ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущества по предварительной заявке на патент США №62/066,862, поданной 21 октября, 2014 г., и предварительной заявке на патент США №62/215,433, поданной 8 сентября, 2015 г., каждая из которых включена посредством ссылки для любых целей.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам для лечения рака, такого как меланома, или его метастазов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Для лечения различных онкологических заболеваний было разработано множество лекарственных средств или потенциальных лекарственных средств, в том числе ряд низкомолекулярных соединений. Однако существующие способы лечения многих видов онкологий не являются высокоэффективными у пациентов, имеющих определенный подтип ракового заболевания, или указанные способы являются в целом чрезмерно токсичными или чрезмерно токсичными для таких пациентов.
Рак кожи представляет собой наиболее распространенную форму онкологического заболевания в Соединенных Штатах. В 2007 г., по оценке Американского онкологического общества, приблизительно 8110 случаев смерти было обусловлено меланомой; при этом, по оценкам, еще 59940 случаев меланомы должно быть диагностировано в данной стране.
Меланома представляет собой злокачественную меланоцитарную опухоль, обнаруживаемую преимущественно в коже, однако данная опухоль может быть обнаружена также в кишечнике и в глазу (увеальная меланома). Эта опухоль представляет собой один из более редких типов рака кожи, однако им обусловлена бόльшая часть связанных с раком кожи случаев смерти.
Доступные в настоящее время способы лечения включают хирургическое удаление опухоли; адъювантную терапию; химио- и иммунотерапию, или лучевую терапию. Метастазы первичной опухоли меланомы являются в особенности опасными. При этом в данной области техники сохраняется потребность в усовершенствованных способах лечения меланомы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением предложены композиции и способы для лечения рака или комбинации раковых заболеваний разного типа у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой млекопитающее. Согласно некоторым вариантам реализации указанное млекопитающее представляет собой человека.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество первого иммуностимулятора и второго иммуностимулятора субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации указанный первый иммуностимулятор представляет собой пептид тимозина-альфа. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой соединение, отличное от ИЛ-2, интерферона-(или IRX-2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор содержит специфическое иммуностимулирующее средство. Согласно определенному варианту реализации указанный второй иммуностимулятор содержит неспецифическое иммуностимулирующее средство.
Согласно определенному варианту реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой иммуностимулирующее средство, эффективное при лечении сепсиса. Согласно определенному варианту реализации указанное иммуностимулирующее средство содержит гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), ингибиторы белка запрограммированной гибели клеток-1 (PD-1) и/или интерлейкин-7 (ИЛ-7).
Согласно определенному варианту реализации указанная композиция дополнительно содержит дополнительный противораковый агент.Согласно некоторым вариантам реализации указанный дополнительный противораковый агент представляет собой химиотерапевтический агент.
Согласно определенному варианту реализации указанный второй иммуностимулятор вводят указанному субъекту в дозировке, составляющей приблизительно от 0,01 до приблизительно 1000 мг/сутки.
Согласно определенному варианту реализации указанный второй иммуностимулятор содержит ГМ-КСФ, и дозировка ГМ-КСФ составляет приблизительно от 10 до 500 мкг/м2, например, приблизительно от 125 до приблизительно 250, от 10 до 500 мкг/м2.
Согласно определенному варианту реализации указанный второй иммуностимулятор содержит ингибитор PD-1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор PD-1 представляет собой агент, который ингибирует PD-1, такой как антитело к PD-1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор PD-1 представляет собой агент, который ингибирует лиганд PD-1, такой как антитело к лиганду PD-1. Согласно определенному варианту реализации дозировка ингибитора PD-1 составляет приблизительно от 0,1 до 10 мг/кг, например, приблизительно 1-5 мг/кг, или приблизительно 2-3 мг/кг.Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор PD-1 представляет собой антитело к PD-L1, и дозировка составляет приблизительно 15-20 мг/кг.Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело к PD-L1 применяют в постоянной дозе, составляющей 1200 мг, каждые две, три или четыре недели.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор содержит интерлейкин, который не является ИЛ-2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерлейкин представляет собой ИЛ-7. Согласно определенному варианту реализации дозировка ИЛ-7 составляет приблизительно от 0,1 до 100 мкг/кг, например, приблизительно от 1 до 50 мкг/кг, или приблизительно от 3 до 30 мкг/кг.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептид тимозина-альфа вводят субъекту в течение по меньшей мере части периода лечения в дозировке, находящейся в пределах диапазона от приблизительно 0,1 до 100 мг/сутки, например, приблизительно 0,5-50 мг/сутки, или приблизительно 0,1-10 мг/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептид тимозина-альфа представляет собой тимозин-альфа-1 (TA1).
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают введение TA1 ежедневно на протяжении периода, составляющего приблизительно 1-10 дней, после чего на протяжении приблизительно 1-5 дней TA1 не вводят.Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят ежедневно на протяжении приблизительно 3-5 дней, после чего на протяжении приблизительно 2-4 дней TA1 не вводят.Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят ежедневно на протяжении приблизительно 4 дней, после чего на протяжении приблизительно 3 дней TA1 не вводят.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают введение ингибитора киназы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор киназы содержит сорафениб. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор киназы вводят указанному пациенту в дозировке, находящейся в пределах диапазона приблизительно от 10 до 200 мг/кг/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают введение антинеопластического активатора апоптоза при тепловом шоке (HSAA). Согласно некоторым вариантам реализации указанный HSAA содержит STA-4783 (элескломол). Согласно некоторым вариантам реализации указанный HSAA вводят указанному пациенту в дозировке, находящейся в пределах диапазона приблизительно от 0,01-100 мг/кг/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают введение ингибитора ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами антигена 4 (CTLA4), такого как антитело против CTLA4. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело против CTLA4 включает 9H10, MDC010, 1F4, BNI3, Q01, A01, M08, 1B8, WKH203, ab9984, ab13486, ипилимумаб, тицилимумаб или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело к CTLA4 вводят указанному пациенту в дозировке, находящейся в пределах диапазона приблизительно от 0,001 до 50 мг/кг/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают введение алкилирующего антинеопластического агента (AlkAA). Согласно некоторым вариантам реализации указанный алкилирующий антинеопластический агент (AlkAA) содержит дакарбазин (DTIC). Согласно некоторым вариантам реализации указанный алкилирующий антинеопластический агент (AlkAA) вводят указанному пациенту в дозировке, находящейся в пределах диапазона приблизительно от 700 до 1300 мг/кг/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают введение субъекту химиотерапевтического агента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный химиотерапевтический агент представляет собой дакарбазин (DTIC) или цисплатин.
Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой меланому.
В соответствии с настоящим изобретением также предложены способы лечения рака или его метастаза у субъекта, включающие введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество иммуностимулятора, при этом указанный иммуностимулятор эффективен при лечении сепсиса. Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой меланому. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой млекопитающее. Согласно некоторым вариантам реализации указанное млекопитающее представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанное иммуностимулирующее средство, эффективное при лечении сепсиса, содержит гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), ингибиторы белка запрограммированной гибели клеток-1 (PD-1) и/или интерлейкин-7 (ИЛ-7), или любую их комбинацию.
Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция дополнительно содержит дополнительный противораковый агент.Согласно некоторым вариантам реализации указанный дополнительный противораковый агент представляет собой пептид тимозина-альфа. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептид тимозина-альфа представляет собой тимозин-альфа-1(TA1).
Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ дополнительно включает введение субъекту химиотерапевтического агента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный химиотерапевтический агент представляет собой дакарбазин (DTIC) или цисплатин.
В соответствии с настоящим изобретением также предложены способы определения восприимчивости субъекта-человека к лечению ракового заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой меланому. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают определение уровня активности одного или большего числа биомаркеров в биологическом образце, полученном от субъекта-человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанные биомаркеры выбраны из группы, состоящей из ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10. Согласно некоторым вариантам реализации лечение ракового заболевания проводят в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.
Согласно некоторым вариантам реализации уровень активности ИЛ-1β, превышающий нормальный, указывает на восприимчивость указанного субъекта-человека к лечению.
Согласно некоторым вариантам реализации уровень активности ИЛ-4 ниже нормального указывает на восприимчивость указанного субъекта-человека к лечению.
Согласно некоторым вариантам реализации уровень активности ИЛ-6, превышающий нормальный, указывает на восприимчивость указанного субъекта-человека к лечению.
Согласно некоторым вариантам реализации активности уровень ИЛ-10, превышающий нормальный, указывает на восприимчивость указанного субъекта-человека к лечению.
В соответствии с настоящим изобретением также предложены способы определения дозировки или схемы для лечения ракового заболевания у субъекта-человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой меланому. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают определение уровня активности одного или большего числа биомаркеров в биологическом образце, полученном от субъекта-человека, получающего лечение. Согласно некоторым вариантам реализации указанные биомаркеры выбраны из группы, состоящей из ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10.
Согласно некоторым вариантам реализации пониженный уровень активности ИЛ-1(после лечения указывает на эффективность указанного лечения. Согласно некоторым вариантам реализации неизменный или повышенный уровень активности ИЛ-1(после лечения указывает на неэффективность указанного лечения. Дозировки или схемы лечения могут быть соответствующим образом модифицированы.
Согласно некоторым вариантам реализации повышенный уровень активности ИЛ-4 после лечения указывает на восприимчивость указанного субъекта-человека к лечению. Согласно некоторым вариантам реализации неизменный или пониженный уровень активности ИЛ-4 после лечения указывает на неэффективность указанного лечения. Дозировки или схемы лечения могут быть соответствующим образом модифицированы.
Согласно некоторым вариантам реализации пониженный уровень активности ИЛ-6 после лечения указывает на эффективность указанного лечения. Согласно некоторым вариантам реализации неизменный или повышенный уровень активности ИЛ-6 после лечения указывает на неэффективность указанного лечения. Дозировки или схемы лечения могут быть соответствующим образом модифицированы.
Согласно некоторым вариантам реализации пониженный уровень активности ИЛ-10 после лечения указывает на эффективность указанного лечения. Согласно некоторым вариантам реализации неизменный или повышенный уровень активности ИЛ-10 после лечения указывает на неэффективность указанного лечения. Дозировки или схемы лечения могут быть соответствующим образом модифицированы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1A представлен противоопухолевый эффект цисплатина при лечении в модели меланомы B16F10 на мышах исходя из оценки объема опухоли после инокуляции опухоли.
На Фиг. 1B представлены изменения массы тела мышей в модели меланомы B16F10 на мышах после инокуляции опухоли при лечении либо носителем, либо цисплатином.
На Фиг. 2 представлена противоопухолевая активность тимозина. Животные с происходящей из B16F10 опухолью получали лечение Задаксином (ZADAXIN™, тимальфазин). При всех протестированных дозах у животных наблюдалось уменьшение роста опухоли по сравнению с получавшей носитель группой.
На Фиг. 3 представлена противоопухолевая активность для нескольких различных доз тимозина. Все протестированные дозы тимозина обеспечивали статистически значимое уменьшение роста опухоли по сравнению с получавшей носитель группой.
На Фиг. 4A представлена оценка ИЛ-1(в модели подкожной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6, получавших лечение тимозином. Задаксин((тимальфазин) вводили мышам подкожно 2 раза в сутки в течение 6 дней в дозе 0,02, 0,06, 0,2, 0,3, 2 или 6 мг/кг 10 мкл/г.Уровни ИЛ-1(были ниже в получавших лечение Задаксином((тимальфазином) группах по сравнению с получавшими носитель группами на 4 и 7 дни (D4 и D7) после начала дозирования.
На Фиг. 4B представлена оценка ИЛ-4 в модели подкожной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6, получавших лечение тимозином. Задаксин((тимальфазин) вводили мышам подкожно 2 раза в сутки в течение 6 дней в дозе 0,02, 0,06, 0,2, 0,3, 2 или 6 мг/кг 10 мкл/г.Уровни ИЛ-4 были выше в получавших лечение Задаксином((тимальфазином) группах по сравнению с получавшими носитель группами в дни D4 и D7 после начала дозирования.
На Фиг. 4C представлена оценка ИЛ-6 в модели подкожной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6, получавших лечение тимозином. Задаксин((тимальфазин) вводили мышам подкожно 2 раза в сутки в течение 6 дней в дозе 0,02, 0,06, 0,2, 0,3, 2 или 6 мг/кг 10 мкл/г.Уровни ИЛ-6 были ниже в получавших лечение Задаксином((тимальфазином) группах по сравнению с получавшими носитель группами в дни D4 и D7 после начала дозирования.
На Фиг. 4D представлена оценка ИЛ-10 в модели подкожной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6, получавших лечение тимозином. Задаксин((тимальфазин) вводили мышам подкожно 2 раза в сутки в течение 6 дней в дозе 0,02, 0,06, 0,2, 0,3, 2 или 6 мг/кг 10 мкл/г.Уровни ИЛ-10 были ниже в получавших лечение Задаксином((тимальфазином) группах по сравнению с получавшими носитель группами в дни D4 и D7 после начала дозирования.
На Фиг. 4E представлена оценка ИФН-гамма в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4F представлена оценка ИЛ-1(в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4G представлена оценка ИЛ-4 в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4H представлена оценка ИЛ-5 в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4I представлена оценка ИЛ-6 в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4J представлена оценка ИЛ-10 в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4K представлена оценка ИЛ-12 в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 4L представлена оценка ФНО-(в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения.
На Фиг. 5 представлена модель меланомы B16F10 на мышах с метастазами в легкие и дизайн эксперимента. Клетки меланомы B16F10 инокулировали мышам на 0 день.
На Фиг. 6A представлено группированное распределение метастазов в легкие на 16 день у мышей, получавших носитель, только тимозин, только анти-PD-1, тимозин плюс анти-PD-1, или циклофосфамид.
На Фиг. 6B представлено среднее групповое значение изменения массы тела в процентах с 1 дня у мышей B16MET, получавших носитель, только тимозин, только анти-PD-1, тимозин плюс анти-PD-1, или циклофосфамид.
На Фиг. 7A представлено группированное распределение метастазов в легкие на день 15 у мышей, получавших носитель, только тимозин, только анти-PD-1, тимозин плюс анти-PD-1, или циклофосфамид в разных дозах.
На Фиг. 7B представлена оценка ИЛ-1(в модели меланомы B16F10 на мышах с метастазами в легкие после лечения носителем, только тимозином, только анти-PD-1, тимозином плюс анти-PD-1, или циклофосфамидом в разных дозах.
На Фиг. 7C представлено среднее групповое значение изменения массы тела в процентах с 1 дня у мышей B16F10, получавших носитель, только тимозин, только анти-PD-1, тимозин плюс анти-PD-1, или циклофосфамид.
На Фиг. 8 показаны очаги метастазов в легкие в разных группах на 13 день после инокуляции опухоли при лечении носителем, только тимозином, только анти-PD-1, тимозином плюс анти-PD-1, или циклофосфамидом.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам лечения и/или предотвращения ракового заболевания у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой меланому или ее метастазы. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают введение субъекту композиции, содержащей по меньшей мере один иммуностимулятор.
Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы могут применяться при лечении раковых заболеваний на ранних стадиях, в том числе новообразований на ранних стадиях, которые могут быть небольшими, медленно растущими, локализованными и/или неагрессивными, например, с целью излечения заболевания или стимуляции регрессии рака, а также при лечении раковых заболеваний промежуточных и поздних стадий. в том числе распространенных и/или метастатических и/или агрессивных новообразований, например, для замедления прогрессирования заболевания, для уменьшения метастазирования или для повышения выживаемости пациента. Аналогичным образом, указанные комбинации могут применяться при лечении низко злокачественных раковых заболеваний, раковых заболеваний средней степени злокачественности и/или высоко злокачественных раковых заболеваний.
Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы могут также применяться при лечении индолентных раковых заболеваний, рецидивирующих раковых заболеваний, в том числе местно-рецидивирующих, отдаленно-рецидивирующих и/или рефрактерных раковых заболеваний (т.е. раковых заболеваний, не отвечавших на лечение), метастатических раковых заболеваний, местно-распространенных раковых заболеваний и агрессивных раковых заболеваний. Соответственно, «распространенный» рак включает местно-распространенный рак и метастатический рак и относится к заболеванию с явной клинической картиной у пациента, отличающемуся тем, что такое заболевание с явной клинической картиной не поддается местному лечению, например, хирургическому лечению или радиационной терапии. Термин «метастатический рак» относится к раковому заболеванию, распространяющемуся из одной части организма в другие. Распространенные раковые заболевания могут также быть неоперабельными, то есть распространяться на окружающие ткани с невозможностью удаления хирургическим путем.
Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы могут также применяться при лечении лекарственно-устойчивых раковых заболеваний, в том числе опухолей с множественной лекарственной устойчивостью. Как известно в данной области техники, устойчивость раковых клеток к химиотерапии представляет собой одну из центральных проблем при ведении раковых заболеваний.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что многие из указанных категорий могут перекрываться, например, агрессивные раковые заболевания, как правило, также являются метастатическими. «Агрессивный рак» в настоящем документе относится к быстрорастущим раковым образованиям. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в случае некоторых раковых заболеваний, таких как рак молочной железы или рак предстательной железы, термин «агрессивный рак» относится к распространенному раку, рецидивировавшему примерно в течение первых двух третей диапазона безрецидивных периодов для конкретного ракового заболевания, тогда как для других типов раковых заболеваний практически во всех случаях наблюдаются быстрорастущие раковые образования, считающиеся агрессивными. Термин, таким образом, может охватывать подвид определенного типа раковых заболеваний или может включать все другие типы раковых заболеваний.
Согласно некоторым вариантам реализации раковых заболеваний, для лечения которых могут применяться способы согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, СПИД-ассоциированные раковые заболевания, рак коры надпочечников, рак анального канала, рак мочевого пузыря, рак ободочной и прямой кишки, рак головного мозга и ЦНС, рак молочной железы, карциноидный рак, рак шейки матки, хондросаркому, хориокарцинома, колоректальный рак, эндокринный рак, рак эндометрия, саркома Юинга, рак глаза, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочеполовой системы, глиому, гинекологический рак, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, болезнь Ходжкина, гипофарингиальный рак, рак островковых клеток, саркому Капоши, рак почки, рак гортани, лейкоз, рак печени, рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого), лимфому, меланому, базально-клеточную карциному, мезотелиому, миелому, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак гипофиза, почечноклеточный рак, рак предстательной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, рак кожи, плоскоклеточную карциному, рак желудка, рак яичка, рак вилочковой железы, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак, трофобластический рак, рак матки, рак влагалища, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильма и лейкоз.
В соответствии со способами согласно настоящему изобретению, термин «субъект» и его варианты в настоящем документе включают любого субъекта, у которого имеется или предположительно имеется заболевание или состояние, или существует риск заболевания или состояния. Подходящие субъекты (или пациенты) включают млекопитающих, такие как лабораторные животные (например, мышь, крыса, кролик, морская свинка), сельскохозяйственные животные и домашние животные или животные-компаньоны (например, кошка, собака). Включены не являющиеся людьми приматы и, предпочтительно, пациенты-люди. У субъекта, у которого «существует риск», может присутствовать или отсутствовать детектируемое заболевание, и может наблюдаться или не наблюдаться детектируемое заболевание до применения способов диагностики или лечения, описанных в настоящем документе. «Существующий риск» означает, что у субъекта имеется один или большее число так называемых факторов риска, которые являются измеряемыми параметрами, коррелирующими с развитием описанного в настоящем документе состояния, которые описаны в настоящем документе. При наличии у субъекта одного или большего числа указанных факторов риска, вероятность развития у него состояния, описанного в настоящем документе, выше чем у субъекта, у которого отсутствует(ют) указанный(ые) фактор(ы) риска. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой млекопитающее. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой человека, у которого диагностирована меланома. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой человека, у которого, предположительно, имеется меланома. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой человека, у которого имеется высокий риск развития меланомы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой пациента, страдающего меланомой с метастазами. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой пациента, страдающего меланомой с высоким риском метастазирования.
Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы используют при лечении меланомы. Согласно некоторым вариантам реализации меланома выбрана из злокачественного лентиго, меланомы типа злокачественного лентиго, поверхностной распространяющейся меланомы, акральной лентигинозной меланомы, меланомы слизистых оболочек, нодулярной меланомы, полипоидной меланомы, десмопластической меланомы, амеланотической меланомы, меланомы мягких тканей, меланомы с мелкими невусоподобными клетками, меланомы с признаками эпителиоидного невуса, увеальной меланомы или их комбинаций.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный пациент-человек страдает меланомой стадии 0, I, II, III или IV, или соответствующих подстадий. Согласно определенным вариантам реализации меланома, лечение которой проводится, представляет собой злокачественную метастатическую меланому. Согласно определенным вариантам реализации меланома, лечение которой проводится, представляет собой меланому стадии I, стадии II, стадии III или стадии IV. Согласно другим вариантам реализации меланома, лечение которой проводится, представляет собой меланому стадии M1a, M1b или M1c. Подробную информацию о стадировании можно найти в источнике: Balch et al. (2001, "Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma". J Clin Oncol 19 (16): 3635-48. PMID 11504745), включенный полностью посредством ссылки.
Согласно некоторым вариантам реализации у пациента-человека присутствует один или большее число ранних признаков меланомы, например, изменения формы или цвета существующих родимых пятен, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, асимметричность, границы неправильной формы, неоднородность цвета, диаметр, превышающий приблизительно 6 мм, изменения с течением времени, зуд, изъязвление или кровоточивость. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пациент-человек страдает нодулярной меланомой, и ранние признаки включают, не ограничиваясь перечисленными, появление где-либо на коже нового узелка, приподнятого над поверхностью кожи, твердого на ощупь, и непрерывный рост.
Метастазирование, или метастатическое заболевание, представляет собой распространение ракового заболевания из одного органа в другие. Некоторые раковые клетки приобретают способность к проникновению через стенки лимфатических и/или кровеносных сосудов, после чего они могут переноситься с кровотоком в другие участки и ткани организма. После остановки опухолевых клеток в другом участке они вновь проникают в сосуд или стенки и продолжают размножаться, в результате формируя еще одну клинически детектируемую опухоль.
Согласно некоторым вариантам реализации указанная меланома представляет собой злокачественную метастатическую меланому. Согласно некоторым вариантам реализации метастатическая меланома вызывает у пациента неспецифические паранеопластические симптомы, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, снижение аппетита, тошноту, рвоту и утомляемость. Согласно некоторым вариантам реализации у пациента присутствуют метастазы в головной мозг. Согласно некоторым вариантам реализации меланома распространяется в печень, кости, брюшную полость и/или отдаленные лимфатические узлы.
Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта, подлежащего лечению, имеется высокий риск развития меланомы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект-человек представляет собой представителя белой европеоидной расы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пациент-человек живет в солнечном климате с интенсивным воздействием УФ-излучения. Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта, подлежащего лечению, имеется одна или большее количество генетических мутаций, которые повышают подверженность меланоме. Согласно некоторым вариантам реализации это генетические мутации BRAF, MC1R, CDKN2A, CDK4, ферментов эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) (заболевание, также известное как пигментная ксеродерма, ПК), супрессора множественных опухолей 1 (MTS1) и/или MDM2.
Хорошо известны способы диагностики меланомы, например, описанные в публикации Wurmand Soyer (октябрь 2010 г., «Scanning for melanoma». Australian Prescriber (33): 150-5), включенной в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации указанная диагностика проводится посредством виртуальный осмотр. Согласно некоторым вариантам реализации диагностику проводят с применением рентгеновского излучения, КТ-сканирования, МРТ, ПЭТ и ПЭТ/КТ, ультразвука, теста ЛДГ и/или фотоакустической детекции.
После диагностирования меланомы могут проводиться дополнительные тесты для определения распространения раковых клеток в коже или других частях организма. Тесты включают, не ограничиваясь перечисленными, физическое обследование и анамнез, картирование лимфатических узлов и сигнальный лимфатический узел биопсия, КТ-сканирование, ПЭТ-сканирование, МРТ и биохимический анализ крови.
Термины «лечить» и «лечение» в настоящем документе относятся к способу получения благоприятных или требуемых результатов, в том числе клинических результатов, и могут включать даже минимальные изменения или улучшения, относящиеся к одному или большему числу измеряемых маркеров заболевания или состояния, лечение которого проводится. Лечение обычно эффективно уменьшает по меньшей мере один симптом состояния, заболевания, расстройства, повреждение или поражения. Примеры маркеров клинического улучшения очевидны для специалистов в данной области техники. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленными, что-либо одно или более из следующего: уменьшение тяжести и/или частоты одного или большего числа симптомов, обусловленных указанным заболеванием, уменьшение степени заболевания, стабилизация заболевания (например, предотвращение или задержка усугубления заболевания), задержка или замедление прогрессирования заболевания, облегчение болезненного состояния, уменьшение дозы одного или большего числа других медикаментов, необходимых для лечения заболевания, и/или повышение качества жизни, и т.п.
«Профилактика», «профилактическое лечение», или «лечение с целью предотвращения» относится к предотвращению или уменьшению частоты появления или тяжести одного или большего числа симптомов и/или их первопричины, например, предотвращение заболевания или состояния у субъекта, подверженного развитию заболевания или состояния (например, при наличии более высокого риска, обусловленного генетической предрасположенностью, факторами окружающей среды, предрасполагающими заболеваниями или расстройствами, или т.п).
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества и/или профилактически эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один иммуностимулирующее средство. Термин «терапевтически эффективное количество» в настоящем документе относится к уровню или количеству одного или большего числа агентов, необходимому для лечения состояния, или уменьшения или предотвращения повреждения или поражения, необязательно без сопутствующих значимых негативных или нежелательных побочных эффектов. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству агента, достаточному для предотвращения или уменьшения тяжести будущего заболевания или состояния при введении субъекту, который, предположительно, подвержен заболеванию или состоянию и/или у которого может развиться заболевание или состояние.
Иммуностимуляторы, также известные как иммуностимулирующие средства, или иммуностимулирующие вещества, относятся к веществам, которые стимулируют иммунную систему. Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимуляторы согласно настоящему изобретению могут индуцировать активацию или повышать активность одного или большего числа позитивные регуляторы иммунной системы. Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимуляторы согласно настоящему изобретению могут индуцировать дезактивизацию или понижать активность одного или большего числа негативные регуляторы иммунной системы. В настоящем документе термин «активность» относится к активности определенной мишени на уровне геномной ДНК, уровне транскрипции, на посттранскрипционном уровне, на уровне трансляции, на посттрансляционном уровне, включая, но не ограничиваясь перечисленными, число копий гена, уровень транскрипции мРНК, копийность мРНК, стабильность мРНК, скорость трансляции белка, стабильность белка, модификация белка, активность белка, активность белковых комплексов и т.п.Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулятор может представлять собой специфическое иммуностимулирующее средство. Специфические иммуностимуляторы представляют собой вещества, которые обеспечивают антигенную специфичность при иммунном ответе, такие как вакцины или антигены. Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулятор может представлять собой неспецифическое иммуностимулирующее средство. Неспецифические иммуностимулирующие средства действуют безотносительно антигенной специфичности, повышая иммунный ответ на другие антигены, или стимулируют компоненты иммунной системы без антигенной специфичности, как, например, адъюванты. Иммуностимулятор для применения в способах согласно настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный, синтетический, природный состав, или их комбинации.
Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одно иммуностимулирующее средство является эффективным при лечении сепсиса.
Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одно иммуностимулирующее средство представляет собой пептид тимозина (тимозины). Тимозины представляют собой небольшие белки, которые присутствуют во многих тканях у животных. Первоначально тимозины были выделены из тимуса (вилочковой железы), однако в настоящее время известно, что большинство тимозинов присутствуют во многих других тканях. Согласно настоящему документу тимозины включают тимозин α, тимозин β, тимозин (и их функциональные варианты. Согласно определенным вариантам реализации указанный тимозин представляет собой тимозин-альфа (или альфа-тимозин). Согласно определенным вариантам реализации указанный тимозин представляет собой протимозин-альфа (PTMA). Согласно определенным вариантам реализации указанный тимозин представляет собой тимозин-альфа-1(«TA1», также известный как тимозин-альфа-1, тимозин a-1, тимозин α-1 или тимозин-альфа) и его функциональные варианты, отличающиеся структурной гомологией в отношении TA1. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 представляет собой пептид с последовательностью аминокислот (N-ацетил)-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (SEQ ID NO: 1). Последовательность аминокислот TA1 раскрыта в патенте США 4079137, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. TA1 представляет собой негликозилированный пептид длиной 28 аминокислот с ацетилированным N-концом, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 3108. Согласно некоторым вариантам реализации используют синтетический вариант TA1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный синтетический вариант TA1 коммерчески доступен в некоторых странах под торговым наименованием Задаксин (тимальфазин). В настоящем документе термин TA1 также относится к функциональным вариантам или фрагментам, полученным из SEQ ID NO: 1.
Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере один иммуностимулятор представляет собой тимозин-альфа-1(TA1). Пептиды тимозина-альфа включают пептиды тимозина-альфа-1(TA1), в том числе встречающийся в природе TA1, а также синтетический TA1 или рекомбинантный TA1 с последовательностью аминокислот встречающегося в природе TA1, с последовательностью, по существу идентичной последовательностям встречающегося в природе TA1, или форму с сокращенной последовательностью, и их биологически активные аналоги, содержащие замещенные последовательности, последовательности с удалениями, удлинениями, заменами, или модифицированные иным образом последовательности, обладающие биологической активностью, по существу аналогичной биологической активности TA1, например, происходящий из TA1 пептид, отличающийся достаточно гомологичной TA1 аминокислотной последовательностью чтобы функционировать по существу идентичным TA1 образом, проявляя по существу идентичную ТА1 активность. Подходящие дозировки пептида тимозина-альфа могут находиться в пределах диапазона от приблизительно 0,001 до 10 мг/кг/сутки. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 имеет последовательность аминокислот, раскрытую в патенте США №4079137, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. TA1, изначально выделенный из фракции 5 тимозина (TF5), был секвенирован и химически синтезирован. TA1 представляет собой пептид размером 28 аминокислот с молекулярной массой, составляющей 3108.
