СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для выявления микобактерий туберкулеза в патологическом материале от людей и животных.

Уже известен способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий обработку патологического материала серной, соляной, щавелевой кислотами или щелочами с последующим посевом на плотные питательные среды (1).

Известен также способ выявления микобактерий туберкулеза методом люминесцентной микроскопии (ЛЮМ), включающий обработку патологического материала в течение 20 - 24 часов раствором тринатрий фосфата, посев на плотную питательную среду с последующим изготовлением мазков и их окраской смесью аурамина и родамина по БОЮ (2, 3). Однако известный способ сложен в осуществлении, так как требует корректировки pH перед посевом патологического материала и перед изготовлением мазков для ЛЮМ. Кроме того, пары тринатрий фосфата раздражают дыхательные пути обслуживающего персонала, портят оборудование; а его раствор выщелачивает стеклянную посуду, делая ее непригодной к употреблению.

В качестве прототипа рассматривается способ выявления микобактерий туберкулеза методом посева и ЛЮМ, включающий использование для обработки посевного материала хлоргексидина биглюконикума в концентрации 0,05 - 0,2% в течение 20 - 24 ч (4).

Рассматриваемый способ-прототип достаточно эффективен, однако его использование ограничено, так как дезинфектант, используемый в способе-прототипе, слабо разрушает некротизированные ткани, что затрудняет выход из них в осадок микобактерий туберкулеза, а это отрицательно влияет на результативность посева и ЛЮМ.

Цель изобретения - повышение эффективности при упрощении и снижении трудоемкости способа.

Поставленная цель достигается тем, что посевной материал обрабатывают в течение 18 - 24 ч при 29 - 37^oC препаратом Пливасепт в концентрации 0,08%, который смешивают с ферментом имозимазой в соотношении 100:1, а pH смеси доводят введением натрия бикарбоната до 0,7 - 8,2.

Препарат "Пливасепт" 5% - нейтральный раствор с поверхностно-активным веществом для дезинфекции кожи и предметов выпускается фирмой "Плива-Загреб" Республики Хорватия. 100 мл раствора содержит 5 г хлоргексидина глюконата. Пливасепт 5% представляет собой слегка желтоватый раствор, оказывающий сильное бактерицидное действие на многие грамположительные и грамотрицательные бактерии. При приготовлении соответствующих разведений из жесткой воды поверхностно-активное вещество (оксиэтилированный жирный спирт) предотвращает образование осадка. Средство также способствует лучшему проникновению действующего вещества хлоргексидина в глубокие слои кожи в месте применения. Пливасепт 5% применяется в разведении с водой и этиловым спиртом в соответствующих концентрациях. Готовые водные разведения Пливасепта 5%, содержащие до 1% хлоргексидина глюконата, можно стерилизовать в автовклаве при 120^oC в течение 30 мин. Водные растворы можно готовить в стерильной воде.

Имозимаза (протеолитическая активность ПЕ/мл, 60) выпускается медико-биологическим центром научной фирмы "Биосиб" (Новосибирск) во флаконах, содержащих 10 мл фермента.

В соответствии с предлагаемым способом 1000 мл препарата "Пливасепт" в концентрации 0,08% смешивают с 10 мл фермента (содержимое 1 флакона), т.е. в соотношении 100:1 с доведением pH смеси введением натрия бикарбоната до 7,2 - 8,2 и ее последующим использованием для обработки патологического материала, который помещают в стерильные флаконы и заливают равным объемом смеси.

Новизна предлагаемого способа заключается в использовании для обработки посевного материала препарата Пливасепт в концентрации 0,08%, который смешивают с ферментом имозимазой с доведением pH смеси введением в нее натрия бикарбоната до 7,2 - 8,2. Фермент имозимаза длительно гидролизуют денатурированные белки патологического материала, оставляя микобактерии в жизнеспособном состоянии, что повышает результативность посева мокроты, а pH смеси и режимы обработки патологического материала являются оптимальными для действия фермента. В этом состоит новый технический результат, находящийся в причинно-следственной связи с существенным признаком. Существенный признак совпадает с отличительным.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят 0,08%-ный раствор препарата Пливасепт, который смешивают с ферментом имозимазой в соотношении 100:1. В полученную смесь вводят натрия бикарбонат до получения pH 7,2 - 8,2. Патологический материал помещают в стерильные флаконы, заливают равным объемом полученной смеси, гомогенизируют на встряхивателе и оставляют на 18 - 24 ч при 29 - 31^oC, высевают на плотную питательную среду. Посев и окраску мазков для ЛЮМ проводят без корректировки pH посевного материала.

