Производные 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-она в качестве ингибиторов гистондеацетилазы и способ их получения Российский патент 2021 года по МПК C07D239/92 A61K31/517 

Настоящее изобретение относится к производным 3-гидроксихиназолин-4(3H)-она, и касается непосредственно новых производных 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов, имеющих в составе гидроксамовую кислоту, которые могут использоваться в медицине для лечения ряда заболеваний посредством ингибирования гистоновых деацетилаз, например при лечении онкологических и нейродегенеративных заболеваний.

Как известно, гистондеацетилазы (HDAC) - это ферменты, катализирующие удаление ацетильной группы ε-N-ацетиллизина гистонов. Модифицируя гистоны и изменяя конформацию хроматина, гистондеацетилазы играют важную роль в регуляции экспрессии генов. Таким образом, HDAC является важной эпигенетической мишенью при терапии рака, а ингибиторы HDAC демонстрируют успешную картину как цитотоксические агенты. В нескольких исследованиях было показано, что ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC) являются новыми перспективными средствами для лечения нейродегенеративных заболеваний, особенно болезни Альцгеймера [Ziemka-Nalecz М., Jaworska J., Sypecka J., Zalewska Т. J Neuropathol. Exp. Neurol. 2018. Vol. 77, No 10. P. 855-870; De Simone A., Milelli A. ChemMedChem. 2019. Vol.14. No 11. P. 1067-1073; Cuadrado-Tejedor M, Perez-Gonzalez M, Garcia-Munoz C, et al. Front Aging Neurosci. 2019. Vol. 11. 149].

Большинство ингибиторов HDAC имеют трехкомпонентную структуру, состоящую из цинк-связывающего участка, линкера, способного занимать канал фермента, и фрагмента, взаимодействующего с аминокислотными остатками у входа в активный центр HDAC. Ингибиторы классических деацетилаз функционируют путем связывания иона цинка в активном центре фермента и, таким образом, инактивируют систему смены зарядов.

Известно, что эффективными ингибиторами гистондеацетилаз (HDAC) являются производные гидроксамовой кислоты, например, Вориностат (SAHA), Панобиностат (LBH589) и Белиностат. Они одобрены FDA USA для лечения Т-клеточной лимфомы кожи (CTCL) и множественной миеломы [Mottamal М, et al. Molecules. 2015; 20(3):3898-941].

Одной из перспективных стратегий в создании новых фармацевтических препаратов в настоящее время является проектирование и синтез гибридных соединений, состоящих из двух или более различных биоактивных фрагментов, и действующих через активацию/блокирование нескольких мишеней. Совмещение двух активных групп в одной молекуле может приводить к более выраженному терапевтическому эффекту, по сравнению с индивидуальными компонентами при комбинированном применении

Известно, что хиназолин является важным фармакологическим фрагментом. Хиназолиновый цикл присутствует как в различных природных соединениях, так и в молекулах многих лекарственных препаратов. Соединение в одной молекуле хиназолиновой и гидроксамовой фармакофорных групп может потенциально приводить к новым перспективным соединениям, что подтверждается многочисленными примерами.

Описан ряд соединений, содержащих хиназолиновый цикл и гидроксамовую кислоту, применяемых в качестве бифункциональных ингибиторов тирозинкиназ и гистондеацетилаз [WO 2009063054, А61K 31/517, 2009; WO 2008033749, А61K 31/517, 2008; WO 2018005799, А61K 31/517, 2018; US 2008221132, А61K 31/517, 2008; KR 101964810, А61K 31/517,2019; US 2018098990, А61K 31/517, 2018].

Одной из возможных позиций присоединения гидроксаматной группы является атом азота в 3-м положении хиназолинового цикла. Примером таких соединений является серия синтезированных новых N-гидроксибензамидов и N-гидроксипропенамидов, присоединенных по 3-му положению хиназолин-4(3H)-онов [Hieu D.T., Arm D.T., Tuan N.M. et al. Bioorganic Chemistry. - 2018. Vol. 76. - P. 258-267; KR 20190134180, A61K 31/517, 2019]. Несколько соединений из этой серии (например, соединения, представленные на рисунке) показали в несколько раз более высокую цитотоксическую активность, чем ингибитор HDAC - вориностат (SAHA), по отношению к трем линиям раковых клеток человека (рак толстой кишки SW620; рак простаты РС-3; рак легкого NCI-Н23) и ингибировали HDAC со значениями IC₅₀ в субмикромолярном диапазоне:

