ¹Asn и ²Asn), 6.87 и 7.33; 6.99 и 7.44 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.61 (т, ³J=5.3 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.15 (д, 2Н, ³J=7.9 Гц, 2 NH ²Asn), 8.27 (д, 2Н, ³J=7.0 Гц, 2 NH ¹Asn), 12.11 (уш с, 2 Н, 2 СООН Suc).

¹³С -ЯМР (DMSO-d₆): 174.42 (с, 2 СО, СООН Sue), 172.31 (с, 4 CONH₂ ¹Asn и ²Asn), 172.01 (с, 2 CONH Sue), 171.13 (с, 2 CONH ²Asn), 170.92 (с, 2 CONH ¹Asn), 50.52 (с, 4С^{α 1}Asn и ²Asn), 39.19 (s, 2 С¹ спейсер), 37.47 (с, 2 С^{β 2}Asn), 37.09 (с, 2 С^{β 1}Asn), 30.35 (с, 2 С² Sue), 29.56 (с, 2 С¹ Sue), 29.34 (с, 2 С² спейсер), 26.41 (с, 2 С³ спейсер).

ПРИМЕР 2. Получение гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-D-аспарагина) (ГТС-301LD)

а) N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагин, Boc-D-Asn-OH

Получали аналогично примеру 1 пункт а.

К раствору 17.04 г (0.1135 моль) моногидрата H-D)-Asn-OH в 130 мл 1М NaOH при перемешивании последовательно приливали раствор 6.30 г (0.075 моль) NaHCO₃ в 56.75 мл воды и 113.5 мл i-PrOH. Далее при комнатной температуре к реакционной массе порционно прибавляли 35 мл (0.164 моль, 30% избыток) ди-трет-бутилпирокарбоната в течение 40 мин и перемешивали 20 ч. Реакционную массу упаривали до 1/3 объема и разбавляли 200 мл воды, избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали гексаном (2×100 мл). Водный раствор охлаждали до +10°С и подкисляли 1М HCl до рН=2.5.

Выпавший осадок отфильтровывали, промывали 100 мл холодной воды (+10°С), i-PrOH (100 мл), гексаном (50 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Выход продукта Boc-D-Asn-OH 22.79 г (87%) в виде белого кристаллического продукта. R_ƒ0.51 (A), R_ƒ0.84 (Е), R_ƒ0.71 (В); т.пл. 172.4-173.1°С; [α]_D²²+7.5° (с = 1, DMF); [α]_D²²+7.0° (с = 2, DMF). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.37 (с, 9Н, -ОС(СН₃)₃ Boc), 2,42 и 2,52 (два дд, 2Н, ³J=5.59 Гц и ³J=7.36 Гц, ²J=15.27 Гц С^βН₂ Asn), 4.23 (м, 1Н, C^αH Asn), 6,87 (д, 1Н, ³J 8,5 Гц, NH Asn), 6.91 and 7.32 (два с, 2Н, -C(О)NH₂ Asn), 12.51 (с, 1Н, СООН).

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагина, Boc-D-Asn-OPfp

Получали аналогично примеру 1 пункт б.

К суспензии 20.0 г (0.0861 моль) Boc-D-Asn-OH в 150 мл EtOAc при комнатной температуре и перемешивании приливали раствор 12.01 г (52 ммоль) PfpOH в 60 мл EtOAc. Раствор охлаждали до 10°С и порционно приливали раствор 10.73 г (52 ммоль) DCC в 50 мл EtOAc. Реакционную массу перемешивали 7 ч при 10-12°С и оставляли при этой температуре на 12 ч без перемешивания. Выпавший осадок DCU отфильтровывали (фильтрацию проводили при 10°С), промывали 60 мл EtOAc (10°С). Объединенные фильтраты упаривали, полученный твердый остаток затирали под петролейным эфиром (75 мл) и оставляли в холодильнике на 12 ч. Осадок отфильтровывали, промывали петролейным эфиром (50 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 31.23 г (91%) в виде белого кристаллического продукта. R_ƒ0.74 (С), R_ƒ0.67 (D), R_ƒ0.63 (F); т.пл. 116.5-119°С; [α]_D²³+17.7° (с = 1, EtOAc);. ¹Н-ЯМР (CDCl₃): 1.47 (с, 9Н, -ОС(СН₃)₃ Boc), 2.91 (дд, 1H, ²J=16.5 Гц, ³J=4.0 Гц, С^βН₂ Asn), 3.15 (дд, 1H, ²J=16.5 Гц, ³J=4.7 Гц С^βН₂ Asn), 4.91 (м, 1H, С^αН Asn), 5.90 (д, ³J=8.7 Гц, 1H, NH Asn), 5.73 и 5.91 (два уш с, 2Н, -C(О)NH₂ Asn).

в) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-2)-аспарагина), (Boc-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт в.

К раствору 3.87 г (9.73 ммоль) Boc-D-Asn-OPfp в 20 мл DMF, при перемешивании приливали раствор 0.51 г (4.40 ммоль) гексаметилендиамина в 15 мл DMF. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (40°С), к остатку приливали 200 мл дистиллированной воды (43-45°С) и оставляли при комнатной температуре до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), петролейным эфиром (2×40 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.68 г (70%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.95 (Е), R_ƒ0.75 (В); т.пл. 210-219°С (с разложением); [α]²⁷_D+0.51° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.21 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.37 (м, 22Н, 2 С²Н₂ спейсер, 2 -ОС(СН₃)₃), 2.36 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 3.02 (м, 4Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.16 (м, 2Н, С^αН Asn), 6.81 (д, ³J=8.2 Гц, 2Н, NH Asn) 6.86 и 7.24 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 7.65 (т, ³J=4.7 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-).

г) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(D-аспарагина), (CF₃COOH*H-D)-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт г.

Раствор 1.50 г (2.75 ммоль) (Boc-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали при комнатной температуре 2 ч, затем упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1,43 г (91%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.17 (В), R_ƒ0.33 (Е); т.пл. 171-180°С (с разложением); [α]_D²⁴ -3.7° (с = 1, МеОН), [α]_D²³-1.4° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.26 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.40 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 2.58 и 2.66 (два дд, 4Н ²J=17.0 Гц, ³J=5.22, ³J=7.82 Гц 2 С^βН₂ Asn), 2.99-3.19 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 3.98 (уш с, 2Н, 2 C^αH Asn), 7.24 и 7.66 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 8.09 (уш с, 6Н, 2 N⁺H₃ Asn), 8.34 (т, ³J=5.5 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-).

д) Гексаметилендиамида бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагинил-D-аспарагина), (Boc-L-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт д.

К раствору 1.45 г (2.53 ммоль) (CF₃COOH*H-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл DMF приливали 1.04 мл (6.00 ммоль) DIEA и при перемешивании присыпали 2.42 г (6.07 ммоль) Boc-L-Asn-OPfp. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 50 мл дистиллированной воды (45°С) и оставляли до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), гексаном (20 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.16 г (59%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.82 (A), R_ƒ0.58 (В); т.пл. 201-218°С (с разложением); [α]_D²³+8.1° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.23 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.38 (м, 22Н, 2 С²Н₂ спейсер, 2 -ОС(СН₃)₃ Вос), 2.42-2.50 (м, 8Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.14 и 4.42 (два м, 4Н, С^αН ¹Asn и ²Asn), 6.86 и 7.31; 6.94 и 7.34 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.04 и 8.19 (два д, 4Н, ³J=7.0, ³J=8.3 Гц, 4 NH ¹Asn и ²Asn), 7.55 (т, ³J=5.1 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-).

е) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(L-аспарагинил-D-аспарагина), (CF₃COOH*H-L-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт е.

К суспензии 1.03 г (2.62 ммоль) (Boc-L-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 15 мл DCM при комнатной температуре приливали 15 мл ТФУ, перемешивали 2.5 ч, затем реакционную массу упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.98 г (92%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.06 (A), R_ƒ0.08 (В); т.пл. 144-153°С (с разложением); [α]_D^23.5+12.9° (с,1; МеОН), [α]_D^23.5+29.2° (с = 1, H₂O), [α]_D^23.1+6.0° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.23 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, -2 С²Н₂ спейсер), 2.34-2.68 (м, 8Н, 4 С^βН₂, ¹Asn и ²Asn), 3.01 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.12 (м, 2Н, 2 С^αН ¹Asn), 4.52 (м, 2Н, 2 С^αН ²Asn), 6.87 и 7.36; 7.25 и 7.67 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.89 (т, ³J=5.4 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.11 (уш с, 6Н, 2 N⁺H₃ ²Asn), 8.62 (д, 2Н, ³J=1.9 Гц, 2 NH ²Asn).

ж) Гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина), (HOOC-(CH₂)₂-CO-L-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, ГТС-301LD

Получали аналогично примеру 1 пункт ж.

