СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6876 

Заявленное изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии и репрудоктологии, и предназначено для количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бесплодие является актуальной медицинской и социальной проблемой, у 50% пар оно связано с мужским фактором, и в половине случаев этиология его остается неизвестной. Различные микроорганизмы, в том числе бактерии, вирусы и простейшие, инфицируют половые пути мужчин и ухудшают их фертильность.

Вопрос о роли вирусного инфицирования в нарушении фертильности до сих пор остается дискуссионным.

Если вирусы, вызывающие заболевания урогенитальных органов, локализованы только в семенной жидкости и несперматогенных клетках, следует учитывать возможность функционирования эякулята в качестве субстрата-переносчика вирусных заболеваний, в том числе инфекций, передаваемых половым путем, с соответствующими рекомендациями по диагностике инфекций. В этом случае пациенты остаются в сфере интересов врачей-венерологов. При инфицировании самих половых клеток возникают проблемы с их освобождением от вирусов и могут быть затронуты механизмы репродукции. Обсуждаемыми клиническими последствиями вирусного инфицирования сперматозоидов являются повышенный риск ранних спонтанных абортов и неудачи вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), а также более высокая частота идиопатического мужского бесплодия.

Вирусы простого герпеса (ВПГ) – ДНК-содержащие вирусы, относятся к возбудителям инфекций, передаваемых половым путем, и включены в семейство Herpesviridae, для которых характерна персистенция в клетках организма-хозяина.

В настоящее время в сперматозоидах обнаружены вирусы иммунодефицита человека, папилломы человека (в том числе штаммов онкогенного риска), гепатитов В и С, простого герпеса и цитомегаловирус.

Сперматозоиды – высокодифференцированные транскрипционно инертные клетки с минимальной цитоплазмой и уникальной структурой ядра. Из-за особенностей структуры ядра сперматозоидов подтвердить наличие вирусов в сперматозоидах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), который в настоящее время повсеместно используется для диагностики различных клинических форм вирусной инфекции, в стандартной клинической практике затруднительно. В настоящее время в исследованиях для доказательства внутригаметной локализации вирусов применяются довольно дорогие для рутинной лабораторной работы методы гибридизации in situ, ПЦР in situ, иммунофлуоресценции, секвенирования, вложенной ПЦР и электронной микроскопии.

При обнаружении в образцах спермы инфицированных вирусом сперматозоидов наиболее важным аспектом становится количественное определение вирусных ДНК, которое является индикатором для мониторинга вирусных инфекций при бесплодии и своевременного принятия решения о начале терапии.

В общедоступной литературе авторам не удалось найти данных о недорогих и точных способах количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов в обычной медицинской лаборатории.

В непатентной литературе в качестве близких аналогов можно указать следующие источники:

1) В.В. Евдокимов, В.А. Науменко, Ю.А. Тюленев, Л.Ф. Курило, В.П. Ковалык, Т.М. Сорокина, А.Л. Лебедева, М.А. Гамберг, А.А. Кущ «Количественная оценка ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска и герпесвирусов человека у мужчин при нарушении фертильности», Вопросы вирусологии, 2016, 61(2);

2) Naumenko V., Tyulenev Y., Kurilo L., Shileiko L., Sorokina T., Evdoki- mov V. et al. Detection and quantification of human herpes viruses types 4–6 in sperm samples of patients with fertility disorders and chronic inflammatory urogenital tract diseases. Andrology. 2014; 2 (5): 687–94;

3) Е.Е. Брагина, Е.Н. Бочарова «Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов при диагностике мужского бесплодия», «Андрология и генитальная хирургия», № 1, 2014;

4) Jérôme LeGoff, Hélène Péré & Laurent Bélec «Diagnosis of genital herpes simplex virus infection in the clinical laboratory», Virology Journal, Article number: 83 ( 2014),  Published: 12 May 2014. The Erratum to this article has been published in Virology Journal2015 12:167;

5) Yun Ji Hong, Mi Suk Lim, Sang Mee Hwang, Taek Soo Kim, Kyoung Un Park, Junghan Song and Eui Chong Kim «Detection of Herpes Simplex and Varicella-Zoster Virus in Clinical Specimens by Multiplex Real-Time PCR and Melting Curve Analysis», Laboratory Medicine 2014, Published 16 Apr 2014;

6) H.N Madhavan, K Priya, A.R Anand, K Lily Therese «Detection of Herpes simplex virus (HSV) genome using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples: Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV», Journal of Clinical Virology, Volume 14, Issue 2, October 1999, Pages 145-151;

7) Науменко В.А., Климова Р.Р., Курило Л.Ф. Выявление вируса простого герпеса в мужских половых клетках при экспериментальной инфекции органной культуры семенника и в эякуляте мужчин с нарушениями фертильности. Акушерство и гинекология. 2010; 3: 42–6. Культура клеток.