Согласно некоторым вариантам реализации эффективные количества пептида тимозина-альфа представляют собой количества, которые могут представлять собой единицы дозирования в диапазоне, соответствующем приблизительно 0,01-20 мг TA1, приблизительно 1-10 мг TA1, приблизительно 2-10 мг TA1, приблизительно 2-7 мг TA1, или приблизительно 3-6,5 мг TA1, и могут включать приблизительно 1,6, 3,2 или 6,4 мг TA1, или приблизительно 3,2 или 6,4 мг TA1. Единица дозирования может вводиться один раз в сутки или несколько раз в сутки. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от приблизительно 0,5 до 10 мг/сутки. Согласно определенным вариантам реализации дозировка TA1 находится в пределах диапазона от приблизительно 1,5 до 7 мг/сутки, или в пределах диапазона от приблизительно 1,6 до 6,4 мг/сутки. Согласно определенным вариантам реализации дозировка TA1 находится в пределах диапазона от приблизительно 1,7 до 10 мг/сутки, от приблизительно 1,7 до 7 мг/сутки, или от приблизительно 3 до 7 мг/сутки. Согласно некоторым вариантам реализации эффективные дозировки включают приблизительно 1,6, 3,2 или 6,4 мг/сутки. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят субъекту в дозировке, составляющей от приблизительно 0,01 до приблизительно 6 мг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят субъекту один раз в сутки, 2 раза в сутки, три раза в сутки, четыре раза в сутки или более. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят субъекту отдельно или в сочетании с одним или большим числом дополнительных иммуностимуляторов.
Пептиды TA1 включают встречающийся в природе TA1, а также синтетический TA1 или рекомбинантный TA1 с последовательностью аминокислот встречающегося в природе TA1, последовательностью аминокислот, по существу аналогичной ему, или форму с сокращенной последовательностью, и их биологически активные аналоги, содержащие замещенные последовательности, последовательности с удалениями, удлинениями, заменами, или модифицированные иным образом последовательности, обладающие биологической активностью, по существу аналогичной биологической активности TA1, например, происходящий из TA1 пептид, отличающийся достаточно гомологичной TA1 аминокислотной последовательностью, чтобы функционировать по существу идентичным TA1 образом, проявляя по существу идентичную ТА1 активность. Согласно некоторым вариантам реализации подходящие дозировки тимозина могут находиться в пределах диапазона от приблизительно 0,001 до 10 мг/кг/сутки, например, составлять 0,001; 0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 или более мг/кг/сутки. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 имеет последовательность аминокислот, раскрытую в патенте США №4079137, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
TA1, изначально выделенный из фракции 5 тимозина (TF5), был секвенирован и химически синтезирован. TA1 представляет собой пептид длиной 28 аминокислот, имеющий молекулярную массу, составляющую 3108. Термин «TA1» также включает функциональные варианты и функциональный фрагмент TA1, встречающийся в природе, синтетический или рекомбинантный тимозин. TA1 был изначально выделен из бычьей вилочковой железы, где, как было показано, он восстанавливает «иммунную функцию» в моделях тимэктомии на животных. Согласно некоторым вариантам реализации тимозин содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:1 (необязательно включающую ацилированный, например, ацетилированный, N-конец). Согласно некоторым вариантам реализации указанный тимозин содержит последовательность аминокислот, по существу аналогичную TA1, и сохраняет иммуномодулирующую активность TA1. Указанная по существу аналогичная последовательность может содержать, например, от приблизительно 1 до приблизительно 10 удалений, вставок и/или замен аминокислот (в совокупности) относительно TA1. Например, указанный тимозин может содержать от приблизительно 1 до приблизительно 5 (например, 1, 2, или 3) вставок, удалений, и/или замен аминокислот (в совокупности) относительно TA1.
Соответственно, указанный тимозин может содержать сокращенную последовательность TA1, где, например, удалено от 1 до приблизительно 10 аминокислот, или приблизительно 1-5 аминокислот, или 1, 2 или 3 аминокислоты относительно TA1. Такие удаления могут происходить на N-конце или на C-конце, и/или внутри последовательности, при условии, что иммуномодулирующая активность пептида по существу сохраняется. Согласно альтернативному или дополнительному варианту указанная по существу аналогичная последовательность может содержать от приблизительно 1 до приблизительно 5 вставок аминокислот (например, 1, 2, или 3 вставок аминокислот) относительно TA1, при этом иммуномодулирующая активность TA1 по существу сохраняется. Согласно альтернативному или дополнительному варианту указанная по существу аналогичная последовательность может содержать от 1 до приблизительно 10 замен аминокислот, при этом иммуномодулирующая активность по существу сохраняется. Например, указанная по существу аналогичная последовательность может содержать от 1 до приблизительно 5, или 1, 2, или 3 замены аминокислот, которые могут включать консервативные и неконсервативные замены. Согласно некоторым вариантам реализации указанные замены являются консервативными. Как правило, консервативные замены включают замены на химически аналогичные аминокислоты (например, полярные, неполярные, или заряженные). Аминокислота для замены может быть выбрана из 20 стандартных аминокислот или может представлять собой нестандартную аминокислоту (например, консервативную нестандартную аминокислоту).
Согласно некоторым вариантам реализации указанный тимозин содержит последовательность аминокислот, отличающуюся по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей последовательности SEQ ID NO:1, при сохранении иммуномодулирующей активности TA1. Например, указанный тимозин может содержать последовательность аминокислот, отличающуюся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% идентичностью последовательностей последовательности SEQ ID NO:1. Указанный тимозин может содержать последовательность аминокислот, отличающуюся 100% идентичностью последовательностей последовательности SEQ ID NO:1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный N-конец может быть необязательно ацилирован (например, ацетилированный) или алкилирован, например, ацильной или алкильной группой C1-10 или C1-C7.
Согласно определенным вариантам реализации описанные выше по существу аналогичные и гомологичные пептиды могут функционировать на уровне, составляющем по меньшей мере приблизительно 50%, 70%, 80%, 90%, или приблизительно 100% относительно TA1 (SEQ ID NO:1).
Указанный тимозин может быть получен синтетическим путем, например, посредством твердофазного синтеза, или может быть получен рекомбинантным способом и очищен с применением известных техник. Указанный тимозин может также быть получен в лиофилизированной форме и восстановлен в стерильном (например, водном) разбавителе перед введением. Составы с тимозином могут вводиться путем подкожной инъекции или другим эффективным способом.
Согласно определенным вариантам реализации указанный тимозин пегилирован для увеличения времени его полужизни в кровотоке. Такие стратегии увеличения времени полужизни терапевтических белков хорошо известны.
Полагают, что тимозин играет роль в воспалительном и врожденном иммунном ответе, и в облегчении различения собственных от чужеродных антигенов у млекопитающих. Активация лигандов PAMP (патоген-ассоциированных молекулярных паттернов) тимозином приводит к стимуляции внутриклеточных путей передачи сигнала, что приводит к экспрессии костимулирующих молекул, провоспалительных цитокинов, оксида азота и эйкозаноидов. Тимозин может влиять, например, на дендритные клетки, T-клетки, B-клетки и NK-клетки.
Согласно некоторым вариантам реализации TA1 комбинируют с вторым иммуностимулятором.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой иммуностимулятор, эффективный при лечении сепсиса. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой ГМ-КСФ, интерферон (например, интерферон-γ), интерлейкин 7, интерлейкин 15 или ингибитор PD-1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор, эффективный при лечении сепсиса, способен уменьшать истощение T-клеток у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор представляет собой вещество, способное повышать активность ГМ-КСФ, интерферона (например, интерферона-γ), или интерлейкина 7, или интерлейкина 15, см. источник: Boomer (“The changing immune system in sepsis: Is individualized immuno-modulatory therapy the answer?”, Virulence 5:1, 45-56; January 1, 2014), включенный полностью посредством ссылки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой ингибитор белка контрольной точки (также известный как ингибитор контрольной точки, модуляторы иммунных контрольных точек, или CPM). В настоящем документе белок контрольной точки представляет собой белок, предотвращающий атаку клеток иммунной системой. Ингибиторы контрольной точки сконструированы таким образом, чтобы уменьшать эффективность белки контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации указанные белки контрольных точек включают, не ограничиваясь перечисленными, PD1, PDL1, CTLA4, KIR, IDO1, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134) и LAG3.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные вторые иммуностимулирующие средства способны ослаблять аномальное подавление иммунитета у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанное аномальное подавление иммунитета обусловлено аномально высокой активностью иммуносупрессора в иммунной системе. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуносупрессор, отличающийся аномально высокой активностью у субъекта, представляет собой рецептор запрограммированной гибели (PD-1), лиганд белка запрограммированной гибели (PD-L), аттенюатор B- и T-лимфоцитов (BTLA), медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) или цитокин ИЛ-10. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор, эффективный при лечении сепсиса, представляет собой ингибитор иммуносупрессора, отличающегося аномально высокой активностью у страдающего сепсисом пациента во время гиповоспалительной фазы, см. источник: Boomer (“The changing immune system in sepsis: Is individualized immuno-modulatory therapy the answer?”, Virulence 5:1, 45-56; January 1, 2014), включенный в настоящий документ посредством ссылки полностью для любых целей. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой ингибитор PD-1, PD-L, BTLA, HVEM и/или ИЛ-10. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор уменьшает активность PD-1, PD-L, BTLA, HVEM и/или ИЛ-10 на уровне ДНК, мРНК и/или белков. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор представляет собой антитело к PD-1, PD-L, BTLA, HVEM или ИЛ-10. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор представляет собой антитело к PD-1, такое как описанные в патентах США №8552154, №8741295, №8008449, №8460886 и №7029674, или опубликованных заявках на патент США №20110171220, №20110271358, №20140044738, каждый из включенном в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор представляет собой антитело к лиганду PD. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор ингибирует взаимодействие PD-1 и его лиганда.
Согласно определенному варианту реализации указанный ингибитор PD-1 представляет собой антитело к PD-1. Согласно некоторым вариантам реализации дозировка антитела к PD-1 составляет от приблизительно 0,1 до 10 мг/кг, например, приблизительно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; или 10 мг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации дозировка антитела к PD-1 составляет приблизительно 1-5 мг/кг или приблизительно 2-3 мг/кг.
В настоящем документе выражение «ингибитор PD-1» относится к соединению, которое ингибирует сигнальный путь, опосредованный PD-1, например, ингибитору компонента сигнального пути PD-1. Сигнальный путь PD-1 описан в источнике: Riley (Immunol Rev. 2009 May; 229(1): 114-125.), включенном в настоящий документ полностью посредством ссылки. В настоящем документе термин «активность» компонента сигнального пути PD-1 может представлять собой показатель, относящийся к уровню геномной ДНК, уровню транскрипции, посттранскрипционному уровню, уровню трансляции, посттрансляционному уровню, в том числе, однако не ограничиваясь перечисленными, активность гена, активность РНК и активность белка. Активность гена может относиться к числу копий гена, уровню амплификации гена или активности промотора и т.п. Активность РНК может относиться к копийности мРНК, скорости синтеза и/или стабильности, и т.п. Активность белка может относиться к содержанию белка, скорости синтеза, стабильности, ферментативной активности, скорости фосфорилирования, модификациям, связывающей активности и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации указанные ингибиторы снижают активность PD-1. Согласно некоторым вариантам реализации указанные ингибиторы уменьшают активность лиганда PD-1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор представляет собой ингибитор PD-1, такой как антитело к антитело к PD-1, или ингибитор лиганда PD-1 (также известный как PDL-1), такой как антитело к PDL-1. Указанное антитело может представлять собой моноклональное антитело, поликлональное антитело или их комбинацию.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор представляет собой цитокин. Согласно некоторым вариантам реализации цитокины включают, не ограничиваясь перечисленными, хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины, фактор некроза опухоли.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный цитокин, представляющий собой второй иммуностимулятор, представляет собой колониестимулирующий фактор (КСФ). В настоящем документе термин «КСФ» относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным КСФ, в том числе его функциональным производным и функциональным фрагментам. В настоящем документе термин «КСФ» относится к веществам, содержащим полноразмерный колониестимулирующий фактор полипептид, его функциональный фрагмент и/или функциональные производные. Колониестимулирующие факторы представляют собой секретируемые гликопротеины, которые связываются с рецепторными белками на поверхности гемопоэтических стволовых клеток, с активацией таким образом внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к пролиферации клеток и/или дифференцировке конкретных типов клеток крови, таких как лейкоциты.
Согласно некоторым вариантам реализации КСФ включает полипептидные макрофагальные колониестимулирующие факторы (например, КСФ-1, или M-КСФ), гранулоцитарно-макрофагальные колониестимулирующие факторы (например, КСФ-2, также известный как ГМ-КСФ), гранулоцитарные колониестимулирующие факторы (например, КСФ-3, также известный как ГКСФ, или Г-КСФ) и/или их аналоги, такие как промегапоэтин или филграстим, или их функциональный фрагмент, способный стимулировать иммунную систему субъекта.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный цитокин, представляющий собой второй иммуностимулятор, представляет собой ГМ-КСФ. В настоящем документе термин ГМ-КСФ относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным ГМ-КСФ, в том числе их функциональным производным и функциональным фрагментам. В естественных условиях ГМ-КСФ может секретироваться макрофагами, T-клетками, тучными клетками, NK-клетками, эндотелиальными клетками и фибробласты. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор может быть представлен фармацевтическими аналогами природного ГМ-КСФ, например, сарграмостимом и молграмостимом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ГМ-КСФ представлен гомодимерной или гетеродимерной формой. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ГМ-КСФ получают с применением рекомбинантной технологии (например, молграмостим или сарграмостим (также известный как лейкин)).