К раствору 0.98 г (1.71 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл DMF приливали 0.66 мл (3.76 ммоль) DIEA, затем при перемешивании присыпали 0.38 г (2.20 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 4 ч, далее оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 40 мл ацетона и оставляли на 2 ч при перемешивании, сформировавшийся осадок отфильтровывали, промывали горячим МеОН (3×10 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.86 г (68%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.38 (A), R_ƒ0.22 (В); т.пл. 191-213°С (из метанола, с разложением); [α]_D^25.5+1.56° (с = 1, DMSO). Найдено, m/z: 773.34 [М+Н]⁺; m/z: 771.33 [М-Н]^-. C₃₀H₄₈N₁₀O₁₄. Вычислено, m/z: 772.77. ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.20 (с, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.37 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 2.34-2.56 (м, 16Н, 4 C^βH₂ ¹Asn и ²Asn; 2 -СН₂СН₂-СООН Suc), 3.01 (м, 4 H, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.36 (м, 4Н, 4 С^αН ¹Asn и ²Asn), 6.88 и 7.31, 6.95 и 7.41 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.62 (т, ³J=5.4 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.16 (д, 2Н, ³J=8.2 Гц, 2 NH ²Asn), 8.31 (д, 2Н, ³J=7.0 Гц, 2 NH ¹Asn), 12.23 (уш с, 2 Н, 2 СООН Suc).

¹³С -ЯМР (DMSO-d₆): 174.54 (с, 2 СО, СООН Suc), 172,46 (с, 2 CONH₂ ¹Asn), 172,44 (с, 2 CONH₂ ²Asn), 172,14 (с, 2 CONH Suc), 171.29 (с, 2 CONH ¹Asn), 170.85 (с, 2 CONH ²Asn), 50.79 (c, 2C^{α 1}Asn), 50.53 (с, 2C^{α 2}Asn), 39.23 (s, 2 С¹ спейсер), 37.09 (с, 2 C^{β 1}Asn), 36.94 (с, 2 C^{β 2}Asn), 30.46 (с, 2 С² Sue), 29.66 (с, 2 С¹ Suc), 29.30 (с, 2 С² спейсер), 26.43 (с, 2 С³ спейсер).

ПРИМЕР 3. Получение гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-L-аспарагина) (TTC-301DL)

а) N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагин, Boc-L-Asn-OH

Смотрите пример 1 пункт а.

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина, Boc-L-Asn-OPfp

Смотрите пример 1 пункт б.

в) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина), (Boc-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Смотрите пример 1 пункт в.

г) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(L-аспарагина), (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)2(CH₂)₆

Смотрите пример 1 пункт г.

д) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагннил-L-аспарагина), (Boc-D-Asn-Z,-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт д.

К раствору 1.50 г (2.62 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл DMF приливали 1.0 мл (5.74 ммоль) DIEA и при перемешивании присыпали 2.50 г (6.30 ммоль) Boc-D-Asn-OPfp. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 50 мл дистиллированной воды (45°С) и оставляли до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), гексаном (20 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.60 г (79%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка с легким кремовым оттенком. R_ƒ0.71 (A), R_ƒ0.46 (В); т.пл. 196-215°С (с разложением); [α]_D²² - 4.8° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.23 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.38 (м, 22Н, 2 С²Н₂ спейсер, 2 -ОС(СН₃)₃ Boc), 2.42-2.50 (м, 8Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.11-4.18 и 4.39-4.45 (два м, 4Н, C^αH ¹Asn и ²Asn), 6.87 и 7.32, 6.94 и 7.36 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.06 (д, 2Н, ³J=7.2 Гц, 2 NH ²Asn), 7.56 (т, ³J=5.2 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.20 (д, 2Н, ⁵J=8.1 Гц, 2 NH ¹Asn).

е) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-D-аспарагинил-L-аспарагина), (CF₃COOH*H-D-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт е.

Суспензию 1.60 г (2.07 ммоль) (Boc-D-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали 2.5 ч, затем реакционную массу упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.51 г (90%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.06 (A), R_ƒ0 (В), R_ƒ 0.20 (Е); т.пл. 148-154°С (с разложением); [α]_D²²-5,4° (с = 1, DMSO), [α]_D²⁴ -10.0° (с = 1, МеОН), [α]_D²⁴ -25.8° (с=1, Н₃О). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.21 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, -2 С²Н₂ спейсер), 2.34 - 2.69 (м, 8Н, 4 С^βН₂ ²Asn), 3.01 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.11 (м, 2Н, 2 C^αH ²Asn), 4.53 (м, 2Н, 2 С^αН ¹Asn), 6.87 и 7.35, 7.25 и 7.67 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.89 (т, ³J=5.6 Гц, 2Н, - NH(CH₂)₆NH-), 8.11 (уш с, 6Н, 2 N⁺H₃ ²Asn), 8.62 (д, 2Н, ³J=7.9 Гц, 2 NH ¹Asn).

ж) Гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина), (HOOC-(CH₂)₂-CO-D-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, TTC-301DL

Получали аналогично примеру 1 пункт ж.

К раствору 0.70 г (0.87 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл DMF приливали 0.32 мл (1.83 ммоль) DIEA, затем при перемешивании присыпали 0.20 г (1.91 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 4 ч, далее оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 40 мл ацетона и оставляли на 2 ч при перемешивании, сформировавшийся осадок отфильтровывали, промывали горячим МеОН (3×10 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.57 г (85%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка с легким кремовым оттенком. R_ƒ0.39 (A), R_ƒ0.14 (В), R_ƒ0.59 (Е); т.пл. 193-222°С (из этанола, с разложением); [α]_D²³⁵ -1.68° (с = 1, DMSO). Найдено, m/z: 773.34 [М+Н]⁺; m/z: 771.33 [М-Н]^-. C₃₀H₄₈N₁₀O₁₄. Вычислено, m/z: 772.77. ¹ Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.19 (с, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 2.34-2.56 (м, 16Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn; 2 -СН₂СН₂-СООН Suc), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.38-4.47 (м, 4Н, 4 С^αН ¹Asn и ²Asn), 6.89 и 7.30; 6.96 и 7.41 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.63 (т, ³J=5.4 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.15 (д, 2Н, ³J=8.1 Гц, 2 NH ²Asn), 8.30 (д, 2Н, ³J=7.0 Гц, 2 NH ¹Asn), 12.14 (уш с, 2 Н, 2 СООН Sue). ¹³С -ЯМР (DMSO-d₆): 174.41 (с, 2 СО, СООН Suc), 172.47 (с, 2 CONH₂ ¹Asn), 172.31 (с, 2 CONH₂ ²Asn), 172.10 (с, 2 CONH Suc), 171.28 (с, 2 CONH ¹Asn), 170.82 (с, 2 CONH ²Asn), 50.75 (с, 4С^{α 1}Asn и ²Asn), 39.23 (s, 2 С¹ спейсер), 37.10 (с, 2 С^{β 1}Asn), 36.92 (с, 2 С^{β 2}Asn), 30.40 (с, 2 С² Sue), 29.50 (с, 2 С Sue), 29.31 (с, 2 С² спейсер), 26.42 (с, 2 С³ спейсер).

ПРИМЕР 4. Получение гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-D-аспарагина) (TTC-301DD)

а) N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагин, Boc-D-Asn-OH

Смотрите пример 2 пункт а.

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагина, Boc-D-Asn-OPfp

Смотрите пример 2 пункт б.

в) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагина), (Boc-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Смотрите пример 2 пункт в.

г) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(D-аспарагина), (CF₃COOH*H-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Смотрите пример 2 пункт г.

д) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-D-аспарагинил-D-аспарагина), (Boc-D-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт д.

К раствору 1.24 г (2.17 ммоль) (CF₃COOH*H-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл DMF приливали 0.84 мл (4.80 ммоль) DIEA и при перемешивании присыпали 1.90 г (4.77 моль) Boc-D-Asn-OPfp.Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 50 мл дистиллированной воды (45°С) и оставляли до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), гексаном (20 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.54 г (92%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.75 (A), R_ƒ0.47 (В), R_ƒ0.87 (Е); т.пл. 224-227°С (с разложением); [α]_D¹⁹+13.2° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.19 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.38 (м, 22Н, 2 С²Н₂ спейсер, 2 -ОС(СН₃)₃ Boc), 2.34-2.54 (м, 8Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.14-4.20 и 4.38-4.44 (два м, 4Н, 2 C^αH ¹Asn и ²Asn), 6.89 и 7.34, 6.97 и 7.40 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.62 (т, ³J=5.5 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 7.02 и 8.13 (два д, 4Н, ⁵J=7.3 и ³J=1.9 Гц, 4 NH ¹Asn и ²Asn).

е) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(N-аспарагинил-D-аспарагина), (CF₃COOH*H-D-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт е.