Из приведенных выше источников наиболее релевантна к предлагаемому изобретению научная работа (первый источник, коллектив авторов – В.В. Евдокимов и др.), в которой приведена следующая информация. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ДНК ВПЧ в клиническом материале определяли методом ПЦР с помощью реагентов фирмы «ИнтерЛабСервис» (Москва): комплект реагентов для экстракции ДНК «АмплиСенс ДНК-сорб-В» и набор реагентов для выявления ДНК ВПЧ 12 типов ВКР: типы 16, 31, 33, 35, 52, 58 (клайд А9); 18, 39, 45, 59 (клайд А7); 51 (клайд А5); 56 (клайд А6). Использовали набор для ПЦР c гибридизационно-флюоресцентной детекцией АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-FL. Амплификацию проводили с помощью Rotor-Gene 6000 («Corbett Research», Австралия). При интерпретации количественных данных руководствовались рекомендациями производителя тест-систем, разработанными для анализа ВПЧ в урогенитальных соскобах: концентрации ВПЧ <3 lg 10/100 тыс. кл. оцениваются как клинически малозначимые, от 3 до 5 lg 10/100 тыс. кл. - как клинически значимые; более 5 lg 10/ 100 тыс. кл. - как клинически значимые с высоким риском развития дисплазии. Для количественного определения ДНК ГВЧ (ВЭБ, ЦМВ и ВГЧ-6) в клинических материалах использовали набор реагентов для ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени - АмплиСенс ЕВУ/СМУ/ННУ6-скрин. Для эндогенного внутреннего контроля использовали Р-глобиновый ген. Статистический анализ. Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ Statistica 6.0 и BIOSTAT. Статистические различия анализировали, применяя критерии хи-квадрат, Стьюдента, Манна - Уитни. Различия показателей считали статистически значимыми при р < 0,05.

Недостатком известного способа является выделение ДНК с помощью набора АмплиСенс ДНК-сорб-В, который не предназначен для выделения ДНК из сперматозоидов. Широко известно из литературы, а мы также знаем это из личного опыта, что лизирующие смеси, предназначенные для обычных (соматических) клеток, в том числе и смесь, входящая в состав набора АмплиСенс ДНК-сорб-В, недостаточно эффективны в отношении зрелых сперматозоидов. В результате их использования происходит преимущественное выделение ДНК из присутствующих в образцах спермы соматических клеток и семенной жидкости, но не из сперматозоидов. Такой метод подходит для исследования внеклеточного инфицирования образцов спермы, но не для детекции вирусной ДНК внутри сперматозоидов. Еще одним недостатком известного способа является использование в реакции ПЦР специальных наборов, разработанных для детекции определенных вирусов. Для детекции других вирусов пришлось бы использовать другие предназначенные именно для них наборы.

В патентной литературе авторами изобретения также были найдены различные способы определения вирусного инфицирования, среди которых можно указать близкие к предлагаемому изобретению аналоги.

Так, из патентного документа RU 2435865 С2 (опубликовано 10.12.2011) известен способ, который включает применение диагностической мультиплексной панели (DMP), созданной для одновременной идентификации совокупности возможных микроорганизмов, которые могут присутствовать в биологическом образце, с применением реакции удлинения праймеров в отношении высококонсервативных нуклеотидных последовательностей в тестируемых микроорганизмах. Биологический образец иммобилизуют на или в твердом субстрате в первом местоположении, затем переносят в другое местоположение и осуществляют стадию экстракции на твердом субстрате таким образом, чтобы экстрагировалась ДНК любого микроорганизма, присутствующего в пробе. Затем проводят амплификацию нуклеиновой кислоты на экстрагированных ДНК микроорганизмов, затем смешивают целевые последовательности с праймерами с применением DMP. В результате определяют генотип любых присутствующих микроорганизмов и идентифицируют искомые микроорганизмы. Для осуществления способа используют диагностическую мультиплексную панель (DMP), пригодную для генотипирования патогенных микроорганизмов и набор для тестирования микроорганизмов. Использование изобретения позволяет надежный отбор биологических образцов и их тестирование, обеспечивая при этом одновременное тестирование множества микроорганизмов.

Известный способ позволяет детектировать одновременно присутствие нескольких (из определенного набора) микроорганизмов в биологических образцах. Однако он является чисто качественным, то есть позволяет лишь определять наличие или отсутствие ДНК искомых микроорганизмов без количественной оценки инфекционной нагрузки. Кроме того, данный метод достаточно дорогостоящий, в том числе за счет использования специальных диагностических мультиплексных панелей.

В патентном документе CN 110669847 А (опубликовано 10.01.2020) описан способ определения чистоты сперматозоидов, содержащих сперматозоиды животных. Способ включает этапы, на которых ПЦР в режиме реального времени выполняется на Х-сперматозоидах и Y-сперматозоидах в стандартах, содержащих Х-сперматозоиды и Y-сперматозоиды с различными известными соотношениями концентраций раздельно. Полученные значения КТ Х-сперматозоидов и Y-сперматозоидов используются в качестве переменных факторов для получения стандартной кривой с отношением концентраций Х-сперматозоидов к Y-сперматозоидам. Затем среднее значение Ct Х-сперматозоидов и Y-сперматозоидов в исследуемом образце сравнивается со стандартной кривой для получения отношения концентрации Х-сперматозоидов к Y-сперматозоидам в исследуемом образце с целью получения чистоты исследуемого образца. Метод обнаружения решает проблему систематических ошибок между результатом обнаружения и фактической чистотой образца, вызванных различной эффективностью амплификации различных целевых генов и различных праймерных последовательностей в методах обнаружения в предшествующем уровне техники, и результат обнаружения позволяет быть более точным.

Недостатком известного способа является то, что в нем определяют количественное соотношение сперматозоидов в зависимости от их принадлежности к X-хромосомному или Y-хромосомному типу. Кроме того, способ не позволяет количественно оценить вирусную нагрузку инфицированных сперматозоидов.