Согласно определенному варианту реализации дозировка ГМ-КСФ составляет от приблизительно 1 до 1000 мкг/м2, например, приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 мкг/м2. Согласно некоторым вариантам реализации дозировка ГМ-КСФ составляет от приблизительно 125 до приблизительно 250 мкг/м2.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный цитокин, представляющий собой второй иммуностимулятор, представлен интерфероном. В настоящем документе термин «интерферон» относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным интерферонам, в том числе их функциональным производным и функциональным фрагментам. В настоящем документе интерфероны (ИФН) относятся к полипептидам, синтезируемым и высвобождаемым клетками-хозяевами в ответ на присутствие патогенов, таких как вирусы, бактерии, паразиты или опухолевые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует иммунные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует естественные клетки-киллеры и макрофаги. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон повышает активность антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC). Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон принадлежит к ИФН типа I, ИФН типа II или ИФН типа III. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ИФН типа I представляет собой ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-(или ИФН-ώ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ИФН типа II связывается с IFNR, который состоит из цепей IFNFGR1 и IFNGR2, например, ИФН-γ. Согласно некоторым вариантам реализации сигнал ИФН типа III передается через рецепторный комплекс, состоящий из CRF2-4 и IFNLLR1. Согласно некоторым вариантам реализации интерферон согласно настоящему документу увеличивает активность MHC I и/или активность MHC II. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон увеличивает активность иммунопротеасомы у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон увеличивает активность цитотоксических T-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует комплексы трансдукторов сигнала и активаторов транскрипции (STAT). Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует сигнальный путь Janus-киназы STAT (JAK-STAT). Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует адаптерные белки CRKL семейства CRK, которые представляют собой ядерные адаптеры STAT5, также регулирующие сигнализацию через путь C3G/Rap1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует митоген-активируемую протеинкиназу p38 (MAP-киназу), индуцируя транскрипцию генов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон активирует фосфатидилинозитол-3-киназный (PI3K) сигнальный путь. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон увеличивает активность хелперных T-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон представляет собой ИФН-γ. Согласно некоторым вариантам реализации указанные интерфероны непосредственно активируют макрофаги и/или естественные клетки-киллеры. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор может индуцировать интерфероны. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерферон соединен с полиэтиленгликолем.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный цитокин, представляющий собой второй иммуностимулятор, представляет собой фактор некроза опухоли (ФНО). В настоящем документе термин ФНО относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным ФНО, в том числе их функциональным производным и функциональным фрагментам. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ФНО может быть синтезирован активированными макрофагами, CD4+-лимфоцитами, NK-клетками, нейтрофилами, тучными клетками, эозинофилами или нейронами.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный цитокин, представляющий собой второй иммуностимулятор, представлен интерлейкином. В настоящем документе термин «интерлейкин» относится к выделенным, синтетическим, или рекомбинантным интерлейкинам, в том числе их функциональным производным и функциональным фрагментам. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерлейкин может быть синтезирован хелперными CD4 T-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами или эндотелиальными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерлейкин способствует развитию и/или дифференцировке T-лимфоцитов, B-лимфоцитов и/или гематопоэтических клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор включает интерлейкин 1, интерлейкин 3, интерлейкин 4, интерлейкин 5, интерлейкин 6, интерлейкин 7, интерлейкин 8, интерлейкин 9, интерлейкин 10, интерлейкин 11, интерлейкин 12, интерлейкин 13, интерлейкин 14, интерлейкин 15, интерлейкин 16 или интерлейкин 17. В настоящем документе термин «интерлейкин» относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным интерлейкинам, в том числе их функциональным производным и функциональным фрагментам. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор включает ИЛ-7, ИЛ-9 и/или ИЛ-15. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор включает интерлейкин, который может функционировать в качестве фактора роста лимфоидных клеток, таких как клетки B-линий, T-линий, и/или NK-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит интерлейкин, который может поддерживать рост хелперных T-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит интерлейкин, который может стимулировать и поддерживать клеточный иммунный ответ.Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит интерлейкин, который может стимулировать пролиферацию лимфоидных клеток, таких как клетки B-линий и/или T-линий.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор содержит вещество, которое может усиливать активность ИЛ-рецептора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ИЛ-рецептор представляет собой рецептор ИЛ-7. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит вещество, которое может усиливать взаимодействие ИЛ-7 и рецептора ИЛ-7. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор включает альфа-рецептор интерлейкина-7. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит общую рецепторную гамма-цепь, которая образует гетеродимер с альфа-цепью рецептора интерлейкина-7. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ИЛ-рецептор представляет собой рецептор ИЛ-9. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит вещество, которое может усиливать взаимодействие ИЛ-9 и рецептора ИЛ-9. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор включает рецептор интерлейкина-9. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ИЛ-рецептор представляет собой рецептор ИЛ-15. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит вещество, которое может усиливать взаимодействие ИЛ-15 и рецептора ИЛ-15. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит бета-цепь рецептора интерлейкина-15 (CD122). Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор содержит общую гамма-цепь рецептора интерлейкина-15 (гамма-C, CD132).
Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй иммуностимулятор содержит интерлейкин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный интерлейкин представляет собой ИЛ-7. Согласно определенному варианту реализации дозировка ИЛ-7 составляет приблизительно от 0,1 до 100 мкг/кг, например, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг/кг. Согласно определенному варианту реализации дозировка составляет приблизительно от 1 до 50 мкг/кг, или приблизительно от 3 до 30 мкг/кг.
Могут применяться другие иммуностимуляторы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор может функционировать в качестве фактора роста лейкоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор стимулирует стволовые клетки с образованием гранулоцитов (например, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов) и/или моноцитов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор может предотвращать нейтропению после химиотерапии. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор может стимулировать выживание, пролиферацию, дифференцировку и/или функцию предшественников нейтрофилов и зрелых нейтрофилов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор функционирует, задействуя один или большее количество сигнальных путей, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, пути передачи сигнала киназы Janus (JAK), белков передачи сигнала и активаторов транскрипции (STAT), Ras/митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и протеинкиназы B (Akt).
Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулирующее средство или комбинацию по меньшей мере двух иммуностимулирующих средств согласно настоящему документу комбинируют с противораковым агентом.
Согласно некоторым вариантам реализации противораковый агент, который может применяться в комбинации с иммуностимулирующим средством согласно настоящему документу, может включать, не ограничиваясь перечисленными, антагонист рецептора эстрогена, ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, ингибиторы репликации раковых клеток, ингибиторы сигнализации раковых клеток, или сайленсеры и другие ингибиторы поверхностных или внутриклеточных сигнальных молекул раковых клеток, вовлеченных в рост раковых клеток, устойчивость раковых клеток к апоптозу и/или метастазирование раковых клеток.
Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулирующее средство согласно настоящему документу применяют в комбинации с антагонистом рецептора эстрогена (ERANT), ингибитором рецептора эстрогена или лигандом ингибитора рецептора эстрогена.
Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулирующее средство согласно настоящему документу применяют в комбинации с ингибитором рецепторной тирозинкиназы. Ингибиторы тирозинкиназ представлены классом терапевтических агентов или лекарственных средств, нацеленных на рецепторные и/или нерецепторные тирозинкиназы в клетках, например, в опухолевых клетках. В некоторых случаях ингибитор тирозинкиназы представляет собой форму таргетной терапии на основе антитела (например, моноклонального антитела к тирозинкиназе и т.п.) или на основе полинуклеотида (например, антисмыслового олигонуклеотида тирозинкиназы, малой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты и т.п.). Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор тирозинкиназы представляет собой малую молекулу, которая ингибирует целевые тирозинкиназы посредством связывания с АТФ-связывающим сайтом фермента.
Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулирующее средство согласно настоящему документу применяют в комбинации с ингибитором репликации раковых клеток, например, с агентами - блокаторами микротрубочек, которые относятся к химическим веществам, блокирующим деление клетки за счет подавления функции микротрубочек.
Согласно некоторым вариантам реализации иммуностимулирующее средство согласно настоящему документу применяют в комбинации с ингибитором сигнализации раковых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанные ингибиторы сигнализации раковых клеток включают агенты, которые могут ингибировать отклик рЭФР (рецептора эпидермального фактора роста), такие как антитела к рЭФР, антитела к ЭФР и молекулы, представляющие собой ингибиторы рЭФР; ингибиторы ФРЭС (фактора роста эндотелия сосудов); и ингибиторы рецептора erbB2, такие как органические молекулы или антитела, которые связываются с рецептором erbB2.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный дополнительный противораковый агент может вводиться до, одновременно или после введения первого иммуностимулятора согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный противораковый агент содержит ипилимумаб или его производные согласно описанию в патентах США №7611702, №7741345 и №8088770, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный противораковый агент содержит ингибитор передачи сигнала. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор передачи сигнала представляет собой ингибитор BRAF, например, вемурафениб и дабрафениб. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор передачи сигнала представляет собой ингибитор MEK, такой как траметиниб. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор передачи сигнала представляет собой ингибитор c-KIT, такой как иматиниб.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный противораковый агент содержит ингибитор киназы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор киназы содержит сорафениб или производные согласно описанию в патенте США №7235576. Указанный ингибитор киназы может вводиться непрерывно (т.е. ежедневно), несколько раз в сутки, через день и т.п., и может вводиться до, одновременно или после введения иммуностимулятора согласно настоящему изобретению, например, в тот же день (дни) или в другие дни на протяжении курса лечения. Согласно определенным вариантам реализации указанный ингибитор киназы вводят в диапазоне доз, составляющих, например, приблизительно 10-2000 мг/сутки, приблизительно 50-1000 мг/сутки или приблизительно 50-800 мг/сутки. Суточные дозы могут составлять, например, приблизительно 50 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг, 800 мг и т.п.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный противораковый агент содержит антинеопластический активатор апоптоза при тепловом шоке (HSAA), см. опубликованную заявку на патент США №20100317583, включенную в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации указанный HSAA содержит STA-4783 (элескломол). Указанный HSAA может вводиться непрерывно (т.е. ежедневно), несколько раз в сутки, через день и т.п., и может вводиться до, одновременно или после введения иммуностимулятора согласно настоящему изобретению, например, в тот же день (дни) или в другие дни на протяжении курса лечения. Согласно определенным вариантам реализации указанный HSAA вводят в дозировках в пределах диапазона, например, приблизительно 0,01-1000 мг/кг/сутки, приблизительно 0,1-500 мг/кг/сутки или приблизительно 1-200 мг/кг/сутки. Суточные дозы могут составлять, например, 25 мг/кг, 100 мг/кг и т.п.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный противораковый агент содержит ингибитор ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами антигена 4 (CTLA4), см. опубликованную заявку на патент США №20100330093, включенную в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор представляет собой антитело к CTLA4. Согласно некоторым вариантам реализации антитела к CTLA4 включают, не ограничиваясь перечисленными, 9H10 (EBIOSCIENCE), MDX010 (MEDAREX), 1F4 (GENETEX), BNI3 (GENETEX), Q01 (ABNOVA), A01 (ABNOVA), M08 (ABNOVA), 1B8 (ABCAM), WKH203 (ABCAM), ab9984 (ABCAM), ab13486 (ABCAM), ипилимумаб, тицилимумаб или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации антитела к CTLA4 могут вводиться непрерывно (т.е. ежедневно), несколько раз в сутки, через день, и т.п., и могут вводиться до, одновременно или после введения иммуностимулятора согласно настоящему изобретению, например, в тот же день (дни) или в другие дни на протяжении курса лечения. Согласно некоторым вариантам реализации антитела к CTLA4 вводят в диапазоне доз, например, от 0,001 до 50 мг/кг массы тела пациента в сутки, или приблизительно 0,01-20 мг/k, или приблизительно 1-15 мг/кг.
Согласно определенным вариантам реализации указанный противораковый агент включает один или большее количество антинеопластических агентов. Согласно некоторым вариантам реализации указанные антинеопластические агенты представляют собой химиотерапевтические средства. Согласно некоторым вариантам реализации указанные химиотерапевтические средства выбраны из алкилирующих агентов, антиметаболитов, агентов-блокаторов микротрубочек, ингибиторов топоизомеразы и цитотоксических антибиотиков.
В настоящем документе термин «алкилирующие агенты» относится к агентам, которые обладают способностью алкилировать молекулы у субъекта, в том числе белки, РНК и ДНК. Неограничивающие примеры алкилирующих агентов включают мустаргены, нитрозомочевины, тетразины, азиридины, цисплатины и производные, и неклассические алкилирующие агенты. Мустаргены включают мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид и бусульфан.
В настоящем документе термин «антиметаболиты» относится к молекуле, которая препятствует синтезу ДНК, РНК или белка. Согласно некоторым вариантам реализации антиметаболиты напоминают нуклеиновые основания или нуклеозиды (нуклеотид без фосфатной группы), однако содержат измененные химические группы. Указанные лекарственные средства оказывают эффект либо за счет блокирования ферментов, необходимых для синтеза ДНК, либо за счет включения в ДНК или РНК. Ингибируя ферменты, вовлеченные в синтез ДНК, они предотвращают митоз из-за неспособности ДНК дуплицироваться. Также после ошибочного включения молекул в ДНК может происходить повреждение ДНК и индукция запрограммированной гибели клеток (апоптоз). Согласно некоторым вариантам реализации указанный антиметаболиты представляют собой антифолаты, фторпиримидины, аналоги дезоксинуклеозидов и тиопурины. Согласно некоторым вариантам реализации указанные антиметаболиты выбраны из метотрексата, пеметрекседа, фторурацила, капецитабина, цитарабина, гемцитабина, децитабина, Вайдазы, флударабина, неларабина, кладрибина, клофарабина, пентостатина, тиогуанина и меркаптопурина.
В настоящем документе термин «агенты-блокаторы микротрубочек» относится к химическим веществам, которые блокируют деление клеток путем предотвращения функционирования микротрубочек.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные противоопухолевые агенты представляют собой ингибиторы митоза.
В настоящем документе термин «ингибиторы топоизомеразы» относится к агентам, которые могут модулировать активность топоизомеразы I и/или топоизомеразы II. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор топоизомеразы согласно настоящему изобретению может представлять собой ингибитор топоизомеразы I. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор топоизомеразы представляет собой ингибитор топоизомеразы II.
В настоящем документе термин «цитотоксические антибиотики» включает, не ограничиваясь перечисленными, актиномицин, блеомицин, митомицин, пликамицин и т.п.Примеры ингибиторов тирозинкиназ включают, не ограничиваясь перечисленными, нилотиниб, иматиниб, гефинитиб, эрлотиниб, цетуксимаб, панитумумаб, залутумумаб, нимотузумаб, матузуман и т.п.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные другие противораковые агенты представляют собой моноклональные антитела, такие как алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, гемтузумаб, ритуксимаб, и трастузумаб; фотосенсибилизаторы, такие как аминолевулиновая кислота, метиламинолевулинат, порфимер натрия и вертепорфин; и другие агенты, такие как алитретиноин, алтретамин, амсакрин, анагрелид, триоксид мышьяка, аспарагиназа, бексаротен, бортезомиб, целекоксиб, денилейкин-дифтитокс, эрлотиниб, эстрамустин, гефинитиб, гидроксикарбамид, иматиниб, пентостатин, мазопрокол, митотан, пэгаспаргаза и третиноин.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный антинеопластический агент включает алкилирующие антинеопластические агенты (AIkAA). Согласно некоторым вариантам реализации указанные AIkAA включают дакарбазин (DTIC). Согласно некоторым вариантам реализации алкилирующий антинеопластический агент может вводиться пациенту в диапазоне доз, например, от приблизительно 700 до 1300 мг/м2/сутки, более предпочтительно - в диапазоне доз от приблизительно 800 до 1200 мг/м2/сутки, и наиболее предпочтительно в дозе, составляющей приблизительно 1000 мг/м2/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может смягчать, лечить и/или предотвращать один или большее число симптомов меланомы клинически релевантным, статистически значимым и/или устойчивым образом. Согласно некоторым вариантам реализации введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению обеспечивает статистически значимый терапевтический эффект в виде облегчения, лечения и/или предотвращения одного или большего числа симптомов меланомы. Согласно одному варианту реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют на основании одного или большего числа стандартов или критериев, предложенных одним или большим числом контролирующих органов в Соединенных Штатах, например, FDA, или в других странах. Согласно некоторым вариантам реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют на основании результатов, полученных в ходе одобренного контролирующим органом клинического испытания и/или процедуры. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает статистически значимый терапевтический эффект согласно оценке периода жизни без рецидива (RFS, продолжительность периода времени до возникновения рецидива или наступления смерти). Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает статистически значимый терапевтический эффект согласно оценке частоты и/или тяжести метастазов.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют в популяции, включающей по меньшей мере 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более пациентов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют на основании данных, полученных в рандомизированном двойном слепом клиническом исследовании. Согласно некоторым вариантам реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют на основании данных с P-значением, равным или составляющим менее чем приблизительно 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 или 0,01. Согласно некоторым вариантам реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют на основании данных с доверительным интервалом, равным или превышающим 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Согласно некоторым вариантам реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют после одобрения клинического исследования фазы III способов, предложенных в соответствии с настоящим изобретением, например, FDA в США.
