СЛИТЫЕ БЕЛКИ IL-10/FC, ПРИГОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ЭНХАНСЕРОВ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/54 A61K38/20 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в общем относится к области противораковой терапии, в частности, к соагентам, подходящим для противораковой терапии, такой как иммунотерапия путем адоптивного переноса Т-клеток (ACT) и блокирование иммунных контрольных точек.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

За последнее время иммунотерапия путем адоптивного переноса Т-клеток (ACT) дала великолепные клинические результаты. В отличие от обычной химио- и лучевой терапии, иммунотерапия активирует иммунную систему хозяина, чтобы она атаковала злокачественные новообразования, и это потенциально обеспечивает длительную защиту от рецидива с меньшей токсичностью по сравнению с обычной химио- и лучевой терапией. При адоптивной терапии CD8+ Т-клетками, большие количества опухолеспецифических Т-клеток получают из организма пациентов, размножают in vitro и вводят путем инфузии обратно пациентам (Jiang et al., 2019, Cancer Lett., 10;462:23-32; Levine et al, 2017 Cell Therapy. Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. 4, 92-101). T-клетки можно размножить из индуцированных естественным образом опухолеспецифических CD8+ Т-клеток, выделенных из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ), или генетически модифицированных аутологических циркулирующих CD8+ Т-клеток. Сконструированные Т-клетки экспрессируют рецепторы против специфических опухолевых антигенов, включая химерные антигенные рецепторы (CAR) и Т-клеточные рецепторы (TCR), полученные из культивированных клонов Т-клеток, соответственно. Наиболее успешная ACT, терапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором против CD19 (CAR-T), направленная против В-клеточной лимфомы, уже одобрена для применения на основании доказательства эффективности (June et al., 2018, Science 359, 1361-1365). Несмотря на большой успех в лечении гематологических злокачественных новообразований, солидная опухоль остается главной проблемой для ACT, и излечение остается редким (Lim et al, 2017, Cell 168, 724-740; Jiang et al., 2019, выше). Сообщалось, что инфильтрирующие опухоль лимфоциты (ИОЛ) постепенно утрачивают эффекторные функции и способность к пролиферации в микроокружении опухоли (МОО), что называют 'истощением' Т-клеток (Thommen et al., 2018, Cancer Cell, 33, 547-562). С метаболической точки зрения, постоянная стимуляция антигеном и другой метаболический стресс в МОО сильно изменяет сигнализацию Т-клеток и нарушает их противоопухолевый иммунный ответ (Schietinger et al, 2016, Immunity 45, 389-401; Vodnala et al, 2019, Science 363). Было показано, что метаболическое перепрограммирование Т-клеток для адоптивного переноса посредством предварительной обработки ex vivo улучшает иммунотерапию ACT (Li et al., 2019, Nat. Rev. Clin. Oncol, doi: 10,1038/s41571-019-020). Было проведено очень мало доклинических исследований метаболического вмешательства in vivo в инфильтрирующие опухоль CD8+ Т-клетки (Chamoto et al., 2017, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 114, E761-E770; Chowdhury et al, 2018, Cancer Immunol. Res. 6, 1375-1387), но в этих способах отсутствовала специфичность к клеткам-мишеням. Было проведено несколько доклинических исследований метаболического вмешательства ex vivo в специфические к опухолевым антигенам CD8+ Т-клетки или CAR Т-клетки (Klebanoff et al, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1969-1974; Vodnala et al, 2019, выше; Klebanoff et al, 2017, JCI Insight 2). Тем не менее, все еще отсутствует простое и безопасное метаболическое вмешательство in vivo, которое можно комбинировать с ACT, чтобы устранить солидные опухоли и вызвать долговременное излечение.

Интерлейкин-10 (IL-10), представитель семейства цитокинов IL-10, в основном считают иммуносупрессивным, так как он уменьшает повреждение ткани, вызванное неконтролируемыми воспалительными ответами (Moore et al, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765). Использование в клинике его противовоспалительных свойств было ограничено его коротким временем полужизни в сыворотке крови, и, следовательно, был разработан слитый белок, содержащий IL-10 человека и фрагмент Fc IgG (hIL-10/Fc), и экспрессирован bPichiapastoris (Guo et al, 2012, ProteinExpr Purif., 83(2): 152-6), чтобы увеличить время полужизни в кровотоке IL-10 человека in vivo, и его иммуноингибиторное действие было предложено для лечения аутоиммунного заболевания.

Были разработаны гетер о логичные мультимерные белки, содержащие цетуксимаб и две молекулы IL-10, ковалентно связанные полипептидным линкером (CmAb-(IL-10)2), чтобы продлить время полужизни IL-10 и позволить его направленную доставку в опухоль (Qiao et al., 2019, Cancer Cell, 35(6), 901-915).

Следовательно, существует крайняя необходимость в безопасных средствах для метаболического перепрограммирования Т-клеток для адоптивного переноса, которые можно комбинировать с ACT, чтобы вызвать долговременное излечение от солидных опухолей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданных открытиях, состоящих в том, что метаболическое перепрограммирование инфильтрирующих опухоль лимфоцитов с помощью слитого белка IL-10/Fc заметно повышает эффективность ACT против прижившихся солидных опухолей в моделях на мышах, несущих сингенную опухоль. Неожиданно было обнаружено, что слитый белок IL-10/Fc согласно настоящему изобретению селективно приводит к размножению опухолеспецифических PD-1+TIM-3+CD8+ Т-клетки в микроокружении опухоли, что свидетельствует о том, что слитый белок оказывает незначительное системное влияние на другие субпопуляции клеток, и при этом имеет хороший профиль безопасности по сравнению с методами лечения на основе IL-12 или IL-15 (Wang et al, 2017, Nat. Commun., 8, 1-15; Momin et al, 2019, Sci. Transl. Med. 11, eaaw2614; Berger et al, 2009, Blood, 114, 2417-2426, Huntington et al, 2011, Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A., 108, 6217-6222; Guo et al 2015, J. Immonol. 195, 2353-2364). Такое непосредственное влияние на окончательно истощенные CD8+ Т-клетки позволяет возобновить функцию и пролиферацию инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток путем метаболического перепрограммирования, при этом ожидается гораздо меньше побочных действий, чем у других терапевтических подходов, которые усиливают зависимые от CD8+ Т-клеток ответы опухоли путем регуляции продукции IFNγ дендритными клетками (ДК) посредством рецептора IL-10 на дендритных клетках, таких как, например, гетерологичный мультимерный белок CmAb-(IL-10)2, предложенный Qiao et al, 2019, выше.

Следует отметить, что наблюдаемая поразительная эффективность (90% получивших лечение мышей с очень агрессивными опухолями были полностью вылечены) комбинации слитого белка IL-10/Fc согласно настоящему изобретению и ACT была полностью неожиданной, так как IL-10/Fc обычно считают иммуносупрессивным и оказывающим отрицательное влияние на терапию рака цитокином.

Поскольку на сегодняшний день не существует доступной стратегии метаболического вмешательства in vivo в инфильтрирующие опухоль CD8+ Т-клетки для высокоэффективной иммунотерапии рака путем ACT, есть огромный потенциал для применения слитого белка IL-10/Fc согласно настоящему изобретению или его вариантов в качестве энхансера иммунотерапии, такой как способы терапии путем ACT или блокирование иммунных контрольных точек.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложен Fc-слитый белок для применения для предотвращения и/или лечения рака, причем указанный Fc-слитый белок представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом или С-концом домена Fc посредством полипептидного линкера (например, гибкого шарнира), и два гетерологичных полипептида нековалентно соединены в гомодимер.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один Fc-слитый белок согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество и по меньшей мере один агент, подходящий для противораковой терапии.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение Fc-слитого белка согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для предотвращения и/или лечения рака.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения рака, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного Fc-слитого белка согласно настоящему изобретению.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ стимуляции иммунитета или восстановления способности реагировать на иммунотерапию у субъекта, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту Fc-слитого белка согласно настоящему изобретению в комбинации с терапией путем блокирования иммунных контрольных точек.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1 представлено, какой IL-10/Fc стимулировал OXPHOS в CD8+ Т-клетках в фазе примирования и повышал пролиферацию Т-клеток. (а) Слева: схематическое изображение слитого белка согласно настоящему изобретению в виде гомодимера, описанного здесь (IL-10/Fc), содержащего два полипептида, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека или ее вариант, причем каждый гетерологичный полипептид связан ковалентной связью с N-концом или С-концом домена Fc посредством полипептидного линкера L, и два указанных полипептида IL-10 нековалентно соединены в гомодимер (пунктирные линии между гетерологичными полипептидами IL-10); справа: ЭФ в ПААГ/ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) слитого белка из рекомбинантного IL-10 человека и Fc IgG1. Дисульфидная связь между каждым из мономеров расщеплялась в присутствии восстанавливающего агента ДТТ (дитиотреитол). (b и с) Свежевыделенные спленоциты мыши Pmel-1 метили отслеживающим пролиферацию красителем CFSE (сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина) и стимулировали различными концентрациями распознаваемого ими пептида hgp100 в присутствии или без IL-10/Fc в течение 3 дней. Количества CD8⁺ Т-клеток (b) и проценты неделящихся клеток (с) анализировали с помощью проточной цитометрии. (d) Типичная кривая скорости потребления кислорода (OCR) для CD8⁺ Т-клеток, стимулированных, как описано в (b и с), (е) Статистический анализ максимальной OCR из (d). (f) Типичная кривая скорости внеклеточного окисления (ECAR) для CD8⁺ Т-клеток, стимулированных, как описано в (b и с), (g) Статистический анализ максимальной ECAR из (f). (h) Соотношения OCR/ECAR из (е) и (g). Представлены результаты по меньшей мере трех независимых экспериментов. Планки погрешностей указывают на стандартную ошибку среднего значения (СО).