Из патентного документа RU 2371718 C1 (опубликовано 27.10.2009) известен способ подготовки пробы сперматозоидов для электронно-микроскопического исследования, при котором осуществляют разбавление эякулята в отношении 1:10-1:20 физиологическим раствором, фиксацию 2,5% раствором глутарового альдегида. Полученный зафиксированный материал в виде капли фиксатора с взвешенными после ресуспендирования в нем клетками осадка наносят на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубируют во влажной камере при комнатной температуре 25÷35 мин, осуществляют промывку фольги с прикрепившимися клетками в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,4 с последующей фиксацией в 1% осмиевом фиксаторе и обезвоживанием, помещением фольги с клетками в насыщенный раствор уранилацетата в 70% этаноле и инкубированием в закрытой пробирке 12-14 часов. Далее проводят дегидратацию и осуществляют заливку эпоксидной смолой, после полимеризации алюминиевую фольгу отделяют от полученной пластины из эпоксидной смолы, на поверхности которой находятся сперматозоиды. Использование данного способа позволяет исследовать единичные сперматозоиды в образцах с очень низкой концентрацией и получать ультратонкие ориентированные срезы сперматозоидов.

Известный метод позволяет исследовать образцы спермы на предмет внутриклеточного вирусного инфицирования и определить долю инфицированных клеток. Однако, точное определение вида вируса и количественное определение вирусной нагрузки (число вирусных частиц на сперматозоид) с помощью этого метода невозможны.

В патентном документе RU 2660557 C1 (опубликовано 06.07.2019) раскрыт способ ранней диагностики риска потери плода в семейной паре при наличии урогенитальной инфекции у мужчин, характеризующийся тем, что на этапе прегравидарной подготовки у пациента определяют следующие показатели: уровни ФНОα, ИЛ-17, ИЛ-13 и ТИМП-2 в сыворотке венозной крови, а также ФНОα, ИЛ-13 и ММП-8 в эякуляте с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, и в случае выявления: в сыворотке венозной крови ФНОα более 12,0 пг/мл, ИЛ-17 выше 8,5 пг/мл, ИЛ-13 выше 100,0 пг/мл и ТИМП-2 ниже 110,0 нг/мл и в эякуляте ФНОα выше 5,0 пг/мл, ИЛ-13 выше 55,0 пг/мл и ММП-8 выше 10,0 нг/мл диагностируют высокий риск потери плода. Осуществление изобретения позволяет в короткие сроки прогнозировать наличие риска потери плода на этапе прегравидарной подготовки семейной пары и принять необходимую стратегию профилактики и лечения синдрома потери плода в семейной паре.

Недостатком известного способа является то, что оценка риска потери плода осуществляется по клиническим маркерам воспалительного ответа. И хотя эти маркеры действительно отражают вероятность наличия инфекции, они не дают никакой информации о природе инфекционного агента. Между тем, наличие такой информации является определяющим при выборе способа лечения инфекции.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению является патентный документ RU 2633755 C1 (опубликовано 17.10.2017), в котором раскрыт способ выявления вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке путем определения в биопробе ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов. Выявление проводят в плазме и/или сыворотке крови, сгустке крови, ротоглоточных смывах, сперме, тканях печени. Выявление проводится в два этапа. На первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер: 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер: 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'). На втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов генома ВГВ. Способ обеспечивает повышение специфичности и чувствительности диагностики вируса гепатита В.

Недостатком известного способа является то, что задача количественной оценки вирусной нагрузки не ставится, а осуществляется только качественная детекция (наличие или отсутствие) вируса гепатита B в биологических образцах. С точки зрения количественного определения в известном способе упоминается лишь то, что использование двухступенчатой ПЦР позволяет повысить чувствительность метода, направленного на детекцию вирусной ДНК в условиях низкой вирусной нагрузки. Кроме того, известный способ применим только к вирусу гепатита В, а не к любому ДНК-содержащему вирусу.

Проведенный анализ уровня техники показал, что существует необходимость создание способа количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов, который устранял бы все приведенные недостатки известных способов.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническими результатами, на достижение которых направлено предлагаемое изобретение, являются:

- упрощение и ускорение подготовки образцов ДНК из образца спермы;

- упрощение и удешевление процедуры ПЦР;

- обеспечение получения информации о природе инфекционного агента (вируса) и одновременного определения его количества,

- повышение точности количественной оценки вирусной нагрузки;

- применимость к любому ДНК-содержащему вирусу;

- количественное определение вирусной нагрузки во всех сперматозоидах, вне зависимости от их типа.

Достижение указанных технических результатов обеспечивается способом количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов, характеризующимся тем, что он состоит из четырех последовательно осуществляемых стадий:

- на первой стадии проводят выделение образцов ДНК из образца спермы методом извлечения ДНК с помощью ионообменной смолы,

- на второй стадии проводят анализ с помощью количественной полимеразной цепной реакции с регистрацией в реальном времени и нормализацию полученных данных с помощью праймеров NOG и BMP4 с получением значения среднего содержания вирусной ДНК на сперматозоид,

- на третьей стадии определяют долю инфицированных сперматозоидов с помощью электронно-микроскопического исследования сперматозоидов с получением значения доли инфицированных сперматозоидов,

- на четвертой стадии определяют вирусное инфицирование сперматозоидов, вычисляя вирусную нагрузку на инфицированный сперматозоид L по формуле: L=100×N/E, где N – среднее содержание вирусной ДНК на сперматозоид, E – доля инфицированный сперматозоидов в процентах, при этом анализ с помощью количественной полимеразной цепной реакции и нормализацию полученных данных осуществляют параллельно для каждого образца спермы.

В методе извлечения ДНК с помощью ионообменной смолы используют сухой порошок Chelex-100, деионизированную воду, высокоочищенную воду, образец спермы, раствор протеиназы К и дитиотреитол. Полученные на первой стадии образцы ДНК могут храниться при −20 ^оС не более 12 месяцев.