Согласно определенному варианту реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют в рандомизированном двойном слепом клиническом исследовании на популяции, включающей по меньшей мере 50, 100, 200, 300 или 350 пациентов; получающих лечение фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, но не комбинацией с любым другим агентом для лечения симптомов метастатического заболевания (МЗ). Согласно определенному варианту реализации указанный статистически значимый терапевтический эффект определяют в рандомизированном клиническом исследовании на популяции, включающей по меньшей мере 50, 100, 200, 300 или 350 пациентов, с применением любых общепринятых критериев оценки симптомов МЗ, таких как критерии, описанные в настоящем документе.
В общем, статистический анализ может включать любой подходящий способ, разрешенный контрольным органом, например, FDA, в США, в Китае или в любой другой стране. Согласно некоторым вариантам реализации статистический анализ включает нестратифицированный анализ, логарифмический ранговый анализ, например, критерии Каплана-Майера, Якобсона-Труакса, Гулликсена-Лорда-Новика, Эдвардса-Нанналли, Хагемана-Арринделла, иерархическое линейное моделирование (HLM) и регрессионный анализ Кокса.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают введение указанного иммуностимулятора в течение конкретной фазы прогрессирования меланомы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор вводят субъекту, когда у него начинается апоптоз T-клеток. Хорошо известны такие способы детекции апоптоза T-клеток, например, с применением аннексина V-ФИТЦ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор вводят субъекту, когда у указанного субъекта происходит истощение T-клеток в результате апоптоза T-клеток. Хорошо известны такие способы количественного определения T-клеток, например, с применением проточной цитометрии. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммуностимулятор вводят субъекту для поддержания заранее заданного уровня активных T-клеточных популяций у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный активированные T-клетки представляют собой CD8+T-клетки и/или CD4+T-клетки.
Согласно определенным вариантам реализации схема лечения включает несколько дней введения фармацевтической композиции, содержащей иммуностимулятор согласно настоящему изобретению, и указанный иммуностимулятор может вводиться субъекту на протяжении по меньшей мере части курса, предусмотренного схемой лечения.
Согласно определенным вариантам реализации указанная схема лечения включает введение указанной фармацевтической композиции на протяжении периода, составляющего приблизительно 1-10 дней, приблизительно 1-20 дней, приблизительно 1-30 дней, приблизительно 1-40 дней, приблизительно 1-50 дней, приблизительно 1-60 дней, приблизительно 1-70 дней, приблизительно 1-80 дней, приблизительно 1-90 дней, приблизительно 1-100 дней или более.
Согласно определенным вариантам реализации указанная схема лечения дополнительно включает приблизительно 1-5 дней, приблизительно 5-10 дней, приблизительно 10-20 дней, приблизительно 20-30 дней или более, когда фармацевтическая композиция не вводится. Согласно некоторым вариантам реализации указанная фармацевтическая композиция может вводиться ежедневно в течение 1-10 дней, приблизительно 1-20 дней, приблизительно 1-30 дней, приблизительно 1-40 дней, приблизительно 1-50 дней, приблизительно 1-60 дней, приблизительно 1-70 дней, приблизительно 1-80 дней, приблизительно 1-90 дней, приблизительно 1-100 дней или более, после чего на протяжении приблизительно 1-5 дней, приблизительно 5-10 дней, приблизительно 10-20 дней, приблизительно 20-30 дней пептид тимозина-альфа не вводится.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают мониторинг отклика субъекта после введения, чтобы избежать тяжелых и/или фатальных иммуно-опосредованных нежелательных реакций за счет сверхактивации и пролиферации. Согласно некоторым вариантам реализации введение указанного иммуностимулятора модифицируют, например, уменьшают, приостанавливают или прекращают, если у пациента наблюдаются устойчивые умеренные нежелательные реакции. Согласно некоторым вариантам реализации модифицируют дозировку, если у пациента не наблюдается отклика в течение приблизительно 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель, 13 недель, 14 недель, 15 недель, 16 недель или более после введения первой дозы. Согласно некоторым вариантам реализации модифицируют дозировку, если у пациента наблюдаются тяжелые или опасные для жизни нежелательные реакции, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, колит с абдоминальной болью, лихорадка, обструкция кишечника или перитонеальные симптомы; увеличение частоты стула(≥7 относительно исходной), недержание стула, необходимость внутривенной регидратации в течение>24 часов, желудочно-кишечное кровотечение и перфорация желудочно-кишечного тракта, показатель АСТ или АЛТ>5(относительно верхней границы нормы (ULN) или общий билирубин>3×ULN, синдром Стивенса-Джонса, токсический эпидермальный некролиз или сыпь, осложненная полнослойным изъязвлением кожи или некротическими, буллезными или геморрагическими проявлениями, тяжелая двигательная или сенсорная нейропатия, синдром Гийена-Барре, тяжелая миастения, тяжелые иммуно-опосредованные реакции с вовлечением любой системы органов, иммуно-опосредованное заболевание глаз, не отвечающие на местную иммуносупрессивную терапию.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают определение активности одного или большего числа компонентов иммунной системы до, во время и/или после введения иммуностимулятора согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации схема лечения согласно настоящему изобретению может быть модифицирована на основании активности одного или большего числа компонентов иммунной системы. Согласно некоторым вариантам реализации указанные компоненты иммунной системы включают, не ограничиваясь перечисленными, T-клеточный апоптоз, CD+8 T-клетки и CD+4 T-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают определение одного или большего количество биомаркеров, указывающий на активность T-клеточного апоптоза, CD+8 T-клеток и/или CD+4 T-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают определение активности эффекторных T-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают определение активности хелперных T-клеток.
Согласно некоторым вариантам реализации активность одного или большего числа компонентов иммунной системы субъекта сравнивают с заранее заданным стандартом для принятия решения о введении фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению субъекту и/или возможном времени введения фармацевтической композиции субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации указанный компонент может представлять собой ИЛ-2, рецептор ИЛ-2, ИЛ-7, рецептор ИЛ-7, ИЛ-15, рецептор ИЛ-15, CD69, ИФН-γ, ИЛ-6, ФНО, ИЛ-1, ГМ-КСФ, PD-L, PD-1, ИЛ-10, BTLA, HVEM, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту в том случае, если активность PD-L, PD-1, ИЛ-10, TLA, и/или HVEM выше по сравнению с заранее заданным стандартом. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту в том случае, если активность ИЛ-2, рецептора ИЛ-2, ИЛ-7, рецептора ИЛ-7, ИЛ-15, рецептора ИЛ-15, CD69, ИФН-γ, ИЛ-6, ФНО и/или ГМ-КСФ ниже заранее заданного стандарта. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту в том случае, если активность ИЛ-1(выше по сравнению с заранее заданным стандартом. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту в том случае, если активность ИЛ-4 ниже заранее заданного стандарта. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту в том случае, если активность ИЛ-6 выше по сравнению с заранее заданным стандартом. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту в том случае, если активность ИЛ-10 выше по сравнению с заранее заданным стандартом.
Согласно некоторым вариантам реализации способы лечения согласно настоящему изобретению комбинируют с одним или большим числом дополнительных вариантов лечения ракового заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное лечение представляет собой хирургическое лечение. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное лечение представляет собой адъювантную терапию. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное лечение представляет собой химиотерапию. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное лечение представляет собой иммунотерапию. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное лечение представляет собой лучевую терапию. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное лечение представляет собой таргетную терапию, такую как адоптивная клеточная терапия или генная терапия.
Согласно определенным вариантам реализации указанный субъект представляет собой субъекта с иммунодефицитом. У субъекта с иммунодефицитом (например, субъекта-человека) наблюдается пониженная способность противостоять инфекционным заболеваниям и/или пониженная способность к ответу на воздействие патогена. Примеры таких субъектов с иммунодефицитом включают пациента старшего возраста, новорожденного, пациента с лейкозом или нейтропенией, пациента на гемодиализе (например, для лечения хронической болезни почек), пациента, получающего иммуносупрессивную терапию, пациента с синдромом СПИД, пациента с диабетом, пациента, получающего химиотерапию или лучевую терапию ракового заболевания, с иммунодефицитом, вызванным генетическим дефектом, недостаточностью или нарушением питания, употреблением наркотических средств /злоупотреблением лекарственными средствами, алкоголизмом или другой(им) нарушающим иммунитет болезнью или состоянием.
Согласно определенным вариантам реализации указанный субъект с нарушением иммунитета представляет собой субъекта старшего возраста. С возрастом иммунный ответ у животных снижается, и уменьшается надежность иммунного ответа в связи с преобладанием выделения низкоаффинных антител. Соответственно, субъект согласно указанным вариантам реализации может представлять собой пациента-человека в возрасте более 45 лет или в возрасте более 50 лет. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект представляет собой пациента-человека в возрасте 60 лет или более, 65 лет или более, или 70 лет или более.
Согласно определенным вариантам реализации указанная схема лечения дополнительно включает определения отклика пациента во время лечения. Согласно некоторым вариантам реализации оценивают один или большее число симптомов, связанных с инфекцией, для определения отклика субъекта на схему лечения.
Согласно некоторым вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению индуцирует сильный и быстрый иммунный ответ на патогены у субъекта или в популяции субъектов. Схема введения тимозина согласно описанию в настоящем документе обеспечивает более надежный иммунный ответ на воздействие патогена у пациента, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, более высокий титр антитела и/или более быстрое выделение антител. Согласно некоторым вариантам реализации указанная схема обеспечивает такие преимущества в течение периода до приблизительно 10 дней, 20 дней, 30 дней, 40 дней, 50 дней или более уже после одного, двух, трех или четырех введений.
Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта было диагностировано наличие ракового заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой меланому.
Согласно некоторым вариантам реализации композицию согласно настоящему изобретению вводят с применением любых подходящих способов, известных в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации введение композиции согласно настоящему изобретению может осуществляться перорально, парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально, посредством интраназальной инстилляции, посредством имплантации, посредством внутриполостной или внутрипузырной инстилляции, интраокулярно, внутриартериально, внутриочагово, чрескожно или посредством нанесения на слизистые оболочки. Ингибитор может вводиться с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно некоторым вариантам реализации указанный тимозин вводят субъекту посредством инъекции (например, внутримышечной, внутриартериальной, внутрисосудистой, внутривенной, интраперитонеальной или подкожной). Под «фармацевтически приемлемым» подразумевается материал, не являющийся нежелательным по биологическим или иным причинам, т.е. указанный материал может быть включен в фармацевтическую композицию, которая вводится пациенту, не вызывая каких-либо значимых нежелательных биологических эффектов или не взаимодействуя пагубным образом с любыми другими компонентами композиции, в состав которой он входит. При использовании термина «фармацевтически приемлемый» в отношении фармацевтического носителя или вспомогательного вещества подразумевается, что указанный носитель или вспомогательное вещество отвечает требуемым стандартам по результатам токсикологического и производственного тестирования, или включен в Справочник по неактивным компонентам, составленный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
Согласно некоторым вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена фармацевтическими композициями, содержащими носитель (основу), например, искусственные мембранные везикулы (включая липосомы, липидные мицеллы и т.п.), микрочастицы или микрокапсулы.
Композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть представлены в виде твердых или текучих единичных лекарственных форм. Текучая единичная лекарственная форма может быть получена в соответствии с известными в данной области техники процедурами для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или большее количество агентов, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих агентов, вкусоароматических агентов, красящих агентов и консервирующих агентов, для получения фармацевтических составов с лаконичной рецептурой, приятных на вкус.Эликсир получают с применением водно-спиртовой основы (например, этанола) с подходящими подсластителями, такими как сахар и сахарин, в сочетании со вкусоароматическим агентом. Суспензии на водной основе могут быть получены с применением суспендирующего агента, такого как аравийская камедь, трагакант, метилцеллюлоза и т.п.
Твердые составы, такие как таблетки, содержат активный ингредиент в смеси с нетоксическими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, подходящими для получения таблеток. Указанные вспомогательные вещества могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия: гранулирующие агенты и дезинтегрирующие агенты, например, кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; связующие агенты, например, крахмал, желатин или аравийскую камедь; и смазывающие агенты, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк, и другие стандартные ингредиенты, такие как двузамещенный фосфат кальция, алюмосиликат магния, сульфат кальция, крахмал, лактозу, метилцеллюлозу и функционально аналогичные материалы. Таблетки могут не иметь покрытия, или на них может быть нанесено покрытие путем применения известных техник для задержки дезинтеграции и абсорбции в желудочно-кишечном тракте с обеспечением таким образом продолжительного действия на протяжении более длительного периода. Например, может применяться материал, обеспечивающий задержку во времени, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.
Составы для перорального применения могут также быть представлены твердыми желатиновыми капсулами, отличающимися тем, что активный ингредиент смешивают с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или мягкими желатиновыми капсулами, отличающимися тем, что активный ингредиент смешивают с водной или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом. Мягкие желатиновые капсулы получают путем машинной инкапсуляции суспензии соединения с приемлемым растительным маслом, светлым вазелиновым маслом или другим инертным маслом.
Водные суспензии содержат активные материалы в смеси со вспомогательными веществами, подходящими для получения водных суспензий. Такие вспомогательные вещества представляют собой суспендирующие агенты, например, карбоксилметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидропропилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты могут представлять собой встречающийся в природе фосфатид, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, происходящие из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, происходящими из жирных кислот и ангидридов гексита, например, полиэтиленсорбитанмоноолеат.Водные суспензии могут также содержать один или большее число консервантов, например, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или большее число красящих агентов, один или большее число вкусоароматических агентов или один или большее число подслащивающих агентов, таких как сахароза или сахарин.
Масляные суспензии могут быть введены в состав путем суспендирования активных ингредиентов в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Указанные масляные суспензии могут содержать загущающий агент, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт.Для получения приятных на вкус составов для перорального применения могут быть добавлены подслащивающие агенты, такие как указанные выше, и вкусоароматические агенты. Сохранность указанных композиций может обеспечиваться путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, содержат активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим агентом, суспендирующим агентом, и одним или большим числом консервантов. Примеры подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов представлены уже упомянутыми выше. Могут также присутствовать дополнительные вспомогательные вещества, например, подслащивающие, вкусоароматические и красящие агенты.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут также быть представлены эмульсиями типа «масло в воде». Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например, оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например, жидкий парафин или смеси перечисленного. Подходящие эмульгирующие агенты могут представлять собой встречающиеся в природе камеди, например, аравийскую камедь или трагакантовую камедь, встречающиеся в природе фосфатиды, например, соевый лецитин, и сложные эфиры или неполные сложные эфиры, происходящие из жирных кислот и ангидридов гексита, например, сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных неполных сложных эфиров с этиленоксидом, например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.Указанные эмульсии могут также содержать подслащивающие и вкусоароматические агенты.
Фармацевтические композиции могут быть представлены стерильной инъецируемой водной или масляной суспензией. Указанная суспензия может быть получена в соответствии с известным уровнем техники с применением подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов, упомянутых выше. Стерильный инъекционный состав может также представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксическом приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Приемлемые носители и растворители, подходящие для применения, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды стандартно используются стерильные нелетучие масла. С указанной целью может применяться любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при получении инъецируемых составов находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. В указанный инъецируемый раствор или суспензию могут также быть включены адъюванты, например, местные анестетики, консерванты и буферные агенты.