Пример 1. Осуществление способа.

Раствор для обработки посевного материала готовят следующим образом: 16 мл препарата Пливасепт доливают дистиллированной водой до 1000 мл, смешивают с 10 мл фермента имозимазы и добавляют 5,0 г натрия бикарбоната, тщательно перемешивают. Мокроту, собранную в специальные флаконы, заливают равным объемом приготовленного раствора, гомогенизируют на встряхивателе и оставляют на 18 - 24 ч при 29 - 31^oC. Затем производят посев на плотную питательную среду, изготовление мазков, которые окрашивают для ЛЮМ смесью аурамина и родамина по БОЮ.

С 27.01.97 г. по 17.03.97 г. предлагаемым способом выявляли микобактерии туберкулеза в 2030 пробах мокроты от больных туберкулезом людей I группы диспансерного учета. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Подтверждение осуществимости способа.

Для обработки посевного материала 16 мл препарата Пливасепт доливают дистиллированной водой до 1000 мл и тщательно перемешивают. Мокроту, собранную в специальные флаконы, заливают равным объемом приготовленного препарата. Выявление микобактерий проводят, как в примере 1. Перед посевом и изготовлением мазка корректируют pH каждого образца. В таблице 2 приводятся результаты выявления микобактерий в 1100 образцах мокроты от больных туберкулезом людей I группы диспансерного учета.

В таблице 3 сравниваются результаты выявления микобактерий туберкулеза после обработки посевного материала препаратом Пливасепт (пример 2) и в соответствии с предлагаемым способом (пример 1).

Как видно из таблицы 3, предлагаемый способ обеспечивает сокращение (до 10,4% по сравнению с 23,8%) числа положительных находок методом ЛЮМ, неподтвержденных посевом.

Пример 3. Сравнительная эффективность предлагаемого и известного способов.

В таблице 4 приводятся результаты выявления микобактерий туберкулеза в 1286 образцах мокроты от больных туберкулезом людей I группы диспансерного учета и обработкой посевного материала хлоргексидином биглюконикумом в концентрации 0,05%. Перед посевом и изготовлением мазков корректируют pH каждого образца.

Из таблицы 4 видно, что предлагаемый способ значительно сокращает (до 10,4% по сравнению с 23,5%) число неподтвержденных посевом положительных выявлений микобактерий туберкулеза методом ЛЮМ. Кроме того, уменьшается число образцов, в мазках которых находят лишь единичные микробактерии, что значительно повышает информативность ЛЮМ. Наличие бактериальной массы обеспечивает изучение вида микобактерий и их лекарственной чувствительности. Проведенные исследования подтверждают эффективность предлагаемого способа. Так, сочетание положительных находок методом посева и методом ЛЮМ составляет в предлагаемом способе 62,8% по сравнению с 54,0% в известном способе.

Источники информации, принятые во внимание:
1. Туберкулез сельскохозяйственных животных /Под ред. В.П. Шишкова и В. П. Урбана - М.: Агропромиздат, 1991, с. 114 и 115.

2. О повышении качества ЛЮМ при исследовании патологического материала для обнаружения микобактерий туберкулеза. Методические рекомендации Минздрава СССР, - 18.10.89, N 21-08/11-297.

3. Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза. - М.: 1992.

4. Использование ЛЮМ для диагностики бактериовыделения у больных туберкулезом. Методические рекомендации Минздрава РСФСР и НИИтуберкулеза. - М.: 1981.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для выявления микробактерий туберкулеза. Способ основан на обработке патологического материала и его посеве на плотную питательную среду. Патологический материал перед посевом обрабатывают препаратом "Пливасепт" концентрацией 0,08 %, смешанным ферментом имозимазой в соотношении 100:1 соответственного доведением рН смеси введением натрия бикарбоната до 7,2-8,2. Обработку проводят в течение 18-24 ч при 29-31^oC при равных объемных соотношениях материала и смеси. Способ позволяет снизить число неподтвержденных посевом выявлений микобактерий туберкулеза методом ЛЮМ, уменьшить число образцов, в мазках которых находят лишь единичные микобактерии туберкулеза. 4 табл.

Способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий обработку патологического материала и его посев на плотную питательную среду, отличающийся тем, что обработку патологического материала осуществляют препаратом "Пливасепт" концентрацией 0,08%, смешанным с ферментом имозимазой в соотношении 100 : 1 соответственно с доведением pH смеси введением натрия бикарбоната до 7,2 - 8,2, причем патологический материал обрабатывают указанной смесью в равных объемах в течение 18 - 24 ч при 28 - 31^oС.