Для проведения второй стадии используют наборы для количественной ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя и амплификатор с регистрацией в реальном времени. Также, для проведения второй стадии составляют реакционные смеси, содержащие: образец ДНК, полученный на первой стадии, готовую 5-кратную реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR, пару праймеров, включающую прямой и обратный праймеры, высокоочищенную воду.

Реакция ПЦР включает стадию денатурации ДНК и одновременной активации ДНК-полимеразы.

Реакции ПЦР подвергают сразу несколько образцов ДНК, при этом реакции проводят параллельно для каждого образца ДНК с разными парами праймеров, а в качестве пар праймеров могут быть выбраны пары: HSV1F и HSV1R, CMVF и CMVR, EBVF и EBVR. Параллельно с другими парами праймеров образцы ДНК подвергают реакциям ПЦР с парами праймеров для двух генов человека – NOGF и NOGR, BMP4F и NOGR. С каждым образцом ДНК проводят от 3 до 6 параллельных реакций ПЦР.

Среднее содержание вирусной ДНК (N) определяется по формуле:

N=2^(CqG−CqV)

где C_qG – средний пороговый цикл для генов NOG и BMP4, а C_qV – средний пороговый цикл для исследуемого вируса.

Третью стадию – электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов проводят путем многократной фиксации образца спермы первым и вторым фиксатором, многократного центрифугирования для осаждения сперматозоидов, дегидратации полученного материала, пропитки жидкой эпоксидной смолой с последующей полимеризацией смолы, контрастированием ультратонких срезов сперматозоидов водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. В качестве наиболее приемлемого первого фиксатора может быть использован раствор глутарового альдегида на какодилатном буфере. В качестве наиболее приемлемого второго фиксатора может быть использован раствор четырехокиси осмия на какодилатном буфере.

Долю инфицированных сперматозоидов – E определяют путем подсчета сперматозоидов, содержащих структуры, морфологически идентичные капсидам ДНК-содержащих вирусов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов состоит из четырех последовательно осуществляемых стадий.

На первой стадии проводят выделение образцов ДНК из образца спермы методом извлечения ДНК с помощью ионообменной смолы.

Выделение ДНК из образца спермы может быть осуществлено следующим образом. Сухой порошок Chelex-100 (Sigma-Aldrich, номер по каталогу C7901-100G) промывают в нескольких сменах деионизованной воды и дважды в высокоочищенной воде. Промытый порошок суспендируют в высокоочищенной воде до получения суспензии с концентрацией 5 % (масса/объем) и рН от 6,5 до 7,5. Суспензию хранят при комнатной температуре.

Под высокоочищенной водой по смыслу изобретения понимается вода повышенного биологического качества, не содержащая каких-либо протеаз, ДНКаз и РНКаз.

В подготовленные пробирки с защелками переносят суспензию, непосредственно перед перенесением тщательно перемешанную на вортексе. Туда же добавляют образец спермы, раствор протеиназы К и дитиотреитол, после чего пробирки с содержимым инкубируют 45 мин при 56 ^оС в твердотельном термостате для микропробирок. Далее пробирки инкубируют 8 мин. на кипящей водяной бане.

Затем пробирки извлекают из водяной бани и тщательно перемешивают их содержимое не менее 10 сек на вортексе, после чего центрифугируют в микроцентрифуге на максимальных оборотах 5 мин. Полученная надосадочная жидкость представляет собой готовый для проведения ПЦР образец ДНК.

Осторожно переносят надосадочную жидкость в чистые микропробирки. В таком виде образцы ДНК можно хранить при −20 °C до 12 месяцев.

Далее образцы ДНК передают на вторую стадию, на которой проводят анализ с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с регистрацией в реальном времени и нормализацию полученных данных с помощью праймеров NOG и BMP4 с получением значения среднего содержания вирусной ДНК на сперматозоид.

Для проведения второй стадии используют наборы для количественной ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя и амплификатор с регистрацией в реальном времени. Также, составляют реакционные смеси, содержащие: образец ДНК, полученный на первой стадии, готовую 5-кратную реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR, прямой (F) и обратный праймеры (R), и высокоочищенную воду.

Количественной ПЦР подвергают сразу несколько образцов ДНК. Для каждого образца ДНК реакции с разными парами праймеров проводятся параллельно в соседних лунках прибора. Реакция ПЦР включает стадию денатурации ДНК и одновременной активации ДНК-полимеразы.

Параллельно с реакциями ПЦР для вирусных ДНК в тех же самых условиях в соседних лунках прибора проводятся реакции ПЦР с праймерами для двух генов человека – NOG (ноггин) и BMP4 (белок морфогенеза костной ткани 4). Поскольку известно, что каждый из этих генов в гаплоидном геноме сперматозоидов представлен одной копией, их относительное содержание принимается за 1.

Среднее содержание вирусной ДНК (N) определяется общепринятым методом ΔΔC_q по формуле:

N=2^(CqG−CqV),

где C_qG – средний пороговый цикл для генов NOG и BMP4, а C_qV – средний пороговый цикл для исследуемого вируса.

С каждым образцом ДНК необходимо провести, по меньшей мере, от 3 до 6 параллельных реакций ПЦР в соседних лунках прибора. Наиболее предпочтительно 6 реакций ПЦР для каждого образца ДНК.

Далее проводят третью стадию, определяют долю инфицированных сперматозоидов с помощью электронно-микроскопического исследования сперматозоидов (ЭМИС) с получением значения доли инфицированных сперматозоидов (Е).