Суспензию 1.12 г (14.49 ммоль) (Boc-D-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали 2.5 ч, затем реакционную массу упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.70 г (90%) продукта, который затем растворяли в 25 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. R_ƒ 0.25 (A), R_ƒ0.03 (В), R_ƒ0.28 (Е); т.пл. не измеряли (лиофилизат); [α]_D²⁰+13.3° (с = 0.92, H₂O). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.20 (м, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, -2 С²Н₂ спейсер), 2.41 и 2.52 (два дд, ²J=16.0 Гц, ³J=8.0 Гц, ³J=5.5 Гц, 4Н, 2 C^βH₂ ²Asn), 2.61 и 2.74 (два дд, ²J=17 Гц, ³J=7.8 Гц, ³J=5.2 Гц, 4Н, 2 C^βH₂ ¹Asn), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.05 (м, 2Н, 2 С^αН ²Asn), 4.50-4.57 (м, 2Н, 2 С^αН ¹Asn), 6.93 и 7.37; 7.31 и 7.75 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.86 (т, ³J=5.4 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.12 (уш с, 6Н, 2 N⁺H₃ ²Asn), 8.61 (д, 2Н, ³J=1.5 Гц, 2 NH ¹Asn).

ж) Гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-D-аспарагинил-D-аспарагина), (HOOC-(CH₂)₂-CO-D-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, TTC-301DD

Получали аналогично примеру 1 пункт ж.

К раствору 0.50 г (0.62 ммоль) (CF₃COOH*H-D-Asn-D-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл DMF приливали 0.23 мл (1.30 ммоль) DIEA, затем при перемешивании присыпали 0.20 г (1.99 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 4 ч, далее оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 40 мл ацетона и оставляли на 2 ч при перемешивании, сформировавшийся осадок отфильтровывали, промывали горячим МеОН (3×10 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0,30 г (63%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.24 (A), R_ƒ0.08 (В), R_ƒ0.42 (Е); т.пл. 207-218°С (из метанола, с разложением); [α]_D²⁰+23.5° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.19 (с, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 2.37-2.60 (м, 16Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn; 2 -СН₂СН₂СООН Suc), 3.00 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.38-4.47 (м, 4Н, 4 C^αH ¹Asn и ²Asn), 6.89 и 7.30, 7.00 и 7.46 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.66 (т, ³J=5A Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.15 (д, 2Н, ³J=8.0 Гц, 2 NH ²Asn), 8.25 (д, 2Н, ³J=13 Гц, 2 NH ¹Asn), 12.12 (уш с, 2 Н, 2 СООН Suc).

¹³С -ЯМР (DMSO-d₆): 174.43 (с, 2 СО, СООН Suc), 172.31 (с, 4 CONH₂ ¹Asn и ²Asn), 172.01 (с, 2 CONH Suc), 171.13 (с, 2 CONH ¹Asn), 170.91 (с, 2 CONH ²Asn), 50.51 (с, 4C^{α 1}Asn и ²Asn), 39.18 (s, 2 С спейсер), 37.48 (с, 2 C^{β 2}Asn), 37.09 (с, 2 C^{β 1}Asn), 30.31 (c, 2 C² Sue), 29.52 (c, 2 С Suc), 29.32 (c, 2 С² спейсер), 26.40 (с, 2 С³ спейсер).

ПРИМЕР 5. Получение гексаметилендиамида бис-(N-γ-оксибутирил-L-глутамил-L-аспарагина), (GHB-L-Glu-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, ГТС-302

а) N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагин, Boc-L-Asn-OH

Смотрите пример 1 пункт а.

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина, Boc-L-Asn-OPfp

Смотрите пример 1 пункт б.

в) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина), (Boc-L-Asn-NH-)₂(СН₂)₆

Смотрите пример 1 пункт в.

г) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бис-(L-аспарагина), (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Смотрите пример 1 пункт г.

д) Гексаметилендиамид бис-(N^α-бензилоксикарбонил-γ-трет-бутил-глутамил-аспарагина), (Z-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

К раствору 1.16 г (2.03 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл DMF приливали 0.74 мл (4.26 ммоль) DIEA и при перемешивании прибавляли 1.94 г (4.46 ммоль) Z-L-Glu(tBu)-OSu. Реакционную смесь перемешивали 4 ч при комнатной температуре, далее оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали в вакууме роторного испарителя при температуре 53°С, далее переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 50 мл дистиллированной воды, предварительно нагретой до 45°С и оставляли до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой до нейтральной рН, далее ацетоном (20 мл), петролейным эфиром (20 мл), диэтиловым эфиром (2×20 мл) и высушивали на воздухе, получали 1.10 г (55%) хроматографически гомогенного (Z-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, в виде белого с легким кремовым оттенком кристаллического вещества. R_ƒ0.94 (А), R_ƒ0.83 (В); т.пл. 211-218°С с разлож; [α]²⁵_D -5.2° (с = 1, DMSO).

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.19 (м, 4Н, -NH-(CH₂)₂(CH₂)₂(CH₂)₂NH-), 1.38 (уш.с, 22Н, -NHCH₂-CH₂-(CH₂)₂CH₂CH₂NH-, 2 -ОС(СН₃)₃ tBu), 1.72 и 1.85 (два м, 4Н, 2 С^βН₂ Glu), 2.24 (т, ³J=7.6 Гц, 4Н, 2 C^γH₂ Glu), 2.46-2.50 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 2.99 (м, 4Н, -NHCH₂(CH₂)₄CH₂NH), 3.95-4.01 (м, 2Н, 2 С^αН Clu), 4.41-4.48 (м, 2Н, 2 С^αН Asn), 5.00 и 5.06 (два д, ²J=12.7 Гц, 4Н, 2 -ОСН₂- Z), 6.90 и 7.34 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 7.36 (м, 10Н, 2 -С₆Н₅ Z), 7.56 (д, ³J 7.36 Гц, 2 Н, -NH- Glu), 7.57 (уш.т, 2 Н, -NH-(CH₂)₆-NH-), 8.13 (д, ³J 7.9 Гц, 2Н, NH Asn).

е) Гексаметилендиамид бис-(γ-трет-бутил-глутамил-аспарагина), (H-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)2(CH₂)₆

Суспензию 5.0 г (5.08 ммоль) (Z-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 180 мл метанола подвергали гидрогенолизу в присутствии 1 г 10% Pd/C 50%-ной влажности при комнатной температуре в течение 7 ч, при этом каждые 2 ч откачивали CO₂. Катализатор отфильтровывали, промывали 100 мл метанола. Растворитель удаляли в вакууме, к остатку приливали 30 мл бензола и снова отгоняли в вакууме, остаток в виде масла кристаллизовали в петролейном эфире. Осадок в виде белого порошка досушивали под вакуумом в эксикаторе над CaCl₂, получали 3.06 г (84,5%) хроматографически гомогенного (H-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂-(CH₂)₆, в виде аморфного белого порошка. R_ƒ0.81 (А), R_ƒ0.48 (В); т.пл.174-187°С с разлож.; [α]_D²⁵ -5.7° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.20 (м, 4Н, -NH(CH₂)₂(CH₂)2(CH₂)₂-NH-), 1.38 (уш.с, 22Н, -NHCH₂CH₂(CH₂)₂CH₂CH₂NH-, 2 -ОС(СН₃)₃ tBu), 1.56 и 1.79 (два м, 4Н, 2 С^βН₂ Glu), 1.91 (ш.с, 4Н, 2 NH₂ Glu), 2.24 (т, ³J=7.6 Гц, 4Н, 2 С^γH₂ Glu), 2.37-2.50 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 3.00 (м, 4 Н, -NHCH₂(CH₂)₄CH₂NH), 3.16 (м, 2Н, 2 С^αН Clu), 4.45 (уш.с, 2Н, 2 С^αН Asn), 6.86 и 7.38 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 7.74 (уш.с, 2 Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.21 (уш. с, 2 Н, NH Asn).

ж) Гексаметилендиамид бис-(N-γ-оксибутирил-γ-трет-бутил-глутамил-аспарагина), (GHB-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Суспензию 2.5 г (3.49 ммоль) (H-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 20 мл γ-бутиролактона выдерживали при температуре 60-70°С в течение 4 ч. Далее перемешивали при комнатной температуре 12 ч, выпавший осадок тщательно растирали под диэтиловым эфиром (4×15 мл), декантируя растворитель. Остаток высушивали в вакууме (15 мм рт.ст.) над CaCl₂, кристаллизовали из горячего ацетона. Получали 2.07 г (67%) хроматографически гомогенного (GHB-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, в виде белого кристаллического порошка, R_ƒ0.79 (А), R_ƒ0.64 (В); т.пл. 162-173°С; [α]_D²⁵ -4.8° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.21 (м, 4Н, -NH-(CH₂)₂(CH₂)₂(CH₂)₂NH-), 1.39 (уш.с, 22Н, -NHCH₂CH₂(CH₂)₂CH₂CH₂-NH-, 2 -ОС(СН₃)₃ But), 1.65 (м, 4Н, 2 С²Н₂ GHB), 1.72 и 1.85 (два м, 4Н, 2 -С^βН₂ Glu), 2.19 (т, 4Н, ³J=7.8 Гц -С³Н₂ GHB), 2,24 (т, 4Н, ³J=7.8 Гц, 2СН₂ Glu), 2.40-2.50 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 3.00 (м, 4 Н, -NHCH₂(CH₂)₄CH₂NH), 3.38 (т, ³J=6.4 Гц, 2 С¹Н₂ GHB), 4.08-4.15 (м, 2Н, 2 С^αН Clu), 4.38-4.41 (м, 2Н, 2 С^αН Asn), 6.90 и 7.39 (два с, 4Н, 2 -C(О)-NH₂ Asn), 7.53 (уш. с, 2 Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.16-8.18 (м, 4 Н, 2 NH Asn и 2 NH Glu).