Согласно некоторым вариантам реализации подходящие системы доставки включают системы доставки для замедленного высвобождения, отсроченного высвобождения, для продолжительного высвобождения или контролируемого высвобождения. Согласно некоторым вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению может доставляться с применением системы для контролируемого высвобождения, например, матриц для продолжительного высвобождения. Неограничивающие примеры матриц для продолжительного высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) согласно описанию у Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 и Langer, 1982, Chem. Tech., 12:98-105), или поли(виниловый спирт)], полилактиды (патент США №3773919; EP58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers, 22:547-556), неразлагаемый этиленвинилацетат (Langer et al., выше), разлагаемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT((инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и леупролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота (EP133988). Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция может вводиться посредством внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или с применением других способов введения. Согласно одному варианту реализации может применяться насос (см. Langer, выше; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). Согласно другому варианту реализации могут применяться полимерные материалы. Согласно еще одному варианту реализации система для контролируемого высвобождения может быть размещена поблизости от терапевтической мишени, например, печени; таким образом, требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, в источнике: Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp.115-138 (1984). Другие системы для контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990). Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция может вводиться посредством подкожной инъекции.
Согласно некоторым вариантам реализации происходит «пульсовое» высвобождение композиции. Примеры систем, обеспечивающих «пульсовое» высвобождение, включает, например, системы, в которых композиция заключена в липосомы, инкапсулированные в полимерной матрице и чувствительные к специфическим стимулам, например, температуре, pH, свету или разлагающему ферменту, и системы, в которых композиция инкапсулирована в микрокапсуле с ионным покрытием с разлагающим сердцевину микрокапсулы ферментом.
Согласно некоторым вариантам реализации происходит постепенное/непрерывное высвобождение композиции. Примеры систем, обеспечивающих постепенное и непрерывное высвобождение ингибитора, включают, например, эрозионные системы, в которых композиция заключена в матрице и эффузионные системы, в которых композиция высвобождается с контролируемой скоростью, например, за счет использования полимера. Такие системы для продолжительного высвобождения могут быть, например, представлены в форме пеллет или капсул.
Другие варианты введения композиций согласно настоящему изобретению включают дисперсные системы, защитные покрытия, ингибиторы протеазы или усилители проницаемости при различных способах введения, таких как парентеральный, легочный, назальный и пероральный. Другие фармацевтические композиции и способы получения фармацевтических композиций известны в данной области техники и описаны, например, в руководстве: «Remington: The Science and Practice of Pharmacy» (ранее «Remingtons Pharmaceutical Sciences”); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, Pa. (2000). Согласно некоторым вариантам реализации указанная фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый разбавитель, вспомогательное вещество, носитель или адъювант.
Доза для введения не имеет установленных пределов, однако обычно представляет собой эффективное количество или терапевтически/фармацевтически эффективное количество. Термин «эффективное количество» относится к количеству одного или большего числа соединений, обеспечивающее требуемый исход лечения. Эффективное количество может содержаться в одной или большем числе доз, т.е. для достижения требуемой конечной точки лечения может требоваться одна или несколько доз. Термин «терапевтически/фармацевтически эффективное количество» в настоящем документе относится к уровню или количеству одного или большего числа агентов, требующихся для лечения состояния, или уменьшения или предотвращения повреждения или поражения, необязательно не вызывающего значимых негативных или нежелательных побочных эффектов. Обычно оно эквивалентно, в расчете на моли, количеству фармакологически активной свободной формы, образующейся из дозированной формы при метаболическом высвобождении активного свободного лекарственного средства, необходимому для достижения требуемых фармакологических и физиологических эффектов. Согласно некоторым вариантам реализации указанные композиции могут быть введены в состав единичной лекарственной формы. Термин «единичная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим для применения в качестве единиц дозы у субъектов-людей и других млекопитающих, при этом каждая доза содержит заранее рассчитанное количество активного материала, необходимое для достижения требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим вспомогательным веществом.
Согласно некоторым вариантам реализации схема дозирования тимозина включает, без каких-либо ограничений, количество на дозу, частоту дозирования, например, в сутки, в неделю или в месяц, общее количество на цикл дозирования, интервал дозирования, изменения дозировки, паттерн или модификации в цикле дозирования, максимальную накопленную дозу или подготовительную дозу, или любую комбинацию перечисленного. Согласно некоторым другим вариантам реализации схема дозирования тимозина включает частоту дозирования, например, в сутки или в неделю.
Согласно некоторым другим вариантам реализации схема дозирования включает заранее определенное или фиксированное количество на дозу в комбинации с частотой введения такой дозы. Например, схема дозирования тимозина включает фиксированное количество на дозу в комбинации с частотой введения такой дозы тимозина субъекта.
Согласно некоторым вариантам реализации эффективные количества тимозина представлены количествами, которые могут представлять собой единицы дозирования, содержащие количества тимозина в диапазоне, соответствующем приблизительно до 0,1-20 мг TA1, приблизительно 1-10 мг TA1, приблизительно 2-10 мг TA1, приблизительно 2-7 мг TA1 или приблизительно 3-6,5 мг TA1, и может содержать приблизительно 1,6, 3,2 или 6,4 мг TA1, или приблизительно 3,2 или 6,4 мг TA1. Единица дозирования может вводиться один раз в сутки или несколько раз в сутки. Согласно некоторым вариантам реализации TA1 вводят субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от приблизительно 0,5 до 10 мг/сутки. Согласно определенным вариантам реализации дозировка TA1 находится в пределах диапазона от приблизительно 1,5-7 мг/сутки, или в пределах диапазона от приблизительно 1,6-6,4 мг/сутки. Согласно определенным вариантам реализации дозировка TA1 находится в пределах диапазона от приблизительно 1,7 до 10 мг/сутки, приблизительно 1,7-7 мг/сутки или приблизительно 3-7 мг/сутки. Согласно некоторым вариантам реализации эффективные дозировки включают приблизительно 1,6, 3,2 или 6,4 мг/сутки.
Согласно некоторым вариантам реализации введение обеспечивает уровень в сыворотке тимозина, составляющий от приблизительно 0,1 до 1,0 нг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации введение обеспечивает пиковый уровень в плазме после инъекции приблизительно 100 нг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни TA1 в кровотоке составляет приблизительно 2 часа.
Согласно определенным вариантам реализации указанная схема лечения включает несколько дней введения фармацевтической композиции, содержащей TA1, либо TA1 может вводиться субъекту на протяжении по меньшей мере части курса, предусмотренного схемой лечения.
Согласно определенным вариантам реализации схема лечения включает введение указанной фармацевтической композиции на протяжении периода, составляющего приблизительно 1-10 дней, приблизительно 1-20 дней, приблизительно 1-30 дней или более.
Согласно определенным вариантам реализации схема лечения дополнительно включает приблизительно 1-5 дней, приблизительно 5-10 дней, приблизительно 10-20 дней, приблизительно 20-30 дней или более, когда фармацевтическая композиция не вводится. Согласно некоторым вариантам реализации указанная фармацевтическая композиция может вводиться ежедневно, один раз в два дня, один раз в три дня, один раз в четыре дня, один раз в пять дней, один раз в шесть дней, один раз в неделю, на протяжении приблизительно 1-10 дней, приблизительно 1-20 дней или более, после чего на протяжении приблизительно 1-5 дней, приблизительно 5-10 дней указанный тимозин не вводится.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы дополнительно включают мониторинг отклика субъекта после введения, чтобы избежать тяжелых и/или фатальных иммуно-опосредованных нежелательных реакций за счет сверхактивации и пролиферации. Согласно некоторым вариантам реализации введение указанного иммуностимулятора модифицируют, например, уменьшают, приостанавливают или прекращают, если у пациента наблюдаются устойчивые умеренные нежелательные реакции. Согласно некоторым вариантам реализации модифицируют дозировку, если у пациента не наблюдается отклика в течение приблизительно 1 дня, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 недели, 2 недель или более после введения первой дозы.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также облегчать, снижать тяжесть или уменьшать частоту возникновения одного или большего числа симптомов, связанных с меланомой. Согласно некоторым вариантам реализации такие симптомы включают, не ограничиваясь перечисленными, ранние признаки меланомы, представленные изменениями формы или цвета существующих родимых пятен, или, в случае нодулярной меланомы, появление нового узелка где-либо на коже (при таких повреждениях необходимо незамедлительно обратиться к дерматологу). На более поздних стадиях может возникать зуд, изъязвление или кровоточивость родимого пятна. Ранние признаки меланомы включают, не ограничиваясь перечисленными, асимметричность формы, границы неправильной формы, неоднородность цвета, диаметр, превышающий 6 мм, изменения с течением времени.
Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы предотвращают метастазирование, или уменьшают скорость и/или тяжесть метастазирования.
В соответствии с настоящим изобретением также предложено получение данных о профилях активности панели биомаркеров. В настоящем документе термин «профиль активности» относится к совокупности данных, представляющих отличительные признаки или характеристики одного или большего числа биомаркеров. Такие признаки или характеристики включают, не ограничиваясь перечисленными, относительное содержание транскриптов, стабильность транскриптов, скорость транскрипции, скорость трансляции, посттрансляционную модификацию, содержание белка, стабильность белка и/или ферментативную активность белка, и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации указанный профиль активности включает данные, связанные с уровнем генной экспрессии каждого биомаркера. Согласно некоторым вариантам реализации получение данных, включающих профили активности, осуществляют на основе конкретной популяции субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная конкретная популяция субъектов состоит из клинически нормальных субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная популяция состоит из пациентов, восприимчивых к одному или большему числу агентов, направленных против меланомы, (антимеланомных агентов) согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации указанная популяция состоит из пациентов, не восприимчивых к одному или большему числу агентов, направленных против меланомы (антимеланомных агентов), согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные данные включают профили активности, статистически однородные в одном или нескольких аспектах, например, статистически однородные в отношении одного или большего числа количественных или полуколичественных показателей, описывающих признаки и характеристики профилей активности. Согласно некоторым вариантам реализации указанные количественные показатели включают, не ограничиваясь перечисленными, относительное содержание транскриптов, стабильность транскриптов, скорость транскрипции, скорость трансляции, посттрансляционную модификацию, содержание белка, стабильность белка и/или ферментативную активность белка, и т.п. Наличие или отсутствие статистической однородности групповых профилей активности в одном или нескольких аспектах может быть определено с помощью любого подходящего статистического критерия и/или алгоритма, известного специалисту в данной области техники.
Согласно некоторым вариантам реализации активность одного или большего числа биомаркеров при лечении повышается. Согласно некоторым вариантам реализации активность одного или большего числа биомаркеров при лечении снижается. Согласно некоторым вариантам реализации активность одного или большего числа биомаркеров при лечении сохраняется. В настоящем документе активность биомаркера может представлять собой показатель, относящийся к уровню геномной ДНК, уровню транскрипции, посттранскрипционному уровню, уровню трансляции, посттрансляционному уровню, в том числе, однако не ограничиваясь перечисленными, активности гена, активности РНК и активности белка. Активность гена может относиться к числу копий гена, уровню амплификации гена или активности промотора, и т.п.Активность РНК может относиться к копийности мРНК, скорости синтеза и/или стабильности, и т.п. Активность белка может относиться к содержанию белка, скорости синтеза, стабильности, ферментативной активности, скорости фосфорилирования, модификациям, связывающей активности, и т.п.
В настоящем документе приближение уровня биомаркера к заранее заданному стандартному уровню называют нормализацией.
В настоящем документе уменьшение скорости отдаления уровня биомаркера от заранее заданного стандартного уровня называют стабилизацией.
Согласно некоторым вариантам реализации определяют профили активности у субъекта одного или большего числа биомаркеров согласно настоящему изобретению и сравнивают с заранее заданным стандартным уровнем. В настоящем документе термин «заранее заданный стандартный уровень» или «заранее заданные профили активности» относится к стандартизованным данным или совокупности данных, представляющих средние, отличительные признаки или характеристики одного или большего числа биомаркеров в конкретной популяции. Такие признаки или характеристики включают, не ограничиваясь перечисленными, число копий гена, амплификацию генов, относительное содержание транскриптов, стабильность транскриптов, скорость транскрипции, скорость трансляции, посттрансляционные модификации, содержание белка, стабильность белка и/или ферментативную активность белка, и т.п.Согласно некоторым вариантам реализации указанная конкретная популяция субъектов состоит приблизительно из 5, приблизительно из 10, приблизительно из 20, приблизительно из 50, приблизительно из 100, приблизительно из 200, приблизительно из 300, приблизительно из 400, приблизительно из 500, приблизительно из 1000, приблизительно из 5000, приблизительно из 10000 или более отдельных субъектов. Заранее заданный профиль активности может представлять собой стандартизованные данные или совокупность данных, собранных ранее, во время или после воздействия лекарственного средства на всех субъектов в конкретной популяции. Согласно некоторым вариантам реализации указанная конкретная популяция состоит из субъектов, восприимчивых к определенному лекарственному средству.
Согласно некоторым вариантам реализации субъект является «восприимчивым» к лекарственному средству для лечения, если уровень одного или большего числа биомаркеров согласно настоящему изобретению при воздействии на указанного субъекта лекарственного средства увеличивается или уменьшается относительно заранее определенного стандартного уровня, или если лекарственное средство модифицирует скорость изменения уровней одного или большего числа биомаркеров согласно настоящему изобретению по сравнению с плацебо. Информацию о способах, связанных с детекцией, количественным анализом и сравнением уровней биомаркеров, можно найти, например, в источниках: Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel, Frederick M. (2010); Current Protocols in Protein Science Last, Ed. Coligan, John E., et al. (2010); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Ed. Egli, Martin (2010); Current Protocols in Bioinformatics, Ed. Baxevanis, Andreas D. (2010); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook, Joseph (2001), все из которых включены в настоящий документ полностью посредством ссылки.
Согласно определенным вариантам реализации при измерении биомаркеров или других индикаторов лечения «повышенное» или «пониженное» количество или уровень может включать «статистически значимое» количество. Результат, как правило, называют статистически значимым, если вероятность его случайного получения незначительна. Уровень значимости теста или результата Уровень значимости теста или результата традиционно связывают с количеством доказательств, необходимых для установления малой вероятности случайного наступления события. В определенных случаях статистическая значимость может быть определена как вероятность принятия решения об отклонении истинной нулевой гипотезы (решение, известное как ошибка I типа, или «ложноположительное определение»). Указанное решение часто принимается с использованием p-значения: в случае, если p-значение меньше уровня значимости, нулевую гипотезу отвергают. Чем меньше p-значение, тем более значимым является результат. Для определения статистической значимости могут также быть использованы коэффициенты Байеса (см., например, Goodman S., Ann Intern Med. 130:1005-13, 1999). Согласно некоторым вариантам реализации «повышенное(ый)» или «пониженное(ый)» количество или уровень приблизительно в 1,1×, 1,2×, 1,3×, 1,4×, 1,5×, 2×, 2,5×, 3×, 3,5×, 4×, 4,5×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 15×, 20×, 25×, 30×, 40(или 50(больше или меньше заранее заданного стандарта, или количества в определенный момент времени относительно предыдущего или более раннего момента времени.