Образец спермы помещают для разжижения в термостат. После разжижения его переливают в центрифужную пробирку объемом. На каждые 3 мл образца спермы используют одну 15 мл центрифужную пробирку. Добавляют изотонический раствор NaCl (физраствор), доведя объем жидкости до 15 мл, и перемешивают.

Если после перемешивания появляются хлопья, то пробирку центрифугируют для их осаждения. Надосадочную жидкость, содержащую взвесь сперматозоидов, переливают в чистую центрифужную пробирку.

К жидкости добавляют первый фиксатор и центрифугируют пробирку для осаждения сперматозоидов. В качестве наиболее приемлемого первого фиксатора может быть использован раствор глутарового альдегида на какодилатном буфере (рН 7,4). Если после центрифугирования на поверхности жидкости образуется пена, ее аккуратно удаляют пипеткой. После этого надосадочную жидкость сливают, а к осадку снова добавляют фиксатор и оставляют на 1,5 – 2 часа.

Далее осадок переносят в пробирку типа Эппендорф и снова центрифугируют. Затем надосадочную жидкость снова сливают, а к осадку добавляют второй фиксатор и фиксируют 2 часа. В качестве наиболее приемлемого второго фиксатора может быть использован раствор четырехокиси осмия на какодилатном буфере.

Проводят дегидратацию полученного материала в этиловом спирте восходящей концентрации и в двух сменах ацетона. Далее осуществляют пропитку жидкой эпоксидной смолой для электронной микроскопии в смеси с ацетоном при температуре 20^оС. Смесь эпоксидной смолы с ацетоном сливают, материал помещают в заливочные капсулы для электронной микроскопии, заливают жидкой эпоксидной смолой и инкубируют 12 час для полимеризации смолы.

С помощью микротома с использованием алмазного ножа получают ультратонкие срезы сперматозоидов толщиной 60-100 нм и контрастируют их 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца.

При просмотре в электронном микроскопе в остаточной цитоплазме у основания головки сперматозоида обнаруживаются вирусные капсиды. В области ядерных карманов капсиды выявляются около сохранившихся ядерных пор.

Долю инфицированных сперматозоидов – E определяют путем подсчета сперматозоидов, содержащих структуры, морфологически идентичные капсидам ДНК-содержащих вирусов, для чего просматривают не менее 100 сперматозоидов, выявляя двухмембранные структуры с гексагональной формой внутреннего контура.

Далее осуществляют четвертую стадию, определяя вирусное инфицирование сперматозоидов путем вычисления вирусной нагрузки на инфицированный сперматозоид.

Вирусная нагрузка L представляет собой число копий вируса на инфицированный сперматозоид. Ее вычисляют по формуле:

L=100×N/E,

где N – среднее содержание вирусной ДНК на сперматозоид, E – доля инфицированных сперматозоидов в процентах.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами были проведены клинические испытания.

Клинические испытания проведены в группе мужчин из 27 человек. Возраст пациентов от 24 до 42 лет, женатые. Пациенты обратились для обследования по поводу нарушения фертильности, у жен пациентов в анамнезе более двух беременностей, не закончившихся родами (спонтанный аборт, замершая беременность) либо первичное бесплодие более 1 года. Все пациенты обследованы с применением заявленного способа.

Заявленный способ осуществляли следующим образом.

Первая стадия способа

1 г сухого порошка Chelex-100 (Sigma-Aldrich, номер по каталогу C7901-100G) промыли в нескольких сменах по 5 мл деионизованной воды дважды по 5 мл в высокоочищенной воде. Промытый порошок суспендировали в высокоочищенной воде. Концентрация полученной суспензии - 5 %, рН - 7,0.

Суспензию энергично перемешали на вортексе и перенесли по 200 мкл в каждую из подготовленных 1,5-миллилитровых полипропиленовых микропробирок с защелками. В пробирки добавили 25 мкл образца спермы, 10 мкл раствора протеиназы К (концентрация 20 мг/мл) 10 мкл дитиотреитола (например, Dithiothreitol, Thermo Fisher Scientific P2325). Пробирки инкубировали 45 мин при 56°С. Далее пробирки инкубировали 8 мин. на кипящей водяной бане. Энергично перемешали содержимое не менее 10 сек., после чего центрифугировали в микроцентрифуге (например, Eppendorf MiniSpin Plus) на максимальных оборотах (>10 000g) 5 мин.

Осторожно перенесли надосадочную жидкость (около 200 мкл) в чистые микропробирки. Указанное количество может быть использовано по 20 мкл на 50-мкл реакцию ПЦР или по 10 мкл на 25-мкл реакцию ПЦР.

Вторая стадия способа

Использовали наборы для количественной ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя (например, SYBR Green I от компании Евроген qPCRmix-HS SYBR, номер по каталогу – PK147L) и амплификатор с регистрацией в реальном времени (например, CFX96 компании BioRad).

Составили реакционные смеси по 25 мкл, содержащие: 10 мкл образца ДНК, 5 мкл готовой 5-кратной смесь qPCRmix-HS SYBR, по 1 мкл прямого (F) и обратного (R) праймеров и 8 мкл высокоочищенной воды (например, Molecular Biology Grade, 18 Мом/см). Последовательности праймеров указаны в Таблице 1.

Таблица 1.