На Фигуре 2 представлено, что IL-10/Fc перепрограммирует метаболизм Т-клеток после стимуляции TCR посредством пируват-зависимого способа, (a) CD8⁺ Т-клетки мыши Pmel-1 активировали путем стимуляции пептидами hgp100 в течение 3 дней и оставляли в покое еще на 4 дня, затем следовало совместное культивирование с клетками меланомы мыши B16F10 в течение дополнительных 2 дней, в присутствии или без IL-10/Fc. Контрольные CD8 Т-клетки Pmel-1 оставляли в фазе покоя без клеток B16F10. Типичная кривая OCR и типичная кривая ECAR для CD8⁺ Т-клеток, выделенных из совместной культуры. (b) Статистический анализ максимальной OCR из (а), (с) Статистический анализ максимальной ECAR из (a), (d) Соотношения OCR/ECAR из (с) и (d). (е) Количества опухолевых клеток B16F10 из (a), (f) Количества CD8⁺ Т-клеток из (a), (g) Схематическое изображение путей метаболизма и ингибиторов для каждой части, (h) CD8⁺ Т-клетки мыши Pmel-1 активировали путем стимуляции пептидами hgp100 в течение 3 дней и оставляли в покое еще на 4 дня, с последующей повторной стимуляцией тетрамерами против CD3 в течение дополнительных 2 дней, в присутствии или без IL-10/Fc, и в присутствии различных ингибиторов в (g). Кратность изменения количества CD8⁺ Т-клеток представляет собой количества клеток с IL-10/Fc относительно таковых без IL-10/Fc. (i) Базальная OCR для CD8⁺ Т-клеток из (h). Представлены результаты по меньшей мере трех независимых экспериментов. Планки погрешностей обозначают СО.

На Фигуре 3 представлено, что IL-10/Fc усиливает действие адоптивной терапии Т-клетками, чтобы устранить прижившиеся высокоагрессивные опухоли меланомы мыши, (а) Схема эксперимента по комбинированной терапии ACT CD8⁺ Т-клетками Pmel и IL-10/Fc для модели меланомы у мыши B16F10. (b-е) Кривые роста опухоли для отдельных мышей в контрольной группе ФБР (b), в группах монотерапии IL-10/Fc (с), монотерапии ACT (d) и комбинированной терапии (е) мышей, которых лечили, как описано в (a), (f) Схема эксперимента по комбинированной терапии ACT CD8⁺ Т-клетками Pmel и IL-10/Fc для модели меланомы у мыши B16F10 со сниженными дозами, (g) Отслеживали рост опухоли у мышей, которых лечили, как описано в (f). (h) График выживаемости мышей, которых лечили, как описано в (f). (i и j) Кривые роста опухоли для отдельных мышей в группе монотерапии ACT (i) и комбинированной терапии (j) мышей, которых лечили, как описано в (f). Представлены результаты по меньшей мере трех независимых экспериментов. Планки погрешностей обозначают СО.

На Фигуре 4 представлена комбинация IL-10/Fc с адоптивной терапией Т-клетками, чтобы устранить прижившиеся опухоли во множестве моделей сингенной опухоли у мышей, (а) Отслеживали рост опухоли у мышей, которых лечили, как описано на Фиг. 3(a). (b) График выживаемости мышей, которых лечили, как описано на Фиг. 3(a). (с) Выжившим мышам из группы комбинированной терапии, как на Фиг. 3(a), повторно вводили 1 х 10⁵ клеток B16F10 подкожно на 90 день после первичной прививки. Непримированных мышей дикого типа инокулировали тем же количеством опухолевых клеток, что и контрольных мышей. Отслеживали график выживаемости мышей, (d) 1×10⁶ клетками меланомы мыши YUMM1.7-OVA подкожно инокулировали мышей C57BL/6J. OVA-специфические OT-I CD8⁺ Т-клетки применяли в качестве ACT в данной модели. График эксперимента был таким же, как на Фиг. 3(а.) Отслеживали рост опухоли, (е) График выживаемости мышей, которых лечили, как описано в (d). (f) 1×10⁶ клетками рака толстого кишечника мыши MC38-HER2 подкожно инокулировали мышей C57BL/6J. HER2-CAR-T-клетки применяли в качестве ACT в данной модели. График эксперимента был таким же, как на Фиг. 3(а.) Отслеживали рост опухоли, (g) График выживаемости мышей, которых лечили, как описано в (f). Представлены результаты по меньшей мере трех независимых экспериментов для (а) и (b). Результаты в (с) собраны по двум независимым экспериментам. Планки погрешностей обозначают СО.

На Фигуре 5 показано, что IL-10/Fc повышает противоопухолевый иммунитет, (а) Схема эксперимента по исследованию механизма с помощью проточной цитометрии в модели меланомы у мыши B16F10. Мышей умерщвляли на 14 день и ИОЛ анализировали с помощью проточной цитометрии. (b) Плотность всех CD45.2⁺ лейкоцитов, NK-клеток и CD11c⁺ дендритных клеток (ДК) в опухоли, (с) Проценты Foxp3⁺ регуляторных Т-клеток (Treg) из всех CD4⁺ Т-клеток и отношения совокупного количества CD8⁺ Т-клеток к количеству клеток Treg. Представлены результаты по меньшей мере трех независимых экспериментов. Планки погрешностей обозначают СО.

На Фигуре 6 показано, что IL-10/Fc специфически приводит к размножению PD-1+ TIM-3+ цитотоксических Т-клеток. ИОЛ B16F10 анализировали с помощью проточной цитометрии, как на Фиг. 5(a). (а) Плотность всех CD3⁺ Т-клеток, всех CD8⁺ Т-клеток и CD4⁺ Т-клеток в опухоли. (b) Иммунофлуоресцентное окрашивание CD3 на срезах опухоли с Фиг. 5(a). Масштабный отрезок: 50 мкм. (с) Примеры цитограмм, полученных методом проточной цитометрии, для эндогенных CD8⁺ Т-клеток и перенесенных CD8⁺ Т-клеток Pmel. Статистический анализ процентов PD-1⁺ TIM-3⁺ среди эндогенных CD8⁺ Т-клеток и среди перенесенных CD8⁺ Т-клеток Pmel. (d и е) Плотность PD-1⁺ TIM-3⁺ эндогенных CD8⁺ Т-клеток (d) и PD-1⁺ TIM-3⁺ перенесенных CD8⁺ Т-клеток Pmel (е) в опухоли, (f) Экспрессия IL-10R на различных субпопуляциях эндогенных CD8⁺ Т-клеток из групп ФБР клеток ИОЛ B16F10. (g) Экспрессия PD-1 на эндогенных PD-1+ TIM-3+ CD8⁺ Т-клетках и на перенесенных PD-1⁺ TIM-3⁺ CD8⁺ Т-клетках Pmel. (h) Процент полифункциональных (IFNγ⁺ TNFα⁺ гранзим В⁺) CD8 Т-клеток среди эндогенных CD8⁺ Т-клеток и среди перенесенных CD8⁺ Т-клеток Pmel. (i) Процент полифункциональных (IFNγ⁺ TNFα⁺ гранзим В⁺) CD8 Т-клеток среди эндогенных PD-1⁺ TIM-3⁺ CD8⁺ Т-клеток и среди перенесенных PD-1⁺ TIM-3⁺ CD8⁺ Т-клеток Pmel. (j и k) Сортированные различные субпопуляции CD8⁺ Т-клеток в зависимости от экспрессии PD-1 и TIM-3 с Фиг. 2(h), культивированные совместно с опухолевыми клетками B16F10 в течение 2 дней. Оценивали количества CD8⁺ Т-клеток (j) и эффективность уничтожения клеток B16F10 (k) с помощью проточной цитометрии. (l) Анализ фенотипа памяти (экспрессия CD62L и экспрессия CD44) PD-1⁺ TIM-3⁺ эндогенных CD8⁺ Т-клеток из ИОЛ и спленоцитов. (m) Типичная кривая OCR и максимальная OCR PD-1⁺ TIM-3⁺ CD8⁺ Т-клеток, как на Фиг. 2(h). Представлены результаты по меньшей мере трех независимых экспериментов. Планки погрешностей обозначают СО.

На Фигуре 7 показано, что IL-10/Fc усиливает действие терапии путем блокирования контрольных точек, чтобы устранить прижившиеся опухоли толстого кишечника мыши, (а) Схема эксперимента комбинированной терапии α-PD-1 и IL-10/Fc модели рака толстого кишечника мыши СТ26. 3×10⁵ клеток рака толстого кишечника мыши СТ26 подкожно инокулировали мышам BALB/c. Антитело против PD-1 (RMP-14) давали раз в три дня в качестве контроля. (b) Кривые роста опухоли для отдельных мышей каждой группы, (с) Отслеживали рост опухоли у мышей, которых лечили, как описано в (а), (d) График выживаемости мышей, которых лечили, как описано в (а). Представлены результаты по меньшей мере двух независимых экспериментов. Планки погрешностей обозначают СО.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке "Fc-слитый белок" относится к Fc-слитому белку (гомодимеру), содержащему последовательность IL-10 человека или ее вариант и фрагмент Fc IgG, связанные друг с другом ковалентной связью посредством гибкого шарнира. Согласно одному аспекту, фрагмент Fc IgG может представлять собой фрагмент Fc из изоформы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Фрагменты Fc IgG могут быть мутированы для уменьшения антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (АЗКЦ), как описано в Czajkowsky et al, 2012, EMBO Mol. Med, 1015-1028, или для увеличения времени полужизни или уровня IgG in vivo, как описано в Zalevsky et al, 2010, Nat. Biotechnol 28, 157-159; Vaccaro et al, 2005, Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288 (например, IL-10/Fc).