з) Гексаметилендиамид бис-(N-γ-оксибутирил-глутамил-аспарагина), (GHB-L-Glu-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, ГТС-302

К суспензии 1.50 г (1.69 ммоль) (GHB-L-Glu(tBu)-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 45 мл CH₂Cl₂ при комнатной температуре приливали 15 мл ТФУ, перемешивали 2 ч, затем реакционную массу упаривали, переупаривали с хлористым метиленом (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме над CaCl₂ (15 мм.рт.ст.). ГТС-302 очищали препаративной ОФ ВЭЖХ (τ=10.99 мин), затем лиофилизовывали. Получали 1.0 г (76%) целевого пептида ГТС-302, в виде твердого гигроскопичного вещества белого цвета. R_ƒ0.75 (A), R_ƒ0.25 (В); [α]_D²⁵-4.3°(c = 1, DMSO).

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.20 (м, 4Н, -NH(CH₂)₂(CH₂)₂(CH₂)₂NH-), 1.35 (м, 4Н, -NHCH₂CH₂(CH₂)₂CH₂CH₂-NH-), 1.64 (м, 4Н, 2 С²Н₂ GHB), 1.73 и 1.88 (два м, 4Н, 2 С^βН₂ Glu), 2.19 (т, ³J=7.7 Гц, 2 С³Н₂ GHB), 2.26 (т, ³J=7.7 Гц, 4Н, 2 С^γH₂ Glu), 2.42-2.50 (м, 4Н, 2 C^βН₂ Asn), 3.00 (м, 4 Н, -NHCH₂(CH₂)₄CH₂NH), 3.38 (т, ³J=6.3 Гц, 4Н, 2 С¹Н₂ GHB), 4.08-4.15 (м, 2Н, 2 С^αН Clu), 4.38-4.44 (м, 2Н, 2 С^αН Asn), 6.90 и 7.34 (два с, 4Н, 2 -C(О)-NH₂ Asn), 7.51 (т, ³J=5.5 Гц, 2 Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.08 (д, ³J=8.0 Гц, 2Н, 2 NH Asn), 8.12 (д, ³J=7,0 Гц, 2 Н, 2-NH Glu), 12.07 (ш.с 2Н, 2 СООН Glu).

¹³С-ЯМР (DMSO-d₆): 174.44 (с, 2С, 2 СО 2СООН), 173.71 (с, 2С, 2 СО GHB), 172.31 (с, 2С, 2СО Asn бок), 171.51 (с, 2С, 2СО, Glu), 170.81 (с, 2С, 2СО (Asn)спейсер), 60.80 (с, 2С, 2 С³ GHB), 53.04 (с, 2С, 2 С^α Glu), 50.26 (с, 2С, 2 С^α Asn), 39.11 (с, 2С, 2 С¹ спейсера), 37.07 (с, 2С, 2 C^βAsn), 32.39 (с, 2С, 2 С¹ GHB), 30.57 (с, 2С, 2С^γGlu), 29.30 (с, 2С, 2 С² спейсер), 28.87 (с, 2С, 2 С² GHB), 27.25 (с, 2С, 2 C^βGlu), 26.38 (с, 2С, 2 С³ спейсер).

ПРИМЕР 6. Получение гексаметилендиамида бис-(N-моноглутарил-L-аспарагинил-L-аспарагнна) (ГТС-304)

а) N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагин, Boc-L-Asn-OH

Смотрите пример 1 пункт а.

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина, Boc-L-Asn-OPfp

Смотрите пример 1 пункт б.

в) Гексаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина), (Boc-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Смотрите пример 1 пункт в.

г) Дитрифторацетат гексаметилендиамида бме-(L-аспарагина), (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Смотрите пример 1 пункт г.

д) Гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина), (Glt-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, ГТС-304

К раствору 0.90 г (1.12 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆ в 30 мл DMF при комнатной температуре приливали 0.43 мл (2.46 ммоль) DIEA, затем при перемешивании прибавляли 0.34 г (2.46 ммоль) глутарового ангидрида. Реакционную смесь перемешивали в течение 7 ч при комнатной температуре. DMF упаривали с прибавлением воды (3×20 мл), затем ацетона (20 мл). Парафинообразный остаток промывали горячим ацетонитрилом с фильтрованием на насадке для гигроскопичных веществ (3×10 мл), приливали 15 мл диэтилового эфира и оставляли на 30 мин с перемешиванием на магнитной мешалке, эфир отфильтровывали на насадке, осадок сушили в вакууме водоструйного насоса, досушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.74 г (83%) хроматографически гомогенного продукта в виде кристаллического порошка белого цвета с легким кремовым оттенком. R_ƒ0.3S (A), R_ƒ 0.22 (В); т.пл. 198-224°С (с разлож.); [α]_D²³ -17.9° (с=1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.19 (с, 4Н, 2 С³Н₂ спейсер), 1.36 (м, 4Н, 2 С²Н₂ спейсер), 1,70 (м, 4Н, 2 C^pH₂Glt), 2,15-2,20 (м, 8Н, 2 С^αН₂ и 2 C^YH₂ Git), 2.37-2.59 (м, 16Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn), 3.01 (м, 4 Н, 2 С¹Н₂ спейсер), 4.42 (м, 4Н, 4 С^αН ¹Asn и ²Asn), 6.88 и 7.32 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ ¹Asn), 6.99 и 7.45, 6.95 и 7.40 (четыре с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ ²Asn), 7.70 (т, ³J=5.5 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₆NH-), 8.13 и 8.23 (два м, 4Н, 2 NH ²Asn, 2 NH ¹Asn).

ПРИМЕР 7. Получение гептаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-306)

а) N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагин, Boc-L-Asn-OH

Смотрите пример 1 пункт а.

б) Пентафторфениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина, Boc-L-Asn-OPfp

Смотрите пример 1 пункт б.

в) Гептаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил-L-аспарагина), (Boc-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₇

Получали аналогично примеру 1 пункт в.

К раствору 2.67 г (6.7 ммоль) Boc-L-Asn-OPfp в 20 мл DMF, при перемешивании приливали раствор 0.48 мл 95%-ного гептаметилендиамина в 15 мл DMF. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (40°С), к остатку приливали 200 мл дистиллированной воды (43-45°С) и оставляли при комнатной температуре до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), петролейным эфиром (2×40 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.56 г (92%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого кристаллического порошка. R_ƒ 0.87 (A), R_ƒ0.76 (В), R_ƒ0.9 (Е); т.пл. 196-207°С (с разложением); [α]_D²⁷ -1.0° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.22 и 1.37 (два уш.с, 28Н, -NHCH₂(CH₂)sCH₂NH-, 2 -ОС(СН₃)₃), 2.29-2.43 (м, 4Н, 2 С^βН₂ Asn), 3.02 (м, 4Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-), 4.13-4.20 (м, 2Н, С^αН Asn), 6.80 (д, 2H, ³J=7.92 Гц, NH Asn) 6.85 и 7.25 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 7.64 (уш.с, 2Н, -NH(CH₂)₇NH-).

г) Дитрифторацетат гептаметилендиамида бис(Н-L-аспарагина), 2CF₃COOH х (H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₇

Получали аналогично примеру 1 пункт г.

Раствор 1.40 г (2,5 ммоль) (Boc-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₇ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали при комнатной температуре 2 ч, затем упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.32 г (90%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого кристаллического вещества. R_ƒ 0.18 (A), R_ƒ 0.0 (В), R_ƒ 0.35 (Е). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.25 и 1.40 (два уш.с, 10Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-), 2.58 и 2.66 (два дд, 4Н, ²J=17.0 Гц, ³J=5.12 и ³J=7.92 Гц, 2 С^βН₂ Asn), 2.99-3.16 (м, 4 Н, -NHCH₂(CH₂)₄CH₂NH-), 3.99 (уш.с, 2Н, 2 С^αН Asn), 7.22 и 7.67 (два с, 4Н, 2 -C(О)NH₂ Asn), 8.10 (уш.с, 6Н, N⁺H₃ Asn), 8.33 (т, 2Н, ^JJ=5.5 Гц, NH(CH₂)₇NH-).

д) Гептаметилендиамид бис-(N-трет-бутилоксикарбонил L-аспарагинил-L-аспарагина), (Boc-Z,-Asn-i-Asn-NH-)₂(CH₂)₇

Получали аналогично примеру 1 пункт д.