№ Название Последовательность (5'→3') Длина 1 HSV1F CATACCGGAACGCACCACACAA 22 2 HSV1R CCATATCGACCACACCGACGA 21 3 CMVF AAGCGGCCTCTGATAACCAAGCC 23 4 CMVR AGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG 24 5 EBVF ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG 23 6 EBVR CCTTTGCAGCCAATGCAACT 20 7 NOGF GGGTGGGGTTGTTGTTTG 18 8 NOGR TGCACTTTCAGCTCCATCAC 20 9 BMP4F CTCCAGGAAAAACCCAACAA 20 10 BMP4R GAGGGGAAACCCACCATAAT 20

Реакция ПЦР включала стадию денатурации ДНК и одновременной активации ДНК-полимеразы – 5 мин при 95°C, и 45 циклов [95°C-15 сек – 60°C-1 мин]. Количественной ПЦР подвергли сразу 6 образцов ДНК. Был определен средний пороговый цикл для исследуемого вируса – C_qV.

Параллельно в тех же самых условиях в соседних лунках прибора были проведены реакции ПЦР с праймерами для двух генов человека – NOG и BMP4. Исследовано также 6 образцов ДНК. Был определен средний пороговый цикл для генов NOG и BMP4 – CqG.

Для всех праймеров берутся одни и те же образцы ДНК.

Исходя из полученных для одних и тех же образцов ДНК в реальном времени данных, была осуществлена их нормализация с получением среднего содержание вирусной ДНК (N):

N=2^(CqG−CqV).

Полученные экспериментальные данные сведены в Таблицу 2.

Образец NOG, BMP4 Вирус герпеса Цитомегаловирус Вирус Эпштейна-Барр CqG CqV N CqV N CqV N 60404 24,69 н.о. н.о. 33,49 0,002244 н.о. н.о. 60405 22,63 н.о. н.о. 25,71 0,118257 н.о. н.о. 60407 30,69 н.о. н.о. 26,82 14,6213 н.о. н.о. 60408 22,49 31,41 0,00206 24,39 0,267943 29,34 0,008669 60414 23,74 н.о. н.о. 25,53 0,289172 40,03 1,25E-05 60415 25,11 н.о. н.о. 27,16 0,241484 44,02 2,03E-06 60419 32,47 н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 60420 24,07 н.о. н.о. 35,12 0,000472 н.о. н.о. 61989 22,75 н.о. н.о. 25,98 0,106579 34,65 0,000262 49660 22,92 н.о. н.о. 26,73 0,071298 н.о. н.о. 50194 22,66 32,84 0,00086 25,55 0,134904 30,68 0,003852 56583 22,7 33,48 0,00057 24,21 0,351111 31,56 0,002152 56932 22,6 н.о. н.о. 25,35 0,148651 40,72 3,51E-06 57189 22,45 н.о. н.о. 26,11 0,07911 н.о. н.о. 57275 21,84 37,38 2,1E-05 23,59 0,297302 28,12 0,012869 57931 22,78 н.о. н.о. 25,66 0,135842 34,71 0,000256 58563 22,28 38,38 1,42E-05 25,35 0,11908 32,24 0,001004 60097 23,09 н.о. н.о. 24,66 0,336808 30,17 0,007391 12201 ЭМИС 22,19 н.о. н.о. 27,15 0,032129 30,71 0,002724 10615 ЭМИС 37,6 н.о. н.о. 36,2 2,639016 43,6 0,015625 10617 ЭМИС 32,7 42,8 0,00091 34,6 0,267943 40,6 0,004187 5204 ЭМИС 34,8 46,1 0,0004 33,5 2,462289 38,8 0,0625 45920 34,9 44,8 0,00105 30,7 18,37917 39,1 0,054409 11069 ЭМИС 31,4 36,5 0,02916 28,7 6,498019 32,5 0,466516 47434 32,7 41,5 0,00224 30,1 6,062866 34,4 0,307786 47955 32 40 0,00391 28,4 12,12573 34 0,25 47617 30,1 39,8 0,00120 30,8 0,615572 34,7 0,041235

Третья стадия способа

Разжижение образца спермы в термостате произвели в течение 15-30 мин., после чего сперму перелили в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Каждую пробирку с образцом спермы добавили изотонический раствор NaCl (физраствор), доведя объем жидкости в пробирке до 15 мл, и перемешали.

В каждую пробирку пробирку добавили 0,2 - 0,3 мл первого фиксатора и центрифугировали пробирки для осаждения сперматозоидов. В качестве первого фиксатора использовали 2,5% раствор глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере, рН раствора был равен 7,4. После центрифугирования надосадочную жидкость слили, к осадку снова добавили 2 мл первого фиксатора и оставили фиксироваться на 1,5 – 2 часа при 4^оС.

Затем осадок вместе с первым фиксатором перенесли в пробирку типа Эппендорф объемом 2 мл и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Затем надосадочную жидкость слили, к осадку добавляют 1 мл второго фиксатора и фиксировали 2 часа при 4^оС. В качестве второго фиксатора использовали 1% раствор четырехокиси осмия на какодилатном буфере.

Провели дегидратацию полученного материала в этиловом спирте восходящей концентрации (50% - 5 мин, 70% - от 30 мин до 12 час, 96% - 2 смены по 30 мин) и в двух сменах ацетона по 15 мин.

Далее осуществили пропитку жидкой эпоксидной смолой (DDSA – 6,2мл, MNA – 4,7мл, эпон 812 – 9,1мл, DMP – 0,5мл) для электронной микроскопии в смеси с ацетоном (1 час в смеси из 2 частей ацетона и 1 части смолы, 1 час в смеси из 1 части ацетона и 2 частей смолы) при температуре 20^оС. Смесь эпоксидной смолы с ацетоном слили, материал поместили в заливочные капсулы для электронной микроскопии, залили жидкой эпоксидной смолой и инкубировали 12 часов при 37^оС с последующей полимеризацией смолы при 60^оС в течение 12 часов.