В соответствии с конкретным вариантом реализации в домены Fc IgG1 могут быть введены точечные мутации, как описано в Armour et al, 1999, Eur. J. Immonol. 29, 2613-2624, или Steele et al, 1995, J. Immonol. 154, 5590-5600, чтобы получить нецитолитический домен Fc IgG1.

В соответствии с дополнительным конкретным вариантом реализации, вводят по меньшей мере три мутации, выбранные из L234V, L235A и P331S, в домен Fc IgG1 с последовательностью SEQ ID NO: 2.

В соответствии с другим дополнительным конкретным вариантом реализации вводят по меньшей мере две мутации, выбранные из A330S и P331S, в домен Fc IgG2 с последовательностью SEQ ID NO: 5.

В соответствии с другим дополнительным конкретным вариантом реализации вводят по меньшей мере одну мутацию P329G в домен Fc IgG4 с последовательностью SEQ ID NO: 11.

В данной заявке "IL-10 человека или его вариант" включает последовательности, содержащие последовательность нативного IL-10 человека и ее варианты, такие как описанные вМитт et al, 2011, Cancer Cell, 20, 781-796; Guo, et al, 2012, Protein Expr. Purif., 83, 152-156 (2012); Zheng et al, 1997, J. Immonol, 158, 4507-13; Qiao et al, 2019, Cancer Cell 35, 901-915. e4.

В соответствии с конкретным аспектом, Fc-слитые белки согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы для увеличения времени полужизни in vivo с помощью стандартных стратегий, включая пегилирование (например, пегилирование последовательности IL-10 человека или ее варианта: как описано в Mumm et al, 2011, выше, или домен Fc Fc-слитого белка IL-10/Fc согласно настоящему изобретению также можно заменить на антитела или сывороточный альбумин человека или его вариант, такие как описанные или рассмотренные в Qiao, et al, 2019, Cancer Cell 35, 901-915.e4; Kontermann, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22, 868-876).

В данной заявке "гибкий шарнир", подходящий в контексте настоящего изобретения, может быть пептидным или непептидным. Если гибкий шарнир пептидной природы, то он, как правило, содержит приблизительно от 3 до 20 аминокислот. Например, подходящий шарнир согласно настоящему изобретению можно выбрать из описанных в Klein et al, 2014, Protein Eng. Des. Sel. 27, 325-330. Непептидные гибкие шарниры можно выбрать из линкеров, описанных в Capon et al, 2011, Proc. Japan Acad. Ser. B Phys. Biol Sci., 87, 603-616.

"GS''-линкер относится к любому пептидному линкеру, содержащему аминокислоты, выбранные из G и S, или их комбинацию, объединенную с доменом СРРСР (SEQ ID NO: 15), такую как GGSCPPCP (SEQ ID NO: 16), GGGGSCPPCP (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSCPPCP (SEQ ID NO 14), или более длинному линкеру. Обычно, длина GS-линкера составляет от приблизительно 3 до приблизительно 50 аминокислот, например, приблизительно от 3 до 20, например, от 5 до приблизительно 15 аминокислот.

Термин "вариант", используемый по отношению к пептиду или полипептиду, упоминаемому в данной заявке, означает пептид или полипептид, по существу гомологичный референсной последовательности пептида, но который содержит по меньшей мере одну аминокислоту, отличную от таковой в референсной последовательности благодаря одной или более делециям, вставкам и/или заменам аминокислот. По существу гомологичный означает вариантную последовательность аминокислот, которая идентична обсуждаемой последовательности пептида, за исключением делеции, вставки и/или замены 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков. В более конкретном варианте реализации вариантная последовательность аминокислот идентична обсуждаемой последовательности пептида, за исключением делеции и/или консервативной замены 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков. Идентичность двух последовательностей аминокислот можно определить путем визуального наблюдения и/или математического расчета, или проще путем сравнения информации о последовательностях с применением известной компьютерной программы, применяемой для сравнения последовательностей, такой как пакет программ Clustal версии 1.83. Вариант может содержать последовательность, содержащую по меньшей мере одну консервативно замененную аминокислоту, что означает, что данный аминокислотный остаток заменен на остаток, обладающий сходными химико-физическими свойствами. Примеры консервативных замен включают замену одного алифатического остатка на другой, например, одного из Ile, Val, Leu или Ala на другой, или замены одного полярного остатка на другой, например, замены между Lys и Arg; Glu и Asp; или Gln и Asn. Гидрофобность аминокислот можно найти на основании известных шкал, таких как Kyte, et al, 1982, J. Mol. Biol, 157: 105-131; Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem., 53: 595-623. Хорошо известны другие такие консервативные замены, например, замены целых участков, обладающих сходными гидрофобными свойствами или склонностью к образованию вторичной структуры (Kyte, et al, 1982, выше). Например, «консервативная замена аминокислоты» может включать замену нативного аминокислотного остатка на ненативный остаток, так что не оказывается или оказывается небольшое влияние на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Желательные замены аминокислот (либо консервативные, либо неконсервативные) могут определить специалисты в данной области, когда такие замены потребуются. Примеры замен аминокислот представлены ниже в таблице 1. Термин «вариант» также включает пептид или полипептид, по существу гомологичный обсуждаемой последовательности пептида, но содержащий последовательность аминокислот, отличную от таковой у обсуждаемой последовательности вследствие того, что одна или более аминокислот были химически модифицированы или заменены на аналоги аминокислот. Например, могут быть введены неприродные остатки, чтобы улучшить фармакологические свойства лекарств на основе пептидов (Geurinket al, 2013, J. Med. Chem., 56, 1262; Rand et al, 2012, Med. Chem. Commun, 3, 1282).

В соответствии с другим конкретным вариантом реализации последовательность согласно настоящему изобретению необязательно может быть ацетилирована на N-конце и/или амидирована на С-конце.

В соответствии с другим конкретным вариантом реализации последовательность согласно настоящему изобретению необязательно может быть пегилирована.

В данной заявке "противораковая иммунотерапия" относится к противораковым терапевтическим стратегиям активации эффекторных иммунных клеток, которые включают адоптивную клеточную терапию (ACT) и стратегии нейтрализации иммуносупрессорных механизмов, такие как агенты, в частности, антитела, против молекул иммунных контрольных точек, таких как ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами белок 4 (CTLA-4) и белок запрограммированной клеточной смерти 1 (PD1), такие как описаны в Weiden et al, 2018, Nat. Rev. Immunol., 18, 212-219.

В данной заявке "иммунотерапия ACT" относится к терапевтической методике, в которой Т-клетки собирают из крови или опухоли пациента и растят в лаборатории. После получения достаточного количества Т-клеток, их вводят обратно пациенту, чтобы помочь его иммунной системе бороться с раковыми клетками. Примеры иммунотерапии ACT перечислены в Fan et al., 2018, Theranostics, 8(20): 5784-5800; Rosenberg et al, 2008, Nat. Rev. Cancer 8, 299-308; Wang et al, 2014, Immunotherapy 6, 1265-1278.

В данной заявке "ингибитор иммунных контрольных точек" относится к агентам, которые являются антагонистами или ингибируют молекулы иммунных контрольных точек, и они могут быть выбраны, например, из ингибиторов PD-1, ингибиторов PD-L1, или ингибиторов CTLA-4, или ингибиторов LAG-3, таких как описанные в Par doll et al, 2012, Nat. Rev. Cancer 12, 252-264; Lee et al, 2019, Molecules 4, 1-16.

В данной заявке "ингибиторы PD-1" включают моноклональные антитела против PD-1, такие как Китруда и Опдиво, такие как описанные в Lee et al, 2019, выше.

В данной заявке "ингибиторы PD-L1" включают антитела против PD-L1 и слитый белок PD-1-Ig, такие как описанные в Pardoll et al, 2012, выше.

В данной заявке "ингибиторы CTLA-4" включают моноклональные антитела против CTLA-4, такие как Ипилимумаб и Тремелимумаб, такие как описанные в Pardoll et al, 2012, выше.

В данной заявке "лечение" и "лечить" и тому подобные термины, как правило, означают получение желательного фармакологического и физиологического эффекта. Указанный эффект может быть профилактическим в контексте предотвращения или частичного предотвращения заболевания, симптома или состояния, и/или может быть терапевтическим в контексте частичного или полного излечения заболевания, состояния, симптома или нежелательного явления, связанного с указанным заболеванием. В объем термина "лечение" в данной заявке входит любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности, у человека, и входит: (а) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к указанному заболеванию, но у которого оно еще не диагностировано, такое как профилактическое раннее асимптоматическое вмешательство; (b) подавление заболевания, т.е., купирование его развития; или смягчение заболевания, т.е., достижение регресса заболевания и/или его симптомов или состояний, такое как улучшение или восстановление после повреждения. В частности, способы, применения, составы и композиции согласно настоящему изобретению полезны для предотвращения и/или лечения рака.

