Способ выявления микобактерий туберкулеза из контаминированных тканей Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза из материала, получаемого во время биопсии или открытого доступа из пораженных органов (паренхиматозная, костная ткань).

Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Согласно утвержденным протоколам выявления микобактерий туберкулеза перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание), то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры. Все препараты, используемые в настоящее время для деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной популяции, которая, например, при столбиковой трепанобиопсии не превышает 1/100-1000 объема стандартного забора материала при размере стобикового биоптата: диаметр 1 мм длина до 4 см; открытое хирургическое вмешательство с резекцией пораженного позвонка - объем тел нижнегрудных позвонков у людей весом от 55-80 килограмм колеблется от 10 до 14 куб.см, а поясничных - от 25 до 36 куб.см, что вынуждает использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущую Gr+/- микрофлору, грибы рода Candida, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий [Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации». Приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» IV. Культуральные методы исследования микобактерий комплекса М. Tuberkulosis 257-258].

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ выявления микобактерий туберкулеза из контаминированных тканей (патент RU 2415944, з. 11.06.2009, опубл. 10.04.2011), включающий обработку исследуемого материала от посторонней микрофлоры, посев на питательную среду.

Недостатком способа является длительность процесса деконтаминации исследуемого материала, низкая выживаемость микобактерий туберкулеза, токсичность используемых реагентов.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности микробиологической диагностики, сокращение сроков лабораторных исследований и снижение экономических затрат.

Техническим результатом является повышение жизнеспособности и снижение количественных потерь микобактерий туберкулеза в исследуемом материале при диагностике туберкулеза.

Для решения поставленной задачи в способе выявления микобактерий туберкулеза из контаминированной ткани, включающем обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры, согласно изобретению обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры производят при температуре окружающего воздуха 21°С и нормальном атмосферном давлении 0,9%-ным озонированным раствором NaCl, нагретым до температуры 21°С, и непрерывно насыщаемым озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин, в котором выдерживают исследуемый материал на протяжении 45 минут двукратно с паузой в 60 минут, во время которой исследуемый материал выдерживают в термостате при температуры 37°С.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве исследуемого материала используют, например, столбиковый биоптат костной ткани. Обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры производят при температуре окружающего воздуха 21°С и нормальном атмосферном давлении. Резецированный материал деконтаминируют на протяжении 45 минут в среде 0,9%-ного озонированного раствора NaCl, нагретого до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/3 л/мин. Затем в обработке делают паузу 60 минут, во время которой исследуемый материал выдерживают в термостате при температуре 37°С с целью пророста спор C.Albicans. После чего исследуемый материал повторно выдерживают на протяжении 45 минут в вышеуказанном озонированном физиологическом растворе NaCl. Использование озонированного раствора позволяет подавить быстрорастущие гноеродные, гнилостные микроорганизмы, максимально сохранив жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий. Далее исследуемый материал центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость используют для приготовления мазка с целью проведения люминесцентной микроскопии, осадок засевают поровну в первую и вторую пробирки с жидкой и плотной питательной средой соответственно.

Способ позволяет повысить жизнеспособность и снизить количественные потери микобактерий туберкулеза в исследуемом материале при диагностике туберкулеза.

Клинический пример.

Больной Л. 23 года. Поступил на лечение с диагнозом: спондилит L2-L3 позвонков неуточненной этиологии. Пациенту проведено хирургическое лечение - транспедикулярная фиксация L1-L4, биопсия из тел L2-3.

Полученный столбиковый биоптат направлен на комплексное исследование, а также столбик, указанный на рисунке 1, был обработан по разработанной технологии: деконтаминация при температуре окружающего воздуха 21°С и нормальном атмосферном давлении на протяжении 45 минут в среде 0,9%-ного озонированного раствора NaCl, нагретого до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин. Затем в обработке сделана паузу - 60 минут, во время которой исследуемый материал выдерживался в термостате при температуре 37°С с целью пророста возможных спор C.Albicans. После чего исследуемый материал повторно выдерживался на протяжении 45 минут в вышеуказанном озонированном физиологическом растворе NaCl, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин. Далее исследуемый материал центрифугирован при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочная жидкость использована для приготовления мазка с целью проведения люминесцентной микроскопии, осадок засеян поровну в первую и вторую пробирки с жидкой и плотной питательной средой соответственно.

Получен рост микобактерий туберкулеза: в первой пробирке на 17-е сутки, во второй на 21-е сутки. Признаков роста неспецифической микрофлоры не выявлено.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза из материала, получаемого во время биопсии или открытого доступа из пораженных органов (паренхиматозная, костная ткань). Способ предусматривает обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры при температуре окружающего воздуха 21°С и нормальном атмосферном давлении 0,9%-ным озонированным раствором NaCl, нагретым до температуры 21°С и непрерывно насыщаемым озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин. В озонированном растворе выдерживают исследуемый материал на протяжении 45 минут двукратно с паузой в 60 минут, во время которой исследуемый материал выдерживают в термостате при температуры 37°С. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность микобактерий туберкулеза и снизить их количественные потери в исследуемом материале при диагностике туберкулеза.

Способ выявления микобактерий туберкулеза из контаминированной ткани, включающий обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры, отделение осадка центрифугированием, посев осадка на жидкую питательную среду, отличающийся тем, что обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры производят при температуре окружающего воздуха 21°С и нормальном атмосферном давлении 0,9%-ным озонированным раствором NaCl, нагретым до температуры 21°С и непрерывно насыщаемым озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин, в котором выдерживают исследуемый материал на протяжении 45 минут двукратно с паузой в 60 минут, во время которой исследуемый материал выдерживают в термостате при температуре 37°С.