С помощью микротома (например, Ultracut III) с использованием алмазного ножа (например, Diatome AG, Switzerland) получили ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм и контрастировали их 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца.

При просмотре в электронном микроскопе (например, трансмиссионный электронный микроскоп JEOL1400, Япония) в остаточной цитоплазме у основания головки сперматозоида обнаружены вирусные капсиды. В области ядерных карманов около сохранившихся ядерных пор также выявляли капсиды.

Капсиды имели вид двухконтурных мембранных пузырьков с диаметром внешнего контура 120 – 140 нм и диаметром внутреннего контура 90 – 110 нм. Наружный контур имел строение типичной трехконтурной мембраны толщиной около 10 нм. Внутренний контур толщиной около 12 – 15 нм, в некоторых капсидах хорошо просматривалась гексагональная структура внутреннего контура.

На ультратоних срезах размером не менее 1 мм проводили просмотр не менее 100 сперматозоидов и определяли процентное содержание сперматозоидов с вирусными капсидами. Если на срезе не обнаруживали нужное количество сперматозоидов – проводили повторное получение срезов и повторный подсчет.

Полученные экспериментальные данные сведены в Таблицу 3.

Таблица 3

№ Образец E 1 60404 1% 2 60405 10% 3 60407 2% 4 60408 н.о. 5 60414 4% 6 60415 13% 7 60419 21% 8 60420 15% 9 61989 н.о. 10 49660 н.о. 11 50194 н.о. 12 56583 10% 13 56932 7% 14 57189 6% 15 57275 11% 16 57931 н.о. 17 58563 8% 18 60097 9% 19 12201 ЭМИС 3% 20 10615 ЭМИС 8 21 10617 ЭМИС 7 22 5204 ЭМИС 2 23 45920 10 24 11069 ЭМИС 9 25 47434 5 26 47955 5 27 47617 7

Четвертая стадия способа

Сведения Таблиц 2 и 3 позволили количественно определить вирусную нагрузку L по формуле:

L=100×N/E. Результат округляем до первого знака после запятой. При L<1 вирусная нагрузка считается отсутствующей (н.о.).

Данные расчетов представлены в Таблице 4.

Таблица 4

№ Образец E Вирус герпеса Цитомегаловирус Вирус Эпштейна-Барр N L N L N L 1 60404 1% н.о. н.о. 0,002244 н.о. н.о. н.о. 2 60405 10% н.о. н.о. 0,118257 1,2 н.о. н.о. 3 60407 2% н.о. н.о. 14,6213 731,1 н.о. н.о. 4 60408 н.о. 0,00206 н.о. 0,267943 ≥26,8* 0,008669 н.о. 5 60414 4% н.о. н.о. 0,289172 7,2 1,25E-05 н.о. 6 60415 13% н.о. н.о. 0,241484 1,9 2,03E-06 н.о. 7 60419 21% н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 8 60420 15% н.о. н.о. 0,000472 н.о. н.о. н.о. 9 61989 н.о. н.о. н.о. 0,106579 ≥10,7* 0,000262 н.о. 10 49660 н.о. н.о. н.о. 0,071298 ≥7,1* н.о. н.о. 11 50194 н.о. 0,00086 н.о. 0,134904 ≥13,5* 0,003852 н.о. 12 56583 10% 0,00057 н.о. 0,351111 3,5 0,002152 н.о. 13 56932 7% н.о. н.о. 0,148651 2,1 3,51E-06 н.о. 14 57189 6% н.о. н.о. 0,07911 1,3 н.о. н.о. 15 57275 11% 2,1E-05 н.о. 0,297302 2,7 0,012869 н.о. 16 57931 н.о. н.о. н.о. 0,135842 ≥13,6* 0,000256 н.о. 17 58563 8% 1,42E-05 н.о. 0,11908 1,5 0,001004 н.о. 18 60097 9% н.о. н.о. 0,336808 3,7 0,007391 н.о. 19 12201 ЭМИС 3% н.о. н.о. 0,032129 1,1 0,002724 н.о. 20 10615 ЭМИС 8 н.о. н.о. 2,639016 33,0 0,015625 н.о. 21 10617 ЭМИС 7 0,00091 н.о. 0,267943 3,8 0,004187 н.о. 22 5204 ЭМИС 2 0,0004 н.о. 2,462289 123,1 0,0625 3,1 23 45920 10 0,00105 н.о. 18,37917 183,8 0,054409 н.о. 24 11069 ЭМИС 9 0,02916 н.о. 6,498019 72,2 0,466516 5,2 25 47434 5 0,00224 н.о. 6,062866 121,3 0,307786 6,2 26 47955 5 0,00391 н.о. 12,12573 242,5 0,25 5,0 27 47617 7 0,00120 н.о. 0,615572 8,8 0,041235 н.о.

В некоторых образцах спермы не обнаруживается вирусного заражения с помощью ЭМИС, но обнаруживаются существенные количества вирусной ДНК. Такая ситуация вполне объяснима, поскольку ЭМИС обнаруживает только наличие зрелых вирусных частиц, а ПЦР – наличие вируса на любой стадии жизненного цикла. Такая ситуация возможна лишь при низких значениях E (≤1%), когда вероятность не встретить ни одного сперматозоида, содержащего зрелые вирусные частицы, достаточно высока.