Выражение "солидная раковая опухоль" включает рак легких (мелкоклеточный и немелкоклеточный), рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак матки, рак головы и шеи, глиобластому, печеночно-клеточную карциному, рак толстого кишечника, ректальный рак, колоректальную карциному, рак почки, рак предстательной железы, рак желудка, рак бронха, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак печени и рак головного мозга, или рак кожи, в частности, меланому.

Термин "субъект" в данной заявке относится к млекопитающим. Например, млекопитающие, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, включают человека, приматов, одомашненных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади, лабораторные грызуны, другие питомцы и тому подобные млекопитающие.

Термин «эффективное количество» в данной заявке относится к количеству по меньшей мере одного соединения согласно настоящему изобретению или содержащего его фармацевтического состава в соответствии с настоящим изобретением, которое вызывает необходимый биологический или медицинский ответ в ткани, системе, организме животного или человека. В одном варианте реализации эффективное количество представляет собой «терапевтически эффективное количество» для частичного снятия симптомов заболевания или состояния, которое лечат. В другом варианте реализации эффективное количество представляет собой «профилактически эффективное количество» для профилактики симптомов заболевания или состояния, которое предотвращают. В объем данного термина в данной заявке также входит количество соединения согласно настоящему изобретению, достаточное для уменьшения прогрессирования заболевания, в частности, для уменьшения или подавления прогрессирования ракового расстройства, тем самым добиваясь необходимого ответа (т.е., «эффективное количество»). Обычно, эффективное количество можно применять для ингибирования роста клеток рака, т.е., любого замедления скорости пролиферации и/или миграции клеток рака, остановки пролиферации и/или миграции клеток рака, или уничтожения клеток рака, так что скорость роста клеток рака уменьшается по сравнению с наблюдаемой или прогнозируемой скоростью роста необработанной контрольной клетки рака. Термин «ингибирует рост» также может относиться к уменьшению размера или исчезновению клетки рака или опухоли, а также к снижению ее метастатического потенциала.

Предпочтительно, такое ингибирование на клеточном уровне может уменьшать размер, задерживать рост, уменьшать агрессивность, или предотвращать или ингибировать метастазирование рака у пациента. Специалисты в данной области техники могут легко определить, с помощью любого из различных подходящих признаков, ингибируется ли рост клеток рака.

"Эффективность" лечения в соответствии с настоящим изобретением можно измерить на основании изменения в течении заболевания в ответ на применение способа согласно настоящему изобретению. В соответствии с конкретным вариантом реализации эффективность можно измерить путем измерения вызванного иммунного ответа против раковых клеток, например, путем анализа опухолеспецифических Т-клеток или путем оценки гибели клеток рака и/или ингибирования роста, прогрессирования и распространения опухоли, уменьшения объема опухоли, и/или увеличения времени выживаемости без прогрессирования, и/или улучшения состояния здоровья и самочувствия субъекта (например, сдерживания рака). Эффективность лечения рака в соответствии с настоящим изобретением можно измерить по ингибированию роста клеток рака, о чем свидетельствует, например, остановка раковых клеток на определенной фазе клеточного цикла, например, остановка на фазе G2/M клеточного цикла. Ингибирование роста клеток рака также можно подтвердить, применяя хорошо известные способы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография, компьютерная аксиальная томография, позитрон-эмиссионная томография (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография ОЭКТ, фотоакустическая визуализация, рентген и флуоресцентная визуализация/детектирование. Рост клеток рака также можно определить опосредованно, например, путем определения уровней в кровотоке раковоэмбрионального антигена, простатического специфического антигена или других специфических антигенов рака, которые коррелируют с ростом клеток рака.

В частности, эффективность комбинированной терапии в соответствии с настоящим изобретением можно оценить по размножению инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток, уменьшению размера опухоли, исчезновению опухоли, выживаемости несущих опухоль мышей или по любому биомаркеру, значимому для данного типа рака.

"Фармацевтически активное производное" относится к любому соединению, которое после введения реципиенту способно непосредственно или опосредованно обеспечить активность, описанную в данной заявке. В объем термина "опосредованно" также входят пролекарства, которые могут превратиться в активную форму лекарства с помощью эндогенных ферментов или метаболизма. Пролекарство представляет собой производное соединения в соответствии с настоящим изобретением и проявляющего противоопухолевую активность, которое содержит химически или метаболически разлагаемую группу, и соединение, которое может превратиться в фармацевтически активное соединение in vivo при физиологических условиях.

Термин "фармацевтический состав" относится к препаратам, который находятся в такой форме, которая позволяет биологической активности активного(-ых) ингредиента(-ов) быть однозначно эффективной, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые были бы токсичны для субъектов, которым будут вводить указанный состав.

Слитые белки IL-10/Fc в соответствии с настоящим изобретением и способы их получения

Fc-слитые белки (гомодимеры), подходящие для применения в контексте настоящего изобретения, описаны в данной заявке.

В соответствии с конкретным аспектом, Fc-слитый белок (IL-10/Fc) в соответствии с настоящим изобретением представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом или С-концом домена Fc посредством полипептидного линкера (например, гибкого шарнира), и два указанных полипептида нековалентно соединены в гомодимер.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность IL-10 человека, например, где указанная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 1 или ее вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность фрагмента Fc IgG, причем указанный фрагмент Fc IgG представляет собой фрагмент Fc IgG1 или его вариант, в частности, нецитолитический Fc IgG1. Например, слитый белок IL-10/Fc содержит фрагмент Fc IgG с последовательностью SEQ ID NO: 2 или его вариант (Zheng et al, 1997, выше; Sazinsky et al, 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20167-20172).

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит гибкий шарнир, выбранный из SEQ ID NO: 3 и последовательности GS-линкера или ее варианта (Klein et al, 2014, выше).

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит гибкий шарнир, выбранный из SEQ ID NO: 3 и последовательности GGS-линкера или ее варианта (Klein et al, 2014, выше).

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит гибкий шарнир, выбранный из SEQ ID NO: 6 или последовательности GS-линкера или ее варианта.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит гибкий шарнир, выбранный из SEQ ID NO: 9 или последовательности GS-линкера или ее варианта.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит гибкий шарнир, выбранный из SEQ ID NO: 12 или последовательности GS-линкера или ее варианта.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность фрагмента Fc IgG, причем указанный фрагмент Fc IgG представляет собой фрагмент Fc IgG2 или его вариант, в частности, нецитолитический Fc IgG2. Например, слитый белок IL-10/Fc содержит фрагмент Fc IgG с последовательностью SEQ ID NO: 5 или его вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность SEQ ID NO: 7 или ее вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность фрагмента Fc IgG, причем указанный фрагмент Fc IgG представляет собой фрагмент Fc IgG3 или его вариант. Например, слитый белок IL-10/Fc содержит фрагмент Fc IgG с последовательностью SEQ ID NO: 8 или его вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность SEQ ID NO: 10 или ее вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность фрагмента Fc IgG, причем указанный фрагмент Fc IgG представляет собой фрагмент Fc IgG4 или его вариант. Например, слитый белок IL-10/Fc содержит фрагмент Fc IgG с последовательностью SEQ ID NO: 11 или его вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, последовательность Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность SEQ ID NO: 13 или ее вариант.

В соответствии с конкретным аспектом, Fc-слитый белок IL-10/Fc содержит последовательность слитого белка IL-10/Fc, описанную в Guo et al, 2012, выше, или в Zheng et al, 1997, J. Immonol, 158, 4507-4513, или в Steele et al, 1995, J. Immonol, 154, 5590-5600, или ее варианты или фрагменты.

Fc-слитые белки IL-10/Fc можно получить, как описано в данной заявке или как описано в Guo et al, 2012, выше, или в Zheng et al, 1997, выше, или в Steele et al, 1995, выше.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением

В соответствии с настоящим изобретением предложены фармацевтические или терапевтические агенты в качестве композиций и способов лечения субъекта, предпочтительно млекопитающего субъекта, и наиболее предпочтительно пациента-человека, который страдает от медицинского расстройства, и, в частности, от рака, в частности, от солидной раковой опухоли.

В одном варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно соединение в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество для нее.

Агент в соответствии с настоящим изобретением или составы с ним можно вводить в виде фармацевтического состава, который может содержать один или более агентов в соответствии с настоящим изобретением в любой форме, описанной в данной заявке. Композиции в соответствии с настоящим изобретением, вместе с обычно используемым адъювантом, носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, можно получить в форме фармацевтических композиций и их единичных доз, и в такой форме можно применять в виде твердых веществ, таких как таблетки или наполненные капсулы, или жидкостей, таких как растворы, суспензии, эмульсии, эликсиры или капсулы, наполненные ими, все для перорального применения, или в форме стерильных инъецируемых растворов для парентерального (включая подкожное) применения путем инъекции или непрерывной инфузии. Инъецируемые композиции обычно получают на основе стерильного солевого раствора для инъекций, или фосфатно-солевого буферного раствора для инъекций, или других носителей для инъекций, известных в данной области. Такие фармацевтические композиции и их единичные лекарственные формы могут содержать ингредиенты в обычных соотношениях, с дополнительными активными соединениями или основными компонентами или без них, и такие единичные лекарственные формы могут содержать любое подходящее эффективное количество активного ингредиента, соответствующее предполагаемому для применения диапазону суточных доз.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой жидкие составы, включая, но не ограничиваясь водными или маслянистыми суспензиями, растворами, эмульсиями, сиропами и эликсирами. Композиции также могут быть составлены в виде сухого продукта для восстановления влагосодержания водой или другой подходящей средой перед применением. Такие жидкие препараты могут содержать вспомогательные вещества, включая, но не ограничиваясь перечисленными: суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, неводные среды и консерванты. Суспендирующие агенты включают, но не ограничены перечисленными: сироп сорбита, метилцеллюлозу, глюкозу/сахарный сироп, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия и гидрогенизированные пищевые жиры. Эмульгирующие агенты включают, но не ограничены перечисленными: лецитин, моноолеат сорбитана и камедь. Консерванты включают, но не ограничены перечисленными: метил- или пропил-п-гидроксибензоат и сорбиновую кислоту. Диспергирующие или смачивающие агенты включают, но не ограничены перечисленными: полиэтиленгликоль, глицерин, бычий сывороточный альбумин, твин®, Span®.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением также могут быть составлены в виде депо-препаратов, которые можно вводить путем имплантации или путем внутримышечной инъекции.