В статье [Hieu D.T., Anh D.T., Hai Р.Т. et al. Chem Biodivers. 2019. 16(4): el 800502] описывается синтез и биологическая активность различных серий новых гидроксамовых кислот, присоединенных к 3-му положению хиназолин-4-(3H)-онов в качестве новых малых молекул, нацеленных на гистондеацетилазы. Биологическая оценка показала, что данные гидроксамовые кислоты обладают сильной цитотоксичностью в отношении трех линий раковых клеток человека (SW620, рак толстой кишки; РС-3, рак простаты; NCI-Н23, рак легкого). Большинство этих соединений проявляют более высокую цитотоксичность, чем SAHA.

Структурными аналогами заявляемых соединений являются производные хиназолин-4(3Н)-онов, в частности, N-гидрокси-6-(4-оксохиназолин-3(4Н)-ил)гексанамид, являющийся ближайшим структурным аналогом заявляемых новых соединений [US 20020115826, А61K 31/121, 2002; US 2009181971, А61K 31/121, 2009]. Однако производные гидроксамовых кислот, присоединенные по атому кислорода в 3-м положении 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов, являющиеся объектом предлагаемого изобретения, ранее не описаны.

Известно несколько возможных путей синтеза гидроксамовых кислот, присоединенных по 3-му положению хиназолин-4(3Н)-онов. Один из них представляет собой трехстадийный синтез, осуществляемый с применением в качестве исходного продукта изатового ангидрида и с использованием на последней стадии процесса карбодиимидного метода для получения гидроксамовой кислоты из свободной карбоновой кислоты [US 2009181971, А61K 31/121, 2009] Данный процесс протекает по следующей схеме (Схема 1):

Недостатками этого метода являются как низкий выход конечного соединения на последней стадии (23%, общий выход продукта после всех стадий около 10%), так и использование дорогих реактивов, таких как N-гидроксибензотриазол (HOBt), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид и замещенные изатовые ангидриды.

Согласно другому методу, описанному в цитированной работе [Hieu D.T., Anh D.T., Hai Р.Т. et al. Chem Biodivers. 2019. 16(4): e1800502] гидроксамовые кислоты, производные хиназолин-4(3H)-она, получают из соответствующих замещенных хиназолин-4(3Н)-онов алкилированием метиловыми эфирами 6-бромгексановой кислоты или 7-бромгептановой кислоты, с последующим аминолизом полученных эфиров гидроксиламином. Процесс протекает по Схеме 2:

Недостатком данного метода является проведение гидроксиламинолиза на последней стадии в достаточно жестких водных условиях со средним выходом гидроксамовых кислот 60-70%.

Во всех рассмотренных выше способах получаются соединения, в которых углеродный линкер, связывающий гидроксаматную функцию и хиназолиновый цикл, присоединен непосредственно к атому азота в 3-м положении. Известны примеры соединений с линкером, присоединенным через кислород по 6-му положению [US 2008221132, А61K 31/40, 2008; US 2015284340, C07D 239/94, 2015], по 7-му положению хиназолинового цикла (US 2019322643, А61Р 35/00, 2019), а также соединения с линкером, присоединенным к атому кислорода в 8-м положении хиназолинового цикла [CN 110382490, А61K 31/517, 2019; Zhang K., Lai F., Lin S. et al. J. Med. Chem. 2019, 62, 15, 6992-7014].

Однако способы присоединения гидроксамовой кислоты через атом кислорода в 3-м положении хиназолинового цикла не известны, как и не известны соответствующие производные хиназолина и гидроксамовой кислоты.

Целью предлагаемого изобретения является расширение ассортимента эффективных препаратов, которые могут использоваться в качестве ингибиторов гистондеацетилаз различных изоформ и применяться для лечения онкологических, нейродегенеративных и других заболеваний, а также разработка нового экономичного и промышленно-осуществимого способа получения таких препаратов.

