Способ культуральной диагностики инфицированности туберкулезом Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к способу лабораторной диагностики туберкулезной инфекции у носителей, больных легочной формой туберкулеза.

Известен способ посева биоматериала на плотную питательную среду Финн - II. Образец мокроты без добавления консервирующих средств хранится в холодильнике 48-72 часа. Для деконтаминации биоматериала в него добавляют активированный раствор NALC-NaOH и оставляют после перемешивания на 15 минут. Вносят фосфатный буфер, увеличивая объем образца и центрифугируют. Осадок промывают повторно фосфатным буфером. Условия посева стандартные. Характерно появление роста на 21-28 день; количество положительных результатов посева 23,3%; уровень контаминации 3,9%; отсутствие роста в 72,8% (1).

Недостатки способа - трудоемкость выполнения, отсроченный рост культуры, исключающий своевременное адресное назначение лечения пациенту с учетом чувствительности к препаратам.

Известен способ посева биоматериала на питательную среду Школьниковой. Хранение биологического материала, деконтаминация образца и процедура посева аналогичны приведенному выше способу. Отличием является состав жидкой питательной среды, включающей широкий спектр минеральных веществ - соли калия, натрия, включая цитрат, магния, железа, аспарагин, глицерин. Характерно появление роста, начиная со дня посева на 18-21 день; количество положительных результатов посева - 24,9%; уровень контаминации - 6,3%; отсутствие роста в 68,8% (2).

Недостатками способа являются большой интервал между посевом и появлением роста, высокий процент невысеваемости, высокий уровень контаминации, трудоемкость, сложность состава питательной среды.

Известен способ посева биоматериала на жидкую питательную среду MGJT. Питательная среда содержит модифицированную бульонную среду Мидцлбрука, полипептиды казеина, альбумин бычий, каталазу, декстрозу, олеиновую кислоту, полиоксиэтиленстеарат, полимиксин В, триметоприм, амфотерицин, азлоциллин, налидиксоновую кислоту. Методика обработки материала, деконтаминация образца, посев на питательную среду аналогичны приведенным ранее способам. Срок появления роста, начиная со дня посева 14-21 день; количество положительных результатов посева - 30,2%; уровень контаминации - 2,8%; отсутствие роста в 77% (3).

Недостатками способа является низкое количество положительных результатов, высокий процент отсутствия роста, что лежит в основе снижения эффективности лечения больных, так как не позволяет оценить чувствительность к противотуберкулезным препаратам и начать адресное лечение. Кроме того, многокомпонентность среды, наличие импортных добавок создает сложность в ее приготовлении.

Известен классический способ посева биоматериала на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена. Хранение биологического материала, деконтаминация образца и процедура посева аналогичны приведенным выше способам. Срок появления роста начиная со дня посева 21-28 дней; количество положительных результатов посева - 15,5%; уровень контаминации - 4,6%; отсутствие роста в 79,9% (4).

Недостатками данного способа являются отсроченный рост культуры, что откладывает и осложняет лечение пациента, т.к. через 28-30 дней превентивного лечения, не основанного на оценке чувствительности возбудителя к антибиотикам, развиваются мутации, обуславливающие устойчивость микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам. Характерно низкое количество положительных результатов, высокий процент отсутствия роста и контаминации. Данный способ принят за прототип

Целью изобретения является разработка культурального способа диагностики инфицированности легочной формой туберкулеза, обеспечивающего сокращение сроков получения положительного результата посева на плотной питательной среде, снижение контаминации сопутствующей микрофлорой.

Эта цель достигается тем, что нативную мокроту без применения консервантов подвергают быстрому замораживанию при температуре от -20 до -25°С и хранят при данной температуре от 16 до 24 часов; размораживают при комнатной температуре; после центрифугирования к оставшемуся осадку при перемешивании добавляют оксид железа в конечной концентрации 0,04 М в натрий фосфатном буфере 1 М, рН 6,8.

Техническим результатом заявляемого способа культуральной диагностики инфицированности туберкулезом является снижение контаминации мокроты сопутствующей микрофлорой, конкурирующей с микобактериями туберкулеза за нутриенты питательной среды и за счет этого препятствующая росту возбудителя туберкулеза. Кроме этого, сокращается время получения результата на 48-50% по сравнению с прототипом и аналогами за счет ускорения роста микобактерий, что позволяет во время определить чувствительность к антибиотикам и начать раннее адекватное лечение, а также имеет эпидемиологическое значение, так как позволяет ограничить контакты больного.

Технический результат достигается тем, замораживание и оттаивание являются деструктивными факторами, разрушающими хрупкие мембраны случайных граммположительных и граммотрицательных бактерий в мокроте. Микобактерии туберкулеза обладают капсулой, толстой многослойной клеточной стенкой, насыщенной липидами, что обеспечивает их механическую и осмотическую устойчивость и высокую гидрофобность, благодаря чему они не подвергаются разрушению при быстром замораживании и оттаивании при таких условиях. Результатом использования этого приема является получение практически монокультуры возбудителя туберкулеза с контаминацией 2,9-3,0%.