Твердые композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть в форме таблеток или пастилок, составленных обычным способом. Например, таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать обычные вспомогательные вещества, включая, но не ограничиваясь перечисленными: связующие агенты, наполнители, лубриканты, дезинтегрирующие агенты и смачивающие агенты. Связующие агенты включают, но не ограничены перечисленными: сироп, камедь, желатин, сорбит, трагакант, крахмальную слизь и поливинилпирролидон. Наполнители включают, но не ограничены перечисленными: лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузные крахмал, фосфат кальция и сорбит. Лубриканты включают, но не ограничены перечисленными: стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и кремний. Дезинтегрирующие агенты включают, но не ограничены перечисленными: картофельный крахмал и натрия крахмалгликолят. Смачивающие агенты включают, но не ограничены лаурилсульфатом натрия. Таблетки могут быть покрыты в соответствии со способами, хорошо известными в данной области.

В соответствии с более конкретным аспектом предложена композиция, в которой последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант.

В соответствии с более конкретным аспектом предложена композиция, в которой последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 7 или ее вариант.

В соответствии с более конкретным аспектом предложена композиция, в которой последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 10 или ее вариант.

В соответствии с более конкретным аспектом предложена композиция, в которой последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 13 или ее вариант.

Соединения в соответствии с настоящим изобретением также можно вводить в формах замедленного высвобождения или из систем доставки лекарственных средств с замедленным высвобождением.

В соответствии с конкретным вариантом реализации, композиции в соответствии с настоящим изобретением предназначены для внутривенного применения.

В соответствии с конкретным вариантом реализации, композиции в соответствии с настоящим изобретением предназначены для интраперитонеального применения.

В соответствии с конкретным вариантом реализации, композиции в соответствии с настоящим изобретением предназначены для внутриопухолевого применения.

В другом конкретном аспекте, композиции в соответствии с настоящим изобретением являются подходящими для доставки путем повторных введений.

В соответствии с конкретным вариантом реализации, композиции в соответствии с настоящим изобретением представляют собой ветеринарные композиции.

Дополнительные материалы, а также методики получения составов и тому подобное описаны в части 5 Remington's "The Science и Practice of Pharmacy", 22^nd edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, который включен в данную заявку посредством ссылки.

Способ введения

Соединения и содержащие их составы в соответствии с настоящим изобретением можно вводить любым образом, включая парентеральное, внутривенное, внутриопухолевое, интратекальное, чрезслизистое, интраназальное, ректальное введение или их комбинации. Парентеральное введение включает, но не ограничено внутривенным, интраартериальным, интраперитонеальным, подкожным и внутримышечным введением. Композиции в соответствии с настоящим изобретением также можно вводить в виде имплантата, который позволяет медленное высвобождение композиций, а также медленную контролируемую в/в инфузию.

Вводимая индивиду дозировка, в виде единичной или множественных доз, будет изменяться в зависимости от различных факторов, включая фармакокинетические свойства, состояния и особенности пациента (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, размер), выраженность симптомов, сопутствующую терапию, частоту введения и необходимый эффект.

Комбинация

В соответствии с одним аспектом, соединения в соответствии с настоящим изобретением необходимо вводить в дополнительной комбинации с по меньшей мере одной терапевтической стратегией, подходящей для предотвращения и/или лечения рака, в частности, с противораковой иммунотерапией, такой как терапия ACT или иммунная терапия путем блокирования контрольных точек.

В соответствии с другим конкретным аспектом, соединения в соответствии с настоящим изобретением необходимо вводить в комбинации с терапией ACT.

В соответствии с другим конкретным аспектом, соединения в соответствии с настоящим изобретением необходимо вводить в комбинации с по меньшей мере одним ингибитором иммунных контрольных точек.

В соответствии с одним аспектом предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один Fc-слитый белок IL-10/Fc и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество для него, и по меньшей мере один агент, подходящий для терапии ACT.

В соответствии с одним аспектом предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один Fc-слитый белок IL-10/Fc и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество для него, и по меньшей мере один ингибитор иммунных контрольных точек.

В объем настоящего изобретения входит введение соединения в соответствии с настоящим изобретением или содержащего его состава, где его вводят субъекту до, одновременно или после других режимов терапии или соагентов, подходящих для предотвращения, лечения и/или стабилизации рака, таких как противораковая терапия.

Соединение в соответствии с настоящим изобретением или содержащий его состав в соответствии с настоящим изобретением, которые вводят одновременно с указанными соагентами, можно вводить в одной или различных композициях и одним или различными путями введения.

В соответствии с одним вариантом реализации предложен фармацевтический состав, содержащий соединение в соответствии с настоящим изобретением в комбинации с по меньшей мере одним соагентом, полезным для лечения и/или стабилизации нейродегенеративного расстройства, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

Применение Fc-слитых белков IL-10/Fc в соответствии с настоящим изобретением

В соответствии с настоящим изобретением предложен Fc-слитый белок (IL-10/Fc) для применения для предотвращения и/или лечения рака.

В соответствии с конкретным аспектом, предложен Fc-слитый белок (IL-10/Fc) для применения в противораковой иммунотерапии.

В соответствии с более конкретным аспектом, предложен Fc-слитый белок (IL-10/Fc) для применения в комбинации с иммунотерапией ACT, в частности, терапией на основе TCR-Т-клеток, или CAR-Т-клеток, или ИОЛ.

Способы в соответствии с настоящим изобретением

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения рака, в частности, солидной раковой опухоли.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ предотвращения и/или лечения рака легких (мелкоклеточного и немелкоклеточного), рака молочной железы, рака предстательной железы, рака, рака яичников, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, рака толстого кишечника, ректального рака, колоректальной карциномы, рака почки, рака желудка, рака бронха, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака печени и рака головного мозга, или рака кожи.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ стимуляции иммунитета у субъекта, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту агентов, блокирующих иммунные контрольные точки, в частности, противораковых агентов, блокирующих иммунные контрольные точки, в комбинации с Fc-слитым белком IL-10/Fc в соответствии с настоящим изобретением.

Ссылочные материалы, цитированные в данной заявке, настоящим полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами реализации, описанными в данной заявке, которые предложены в качестве отдельных иллюстраций отдельных аспектов настоящего изобретения, и функционально эквивалентные способы и компоненты входят в объем настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, дополнительно к показанным и описанным в данной заявке, станут очевидны для специалистов в данной области техники из приведенного выше описания. Предполагается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Настоящее изобретение было описано, следующие примеры представлены с целью иллюстрирования, но не ограничения.

Синтез соединений в соответствии с настоящим изобретением

Соединения в соответствии с настоящим изобретением можно получить из легкодоступных исходных материалов, применяя следующие основные способы и процедуры. Должно быть очевидно, что если приведены обычные или предпочтительные условия эксперимента (т.е., температуры культивирования или реакции, время, моли реагентов, растворители и т.д.), то можно также использовать другие условия эксперимента, если не указано иное. Оптимальные условия реакции могут изменяться в зависимости от конкретных применяемых реагентов или растворителей, но такие условия может определить специалист в данной области техники, применяя обычные процедуры оптимизации.

Пациенты

В некотором варианте реализации пациенты в соответствии с настоящим изобретением страдают от любого типа рака.

В некотором варианте реализации пациенты в соответствии с настоящим изобретением страдают от любого типа рака на любой стадии, включая неметастатическую и метастатическую.

В некотором варианте реализации пациенты в соответствии с настоящим изобретением страдают от рака легких (мелкоклеточного и немелкоклеточного), рака молочной железы, рака предстательной железы, рака, рака яичников, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиобластомы, печеночно-клеточной карциномы, рака толстого кишечника, ректального рака, колоректальной карциномы, рака почки, рака желудка, рака бронха, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака печени, рака головного мозга или рака кожи.

В дополнительном конкретном варианте реализации пациенты в соответствии с настоящим изобретением страдают от опухолей кожи, молочной железы, предстательной железы, легкого, поджелудочной железы, пищевода, печеночно-клеточной опухоли, опухоли яичников, колоректальной опухоли и рака головы и шеи и других солидных опухолей или любого предзлокачественного или злокачественного новообразования.

В дополнительном конкретном варианте реализации пациенты в соответствии с настоящим изобретением страдают от меланомы.

В дополнительном варианте реализации субъекты в соответствии с настоящим изобретением страдают или имеют риск пострадать от рака.

Соединения, композиции и способы в соответствии с настоящим изобретением особенно полезны для повышения пируват-зависимого OXPHOS в CD8+ Т-клетках и, следовательно, для комбинирования со способами иммунотерапии, такими как описанные в данной заявке.