С этой целью предлагаются новые производные 3-гидроксихиназолин-4(3H)-онов, в качестве ингибиторов гистондеацетилаз, имеющие следующую общую формулу:

где R₁ представляет собой галоген или ОМе

R₂ представляет собой водород, ОМе,

n=5, 6.

Также предлагается способ получения производных 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов указанной выше общей формулы, осуществляемый по следующей схеме: раствор производных 2-аминобензгидроксамовой кислоты, например, 2-амино-5-бром-N-гидроксибензамида или 2-амино-4,5-диметокси-N-гидроксибензамида, в пятикратном весовом избытке муравьиной кислоты кипятят в течение 4-6 часов, затем реакционную массу выливают в смесь воды со льдом, подщелачивают до рН 7 и отфильтровывают выпавший осадок производного 3-гидроксихиназолина, который затем обрабатывают алкилирующим агентом, метил 6-бромгексаноатом или метил 7-бромгептаноатом, в диметилформамиде в присутствии карбоната калия при мольном соотношении производного 3-гидроксихиназолина к алкилирующему агенту и карбонату калия, соответственно равном 1:1,1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 4-6 часов, после чего полученный продукт алкилирования высаживают добавлением воды, отфильтровювают, промывают водой, высушивают, затем подвергают аминолизу 4-х кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле в присутствии 2-х эквивалентов 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU), осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 часов до образования целевого продукта, выделяемого фильтрацией с последующей промывкой серным эфиром. Окончание реакции аминолиза определяют с помощью тонкослойной хроматографии.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующей схемой:

Используемые в качестве исходных соединений производные 2-аминобензгидроксамовых кислот могут быть получены по известному методу [Bodanszky М., Bodanszky A. The practice of peptide synthesis. - 2nd, rev. ed. - Springer, 1984. - 217 p. - ISBN-13:978-3-S40-S7S0S-4 - P. 116].

Предлагаемым способом синтезированы, в частности, следующие новые соединения:

6-[(6-бром-4-оксохиназолин-3(4//)-ил)окси]-К-гидроксигексанамид (соединение 1)

7-[(6-бром-4-оксохиназолин-3(4Н)-ил)окси] -N-гидроксигептанамид (соединение 2)

6-[(6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси]-N-гидроксигексанамид (соединение 3)

7-[(6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси]-N-гидроксигептанамид (соединение 4)

Новые соединения в отличие от ранее известных гидроксамовых кислот, присоединенных к атому азота в 3-м положении хиназолин-4(3Н)-онов, являются гидроксамовыми кислотами, присоединенными к атому кислорода в 3-м положении производных 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов. Ниже для сравнения приводятся формулы описанных ранее соединений и заявляемых соединений.

Заявляемого способ получения новых соединений имеет ряд преимуществ по сравнению со способами, применяемыми при получении структурных аналогов, а именно: повышение эффективности процесса синтеза производных 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов с гидроксамовой кислотой, присоединенной через атом кислорода в 3-м положении хиназолинового цикла, низкая трудоемкостью процесса, доступность реагентов. Также заявляемый способ обеспечивает получение целевых соединений с чистотой, удовлетворяющей требованиям фармацевтической промышленности.

Применяемые аналитические методы и оборудование.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5 мкм, 250x4.6 мм. Условия: линейный градиент АВ: 5% В (0 мин) 100% В (20 мин). А - 0.01% ТФУ в воде, В - 0.01% ТФУ в ацетонитриле. Спектры ESI-MS регистрировали на приборе "Agilent LC/MS 1200" при ионизации пробы электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Пробы готовили в системе ацетонитрил/вода 1/1, концентрация 2 мг/мл. Условия анализа: поток 1 мл/мин, давление на нибулайзере 20 psi, температура 360°С, скорость потока осушающего газа 9 л/мин, напряжение 3500 В, целевая масса от 100 до 2000. Температуру плавления определяли на приборе марки "Melting Point М-565" (BUCHI). Спектры ЯМР ¹Н получены на Фурье ЯМР-спектрометре Bruker A VANCE III NanoBay 300 МГц (для ¹Н-ЯМР). Спектры регистрировали в режиме стабилизации по дейтерию, термостабилизация 25°С, внутренний стандарт - тетраметилсилан) в ДМСО-d6. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (δ), КССВ - в герцах. ТСХ проводили на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254, проявление в УФ и нингидрином.