К раствору 1.32 г (2.17 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₇ в 20 мл DMF приливали 1.12 мл (6.45 ммоль) DIEA и при перемешивании присыпали 2.20 г (4.77 ммоль) Boc-L-Asn-OPfp. Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 50 мл дистиллированной воды (45°С) и оставляли до формирования осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой, ацетоном (20 мл), гексаном (20 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 1.51 г (85%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого кристаллического вещества. R_ƒ 0.73 (A), R_ƒ 0.42 (В), R_ƒ 0.88 (Е); т.пл. 195-200°С (с разложением). [α]_D²⁴-10.2° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.21 и 1.38 (два уш. с.м, 28Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-, 2 -ОС(СН₃)₃ Boc), 2.34-2.54 (м, 8Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn), 3.00 (м, 4Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-), 4.13-4.20 и 4.38-4.44 (два м, 4Н, С^αН ¹Asn и ²Asn), 6.87 и 7.32, 6.95 и 7.37 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.60 (уш.с, 2Н, -NH(CH₂)₇NH-), 7.00 и 8.11 (два д, 4Н, ^JJ=7.0 и ³J=7.82 Гц, 4 NH ¹Asn и ²Asn).

е) Дитрифторацетат гептаметилендиамида бис-(L-аспарагинил-L-аспарагина), 2CF₃COOH х (H-D)-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₇

Получали аналогично примеру 1 пункт е.

Суспензию 0.504 г (0.64 ммоль) (Boc-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₇ в 30 мл смеси DCM и TFA (1:1) перемешивали 2.5 ч, затем реакционную массу упаривали, переупаривали с DCM (2×15 мл), остаток затирали под сухим диэтиловым эфиром с декантацией (2×20 мл) и оставляли под диэтиловым эфиром (20 мл) на 2 ч для формирования осадка. Осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0.46 г (88%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒOAO (A), R_ƒ0.23 (Е); т.пл. 165-172°С с разл.; [α]_D^{24 5}-5.3° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.22 и 1.37 (два уш.с, 4Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-), 2.42 и 2.52 (два дд, 4Н, ²J=16.0 Гц, ³J=5.0 и ³J=7.9 Гц, 4 C^βH₂²Asn), 2.62 и 2.74 (два дд, ²J=17.0 Гц, ³J=5.0 и ⁵J=7.6 Гц, 4 С^βН₂ ¹Asn), 2.93-3.12 (м, 4 Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-), 4.05-4.07 (уш. с, 2Н, 2 -C^aH ¹Asn), 4.50-4.57 (м, 2Н, 2 С^αН ²Asn), 6.90 и 7.36, 7.28 и 7.74 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.83 (т, ³J=5.6 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₇NH-), 8.14 (уш.с, 6Н, 2N⁺H₃, ¹Asn), 8.60 (д, 2Н, ³J=7.7 Гц, 2 NH ²Asn).

ж) Гексаметилендиамид бис-(N-нионосукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина), (Suc-L-Asn-L-Asn-NH-)₂(CH₂)₆

Получали аналогично примеру 1 пункт ж.

К раствору 0.46 г (0.56 ммоль) (CF₃COOH*H-L-Asn-L-Asn-NH-)2(CH₂)₇ в 20 мл DMF приливали 0.23 мл (1.30 ммоль) DIEA, затем при перемешивании присыпали 0.15 г (1.30 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 4 ч, далее оставляли на ночь без перемешивания. DMF упаривали (53°С), переупаривали с водой (3×20 мл), к остатку приливали 40 мл ацетона и оставляли на 2 ч при перемешивании, сформировавшийся осадок отфильтровывали, промывали горячим МеОН (3×10 мл), высушивали в вакууме (15 мм.рт.ст.) над CaCl₂. Получали 0,345 г (78%) хроматографически гомогенного продукта в виде белого порошка. R_ƒ0.37 (A), R_ƒ 0.62 (Е), R_ƒ0.07 (В); т.пл. 186-194°С (из метанола, с разложением); [α]_D²²+3.4° (с = 1, DMSO). ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆): 1.21 и 1.37 (два уш.с, 10Н, -NHCH(CH₂)₅CH₂NH-), 2.32-2.59 (м, 16Н, 4 С^βН₂ ¹Asn и ²Asn; 2 -СН₂-СН₂-СООН Sue), 2.93-3.07 (м, 4 Н, -NHCH₂(CH₂)₅CH₂NH-), 4.36-4.45 (м, 4Н, 4C^αH ¹Asn и ²Asn), 6.85 и 7.34, 6.96 и 7.41 (четыре с, 8Н, 4 -C(О)NH₂ ¹Asn и ²Asn), 7.57 (т, ³J=5.5 Гц, 2Н, -NH(CH₂)₇NH-), 8.17 и 8.27 (два д, 4Н, ³J=8.0, ³J=7.0 Гц, 4 NH ¹Asn и ²Asn), 12.20 (уш.с, 2 Н, 2 СООН Suc).

Фармакологическая активность димерных дипептидных миметиков 4-й петли нейротрофина-3 (NT3) в экспериментах in vitro

ПРИМЕР 8. Нейропротекторная активность миметиков 4-й петли NT3

Нейропротекторная активность миметиков изучалась на трех моделях:

1. Модель окислительного стресса на культуре иммортализованных нейронов гиппокампа мыши линии НТ-22 в присутствии перекиси водорода.

2. Модель глатаматной токсичности на клетках НТ-22.

3. Клеточная модель болезни Паркинсона на культуре клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y с использованием нейротоксина 6-гидроксидофамина (6-OHDA)

Модель окислительного стресса в культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22 осуществляли в соответствии с описанием Jackson G.R. et al. [Jackson G.R, Werrbach-Perer K, Ezell E.L, Post J.F., Perez-Polo J.R. Brain Res. 1992; V. 592 (1): 239-248]. Клетки инкубировали в присутствии Н₂О₂ в конечной концентрации 1,5 мМ в атмосфере 5% CO₂ 30 мин при 37°С в среде DMEM, содержащей 5% FBS и 2 мМ L-глутамина. Далее культуральную среду, содержащую Н2О2, заменяли на нормальную и через 4 ч определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста.

Модель глутаматной токсичности в культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22 проводили согласно Tan S. et al [Tan S, Wood M, Maher P. Oxidative stress induces a form of programmed cell death with characteristics of both apoptosis and necrosis in neuronal cells // Neurochem. 1998; V.71: 95-105]. Глутаматную токсичность моделировали путем внесения в культуральную среду глутаминовой кислоты в конечной концентрации 5 мМ в атмосфере 5% СО₂ 30 мин при 37°С в среде DMEM, содержащей 5% FBS и 2 мМ L-глутамина. Время инкубации с глутаминовой кислотой составляло 24 ч, после чего меняли среду на нормальную и определяли жизнеспособность клеток через 24 ч с использованием МТТ-теста.

Клеточную модель болезни Паркинсона с использованием нейротоксина 6-гидроксидофамина (6-ОНДА) осуществляли согласно Riveles К. et al. [Riveles K., Huang L.Z, Quik M. Cigarette smoke, nicotine and cotinine protect against 6-hydroxydopamine-induced toxicity in SH-SY5Y cells // Neurotoxicology. 2008. V.29(3): 421-427]. Для индукции 6-гидроксидофаминовой токсичности в культуру клеток линии SH-SY5Y вносили 6-OHDA в конечной концентрации 100 мкМ и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в 5% СО₂. после чего меняли среду на нормальную и определяли жизнеспособность клеток через 24 ч с использованием МТТ-теста.

Пептиды растворяли в дистиллированной воде при нагревании до 70°С в течение 1-3 ч и вносили за 24 ч и сразу после повреждения клеток в конечных концентрациях от 10^-5 до 10^-13 М. В качестве положительного контроля использовали NT3 (100 нг/мл) [Huang E.J, Wilkinson G. A, Farinas I, Backus C, Zang K, Wong S. L, Reichardt L F. Expression of Trk receptors in the developing mouse trigeminal ganglion: in vivo evidence for NT3 activation of TrkA and TrkB in addition to TrkC // Development. 1999; V. 126(10): 2191-2203].

Статистическую обработку данных производили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну. Активность рассчитывалась по формуле А(%) = (D_эксп - D_н2о2) / (D_контр - D_н2о2) × 100%, где D_эксп - оптическое поглощение раствора в опыте, D_н2о2 - оптическое поглощение раствора активного контроля (с повреждением), D_контр - оптическое поглощение; пассивного контроля (без повреждения).

Дипептид ГТС-301 на модели окислительного стресса статистически значимо увеличивал жизнеспособность клеток в интервале концентраций 10^-5-10^-12М при внесении за 24 ч до перекиси и в концентрациях 10^-5-10^-9 М при внесении после перекиси (табл.2). Активность ГТС-301 составляла 20-30%, активность NT3 - 40-50%. На модели глутаматной токсичности ГТС-301 защищал клетки от гибели при внесении за 24 до глутаминовой кислоты в диапазоне концентраций 10^-5-10^-8 М и при внесении после глутаминовой кислоты в дипазоне концентраций 10^-5-10^-9М (табл.2).