В результате проведенных исследований было установлено, что при использовании заявленного изобретения подготовка образцов ДНК осуществляется проще и быстрее, чем в известных способах, благодаря эффективному и быстрому методу экстракции, дающему достаточно чистую ДНК, пригодную для ПЦР, без дополнительной очистки. Проведение всей процедуры ПЦР происходит проще, быстрее и дешевле, поскольку не требует дорогостоящих наборов реактивов и осуществляется за несколько быстрых и простых операций с использованием стандартного лабораторного оборудования (термостат, миницентрифуга, вортекс).

Кроме того, заявленный способ обеспечивает получения информации о природе инфекционного агента (в рассмотренном варианте осуществления изобретения – вирус герпеса) и одновременного определения его количества (определена вирусная нагрузка L). При этом способ обеспечивает применимость к любому ДНК-содержащему вирусу, поскольку в заявленном способе будут варьироваться только пары олигонуклеотидных праймеров, специфических для конкретного вируса. При известной последовательности генома любого ДНК вируса, конструирование таких праймеров не составляет каких-либо трудностей. Так, изготовление праймеров занимает в-среднем не более 10 дней и обойдется в 500-600 руб. за количество каждого праймера, достаточное для проведения нескольких сотен реакций.

Также, заявленный способ обеспечивает повышение точности количественной оценки вирусной нагрузки инфицирования сперматозоидов, при этом всех сперматозоидов вне зависимости от их типа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии и репрудоктологии, и предназначено для количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов. Проводят выделение ДНК из образца спермы. Проводят количественную полимеразную цепную реакцию с регистрацией в реальном времени и нормализацию полученных данных с помощью праймеров NOG и BMP4 с получением значения среднего содержания вирусной ДНК на сперматозоид. Определяют долю инфицированных сперматозоидов с помощью электронно-микроскопического исследования сперматозоидов с получением значения доли инфицированных сперматозоидов. Вычисляют вирусную нагрузку на инфицированный сперматозоид L по формуле L=100×N/E. Изобретение обеспечивает упрощение и ускорение подготовки образцов ДНК из образца спермы; упрощение и удешевление процедуры ПЦР; повышение точности количественной оценки вирусной нагрузки; применимость к любому ДНК-содержащему вирусу; количественное определение вирусной нагрузки во всех сперматозоидах вне зависимости от их типа. 13 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов, характеризующийся тем, что состоит из четырех последовательно осуществляемых стадий:

- на первой стадии проводят выделение образцов ДНК из образца спермы методом извлечения ДНК с помощью ионообменной смолы,

- на второй стадии проводят анализ с помощью количественной полимеразной цепной реакции с регистрацией в реальном времени и нормализацию полученных данных с помощью праймеров NOG и BMP4 с получением значения среднего содержания вирусной ДНК на сперматозоид,

- на третьей стадии определяют долю инфицированных сперматозоидов с помощью электронно-микроскопического исследования сперматозоидов с получением значения доли инфицированных сперматозоидов,

- на четвертой стадии определяют вирусное инфицирование сперматозоидов, вычисляя вирусную нагрузку на инфицированный сперматозоид L по формуле: L=100×N/E, где N – среднее содержание вирусной ДНК на сперматозоид, E – доля инфицированных сперматозоидов в процентах, при этом анализ с помощью количественной полимеразной цепной реакции и нормализацию полученных данных осуществляют параллельно для каждого образца спермы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в методе извлечения ДНК с помощью ионообменной смолы используют сухой порошок Chelex-100, деионизированную воду, высокоочищенную воду, образец спермы, раствор протеиназы К и дитиотреитол.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученные на первой стадии образцы ДНК могут храниться при 20^оС не более 12 месяцев.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения второй стадии используют наборы для количественной ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя и амплификатор с регистрацией в реальном времени.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения второй стадии составляют реакционные смеси, содержащие: образец ДНК, полученный на первой стадии, готовую 5-кратную реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR, пару праймеров, включающую прямой и обратный праймеры, высокоочищенную воду.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакция ПЦР включает стадию денатурации ДНК и одновременной активации ДНК-полимеразы.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакции ПЦР подвергают сразу несколько образцов ДНК, при этом реакции проводят параллельно для каждого образца ДНК с разными парами праймеров, а в качестве пар праймеров могут быть выбраны пары: HSV1F и HSV1R, CMVF и CMVR, EBVF и EBVR.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что параллельно с другими парами праймеров образцы ДНК подвергают реакциям ПЦР с парами праймеров для двух генов человека – NOGF и NOGR, BMP4F и NOGR.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что с каждым образцом ДНК проводят от 3 до 6 параллельных реакций ПЦР.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среднее содержание вирусной ДНК (N) определяется по формуле:

N=2^(CqG−CqV),

где C_qG – средний пороговый цикл для генов NOG и BMP4, а C_qV – средний пороговый цикл для исследуемого вируса.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов проводят путем многократной фиксации образца спермы первым и вторым фиксатором, многократного центрифугирования для осаждения сперматозоидов, дегидратации полученного материала, пропитки жидкой эпоксидной смолой с последующей полимеризацией смолы, контрастированием ультратонких срезов сперматозоидов водным раствором уранилацетата и цитратом свинца.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве наиболее приемлемого первого фиксатора может быть использован раствор глутарового альдегида на какодилатном буфере.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве наиболее приемлемого второго фиксатора может быть использован раствор четырехокиси осмия на какодилатном буфере.

14. Способ количественного определения вирусного инфицирования сперматозоидов по п. 1, отличающийся тем, что долю инфицированных сперматозоидов E определяют путем подсчета сперматозоидов, содержащих структуры, морфологически идентичные капсидам ДНК-содержащих вирусов.