Ниже приводятся примеры осуществления изобретения.

Пример 1

Синтез 3-гидрокси-6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она

Раствор 2.54 г (12 ммоль) 2-амино-5,4-диметокси-N-гидроксибензамида в 10 мл муравьиной кислоты кипятят при перемешивании 5 часов. Реакционную смесь выливают в 30 мл воды со льдом, 10%-ным раствором гидрокарбоната натрия доводят рН раствора до 7. Отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 2×10 мл воды, сушат на воздухе. Выход 2.49 г (93.6%), бежевый порошок. Т. пл. 253 - 255°С. Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 97.5%. ESI-MS, m/z 223.1 [М+Н]⁺.

Пример 2

Синтез 6-бром-3-гидроксихиназолин-4(3H)-она

Раствор 2.31 г (10 ммоль) 2-амино-5-бром-N-гидроксибензамида в 10 мл муравьиной кислоты кипятят при перемешивании 5 часов. Реакционную смесь выливают в 30 мл воды со льдом, 10%-ным раствором гидрокарбоната натрия доводят рН раствора до 7. Отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 2×10 мл воды, сушат на воздухе. Выход 2.03 г (84.3%), бежевый порошок. Т. пл. 254 - 255°С. Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 98.1%. ESI-MS, m/z 242.2 [М+Н]⁺

Пример 3

Синтез метил 6-((6-бром-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гексаноата

К раствору 6-бром-3-гидроксихиназолин-4(3H)-она 242 мг (1 ммоль) в 5 мл диметилформамида прибавляют 138 мг (1 ммоль) мелкоизмельченного карбоната калия. Затем прибавляют 230 мг (1.1 ммоль) метил 6-бромгексаноата. Перемешивают 5 часов при комнатной температуре. К реакционной массе добавляют 10 мл воды, отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 2×5 мл воды, сушат на воздухе. Выход 3.43 г (93.0%), белый порошок. Т. пл. 62.2- 63.0°С. ¹H ЯМР (ДМСО-d6, δ м. д., J, Гц) 8.66 (s, 1 Н) 8.25 (d, J=2.29, 1 Н) 8.00 (dd, J=8.71, 2.38, 1 Н) 7.68 (d, J=8.71, 1 Н) 4.25 (t, J=6.51, 2 Н) 3.59 (s, 3 Н) 2.34 (t, J=7.29, 2 H) 1.66 - 1.77 (m, 2 H) 1.54 - 1.65 (m, 2 H) 1.39 - 1.50 (m, 2 H). Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 97.4%, ESI-MS, m/z 370.2 [М+Н]⁺.

Пример 4

Синтез метил 7-((6-бром-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гептаноата

К раствору 6-бром-3-гидроксихиназолин-4(3H)-она 242 мг (1 ммоль) в 5 мл диметилформамида прибавляют 138 мг (1 ммоль) мелкоизмельченного карбоната калия. Затем прибавляют 246 мг (1.1 ммоль) метил 7-бромгептаноата. Перемешивают 5 часов при комнатной температуре. К реакционной массе добавляют 10 мл воды, отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 2×5 мл воды, сушат на воздухе. Выход 3.45 г (90.1%), белый порошок. Т. пл. 72.1- 73.9°С. ¹H ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 8.66 (s, 1 Н) 8.25 (d, J=2.29, 1 Н) 8.00 (dd, J=8.71, 2.29, 1 Н) 7.68 (d, J=8.71, 1 Н) 4.25 (t, J=6.51, 2 H) 3.58 (s, 3 H) 2.31 (t,.7=7.34, 2 H) 1.65 - 1.75 (m, 2 H) 1.50 - 1.60 (m, 2 H) 1.39 - 1.49 (m, 2 H) 1.29 -1.38 (m, 2 H). Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 95.1%, ESI-MS, m/z 384.1 [М+Н]⁺.