При этом активность дипептида при внесении после глутаминовой кислоты в концентрации 10^-6М (74%) не отличалась от активности NT3. На модели клеточной болезни Паркинсона (6-OHDA-индуцированная токсичность) ГТС-301 также был активен при введении как за 24 ч до токсина (в концентрациях 10^-5-10^-6 М), так и при введении после токсина (в концентрациях 10^-5-10^-8М) (табл.2). Активность дипептида на этой модели была сопоставима с активностью NT3, а в концентрациях 10^-5 и 10^-6 М ее превышала.

Изучение нейропротекторной активности LD, DL и DD - диастереомеров соединения ГТС-301 (табл.3) показало, что только ГТС-301 (LD) защищает клетки от гибели. Дипептид был активен в диапазоне концентраций 10^-5-10^-7 М при его внесении за 24 ч до перекиси и в концентрациях 10^-6-10^-7 М при его внесении после перекиси. Таким образом, в экспериментах in vitro была выявлена стереоспецифичность нейропротекторного эффекта ГТС-301: при замене N-концевого L-Asn на D-Asn активность исчезала.

Соединение ГТС-302 проявляло нейропротекторную активность на моделях окислительного стресса и глутаматной токсичности только при внесении после токсина, в концентрациях соответственно 10^-6-10^-10 М и 10^-6-10^-7 М (табл.4). На модели окислительного стресса ГТС-302 проявлял относительно слабую активность (8-14%), а на модели глутаматной токсичности его активность (81%) не отличалась от активности NT3.

На модели 6-OHDA-индуцированной токсичности ГТС-302 был активен как при внесении за 24 ч до токсина (в концентрациях 10^-6-10^-7 М), так и при внесении после токсина (в концентрациях 10^-5-10^-7 М). Активность дипептида в концентрации 10^-6 не отличалась от активности NT3 в обеих схемах эксперимента (табл.4).

Нейропротекторная активность дипептида ГТС-304 была выявлена на модели окислительного стресса (табл.5). Соединение защищало клетки от гибели в концентрациях 10^-6-10^-8М при внесении за 24 ч до перекиси и в концентрациях 10^-5-10^-8М при внесении после перекиси.

Соединение ГТС-306 проявляло нейропротекторную активность на модели окислительного стресса при внесении только за 24 ч до перекиси в диапазоне концентрация 10^-6-10^-9М (табл.6).

Таким образом, у дипептидных миметиков 4-й петли нейротрофина NT3 в экспериментах in vitro была выявлена нейропротекторная активность в диапазоне концентраций 10^-5-10^-10 М.

У соединения ГТС-301 была выявлена стереоспецифичность нейропротекторного эффекта.

Фармакологическая активность димерных дипептидных миметиков 4-й петли нейротрофина-3 (NT3) в экспериментах in vivo

ПРИМЕР 9. Антидепрессантоподобная активность

Исследование проведено на мышах-самцах линии BALB/c массой 20-22 г, полученных в Филиале "Столбовая" Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства". Животных содержали при естественной смене светового режима со свободным доступом к стандартному корму и воде. Эксперименты с животными проводили в соответствии с Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. №81 "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств". Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова».

Миметики NT3 вводили внутрибрюшинно (в/б) в виде суспензии в 1% водном растворе Tween 80. Контрольные животные получали 1% водный раствор Tween 80. В качестве препарата сравнения использовали классический трициклический антидепрессант амитриптилин. Амитриптилин вводили в/б в физиологическом растворе в дозе 10 мг/кг. Доза амитриптилина была выбрана в соответствии с литературными данными [Abdelhamid, R.E, Kovacs, K.J, Nunez, M.G. & Larson, A.A. Depressive behavior in the forced swim test can be induced by TRPV1 receptor activity and is dependent on NMDA receptors. Pharmacol. Res. 2014; V79: 21-27]. Объем введения составлял 10 мл на 1 кг массы тела мышей.

Антидепрессантоподобная активность изучалась в тесте вынужденного плавания. Установка для проведения теста представляла собой 5 цилиндров из прозрачного пластика диаметром 10 см и высотой 30 см, между которыми установлены черные пластиковые непрозрачные перегородки, предотвращающие визуальный контакт животных в процессе проведения исследования. Позади цилиндров в качестве фона установлена черная пластиковая панель. Цилиндры заполняли водой температурой 22-23°С на 2/3 высоты - уровень, при котором животные не имеют возможности опираться на дно цилиндра лапами или хвостом. Животных помещали в цилиндры с водой на 10 мин. Через 24 ч проводили тестовую посадку - животных повторно помещали в те же условия на 5 мин. Эксперимент записывали на видеокамеру, полученные видеоматериалы обрабатывали в программе ООО "НПК Открытая Наука" (Москва, Россия) с подсчетом общего времени иммобильности (отказ от активно-оборонительного и исследовательского поведения).

Дизайн эксперимента. Животных случайным образом разделяли на группы по 8-10 мышей. Миметики NT3 вводили по двум схемам - остро или субхронически (7 дней). В первом случае миметики вводили через 1 ч после первой посадки в цилиндры с водой и за 24 ч до второй посадки (амитриптилин вводили за 1 ч до второй посадки). В случае субхронического введения первую посадку в цилиндры проводили через 24 ч после последнего введения миметиков или амитриптилина.

Статистический анализ данных проводили с помощью программы GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, СА). Данные проверяли на нормальность распределения с использованием теста Шапиро-Уилка. Для выявления межгрупповых различий применяли однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) с последующими попарными межгрупповыми сравнениями с помощью критерия Данна. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде средних и стандартных ошибок среднего.

9.1. Антидепрессантоподобная активность ГТС-301 и его LD, DL, DD диастереомеров

Миметик NT3 ГТС-301 не проявлял активности в тесте вынужденного плавания при остром введении в диапазоне доз 1-20 мг/кг (табл.7).

При субхроническом введении ГТС-301 (табл.7) статистически значимо снижал время иммобильности мышей в дозах 10, 20 и 40 мг/кг на 22, 26 и 26% соответственно, что свидетельствует о его антидепрессантоподобной активности. Активность ГТС-301 сравнима с активностью амитриптилина (10 мг/кг), который снижал время иммобильности на 27%.

ГТС-301 (LD) проявлял антидепрессантоподобную активность как при остром введении в дозах 10 и 20 мг/кг, так и при субхроническом введении в дозе 20 мг/кг, статистически значимо снижая время иммобильности мышей с эффектами (24% в обоих случаях), сравнимыми с эффектами амитриптилина (22%) (табл.7).

ГТС-301 (DL) и ГТС-301 (DD) не проявляли антидепрессантоподобных эффектов в тесте вынужденного плавания при остром введении в диапазоне доз 1-20 мг/кг (табл.7). ГТС-301 (DL) не проявлял активности и при субхроническом введении в дозе 20 мг/кг.

Таким образом, у соединения ГТС-301 была выявлена антидепрессантоподобная активность в тесте вынужденного плавания у мышей линии BALB/c.

Как и в случае нейропротекторной активности in vitro, была показана стереоспецифичность антидепрессантоподобной активности ГТС-301: при переходе от LL изомера (ГТС-301) к DL или DD изомерам активность исчезала.

9.2. Антидепрессантоподобная активность соединения ГТС-302

Дипептид ГТС-302 проявлял антидепрессантоподобные эффекты при остром введении в дозах 1, 5 и 10 мг/кг (в/б), статистически значимо снижая время иммобильности у мышей BALB/c в тесте вынужденного плавания соответственно на 19, 17 и 22% (табл.8).

9.3. Антидепрессантоподобная активность соединения ГТС-304

Дипептид ГТС-304 проявлял антидепрессантоподобные эффекты при остром введении в дозах 5 и 10 мг/кг, снижая время иммобильности у мышей BALB/c в тесте вынужденного плавания на 27 и 39% соответственно (табл.9).

Таким образом, у дипептидных миметиков 4-й петли NT3, соединений ГТС-301, ГТС-302 и ГТС-304, была выявлена антидепрессантоподобная активность при их внутрибрюшинном введении в тесте вынужденного плавания у мышей. Дипептид ГТС-301 при субхроническом введении в дозах 10-40 мг/кг оказывал эффекты, сравнимые с эффектами классического антидепрессанта Амитриптилина.

ПРИМЕР 10. Антидиабетическая активность соединения ГТС-301

Исследования выполнены на самцах мышей линии С57 В1/6 (n=60) с исходной массой тела 16-20 г. полученных из ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (филиал «Столбовая»). Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище (за исключением 16 часов, предшествующих введению стрептозотоцина) и воде. Эксперименты с животными проводили в соответствии с Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. №81 "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств". Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Дизайн эксперимента. Стрептозотоциновый диабет является общепринятой экспериментальной моделью сахарного диабета. Экспериментальный диабет у мышей индуцировали однократным внутрибрюшинным (в/б) введением стрептозотоцина (СТЗ) в дозе 110 мг/кг после 16 ч голодания. Раствор СТЗ готовили на цитратном буфере (рН 4,5).

ГТС-301 в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг вводили в/б в виде суспензии в 1% водном растворе Tween 80 в течение 14 дней до и 17 дней после индуцирования диабета. Контрольные животные получали 1% водный раствор Tween 80.