Добавление оксида железа в фосфатном буфере 1 М, рН 6,8 в конечной концентрации 0,04 М с последующим посевом на среду Левенштейна-Йенсена обуславливает обильный рост культуры уже на 12-14 день. Такое действие связано с тем, что ионы железа активируют ферменты, образуя комплекс с субстратом и активным центром, могут играть роль мощного акцептора электронов на определенной стадии каталитического цикла. Это лежит в основе участия его в клеточном дыхании, аккумуляции энергии. Железо является одним из основных микроэлементов, необходимых для роста и развития бактериальных клеток. Оно входит в состав гемов, сирогемов, Fe-S кластеров в составе многих оксидоредуктаз и ферментов некоторых других классов, является важнейшим переносчиком электронов. Установлено, что железо активирует рибонуклеотид-редуктазу, катализирующую образование восстановленных рибонуклеотидов, и таким образом участвует в биосинтезе нуклеиновых кислот. Этот элемент активирует деление и пролиферацию клеток, результатом чего является ускоренный обильный рост микобактерий.

Способ культуральной диагностики инфицированности туберкулезом реализуют следующим образом.

Собранную мокроту подвергают низкотемпературному воздействию путем быстрого замораживания при t=-20-25°С без применения консервантов и хранят при данной температуре 16-24 часа. Далее размораживают при комнатной температуре, обрабатывают 4% раствором едкого натрия, содержащим N-ацетил-L-цистеин. После 20-25 минутной экспозиции добавляют натрий фосфатный буфер 1 М, рН 6,8, затем центрифугируют при 3000-3100 g в течение 20-25 минут. Декантируют образец, супернатант отбрасывают и к оставшемуся осадку при перемешивании добавляют оксид железа в конечной концентрации 0,04 М в натрий фосфатном буфере рН 6,8, 1 М. Производят посев обработанного материала на классическую плотную среду Левенштейна-Йенсена.

Способ иллюстрируется клиническим примером.

Больная С., 16 лет, учащаяся 10 класса. Направлена в поликлинику туб. диспансера с жалобами на боли в области грудной клетки справа, покашливание, одышку при ходьбе, слабость, субфебрильную температуру.

Анамнез жизни: в возрасте 15 лет имела кратковременный квартирный контакт с больным активным туберкулезом, ВК-. Вакцинация БЦЖ в родильном доме, ревакцинация в 1 и 8 классе. В семье: родители, брат 2 года.

Объективно: состояние удовлетворительное, кожные покровы чистые. На левом плече 3 рубчика 5-6-4 мм. Периферические лимфоузлы не пальпируются. При перкуссии отмечается укорочение легочного звука справа от 4-го ребра, здесь же ослабленное дыхание. Тоны сердца ритмичные, пульс 96 в/мин, АД - 110/70 мм рт.ст. На обзорной рентгенограмме легких гомогенное интенсивное затемнение справа над диафрагмой, синус не дифференцируется. Сердечная тень в пределах нормы.

Собрана мокрота, которая обработана по предлагаемому способу. На двенадцатый день на поверхности появились шероховатые вкрапления цвета слоновой кости, прогрессивно увеличивающиеся в диаметре к 3 неделе. Уровень контаминации составил 2,9%. Проведена проба чувствительности возбудителя к антибиотикам, благодаря которым было назначено своевременное эффективное лечение пациентки рифампицином.

Способ культуральной диагностики инфицированности туберкулезом может широко использоваться в специальных лабораториях и фтизиатрических стационарах.

Источники информации

1. Основы биохимии Ленинджера, том 21 / Под ред. Нельсон Д. Кокс. М.: Издательство Бином, 2014. - 43 с.

2. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой С.М. - М.: Издательство Бином, 2010. - 1152 с.

3. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т. 1. Пер. с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. - М: Мир, 2005, - 656 с.

4. Приказ №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Метод приготовления питательных сред изложен в приложении №11, с. 266, с. 268, с. 270

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает следующее. Собранную мокроту подвергают быстрому замораживанию при температуре от -20 до -25°С без применения консервантов и хранят при данной температуре от 16 до 24 часов. Размораживают при комнатной температуре и обрабатывают 4% раствором едкого натрия, содержащим N-ацетил-L-цистеин в течение 20-25 минут. Добавляют натрий фосфатный буфер 1 М и центрифугируют при 3000-3100 g в течение 20-25 минут. Декантируют образец с отделением осадка. К осадку при перемешивании добавляют оксид железа в конечной концентрации 0,04 М в натрий фосфатном буфере 1 М, рН 6,8 и производят посев на питательную среду Левенштейна-Йенсена. Изобретение позволяет сократить сроки получения положительных результатов посевов на плотной питательной среде.

Способ культуральной диагностики инфицированности туберкулезом, включающий обработку нативной мокроты 4% раствором едкого натрия, содержащим N-ацетил-L-цистеин в течение 20-25 минут, добавление при перемешивании раствора натрий фосфатного буфера 1М, рН 6,8, центрифугирование при 3000-3100 g в течение 20-25 минут, суспендирование осадка в растворе натрий фосфатного буфера рН 6,8, 1М, посев на питательную среду Левенштейна-Йенсена, отличающийся тем, что нативную мокроту без применения консервантов подвергают быстрому замораживанию при температуре от -20 до -25°С и хранят при данной температуре от 16 до 24 часов; размораживают при комнатной температуре; после центрифугирования к оставшемуся осадку при перемешивании добавляют оксид железа в конечной концентрации 0,04 М в натрий фосфатном буфере 1М, рН 6,8.