Ссылочные материалы, цитированные в данной заявке, настоящим полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами реализации и фигурами, описанными в данной заявке, которые предложены в качестве отдельных иллюстраций отдельных аспектов настоящего изобретения, и функционально эквивалентные способы и компоненты входят в объем настоящего изобретения. Примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение, не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения никаким образом.

ПРИМЕРЫ

Следующие исследования проводили, чтобы подтвердить эффективность соединений в соответствии с настоящим изобретением.

Пример 1. Получение Fc-слитого белка IL-10/Fc в соответствии с настоящим изобретением.

Получали слитый белок из рекомбинантного IL-10 человека и Fc IgG1 (IL-10/Fc с последовательностью SEQ ID NO: 4) (Фиг. 1a), который мог давать перекрестную реакцию с рецептором IL-10 мыши или человека (IL-10R) посредством домена IL-10 слитого белка IL-10/Fc (Qiao et al, 2019, Cancer Cell 35, 901-915.e4). Следовательно, слитый белок IL-10/Fc мог работать на CD8+ Т-клетках как мыши, так и человека.

Слитый белок IL-10/Fc экспрессировали в клетках HEK293 FreeStyle, применяя коммерчески доступный вектор экспрессии у млекопитающих, такой как pcDNA3.1 или pSectag2A, несущий слитый ген IL-10/Fc, как описано ранее в Guo et al, 2012, выше, или в Zheng et al, 1997, J. Immonol, 158, 4507-4513, или в Steele et al, 1995, J. Immonol, 154, 5590-5600, а затем собирали культуральный супернатант, содержащий IL-10/Fc, путем центрифугирования после культивирования в течение 7 дней.

Слитый белок IL-10/Fc сначала захватывали с помощью колонки с белком А, а затем дополнительно очищали с помощью колонки Superdex 200 Increase. Очищенный слитый белок IL-10/Fc разделяли на аликвоты и хранили при -80°С в качестве исходного раствора. Чистота IL-10/Fc достигала 95%, о чем свидетельствовал анализ методом ЭФ в ПААГ/ДСН и ВЭЖХ. Колонку HiTrap Protein А для аффинной хроматографии использовали для захвата рекомбинантного IL-10/Fc из осветленного супернатанта экспрессии, профильтрованного через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм, промывали буфером для связывания объемом, равным 5 объемам колонки, и элюировали элюирующим буфером (0,05 М цитрат натрия, 0,3 М NaCl, рН 3,0). Элюированный белок незамедлительно собирали в нейтрализующий буфер (1,0 М Трис-HCl, рН 10,0). Элюированный белок концентрировали путем ультрафильтрации через мембрану с размером пор 10 кДа (Vivaspin) и дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на Superdex 200 Increase при скорости потока 1,0 мл/мин с использованием ФБР, и очищенный белок разделяли на аликвоты и хранили при 80°С.

Пример 2. Роль слитого белка IL-10/Fc в соответствии с настоящим изобретением в опосредованном IL-10 метаболическом перепрограммировании.

В системе совместного культивирования клеток меланомы мыши B16F10 и активированных Pmel CD8+ Т-клеток, распознающих соответствующий антиген gp100, как базальная, так и максимальная скорости потребления кислорода (OCR) CD8+ Т-клетками повышались поле обработки слитым белком IL-10/Fc в соответствии с настоящим изобретением, тогда как скорость внеклеточного окисления (ECAR) оставалась неизменной (Фиг. 2а-с). Отношение OCR к EACR для CD8+ Т-клеток, обработанных IL-10/Fc, заметно увеличилось (Фиг. 2d), позволяя предложить, что сигнализация IL-10 активно стимулирует окислительное фосфорилирование в Т-клетках (OXPHOS). В результате, количества Т-клеток и цитотоксичность сильно возрастали (Фиг. 2е и f). Важно отметить, что такой эффект метаболического перепрограммирования не наблюдали в CD8+ Т-клетках без стимуляции антигеном (Фиг. 2d), указывая на то, что опосредованное IL-10 метаболическое перепрограммирование зависело от сигнализации TCR. Аналогично, обнаружили, что слитый белок IL-10/Fc также стимулировал OXPHOS в CD8+ Т-клетках в фазе примирования и повышал пролиферацию Т-клеток (Фиг. 1).

Затем, несколько специфических для пути ингибиторов, таких как 2-дезокси-В-глюкоза, этомоксир или UK5099 (Hildyard et al, 2005, Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg., 1707, 221-230), применяли для исследования. 1,0 миллион/мл покоящихся Pmel Т-клеток повторно стимулировали растворимым тетрамером анти-CD3 (0,1 мкг/мл) с добавлением или без указанных ингибиторов в течение 2 дней, а затем количества Т-клеток анализировали с помощью анализа FACS, молекулярная основа для IL-10/Fc в отношении контролирования метаболизма CD8+ Т-клеток (Фиг. 2g). Затем обнаружили, что ингибирование посредством 2-дезокси-В-глюкозы (2DG) поглощения глюкозы значительно нарушало действие IL-10/Fc на пролиферацию CD8+ Т-клеток (Фиг. 2h). Ограничение глюкозы нарушало действие IL-10/Fc на пролиферацию CD8+ Т-клеток (Фиг. 1е). Примечательно, что ингибирование зависимого от жирных кислот окисления посредством ЕТО еще дополнительно повышало OXPHOS посредством IL-10/Fc (Фиг. 2i). Данные результаты могут свидетельствовать о том, что Fc-слитый белок в соответствии с настоящим изобретением повышал OXPHOS в зависимости от окисления пирувата, а не р-окисления жирных кислот, что было дополнительно подтверждено путем применения ингибитора митохондриального переносчика пирувата (МРС) - UK5099, который фактически нейтрализовал действие IL-10/Fc на пролиферацию Т-клеток и метаболическое перепрограммирование (Фиг. 2h и i).

Эти результаты подтверждают, что слитый белок в соответствии с настоящим изобретением способен перепрограммировать метаболизм Т-клеток, чтобы вызвать пролиферацию Т-клеток путем повышения OXPHOS после стимуляции TCR посредством пируват-зависимого способа, что может свидетельствовать о том, что слитый белок в соответствии с настоящим изобретением также может стимулировать размножение опухо л ере активных CD8+ Т-клеток в МОО посредством перепрограммирования метаболизма Т-клеток.

Пример 3. Противоопухолевые действия in vivo слитого белка в соответствии с настоящим изобретением.

Повышение OXPHOS или ингибирование гликолитического метаболизма в CD8+ Т-клетках с помощью различных реагентов стимулировало пролиферацию CD8+ Т-клеток, развитие памяти и противоопухолевую функцию в MOO (Zhang et al, 2017, Cancer cell 32, 377-391.e9; Chowdhury et al, 2018, Cancer Immunol. Res. 6, 1375-1387; Sukumar et al, 2013, 123, 4479-4488). На основании наблюдаемой функции Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением, состоящей в метаболической регуляции CD8+ Т-клеток, исследовали, можно ли добиться метаболического воздействия in vivo на CD8 Т-клетки с помощью IL-10/Fc в связи с повышением эффективности адоптивной иммунотерапии Т-клетками, направленной против солидных опухолей.

Для того чтобы преодолеть истощение Т-клеток в МОО, противоопухолевое действие in vivo IL-10/Fc вместе с ACT транс генными по TCR CD8+ Т-клетками (Pmel CD8+ Т-клетками или OTI CD8+ Т-клетками) или HER2 CAR-Т-клетками оценивали в нескольких моделях опухоли, таких как B16F10 (слабо иммуногенная, высокоагрессивная модель меланомы мыши), YUMM1.7-OVA (модель меланомы мыши) или MC-38-HER2 (карцинома толстого кишечника мыши), соответственно.

Схему лечения, изображенную на Фиг. 3а, применяли в модели меланомы мыши B16F10 и наблюдали, что лечение IL-10/Fc или ACT-клетками отдельно слегка контролировало рост опухоли по сравнению с группой ФБР, но большинство мышей, в конечном счете, стали жертвой повышенной опухолевой нагрузки (Фиг. 4а, Фиг. 3b-d). Удивительно, что комбинированная терапия с помощью IL-10/Fc и терапии ACT (ACT проводили путем в/в инъекции, а затем следовало введение IL-10/Fc путем внутриопухолевой инъекции) вызывала значительный регресс опухолей и приводила к долговременному излечению у 90% мышей, несущих меланому мыши B16F10 (Фиг. 4b, Фиг. 3е). Даже при уменьшении частоты введения доз IL-10/Fc (Фиг. 3f), выявили эффективность комбинированной терапии IL-10/Fc и ACT, сопоставимую с таковой ранее (Фиг. 3j-g). Примечательно, что приблизительно 80% (11/14) получивших лечение длительно выживающих мышей отторгли вторичную провокацию опухолевыми клетками B16F10 (0,1 миллион опухолевых клеток на мышь) через 3 месяца после последней инъекции (Фиг. 4с).