Мышей случайным образом делили на следующие группы:

(1) «Контроль» (мышам вводили 1% раствор Tween 80 в течение 31 дня);

(2) «Диабет» (мышам в течение 14 дней вводили 1% раствор Tween 80, на 15-й день вводили СТЗ, а затем продолжали введение 1%-го раствора Tween 80 в течение 17 дней);

(3) «Диабет + ГТС-301 (0,5 мг/кг)» (мышам вводили ГТС-301 в дозе 0,5 мг/кг на протяжении 14 дней, на 15-й день вводили СТЗ, а затем ГТС-301 в течение 17 дней);

(4) «Диабет + ГТС-301 (5 мг/кг)» (мышам вводили ГТС-301 в дозе 5 мг/кг 14 дней, на 15-й день вводили СТЗ, а затем ГТС-301 в течение 17 дней);

(5) и (6) - группы «ГТС-301, 0,5» и «ГТС-301, 5 мг/кг» мг/кг, соответственно. Мышам вводили в/б ГТС-301 в дозе 0,5 или 5,0 мг/кг на протяжении 31 дня.

Измерение уровня глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены мышей, проводили при помощи глюкометра One Touch Select Plus Flex (Швейцария) до введения и на 5-е сутки после введения СТЗ. Измерение массы тела мышей проводили каждые 3-4 дня, а потребление корма и воды - ежедневно.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 10. Для оценки нормальности распределения использовался критерий Шапиро-Уилка. Поскольку данные по уровню глюкозы в крови мышей не имели нормального распределения, для выявления межгрупповых различий использовался непараметрический критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Точный тест Фишера использовался для оценки различий между группами в количестве болеющих животных и в количестве потребляемой воды и корма. Значение вероятности р<0,05 считалось статистически значимым.

Введение ГТС-301 в течение 14 дней и 20 дней в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг не вызывало изменений уровня глюкозы в крови здоровых животных (табл.10). Введение СТЗ в дозе 110 мг/кг вызывало выраженное повышение уровня глюкозы. Животных считали заболевшими диабетом при достижении порогового уровня глюкозы в 13 ммоль/л [Watcho Р, Stavniichuk R, Tane P. et al. Evaluation of PMI-5011, an ethanolic extract of Artemisia dracunculus L, on peripheral neuropathy in streptozotocindiabetic mice // Int J Mol Med. 2011. V. 27(3): 299-307]. В группе диабетических мышей, которым вводили ГТС-301 в дозе 0,5 мг/кг на 5-е сутки после введения СТЗ отмечалось достоверное снижение гипергликемии по сравнению с группой нелеченых животных (табл.10). Для оценки достоверности различий в количестве животных с сахарным диабетом (уровень глюкозы в крови ≥13 ммоль/л) применялся точный тест Фишера. Показано что в группе «Диабет + ГТС-301 (0,5 мг/кг)» количество больных животных было статистически значимо ниже (4 из 11 мышей), чем в группе «Диабет» (12 из 13 мышей). ГТС-301 в дозе 5,0 мг/кг не снижал гипергликемию.

Продолжение введения ГТС-301 в дозах 0.5 и 5 мг/кг (группы 5 и 6) в течение 20 дней не оказало влияния на уровень глюкозы в крови здоровых мышей.

Введение ГТС-301 в обеих исследуемых дозах не оказывало влияния на массу тела животных до введения СТЗ, а также на 5-е сутки после введения СТЗ.

Одним из важных индикаторов сахарного диабета является полидипсия. У животных группы «Диабет» суточное потребление воды выросло в 3 раза по сравнению с потреблением воды до индукции диабета (табл.11), а также по сравнению с контрольной группой (точный тест Фишера).

У диабетических животных, получавших ГТС-301 в дозе 0,5 мг/кг, суточное потребление воды выросло в 2 раза по сравнению с потреблением воды до индукции диабета; однако статистически значимо отличалось от группы нелеченых диабетических животных и не отличались от контрольной группы.

У диабетических животных, получавших ГТС-301 в дозе 5,0 мг/кг, суточное потребление воды выросло почти в 6 раз по сравнению с потреблением воды до индукции диабета, и статистически значимо отличалось как от группы диабетических нелеченых животных, так и от группы здоровых животных.

Различий в потреблении корма на 5-е сутки после индукции диабета между группами выявлено не было.

Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что миметик NT3 ГТС-301 при хроническом внутрибрюшинном введении в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг не влияет на уровень глюкозы в крови у здоровых животных. При этом в дозе 0,5 мг/кг ГТС-301 проявляет гипогликемическую активность, снижает количество «болеющих» (с уровнем глюкозы в крови ≥13 ммоль/л) животных и нормализует потребление воды у мышей с СТ3-индуцированным диабетом.

Таким образом, соединение ГТС-301 при хроническом введении в дозе 0,5 мг/кг проявляло антидиабетические эффекты на модели стрептозотоцинового диабета у мышей, оказывая антигипергликемическое действие и нормализуя увеличенное потребление воды.

ПРИМЕР 11. Соединения ГТС-302 и ГТС-304 не влияют на порог болевой реакции при стимуляции ноцицепторов

Эксперименты выполнены на инбредных мышах-самцах линии С57 В1/6 с массой тела 18-22 г (n=76), полученных из ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (филиал «Столбовая»). Животных содержали по 15 особей в клетке стандарта Т/3 в виварии при естественной освещенности с температурой воздуха 21-23°С и относительной его влажности 40-60%, свободном доступе к воде и брикетированному корму в течение 10 суток до начала тестирования. Содержание животных соответствовало правилам надлежащей лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ в соответствии с Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. N 81, ГОСТ 33215-2014 и ГОСТ 33216-2014. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

ГТС-302 и ГТС-304 вводили в/б в виде суспензии в 1% водном растворе Tween 80 в дозах 1-10 мг/кг однократно из расчета 0,1 мл/10 г веса животного за 30 мин до начала тестирования. Животные контрольных групп получали воду для инъекций с Tween-80.

Тест «горячая пластина» использовали для оценки ноцицептивной реакции. С помощью анальгезиметра «Ugo Basile» (Италия) регистрировали латентное время реакции (лизание задней лапы или прыжок). За 2 ч до начала опыта отбирали животных на основе базовой реактивности в условиях экспериментальной модели, исключая мышей, остававшихся на нагретой до 55±0.5°С пластине дольше 10 с. Латентный период в 20 с (максимальное время экспозиции) расценивали как 100% анальгезию. Фиксировали время появления реакции у мышей через 30, 60, 90 и 120 мин после однократного введения изучаемых соединений. Полученные результаты выражали в виде максимально возможного эффекта (МВЭ) в %. МВЭ = (латентный период реакции после введения препарата минус фоновый латентный период реакции)/(максимальное время экспозиции минус фоновый латентный период реакции) X 100%.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и последующих попарных межгрупповых сравнения с помощью теста Дункана. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки средних значений Mean ± SEM. Критический уровень значимости р=0,05.

Средний базовый уровень ноцицептивной реакции для мышей С67В 1/6 в тесте «горячая пластина» составил 6,5±0,5 с. Животных с латентным периодом реакции более 10 с в эксперимент не включали.

При моделировании острой соматической боли установлено, что через 30, 60, 90 и 120 мин после введения соединений пороги болевой реакции в опытных группах не отличались от контрольных (табл.12). Полученные данные свидетельствуют о том, что ГТС-302 и ГТС-304 в изученном диапазоне доз при системном введении не изменяют порог болевой реакции при термическом раздражении ноцицепторов, что подтверждает отсутствие гипералгезии при введении низкомолекулярных миметиков нейротрофина-3, как и у полноразмерного нейротрофина-3 [X-Q Shu, A Llinas, L М Mendell Effects of trkB and trkC neurotrophin receptor agonists on thermal nociception: a behavioral and electrophysiological study // Pain. 1999; V 80(3): 463-470].

Известно, что одним из основных побочных эффектов нейротрофинов является гиперальгезия [Pezet S, McMahon SB. Neurotrophins: mediators and modulators of pain. Annu Rev Neurosci. 2006;29:507-538]. Нами в опытах in vivo доказано отсутствие ноцицептивных и антиноцицептивных свойств миметиков 4-й петли нейротрофина-3 ГТС-302 и ГТС-304 при моделировании острой соматической боли на супраспинальном уровне. Полученные результаты указывают на то, что изученные соединения не вызывают гиперальгезии, характерной для полноразмерных нейротрофинов.