Также предложены способы мониторинга эффективности активного агента в лечении ракового заболевания. Указанные способы включают определение активности одного или большего числа биомаркеров согласно настоящему изобретению в биологическом образце от пациента и передачу указанной информации о биомаркерах стороне, которая обеспечивает определение или оценку лечения или эффективности на основании информации о биомаркерах. Согласно некоторым вариантам реализации активность биомаркера определяют во время или после приема по меньшей мере одной дозы активного агента согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации указанное вещество может обеспечивать определение целесообразности лечения или продолжения лечения активным агентом в том случае, если субъект-человек отвечает одному или большему числу представленных ниже критериев отбора:
(У субъекта-человека наблюдается a пониженный уровень активности ИЛ-1(по сравнению с уровнем у того же субъекта-человека до лечения, и/или наблюдается нормализация или стабилизация активности ИЛ-1(активность относительно такой активности у субъекта-человека или в группе субъектов-людей, восприимчивых к лечению согласно настоящему изобретению;
(У субъекта-человека наблюдается повышенный уровень активности ИЛ-4 по сравнению с уровнем у того же субъекта-человека до лечения, и/или наблюдается нормализация или стабилизация активности ИЛ-4 относительно такой активности у субъекта-человека или в группе субъектов-людей, восприимчивых к лечению согласно настоящему изобретению;
(У субъекта-человека наблюдается пониженный уровень активности ИЛ-6 по сравнению с уровнем у того же субъекта-человека до лечения, и/или наблюдается нормализация или стабилизация активности ИЛ-1(относительно такой активности у субъекта-человека или в группе субъектов-людей, восприимчивых к лечению согласно настоящему изобретению;
(У субъекта-человека наблюдается пониженный уровень активности ИЛ-10 по сравнению с уровнем у того же субъекта-человека до лечения, и/или наблюдается нормализация или стабилизация активности ИЛ-1(относительно такой активности у субъекта-человека или в группе субъектов-людей, восприимчивых к лечению согласно настоящему изобретению.
Способы детекции уровней нуклеиновых кислот, таких как РНК или ДНК, были описаны и хорошо известны специалистам в данной области техники. Способы детекции РНК могут включать, не ограничиваясь перечисленными, ОТ-ПЦР, нозерн-блоттинг, анализ генной экспрессии, анализ на микрочипах, анализ генной экспрессии на чипах, техники гибридизации (в том числе флуоресцентную гибридизацию in situ, FISH), анализ на чипах Expression BeadChip и хроматографию, а также любые другие техники, известные в данной области. Способы детекции ДНК могут включать, не ограничиваясь перечисленными, ПЦР, ПЦР в реальном времени, цифровую ПЦР, гибридизацию (в том числе флуоресцентную гибридизацию in situ, FISH), анализы на микрочипах, анализы для детекции SNP, анализы на основе генотипирования SNP и хроматографию, а также любые другие техники, известные в данной области.
Способы детекции белков и полипептидов могут включать, не ограничиваясь перечисленными, спектрофотометрическое определение концентрации белка, количественный анализ аминокислот, анализ концентрации белка, хроматографические анализы, анализ методом вестерн-блоттинга, гель-электрофорез (с последующим процедурами окрашивания, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, окрашиванием кумасси голубым, серебром, красителями Syber Green, Syber Gold), гибридизацию, мультиплексный анализ цитокинов, иммунологические анализы, ИФА ELISA, анализ белка с бицинхониновой кислотой (БХК), анализ белка методом Бредфорда и анализ белка методом Лоури, а также любые другие техники, известные в данной области техники. Детекция белка может также включать детекцию уровней стабильных или активных белков и такие способы, как кинетический анализ, киназный анализ, ферментный анализ и анализ посттрансляционных модификаций (например, анализы для определения статуса фосфорилирования и гликозилирования) могут также быть применены.
Информация о дополнительных способах, связанных с детекцией, количественным определением и сравнением уровней биомаркеров, приведена, например, в источниках: Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel, Frederick M. (2010); Current Protocols in Protein Science Last, Ed. Coligan, John E., et al. (2010); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Ed. Egli, Martin (2010); Current Protocols in Bioinformatics, Ed. Baxevanis, Andreas D. (2010); и Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook, Joseph (2001), все из которых включены в настоящий документ полностью посредством ссылки.
Согласно некоторым вариантам реализации информацию о биомаркерах путем проведения одного или большего числа тестов. Указанный тест может быть выполнен самим субъектом, врачом, медицинской сестрой, исследовательской лабораторией, медицинской организацией или любой другой стороной, способной провести такой тест.Затем результаты тестирования, включающие информацию о биомаркерах, могут быть проанализированы тем же исполнителем или другой стороной, например, самим субъектом, врачом, медицинской сестрой, исследовательской лабораторией, медицинской организацией, медицинским специалистом, персоналом, задействованным в клиническом исследовании, медицинским стационаром, лабораторией, научно-исследовательским институтом или любой другой стороной, способной проанализировать результаты указанного теста для определения восприимчивости субъекта к лекарственному средству.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения. Разумеется, следует понимать, что указанные примеры являются иллюстративными исключительно для конкретных вариантов реализации настоящего изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Лечение меланомы тимозином в модели подкожной меланомы B16F10 на мышах
Модель меланомы B16F10 на мышах получают из линии MB16 путем последовательного отбора метастатических клонов. Получали клоны B16F1-B16F10 (ATCC №CRL-6475™), при этом клон F10 перевивали мышам 10-кратно, и, соответственно, он является высокометастатическим. Указанная модель широко используется для исследований механизмов метастазирования и оценки противораковых терапевтических средств. Это также одна из наиболее распространенных сингенных моделей иммунотерапии рака. Модели как подкожной меланомы, так и экспериментального метастазирования очень практичны.
Для исследования эффекта тимозина при лечении меланомы пептид тимозина-альфа (Задаксин) вводили мышам с инокулированной B16F10 в ходе двух отдельных исследований:
Таблица 1. Дизайн исследования №1
Таблица 2. Дизайн исследования №2
Объем опухолей и массу тела отслеживали на протяжении всего исследования. Цисплатин вводили в группе положительного контроля в отдельном исследовании исторического контроля. В группе отрицательного контроля во всех исследованиях вводили только носитель.
У мышей B16F10, получавших лечение цисплатином, как правило, наблюдался меньший объем опухолей (Фиг. 1A и Таблица 3). Однако у указанных мышей наблюдалась также значимо меньшая масса тела, что обусловлено токсичностью цисплатина (Фиг. 1B).
Таблица 3. Размер опухоли у мышей B16F10, получавших лечение цисплатином
У животных с происходящей из B16F10 опухолью, получавших Задаксин((тимальфазин) во всех протестированных дозах, наблюдалось уменьшение роста опухоли по сравнению с получавшей носитель группой (Фиг. 2 и Фиг. 3).
В исследовании I средний размер опухоли в получавшей носитель группе (группа 1) достигал 1,995 мм3 на день 14 после инокуляции опухоли. Лечение TA1 в дозе 0,2 мг/кг и 2 мг/кг обеспечивало значимую противоопухолевую активность на 14 день после инокуляции опухоли. Средний размер опухоли составлял 1,148 мм3 (Показатель T/C=57,56%, P-значение<0,001) и 1,384 мм3 (Показатель T/C=69,36%, P-значение=0,006) с задержкой роста опухоли на 1,5 и 0,5 дня, соответственно, при размере опухоли 1,140 мм3. Лечение TA1 в дозе 6 мг/кг может задерживать рост опухоли, однако указанное уменьшение роста не достигает значимой величины (P-значение=0,146). Кроме того, TA1 в дозе 0,2 мг/кг обеспечивал лучшую противоопухолевую активность, чем TA1 в дозе 6 мг/кг.
Кроме того, не наблюдалось значимых изменений массы тела по группам. Соответственно, тимозин может применяться для лечения меланомы.
Пример 2
Исследования на биомаркеры
В описанных выше исследованиях была протестирована группа потенциальных биомаркеров, в том числе ИЛ-7, ИЛ-18, TREM-1, ИФН-α, прокальцитонин, ГМ-КСФ, ИЛ-1α, ИФН-γ, ФНО α, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12p70 и ИЛ-1β. Концентрация некоторых конкретных биомаркеров у мышей, получавших носитель или Задаксин((тимальфазин), показаны на Фиг. 4A-4D. Эти результаты показывают, что указанные биомаркеры могут применяться для оценки эффективности лечения ракового заболевания (однокомпонентной терапии или вариантов комбинированной терапии), для выбора пациентов для эффективного лечения, и для оптимизации дозировки и/или схемы клинических исследований или лечения.
В другом исследовании 8 цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНО-α) в образцах сыворотки в модели системной меланомы B16F10 на мышах C57BL/6 при разных вариантах лечения анализировали с применением ИФА ELISA. Использовали следующие варианты лечения:
1. Носитель 2 раза в сутки (10 п/к
2. Антитело к PD-1 100 мкг/мышь 2 раза в неделю (2 и/п
3. TA1 0,486 мкг/мышь 2 раза в сутки (10 п/к
4. TA1 4,86 мкг/мышь 2 раза в сутки (10 п/к
5. TA1 48,6 мкг/мышь 2 раза в сутки (10 п/к
6. Антитело к PD-1+TA1 (100 мкг/мышь+0,486 мкг/мышь; 2 раза в неделю (2+2 раза в сутки (10 и/п+п/к)
7. Антитело к PD-1+TA1 (100 мкг/мышь+4,86 мкг/мышь; 2 раза в неделю (2+2 раза в сутки (10 и/п+п/к)
8. Антитело к PD-1+TA1 (100 мкг/мышь+48,6 мкг/мышь; 2 раза в неделю (2+2 раза в сутки (10 и/п+п/к)
9. Циклофосфамид 300 мг/кг ежедневно (1 и/п
Концентрации указанных биомаркеров у мышей после лечения приведены на Фиг. 4E-4L. Эти результаты показывают, что указанные биомаркеры могут быть связаны с механизмом действия тимозина, или могут применяться в качестве фармакодинамических маркеров.
Пример 3
Лечение меланомы тимозином в модели меланомы B16F10 с метастазами в легкие на мышах
Материалы и методы
Мыши: Самки мышей B6D2F1/Crl (Charles River), возрастом 9 недель на 1 день (D1) исследования, с массой тела в диапазоне от 19,2 до 24,5 г. Животным предоставляли свободный доступ к воде (вода, очищенная обратным осмосом, 1 м.д. Cl) и пище: модифицированному облученному корму NIH 31 Lab Diet®, состоящему из 18,0% сырого белка, 5,0% сырого жира и 5,0% сырой клетчатки. Мышей размещали на облученной подстилке Enrich-o’cobs(в статических микроизоляторах с 12-часовым световом циклом при 20-22°C (68-72°F) и 40-60% влажности. DRS-NC, в частности, следует рекомендациям, изложенным в Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных в отношении содержания в неволе, ухода, хирургических процедур, регуляции предоставления корма и жидкости, и ветеринарной помощи. Программа содержания и использования животных в DRS-NC аккредитована Международной ассоциацией по оценке и аккредитации условий содержания лабораторных животных, что подтверждает соответствие принятым стандартам содержания и использования лабораторных животных.
Имплантация in vivo: Экспериментальных мышей разделяли на пять экспериментальных групп (n=10) согласно Таблице 1. Шестую группу животных включали в качестве группы «наблюдения» (n=9). Клетки B16-F10 собирали во время фазы логарифмического роста и ресуспендировали в концентрации 7,5×105 клеток/мл в ФСБ. Каждой мыши внутривенно в хвостовую вену инъецировали (в/в) 1,5×105 клеток B16-F10 (0,2 мл суспензии клеток) на день D1 исследования.
Тестируемые вещества: анти-PD1 альфа пептид (кодовое название: анти-PD-1-SCE, лот №5177/0214) и пептид тимозина альфа-1 (тимальфазин, кодовое название SR1, лот №1402-224). В DRS-NC присваивали кодовые названия с целью обеспечения конфиденциальности при проведении штатных тестов. Циклофосфамид (Baxter Pharmaceutical, лот №2E718F, получен 6/7/2013) включали в качестве рефересного контроля. SR1 поставлялся в виде лиофилизированного порошка (90,7% свободное основание), который растворяли в ФСБ с получением раствора для дозирования с концентрацией 22,051 мг/мл, обеспечивавшего дозировку 220,51 мг/кг при объеме дозирования 10 мл/кг. Дозировку на основании массы тела не корректировали. Анти-PD-1-SCE разбавляли ФСБ с получением раствора для дозирования с концентрацией 10,0 мг/мл, обеспечивающем дозу 100 мг/кг при объеме дозирования 10 мл/кг. Дозировку на основании массы тела не корректировали. Циклофосфамид разбавляли солевым раствором с получением 15,0 мг/мл раствора для дозирования, обеспечивающего дозу 300 мг/кг при объеме дозирования 15 мл/кг. Дозировку корректировали исходя из массы тела. Циклофосфамид готовили один раз в начале исследования и хранили при 4°C.
Лечение: В Таблице 4A приведен общий план лечения:
Животные группы 1 получали ФСБ п/к (2 раза в сутки до конца исследования) и служили в качестве контрольной группы.
Группа 2 получала SR1 п/к в дозе 220,51 мг/кг (200 мг/кг свободное основание) (2 раза в сутки до конца исследования).
Группа 3 получала анти-PD-1-SCE и/п в дозе 100 мг/кг (2 раза в неделю (3).
Группа 4 получала и SR1, и анти-PD-1-SCE в дозе 220,51 мг/кг п/к (2 раза в сутки до конца исследования) и 100 мг/кг и/п (2 раза в неделю (3) соответственно.
Группа 5 служила группой положительного контроля и получала циклофосфамид в дозе 300 мг/кг и/п (ежедневно (1),
Группа животных 6 служила в качестве группы «наблюдения» и не получала лечения.
Конечная точка: конечная точка исследования B16MET-e117 была определена как 100 метастазы на оба легких. По 2-3 животных из группы «наблюдения» умерщвляли с трехдневными интервалами, начиная с 9 дня и подсчитывали метастатические очаги в легких. Общее число получали путем добавления числа подсчитанных очагов в верхних, средних, нижних и посткавальных долях правого легкого к числу подсчитанных очагов в левом легком. Исследование прекращали на день D16, всех животных умерщвляли и подсчитывали метастазы. Процент ингибирования был определен как разность числа метастатических очагов в заданной контрольной группе и числа метастатических очагов в получающей лекарственное лечение группе, выраженная в процентах от числа метастатических очагов в заданной контрольной группе:
% Ингибирования=[1 - (Число очагов при лечении/Число очагов в контроле)] (100
Токсичность: Животных взвешивали ежедневно в течение первых пяти дней исследования и затем дважды в неделю. Мышей часто осматривали для обнаружения явных признаков каких-либо нежелательных связанных с лечением побочных эффектов, и регистрировали клинические признаки токсичности при их наличии. Приемлемую токсичность определяли как соответствующую групповому среднему снижению массы тела менее чем на 20% в ходе исследования и не более чем одному связанному с лечением (TR) случаю смерти среди 10 получавших лечение животных. Любая схема дозирования, обуславливающая бόльшую токсичность, считается превышающей максимальную переносимую дозу (MTD). Случай смерти классифицируют как TR, если смерть обусловлена побочными эффектами лечения, что подтверждается клиническими признаками и/или результатами вскрытия, или неизвестными причинами в течение периода дозирования или в пределах 14 дней от введения последней дозы. Случай смерти классифицируют как не связанный с лечением (NTR) при отсутствии данных, указывающих на взаимосвязь смерти с побочными эффектами лечения.