Для того чтобы проверить надежность комбинированной терапии, терапию IL-10/Fc комбинировали с OT-I CD8+ Т-клетками для лечения экспрессирующей OVA модели меланомы мыши (YUMM1.7-OVA) (Meeth et al, 2016, Pigment Cell Melanoma Res. 29, 590-597; Lane et al, 2018, J. Exp.Med. 215, 3057-3074). Опухолевые клетки (1 миллион опухолевых клеток на мышь) вводили путем подкожной инъекции и позволяли им разрастись до высокой опухолевой нагрузки (размер > 60 мм2 или 150 мм3) (Pai et al, 2019, Immunity, 50, 477-492.e8) перед началом терапии. Введение IL-10/Fc и ACT ОТ-I CD8+ Т-клетками вызывало заметный регресс опухоли, тогда как для ACT ОТ I CD8+ Т-клетками отдельно выявили лишь временный регресс опухоли (Фиг. 4d). Более того, 60% (5/8) мышей в группе лечения IL-10/Fc и ACT ОТ I CD8+ Т-клетками излечились, тогда как ни одна мышь не излечилась в группе ACT отдельно (Фиг. 4е).

Также исследовали комбинированную терапию с Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR-T), и проводили противоопухолевые эксперименты in vivo, используя МС-38, ад ено карциному толстого кишечника мыши, которая экспрессирует рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2) человека. МС-38 трансдуцировали путем применения ретровирусной конструкции, содержащей последовательность, кодирующую HER2 человека.

Наблюдали, что IL-10/Fc и HER2 CAR-Т-клетки сильно подавляли рост опухоли MC-38-HER2 (Фиг. 4f), и, в конечном счете, излечилось 80% (4/5) несущих опухоль мышей в группе комбинированной терапии, тогда как терапия HER2 CAR-Т-клетками отдельно приносила очень слабую терапевтическую пользу, и ни одна из мышей не выжила к окончанию эксперимента (Фиг. 4g).

Эти результаты подтверждают, что слитый белок в соответствии с настоящим изобретением способен усиливать действие адоптивной терапии Т-клетками путем стимуляции опосредованного Т-клетками регресса опухоли как в сингенной, так и в ксенотрансплантатной моделях на мышах с уже прижившимися солидными опухолями, чтобы устранить прижившиеся опухоли.

Пример 4. Роль in vivo слитого белка в соответствии с настоящим изобретением в инфильтрации опухолей иммунными клетками.

Для того чтобы понять способность IL-10/Fc коренным образом улучшать эффективность ACT, анализировали инфильтрацию опухолей иммунными клетками в модели опухоли B16F10 (Фиг. 5а).

Опухолевые клетки B16F10 (1×10⁶) инокулировали подкожно мышам С57В 1/6 и позволяли опухоли прижиться в течение 6 д. Мыши затем получали ФБР, IL-10/Fc, адоптивный перенос 5×10⁶ активированных pmel-1 CD8+ Т-клеток (ACT) отдельно или комбинированную терапию IL-10/Fc и ACT (комбо) на 6 день. Мыши получали 4 инъекции IL-10/Fc или ФБР, как указано на схеме эксперимента. Затем мышей умерщвляли на 14 день и анализировали ИОЛ с помощью проточной цитометрии.

Было показано, что IL-10/Fc значительно повышал количество инфильтрирующих опухоль Т-клеток, в частности, CD8+ Т-клеток, в МОО (Фиг. 6а), но не естественных клеток-киллеров (NK) или дендритных клеток (ДК) (Фиг. 5b), в группе, которую лечили комбинированной терапией, по сравнению с ACT отдельно. Результаты подтверждали путем иммунофлуоресцентного окрашивания срезов опухоли (Фиг. 6b). Более того, IL-10/Fc значительно уменьшал процент Treg и увеличивал отношение CD8+/Treg клеток в МОО (Фиг. 5с).

Эти результаты свидетельствовали о том, что IL-10/Fc и ACT синергично переформировывали состав иммунных клеток, особенно CD8+ Т-клеток, в МОО, чтобы повысить противоопухолевый иммунитет. Кроме того, лечение IL-10/Fc также заметно повышало полифункции как эндогенных, так и адоптивно перенесенных Pmel CD8+ Т-клеток в опухолях (Фиг. 6h).

Для того чтобы определить, какая субпопуляция CD8+ Т-клеток отвечала на лечение IL-10/Fc и способствовали заметному повышению эффективности, окрашивали маркеры активации/истощения на инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клетках. ИОЛ, выделенные из тканей опухоли, окрашивали антителами против мышиных CD45.2, CD4, CD8, PD-1 и TIM-3, мечеными флуоресцентными красителями, а затем анализировали с помощью анализа FACS. Недавно сообщалось, что РВ-1+ Т1М-3+ СВ8+ Т-клетки, которые ранее определили как истощенные, в действительности представляют собой клональную и динамично дифференцирующуюся популяцию клеток с высокой пролиферативной активностью в микроокружении опухоли человека, обладающую высокой цитотоксичностью (Miller et al., 2019, Nat. Immunol. 20, 326-336; Li et al, 2019, Cell, 176, 775-789.e18). Эти результаты побудили авторов настоящего изобретения исследовать способность лечения IL-10/Fc осуществлять метаболическое перепрограммирование данной специфической субпопуляции PD-1+ TIM-3+ CD8+ Т-клеток.

Данную специфическую популяцию, наблюдаемую in vivo, получали путем стимуляции TCR антителом против CD3 in vitro, имитируя постоянную стимуляцию антигеном in vivo. 1,0 миллион/мл покоящихся Pmel Т-клеток повторно стимулировали растворимым тетрамером анти-CD3 (0,1 мкг/мл) в течение 2 дней.

Наблюдали, что лечение IL-10/Fc значительно увеличивало долю субпопуляций PD-1+ Tim-3+ среди CD8+ Т-клеток со сходным фенотипом "истощенных Т-клеток" (Фиг. 6с).

Дополнительный анализ показал, что IL-10/Fc приводил к селективному размножению PD-1+ Tim-3+, но не других субпопуляций как среди эндогенных (в 5,9 раз), так и среди адоптивно перенесенных Pmel CD8+ Т-клеток (в 12,9 раз) в опухолях (Фиг. 6d и е). В соответствии с этим наблюдением, экспрессия рецептора IL-10 сильно повышалась на субпопуляциях PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клеток в МОО (Фиг. 6f).

Хотя субпопуляцию PD-1+ Tim-3+ обычно считали "истощенными Т-клетками", авторы настоящего изобретения заметили, что данная субпопуляция в группе лечения комбинированной терапией имела пониженный уровень экспрессии PD-1 как в эндогенных, так и в Pmel CD8+ Т-клетках (Фиг. 6g), что может свидетельствовать о возобновлении эффекторных функций. В соответствии с гипотезой, количества полифункциональных эффекторных клеток среди субпопуляций PD-1+ TIM-3+ CD8+ Т-клеток сильно возрастали в результате лечения IL-10/Fc (Фиг. 6i). Высокий процент внутриопухолевых PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клеток проявлял высокие цитотоксичность и пролиферативный потенциал (Фиг. 6j и k). Дополнительный анализ показал, что PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клетки приобретают фенотип клеток памяти в центральных лимфоидных органах, который может способствовать развитию CD8+ Т-клеток памяти (Фиг. 61).

Соответственно, как количества клеток, так и эффективность киллинга PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клетками, соответственно повышались при обработке IL-10/Fc в системе совместного культивирования Т-клеток и B16F10 (Фиг. 6j и k).

Как ожидалось, OCR субпопуляцией PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клеток значительно повышалась при обработке IL-10/Fc (Фиг. 6m), что указывало на преимущественное использование субпопуляцией PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клеток OXPHOS вместо гликолиза после метаболического перепрограммирования посредством IL-10/Fc.

В совокупности, полученные результаты демонстрируют, что метаболическое вмешательство посредством применения Fc-слитого белка в соответствии с настоящим изобретением эффективно возобновляло CD8+ ИОЛ, в частности, инфильтрирующие опухоль PD-1+ Tim-3+ CD8+ Т-клетки (цитотоксические Т-клетки), путем повышения OXPHOS, чтобы они вновь приобрели/сохранили способность к секреции цитокинов, пролиферативный потенциал, а также формированию длительной памяти, где субпопуляция PD-1+ TIM-3+ CD8+ Т-клеток размножилась до 12,9- и 5,9-кратного числа относительно такового у мышей, не получивших лечение IL-10/Fc, среди адоптивно перенесенных и эндогенных CD8+ Т-клеток, соответственно.

Аналогично, IL-10/Fc также повышал эффективность терапии путем блокирования контрольных точек против прижившейся солидной опухоли у мышей (Фиг. 7). Комбинированная терапия IL-10/Fc и антителом против PD-1 значительно ингибировала рост опухоли и способствовала выживаемости несущих опухоль СТ-26 мышей (Фиг. 7b-d).

Следовательно, Fc-слитый белок в соответствии с настоящим изобретением представляет собой новую стратегию метаболического вмешательства для высокоэффективной иммунотерапии рака путем ACT, направленной против солидных опухолей, такой как TCR-T, CAR-T, а также ИОЛ, выделенные из опухолевых тканей, в качестве персонифицированной иммунотерапии рака.