ПРИМЕР 12. Анксиолитическая активность соединения ГТС-302

Эксперименты выполнены на инбредных мышах-самцах линии BALB/c (n=40) с генетически детерминированной пассивной реакцией на эмоционально-стрессовое воздействие [Carola V, D'Olimpio F, Brunamonti E, Mangia F, Renzi P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice // Behav Brain Res. 2002; V.134(1-2): 49-57] с массой тела 18-22 г (ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая»). Животных содержали в клетках стандарта Т/3 в условиях вивария (температура 21-23°С, относительная влажность воздуха 40-60%) при естественной освещенности и свободном доступе к воде и брикетированному корму в течение 10 суток до начала тестирования. Содержание животных соответствовало ГОСТ 33215-2014 и ГОСТ 33216-2014. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Эмоционально-стрессовое воздействие моделировали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). Установки ПКЛ для мышей (НПК Открытая Наука, Москва, Россия) выполнены из пластмассы серого цвета и имеют непрозрачные боковые стенки, окрашенные в цвет пола. Лабиринты приподняты на высоту 38 см. Каждое животное помещали в центр лабиринта на 300 с. Регистрировали следующие показатели: время нахождения в открытых рукавах; число заходов в открытые рукава; число заходов в закрытые рукава. Общую двигательную активность вычисляли как сумму заходов в открытые и закрытые рукава лабиринта. Анксиолитическое действие оценивали по увеличению продолжительности нахождения в открытых рукавах и числа заходов животных в открытые рукава лабиринта. Показатели «время в открытых рукавах» и «число заходов в открытые рукава», сравнивали помимо абсолютных значений в относительных единицах (в %), которые рассчитывали по формуле:

относительное время в открытых рукавах, % = (время в открытых рукавах в сек /300 сек) × 100%; относительное число заходов в открытые рукава, % = (число заходов в открытые рукава/общее число заходов в открытые и закрытые рукава) × 100%.

Статистическую обработку результатов производили при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием теста Дункана. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки средних значений (mean ± SEM).

ГТС-302 вводили в/б в виде суспензии в 1% водном растворе Tween 80 в дозах 1,0, 5,0 и 10,0 мг/кг, в/б за 30 мин до тестирования в ПКЛ из расчета 0,1 мл / 10 г веса животного. Животные контрольных групп получали воду для инъекций с Tween-80.

В тесте ПКЛ соединение ГТС-302 при остром введении препятствовал формированию тревожной реакции, обусловленной новизной ситуации, у мышей BALB/c в зависимой от дозы манере. Наиболее выраженный эффект ГТС-302 демонстрировал в минимальной изученной дозе 1,0 мг/кг, статистически значимо увеличивая в 1,9 раза время пребывания и в 2,7 раза число выходов в открытые рукава лабиринта по сравнению с контрольной группой при отсутствии влияния на число заходов в закрытые рукава и общую двигательную активность (табл.13). ГТС-302 в дозах 5,0 и 10,0 мг/кг не влиял на время пребывания в открытых рукавах, но увеличивал в 1,9 и 2,1 раз, соответственно, число выходов в открытые рукава лабиринта мышей BALB/c, что указывает на формирование устойчивого анксиолитического действия при введении миметика нейротрофина-3.

Таким образом, в опытах in vivo установлено, что миметик 4-й петли нейротрофина-3 соединение ГТС-302 при однократном введении обладает анксиолитическим действием у «высокоэмоциональных» мышей линии BALB/c.

ПРИМЕР 13. Антиаддиктивные эффекты соединения ГТС-302

Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах-самцах с массой тела 230-250 г. (n=40) (ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая»). Животных содержали по 6 особей в клетке в условиях вивария (температура 21-23°С, относительная влажность воздуха 40-60%) при естественной освещенности и свободном доступе к воде и брикетированному корму в течение 10 суток до начала тестирования. Содержание животных соответствовало ГОСТ 33215-2014 и ГОСТ 33216-2014. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Морфина гидрохлорид (Минмедбиопром объединение «Чимкентбиофарм», субстанция) растворяли в воде для инъекций и вводили внутрибрюшинно (в/б) из расчета 0,1 мл/100 г массы тела крыс. ГТС-302 вводили в/б в виде суспензии в 1% водном растворе Tween 80 в дозах 0,1-10,0 мг/кг из расчета 0,1 мл/100 г массы животного.

Формирование опиатной зависимости и оценку соматических проявлений синдрома отмены морфина у крыс проводили в соответствии со схемой, описанной ранее [Kolik L.G, Konstantinopolsky М.А. Comparative assessment of the effectiveness of noncompetitive NMDA receptor antagonists amantadine and hemantane in morphine withdrawal syndrome model // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2019; T. 166(6): 739-743].

Для получения животных, зависимых от морфина, препарат вводили животным в возрастающих дозах (10-20 мг/кг) 2 раза в день с промежутком в 8 ч в течение 5 суток:

1- е сутки всего - 10 и 10 мг/кг,

2- е сутки - 10 и 20 мг/кг,

3- и сутки - 20 и 20 мг/кг,

4- е сутки - 20 и 20 мг/кг,

5- е сутки - 20 мг/кг.

На 5-й день эксперимента через 5 ч после последней инъекции морфина и за 60 мин до тестирования вводили ГТС-302 в дозах 0,1 (n=10); 1,0 (n=10) и 10,0 (n=10) мг/кг в/б, а животным из группы активного контроля (n=10) - воду для инъекций в эквивалентном объеме. Тестирование животных на наличие специфических признаков синдрома отмены (СО) морфина проводили в течение 5 мин в «открытом поле» (освещенная круглая арена диаметром 80 см) через 15 мин после введения антагониста опиатных рецепторов налоксона ("Du Pont De Nemours Int. S.A, Swiss") в дозе 1,0 мг/кг для провокации СО. Для всех групп регистрировали специфические признаки СО морфина (17 показателей). Дискретные признаки абстиненции (диарею - в баллах, отряхивания и скрежет зубами -по числу актов) оценивали количественно и альтернативно, остальные - в альтернативной форме по принципу «да» - «нет». Суммарный индекс (СИ) выраженности СО для каждого животного и средние значения для опытных и контрольных групп рассчитывали на основании альтернативных признаков при максимально возможной величине СИ, равной 17 баллам. Среднее значение выраженности СО в группе «морфин» (активный контроль) принимали за 100%.

Статистическую обработку полученных результатов производили при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием теста Даннетта. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки средних значений (mean±SEM).

Полученные результаты показывают, что ГТС-302 оказывает существенное, зависимое от дозы, влияние на специфические поведенческие показатели синдрома отмены у крыс, получавших морфин (табл.14).

В сравнении с группой активного контроля снижение суммарного индекса СО морфина для группы «ГТС-302 0,1 мг/кг» составило 26,9%, для группы «ГТС-302 1,0 мг/кг» - 41,4% и для группы «ГТС-302 10,0 мг/кг» - 36,5%. Эффект ГТС-302 был наиболее выражен в дозе 1,0 мг/кг. Оценивая коррекцию отдельных проявлений СО морфина, следует отметить снижение выраженности или полное устранение таких показателей как нарушение позы (р<0,001), отряхивания «мокрой собаки» (р<0,05), вокализация (р<0,05) и встряхивания головой (р<0,01). Несмотря на отсутствие статистически значимых различий, можно отметить тенденцию ослаблять такие проявления отмены как диарея, птоз, диспноэ и судороги с увеличением дозы ГТС-302 (табл.14).

Не отмечалось значимых изменений двигательной активности в течение 5 мин в ОП, вертикальной активности («стоек»), числа актов груминга и дефекаций, а также влияния на такие признаки отмены морфина, как ринорея, пилоэрекция, бегство, стереотипия и корчи у животных, получавших ГТС-302, в сравнении с контрольной группой.

Таким образом, экспериментально доказана способность низкомолекулярного аналога нейротрофина-3 дозозависимо снижать величину суммарного индекса синдрома отмены морфина, не оказывая влияния на общую двигательную активность.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым биологически активным молекулам, содержащим дипептиды, и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает возможность получения соединений, характеризующихся общей формулой (R-CO-L-AK-X-Asn-NH-)₂(CH₂)₆, где R = НООС-(СН₂)₂-, или НООС-(СН₂)₃-, или НО-(СН₂)₃-, AK = Glu или Asn, Х = L- или D-конфигурация соответствующего аминокислотного остатка. Такие соединения представляют собой димерные дипептидные миметики 4-й петли нейротрофина-3 (NT3). Изобретение может быть применимо в медицинской практике при лечении депрессивных состояний и различных нейродегенеративных заболеваний. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 пр., 14 табл.

1. Соединения общей формулы

(R-CO-L-AK-X-Asn-NH-)₂(CH₂)₆,

где R = НООС-(СН₂)₂-, или НООС-(СН₂)₃-, или НО-(СН₂)₃-,

AK = Glu или Asn, Х = L- или D-конфигурация.

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R = НООС-(СН₂)₂-, AK = Asn, X = L.

3. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R = НООС-(СН₂)₂-, AK = Asn, X = D.

4. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R = НООС-(СН₂)₃-, AK = Asn, X = L.

5. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R = НО-(СН₂)₃-, AK = Glu, X = L.

6. Способ лечения острых и хронических нейродегенеративных заболеваний, таких как инсульт, ишемия мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, включающий введение эффективного количества соединения по любому из пп. 2-5.

7. Способ лечения депрессивных состояний, включающий введение эффективного количества соединения по любому из пп. 2-5.