Статистический и графический анализы: Для получения всех графических изображений и статистического анализа использовали Prism (GraphPad) для Windows 6.02. U-критерий Манна-Уитни для анализа медиан использовали для определения статистической значимости различий метастатических очагов B16F10 в контрольных и получавших лечение группах на день D16. Проводили двусторонний статистический анализ при P=0,05. Строили «диаграмму размаха», чтобы показать распределение подсчитанных метастатических очагов для каждой экспериментальной группы на день D16.
В Prism результаты регистрируются как незначимые (н/з) с P>0,05, значимые (обозначены «*») с 0,01<P (0,05, очень значимые («**») с 0,001<P (0,01, и экстремально значимые («***») с P (0,001. Поскольку U-критерий Манна-Уитни представляет собой критерий значимости и не обеспечивает оценку величины различий между группами, все уровни значимости регистрируют либо как значимые, либо как незначимые в Таблице 4B.
Процедуры:
(Имплантация клеток за (1) день до начала исследования.
(59 самок мышей CR B6D2F1 подготавливают путем введения 1,5×105 опухолевых клеток B16MET в 0% Матригеле в/в
(в хвостовую вену.
(Объем инъецируемых клеток составляет 0,2 мл/мышь.
(Возраст на дату начала исследования: 8-12 недель.
(Измерение массы тела: 5/2, затем 2 раза в неделю до конца исследования
(Подсчет метастазов: в конечной точке
(Немедленная регистрация любых нежелательных реакций или случаев смерти в RM, SD, RD или SH.
(Любое отдельное животное, у которое наблюдается снижение массы тела, составляющее>30% по результатам однократного измерения, или снижение массы тела, составляющее>25% по результатам трех последовательных измерений, умерщвляют.
(В любой группе, где наблюдается среднее снижение массы тела>20% или смертность>10% дозирование прекращают.
(Животных в указанной группе не умерщвляют и позволяют им восстановиться. В группе, где наблюдается>20% снижение массы тела, отдельных животных, у которых наблюдается индивидуальное снижение массы тела до уровня конечной точки, умерщвляют. В тех случаях, когда связанное с лечением снижение массы тела в группе восстанавливается до значений в пределах 10% от исходных показателей массы тела, дозирование может быть возобновлено с использованием схемы, предусматривающей более низкие дозы или меньшую частоту введения. В индивидуальном порядке могут допускаться исключения, касающиеся % восстановления массы тела при не связанных с лечением изменениях.
(Конечная точка: приблизительно 100 метастазов на оба легких.
(Умерщвление умирающих животных согласно CRL-NC СОП №687. Животных с признаками респираторного дистресса также умерщвляют согласно описанию выше.
Культура опухолевых клеток: Клетки B16MET культивировали до середины фазы логарифмического роста на среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 2 мМ глутамин, 100 ед/мл натриевой соли пенициллина G, 0,075% бикарбоната натрия, 25 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина. Опухолевые клетки культивировали в колбах для тканевых культур в увлажненном инкубаторе при 37°C, в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха.
Получали модель меланомы B16F10 с метастазами в легкие на мышах. Приблизительно 1,5×105 клеток B16-F10 (0,2 мл суспензии клеток) культивировали in vitro и внутривенно вводили (0 день) самкам мышей B6D2F1/Crl. На 1 день начинали дозирование экспериментальными агентами.
«Группу наблюдения», не получавшую лечения, использовали для оценки, на протяжении периода 15 дней, числа метастазов. На 9 день 3 животных из «группы наблюдения» умерщвляли и подсчитывали метастазы в легких (полученные авторами исторические данные указывают на то, что в указанный момент в легком не получающих лечения мышей может обнаруживаться примерно>50 метастазов). Три дня спустя исследовали еще трех мышей. При достижении числа метастазов, составляющего приблизительно 50-100, умерщвляли животных всех групп исследования и подсчитывали итоговое число метастазов. Показатель группы «наблюдения» не включали в итоговый анализ эффективности. 50-100 местастазов принимали за целевое значение, поскольку на этом уровне большинство индивидуальных метастазов можно с легкостью подсчитать и метастазы с меньшей вероятностью сливаются друг с другом, что затрудняет подсчет.См. Фиг. 5.
В одном исследовании (исследование I) мышам вводили носитель (отрицательный контроль), циклофосфамид (положительный контроль), TA1, анти-PD-1 или комбинацию TA1+анти-PD-1, и оценивали число метастазов. Результат приведен в Таблице 4B, ниже, и на Фиг. 6A и Фиг. 6B.
Значения группового среднего изменения массы тела в процентах, начиная с 1 дня, у мышей B16MET-e117 приведены на Фиг. 6B.
Этот результат показывает, что тимозин уменьшает метастазы в легкие в модели меланомы, однако при использовании указанных конкретных дозировок анти-PD-1 аддитивный эффект не наблюдается.
Во втором исследовании (Исследование II), носитель (отрицательный контроль), циклофосфамид (положительный контроль), TA1, анти-PD-1 или комбинацию TA1+анти-PD-1 вводили мышам в разных дозах. Дизайн исследования и результаты приведены в Таблице 5A и Таблице 5B, ниже, и на Фиг. 7A- 7C.
План лечения для исследования II: В указанном исследовании самкам мышей B6D2F1 в 13 группах вводили дозы в соответствии с протоколом в Таблице 5A. И SR1, и носитель вводили подкожно (п/к) 2 раза в сутки на протяжении всего исследования (2 раза в сутки до конца исследования). Антитело к PD1 вводили интраперитонеально (и/п) дважды в неделю на протяжении двух недель (2 раза в неделю (2). Однократную дозу циклофосфамида вводили и/п (ежедневно (1). В Таблице 5A представлен общий план лечения.
Животные в группе 1 получали ФСБ и служили в качестве контрольной группы.
Группы 2-4 получали SR1 в дозе 0,4862, 4,862 и 48,62 мкг/мышь (0,441, 4,41 и 44,1 мкг/мышь в виде свободного основания), соответственно.
Группы 5 и 6 получали анти-PD-1 в дозе 33,33 и 100 мкг/мышь, соответственно.
Группы 7-9 получали SR1 в дозе 0,4862, 4,862 и 48,62 мкг/мышь в комбинации с анти-PD-1 в дозе 33 мкг/мышь, соответственно.
Группы 10-12 получали SR1 в дозе 0,4862, 4,862 и 48,62 мкг/мышь в комбинации с анти-PD-1 в дозе 100 мкг/мышь, соответственно.
Группа 13 служила группой положительного контроля и получала циклофосфамид в дозе 300 мг/кг.
Группа животных 14 служила в качестве группы «наблюдения»и не получала лечения.
Этот результат показывает, что при определенных дозировках в получавших лечение комбинацией ZDX (Ta1)+анти-PD-1 группах наблюдается меньше метастазов по сравнению с группами, получавшими лечение Ta1 или только анти-PD-1. Указанный результат свидетельствует, что лечение тимозином может обеспечивать положительное статистически значимое уменьшение уровня метастазов в модели на мышах метастазов B16F10 в легкие, с трендами эффективности для комбинации с антителом к PD-1.
Анализировали активность 44 биомаркеров у мышей при каждом варианте лечения. Некоторые из указанных биомаркеров демонстрировали статистически значимо различающуюся активность у мышей, получавших лечение только Ta1 или только анти-PD-1, и у мышей, получавших лечение комбинацией Ta1 и анти-PD-1. Такие биомаркеры включают, не ограничиваясь перечисленными, аполипопротеин А-I, лептин, лимфотактин, макрофагальный колониестимулирующий фактор‐1 (M‐КСФ‐1), моноцитарный хемотактический белок‐5 (MCP‐5), фактор стволовых клеток (SCF) и молекулу адгезии клеток сосудов‐1 (VCAM‐1).
Аналогичное исследование проводили в независимой лаборатории для подтверждения результатов. Результат представлен в Таблице 6 и на Фиг. 8. Интересно, что в указанном исследовании анти-PD-1 не был столь же эффективен, как в исследовании, описанном выше, однако TA1 был. Это может объясняться различиями антител к PD-1 из разных партий, полученных обеими лабораториями, и тем фактом, что B16F10 не всегда отвечает на анти-PD-1 в моделях легочных метастазов. Важно отметить, что при применении комбинации анти-PD-1 и TA1, в частности, низкой дозы TA1, наблюдалось статистически значимое уменьшение уровня метастазов в легких, и положительные тренды в двух других получавших комбинацию группах. Соответственно, указанные предварительные исследования действительно подтверждают аддитивные или возможные синергические эффекты указанных двух компонентов комбинации, в частности, в случаях, когда однокомпонентная терапия одним из них, по-видимому, не работает.
Таблица 6. Противоопухолевая активность тимальфазина при применении в качестве однокомпонентной терапии и в комбинации с антителом к PD-1 при лечении системной меланомы B16F10 в модели на мышах
Если не указано иное, все технические и научные термины в настоящем документе имеют значения, соответствующие общеизвестным для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении или тестировании настоящего изобретения могут применяться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, в настоящем документе описаны предпочтительные способы и материалы. Все цитируемые публикации, патенты и патентные публикации включены в настоящий документ полностью посредством ссылки для любых целей.
Обсуждаемые в настоящем документе публикации представлены исключительно ввиду их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как допущение невозможности датирования настоящего изобретения более ранней датой относительно такой публикации на основании предшествующего изобретения.
Хотя настоящее изобретение было описано на примерах конкретных вариантов реализации, следует понимать, что возможны дополнительные модификации, и настоящей заявкой охвачены любые варианты, способы применения или адаптации настоящего изобретения, в целом соответствующие принципам настоящего изобретения, в том числе такие отступления от настоящего описания, входящие в рамки известной или принятой практики в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и применимые к существенным признакам, изложенным выше и входящим в объем прилагаемой формулы изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>САЙКЛОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК./SCICLONE PHARMACEUTICALS, INC.
КИНГ, Роберт С./KING, Robert S.
ТАТХИЛЛ, Синтия/TUTHILL, Cynthia
БЛОБЕЛЬ, Фридхельм/BLOBEL, Friedhelm
<120>ЛЕЧЕНИЕ РАКА ИММУНОСТИМУЛЯТОРАМИ/
TREATMENT OF CANCER WITH IMMUNE STIMULATORS
<130>№ДЕЛА ПАТЕНТНОГО ПОВЕРЕННОГО: SCIC-113/01WO 191485-3185
<150>62/066862
<151>2014-10-12
<150>62/215433
<151>2015-09-08
<160>1
<170>PatentIn, верс.3.5
<210>1
<211>28
<212>PRT/БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Пептид тимозина-альфа 1
<400>1
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn
20 25
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НОВЫЙ ПОДХОД К ЛЕЧЕНИЮ РАКА С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ | 2016 |
|
RU2817047C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ ПЛИНАБУЛИНА В КОМБИНАЦИИ С ИНГИБИТОРАМИ КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ ИММУННОГО ОТВЕТА | 2016 |
|
RU2723021C2 |
| НОВЫЙ ПОДХОД К ЛЕЧЕНИЮ РАКА С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ | 2016 |
|
RU2711380C2 |
| СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ВКЛЮЧАЮЩИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ TIGIT АГЕНТЫ | 2017 |
|
RU2765410C2 |
| МОДУЛЬНЫЕ ЧАСТИЦЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ | 2014 |
|
RU2672055C2 |
| СПОСОБ УМЕНЬШЕНИЯ МУЛЬТИЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРИПИРОФОСФАТА ИНОЗИТА | 2010 |
|
RU2563127C2 |
| КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ТУКАРЕСОЛ ИЛИ ЕГО АНАЛОГИ | 2017 |
|
RU2753543C1 |
| СЛИТЫЕ БЕЛКИ IL-10/FC, ПРИГОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ЭНХАНСЕРОВ ИММУНОТЕРАПИИ | 2020 |
|
RU2825306C1 |
| ПРОТИВОРАКОВЫЙ АГЕНТ, СОДЕРЖАЩИЙ БЕЛОК LK8 В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА | 2004 |
|
RU2306147C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА ИНГИБИТОРА ИММУННОЙ КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ | 2018 |
|
RU2760132C1 |
Изобретение относится к лечению рака или его метастаза у субъекта. Способ лечения меланомы или ее метастаза у субъекта включает введение композиции, содержащей пептид тимозина-альфа и ингибитор запрограммированной гибели клеток-1 (PD-1), причем пептид тимозина-альфа вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 0,1 до 10 мг/сутки, причем ингибитор PD-1 вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 0,1 до 10 мг/кг. Изобретение обеспечивает синергетический эффект совместного применения тимозина-альфа и PD-1 при лечении меланомы. 21 з.п. ф-лы, 23 ил., 6 табл., 3 пр.
1. Способ лечения меланомы или ее метастаза у субъекта, включающий введение композиции, содержащей пептид тимозина-альфа и ингибитор запрограммированной гибели клеток-1 (PD-1), причем пептид тимозина-альфа вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 0,1 до 10 мг/сутки, причем ингибитор PD-1 вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 0,1 до 10 мг/кг.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой человека.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит дополнительный агент, направленный против меланомы.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная дозировка пептида тимозина-альфа находится в пределах диапазона от 0,5 до 10 мг/сутки.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пептид тимозина-альфа представляет собой тимозин-альфа-1 (TA1).
6. Способ по п. 5, включающий введение TA1 ежедневно в течение периода, составляющего 1-10 дней, после чего в течение 1-5 дней TA1 не вводят.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что TA1 вводят ежедневно в течение 3-5 дней, после чего в течение 2-4 дней TA1 не вводят.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что TA1 вводят ежедневно в течение 4 дней, после чего в течение 3 дней TA1 не вводят.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит ингибитор киназы.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный ингибитор киназы содержит сорафениб.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный ингибитор киназы вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 10 до 200 мг/сутки.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит антинеопластический активатор апоптоза при тепловом шоке (HSAA).
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный HSAA содержит STA-4783 (элескломол).
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный HSAA вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 0,01 до 100 мг/кг/сутки.
15. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение антитела против ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами антигена 4 (CTLA4).
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанное антитело против CTLA4 включает 9H10, MDC010, 1F4, BNI3, Q01, A01, M08, 1B8, WKH203, ab9984, ab13486, ипилимумаб, тицилимумаб или их комбинацию.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанное антитело против CTLA4 вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 0,001 до 50 мг/кг/сутки.
18. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение алкилирующего антинеопластического агента (AlkAA).
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный алкилирующий антинеопластический агент (AlkAA) содержит дакарбазин (DTIC).
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный алкилирующий антинеопластический агент (AlkAA) вводят указанному субъекту в дозировке, находящейся в пределах диапазона от 700 до 1300 мг/кг/сутки.
21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение указанному субъекту химиотерапевтического агента.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что указанный химиотерапевтический агент представляет собой дакарбазин (DTIC) или цисплатин.
| WO 2006062917 A2, 15.06.2006 | |||
| WO 2009075813 A1, 18.06.2009 | |||
| WO 2009076587 A1, 18.06.2009 | |||
| WO 2009079338 A1, 25.06.2009 | |||
| CHRISTIAN MEISEL ET AL | |||
| GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR TO REVERSE SEPSIS-ASSOCIATED IMMUNOSUPPRESSION // American journal of respiratory and critical care medicine, 01.10.2009, Vol:180, Nr:7, р.640 - 648 |