Кроме того, на основании указанных результатов, Fc-слитый белок в соответствии с настоящим изобретением считают безопасным и эффективным возможным энхансером для терапии путем блокирования иммунных контрольных точек.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ECOLE POLYTECHNIQUE FEDERALE DE LAUSANNE (EPFL)

<120> СЛИТЫЕ БЕЛКИ IL-10/FC, ПРИГОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ЭНХАНСЕРОВ ИММУНОТЕРАПИИ

<130> P2401PC00

<150> EP19198358.4

<151> 2019-09-19

<160> 17

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 160

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

<210> 2

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нецитолитический Fc IgG1

<400> 2

Ala Pro Glu Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 3

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий шарнир 1

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 4

<211> 392

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок IL-10/Fc 1

<400> 4

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

165 170 175

Pro Glu Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

180 185 190

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

195 200 205

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

210 215 220

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

225 230 235 240

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

245 250 255

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

260 265 270

Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

275 280 285

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

290 295 300

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

305 310 315 320

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

325 330 335

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

340 345 350

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

355 360 365

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

370 375 380

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385 390

<210> 5

<211> 216

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc IgG2

<400> 5

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

85 90 95

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

130 135 140

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

145 150 155 160

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

165 170 175

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

180 185 190

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

195 200 205

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 6

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий шарнир 2

<400> 6

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 388

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок IL-10/Fc 2

<400> 7

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

165 170 175

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

180 185 190

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

195 200 205

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

210 215 220

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

225 230 235 240

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

245 250 255

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

260 265 270

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

275 280 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

290 295 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305 310 315 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

325 330 335

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

340 345 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

355 360 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

370 375 380

Ser Pro Gly Lys

385

<210> 8

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc IgG3

<400> 8

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 9

<211> 62

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий шарнир 3

<400> 9

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 10

<211> 439

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок IL-10/Fc 3

<400> 10

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

165 170 175

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

180 185 190

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

195 200 205

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro

210 215 220

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp

260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

275 280 285

Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

305 310 315 320

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg

325 330 335

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

340 345 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

355 360 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385 390 395 400

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser

405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435

<210> 11

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc IgG4

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(85)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (108)..(108)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (110)..(110)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (186)..(186)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<400> 11

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Xaa Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Xaa Lys

85 90 95

Gly Leu Gly Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Xaa Ala Xaa Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Xaa Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 12

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий шарнир 4

<400> 12

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 13

<211> 389

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок IL-10/Fc 4

<220>

<221> misc_feature

<222> (257)..(257)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (267)..(267)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (280)..(280)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (282)..(282)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(358)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту

<400> 13

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

165 170 175

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

180 185 190

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

195 200 205

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

210 215 220

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

245 250 255

Xaa Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Xaa Lys Gly Leu Gly Ser

260 265 270

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Xaa Ala Xaa Gly Gln Pro Arg Glu Pro

275 280 285

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

290 295 300

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

305 310 315 320

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

325 330 335

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

340 345 350

Thr Val Asp Lys Ser Xaa Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

355 360 365

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

370 375 380

Leu Ser Leu Gly Lys

385

<210> 14

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Гибкий шарнир 5

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 15

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Домен CPPCP

<400> 15

Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Гибкий шарнир 6

<400> 16

Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Гибкий шарнир 7

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к применению Fc-слитого белка для лечения рака, причем указанный Fc-слитый белок представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека из SEQ ID NO: 1 или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом домена Fc посредством полипептидного линкера, и два гетерологичных полипептида нековалентно соединены в гомодимер. Также раскрыта фармацевтическая композиция для лечения рака. Изобретение также относится к способу предотвращения или лечения рака, к способу стимуляции иммунитета у субъекта и способу восстановления способности реагировать на иммунотерапию у субъекта. Изобретение обеспечивает применение слитого белка IL-10/Fc в качестве энхансера иммунотерапии. 5 н. и 26 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Применение Fc-слитого белка для лечения рака, причем указанный Fc-слитый белок представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека из SEQ ID NO: 1 или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом домена Fc посредством полипептидного линкера, и два гетерологичных полипептида нековалентно соединены в гомодимер, где указанный вариант SEQ ID NO: 1 содержит делецию, вставку и/или замену 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что полипептидный линкер представляет собой гибкий шарнир.

3. Применение по любому из пп. 1 или 2, отличающееся тем, что последовательность указанного слитого белка содержит последовательность фрагмента Fc IgG1 или ее вариант.

4. Применение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что домен Fc иммуноглобулина IgG содержит или состоит из нецитолитического Fc IgG1.

5. Применение по п. 3 или 4, отличающееся тем, что последовательность указанного фрагмента Fc IgG1 или ее вариант содержит последовательность SEQ ID NO: 2 или ее вариант, содержащий делецию, вставку и/или замену 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков.

6. Применение по любому из пп. 2-5, отличающееся тем, что последовательность указанного гибкого шарнира выбрана из SEQ ID NO: 3 и последовательности GS-линкера или ее варианта.

7. Применение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант.

8. Применение по п. 1, отличающееся тем, что домен Fc иммуноглобулина IgG содержит или состоит из нецитолитического Fc IgG2.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что последовательность указанного фрагмента Fc IgG2 или ее вариант содержит последовательность SEQ ID NO: 5 или ее вариант.

10. Применение по любому из пп. 2-5 или 8, 9, отличающееся тем, что последовательность указанного слитого белка содержит последовательность гибкого шарнира, выбранную из SEQ ID NO: 6 и последовательности GS-линкера или ее варианта.

11. Применение по любому из пп. 8-10, отличающееся тем, что последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 7 или ее вариант.

12. Применение по п. 1, отличающееся тем, что домен Fc иммуноглобулина IgG содержит или состоит из Fc IgG3.

13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что последовательность указанного фрагмента Fc IgG3 или ее вариант содержит последовательность SEQ ID NO: 8 или ее вариант.

14. Применение по любому из пп. 12, 13, отличающееся тем, что последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 10 или ее вариант.

15. Применение по п. 1, отличающееся тем, что домен Fc иммуноглобулина IgG содержит или состоит из нецитолитического Fc IgG4.

16. Применение по п. 15, отличающееся тем, что последовательность указанного фрагмента Fc IgG4 или ее вариант содержит последовательность SEQ ID NO: 11 или ее вариант.

17. Применение по любому из пп. 15, 16, отличающееся тем, что последовательность указанного слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 13 или ее вариант.

18. Применение по любому из пп. 1-17, отличающееся тем, что указанное лечение рака представляет собой противораковую иммунотерапию.

19. Применение по п. 18, отличающееся тем, что указанная противораковая иммунотерапия выбрана из адоптивной клеточной терапии (ACT) или иммунной терапии путем блокирования контрольных точек.

20. Применение по п. 19, отличающееся тем, что терапия ACT выбрана из терапии на основе Т-клеточного рецептора (TCR)-T, химерного антигенного рецептора (CAR)-T или инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ).

21. Применение по любому из пп. 1-17, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой солидную раковую опухоль, такую как рак легких, рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак матки, рак головы и шеи, глиобластома, печеночно-клеточная карцинома, рак толстого кишечника, ректальный рак, колоректальная карцинома, рак почки, рак предстательной железы, рак желудка, рак бронха, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак печени и рак головного мозга, или рак кожи, в частности меланома.

22. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая по меньшей мере один Fc-слитый белок, содержащий домен Fc иммуноглобулина IgG и гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека из SEQ ID NO: 1 или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом домена Fc посредством полипептидного линкера, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество, и по меньшей мере один агент, подходящий для противораковой терапии, где указанный вариант SEQ ID NO: 1 содержит делецию, вставку и/или замену 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков.

23. Фармацевтическая композиция по п. 22, отличающаяся тем, что последовательность указанного Fc-слитого белка содержит последовательность SEQ ID NO: 4 или ее вариант.

24. Фармацевтическая композиция по п. 22 или 23, отличающаяся тем, что лечение рака включает адоптивную клеточную терапию (ACT).

25. Фармацевтическая композиция по п. 24, отличающаяся тем, что терапия ACT выбрана из терапии на основе Т-клеточного рецептора (TCR)-T, химерного антигенного рецептора (CAR)-T или инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ).

26. Способ предотвращения или лечения рака, где указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного Fc-слитого белка, указанный по меньшей мере один Fc-слитый белок представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека из SEQ ID NO: 1 или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом домена Fc посредством полипептидного линкера, и два гетерологичных полипептида нековалентно соединены в гомодимер, где указанный вариант SEQ ID NO: 1 содержит делецию, вставку и/или замену 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что указанный способ предотвращения или лечения рака представляет собой противораковую иммунотерапию.

28. Способ по п. 26 или 27, отличающийся тем, что указанный слитый белок предназначен для введения в комбинации с противораковой иммунотерапией, в частности, выбранной из терапии ACT или иммунной терапии путем блокирования контрольных точек.

29. Способ стимуляции иммунитета у субъекта, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту по меньшей мере одного Fc-слитого белка в комбинации с терапией путем блокирования иммунных контрольных точек, причем указанный по меньшей мере один Fc-слитый белок представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека из SEQ ID NO: 1 или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом домена Fc посредством полипептидного линкера, и два гетерологичных полипептида нековалентно соединены в гомодимер, где указанный вариант SEQ ID NO: 1 содержит делецию, вставку и/или замену 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков.

30. Способ восстановления способности реагировать на иммунотерапию у субъекта, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту по меньшей мере одного Fc-слитого белка в комбинации с терапией путем блокирования иммунных контрольных точек, причем указанный по меньшей мере один Fc-слитый белок представляет собой гомодимер двух полипептидов, каждый из которых содержит (i) домен Fc иммуноглобулина IgG и (ii) гетерологичный полипептид, содержащий последовательность IL-10 человека из SEQ ID NO: 1 или ее вариант, причем гетерологичный полипептид ковалентно связан с N-концом домена Fc посредством полипептидного линкера, и два гетерологичных полипептида нековалентно соединены в гомодимер, где указанный вариант SEQ ID NO: 1 содержит делецию, вставку и/или замену 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков.

31. Способ по любому из пп. 26-30, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один Fc-слитый белок является таким, как описано в любом из пп. 1-17.