Пример 5

Синтез метил 6-((6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гексаноата

К раствору 3-гидрокси-6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она 222 мг (1 ммоль) в 5 мл диметилформамида прибавляют 138 мг (1 ммоль) мелкоизмельченного карбоната калия. Затем прибавляют 230 мг (1.1 ммоль) метил 6-бромгексаноата. Перемешивают 5 часов при комнатной температуре. К реакционной массе добавляют 10 мл воды, отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 2×5 мл воды, сушат на воздухе. Выход 3.23 г (92.4%), белый порошок. Т.пл. 111.6-112.0°С. Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 94.6%, ESI-MS, m/z 351.2 [М+Н]⁺. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 8.49 (s, 1 Н), 7.46 (s, 1 Н), 7.18 (s, 1 Н), 4.23 (t, J=6.46, 2Н), 3.91 (s, 3Н), 3.87 - 3.90 (m, 3Н), 3.59 (s, 3Н), 2.34 (t, J=7.29, 2Н), 1.65 - 1.76 (m, 2 Н), 1.54 - 1.63 (m, 2 Н), 1.39 - 1.50 (m, 2Н).

Пример 6

Синтез метил 7-((6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гептаноата

К раствору 3-гидрокси-6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она 222 мг (1 ммоль) в 5 мл диметилформамида прибавляют 138 мг (1 ммоль) мелкоизмельченного карбоната калия. Затем прибавляют 246 мг (1.1 ммоль) метил 7-бромгептаноата. Перемешивают 5 часов при комнатной температуре. К реакционной массе добавляют 10 мл воды, отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 2×5 мл воды, сушат на воздухе. Выход 3.36 г (92.4%), белый порошок. Т.пл. 63.5-65.9°С. Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 91.3%, ESI-MS, m/z 365.2 [М+Н]⁺. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 8.50 (s, 1 Н) 7.47 (s, 1 Н) 7.18 (s, 1 Н) 4.23 (t, J=6.51, 2 Н) 3.91 (s, 3 Н) 3.89 (s, 3 Н) 3.58 (s, 3 Н) 2.31 (t, J=7.34, 2 Н) 1.64 - 1.75 (m, 2 Н) 1.51 - 1.60 (m, 2 Н) 1.39 - 1.48 (m, 2 Н) 1.28 - 1.38 (m, 2 Н).

Пример 7

Синтез 6-((6-бром-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси-N-гидроксигексанамида (соединение 1)

Металлический натрий 140 мг (6 ммоль) растворяют в 10 мл метанола, добавляют 270 мг (4 ммоль) мелкоизмельченного хлоргидрата гидроксиламина, перемешивают 30 минут. Отфильтровывают осадок, к фильтрату прибавляют раствор 369 мг (1 ммоль) 6-((6-бром-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гексаноата в 5 мл метанола. После перемешивания в течение 2-х минут к полученной смеси добавляют DBU (0.28 мл, 2.00 ммоль), выдерживают при комнатной температуре сутки (контроль прохождения реакции по ТСХ до исчезновения исходного эфира, элюент: хлороформ: метанол - 10: 1). Отфильтровывают выпавший осадок, промывают 10 мл серного эфира, сушат на воздухе. Выход 344 мг (93.2%), светло-бежевый порошок. Т. пл. 128 - 132°С. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 10.36 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.25 (d, J=2.3, 1Н), 8.01 (dd, J=8.7, 2.4, 1H), 7.68 (d, J=8.7, 1H), 4.25 (t, J=6.5, 2H), 1.98 (t, J=7.2, 2H), 1.76 - 1.65 (m, 2H), 1.62-1.51 (m, 2H), 1.47 - 1.38 (m, 2H). Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 96.1%, ESI-MS, m/z 372.0 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 55.88; Н, 6.34; N, 11.50. C₁₇H₂₃N₃O₆. Вычислено, %: С, 55.79; Н, 6.37; N, 11.44.

Пример 8

Синтез 7-[(6-бром-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси]-N-гидроксигептанамида (соединение 2)

Металлический натрий 140 мг (6 ммоль) растворяют в 10 мл метанола, добавляют 270 мг (4 ммоль) мелкоизмельченного хлоргидрата гидроксиламина, перемешивают 30 минут. Отфильтровывают осадок, к фильтрату прибавляют раствор 383 мг (1 ммоль) метил 7-((6-бром-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гептаноата в 5 мл метанола. После перемешивания в течение 2-х минут к полученной смеси добавляют DBU (0.28 мл, 2.00 ммоль), выдерживают при комнатной температуре сутки (контроль прохождения реакции по ТСХ до исчезновения исходного эфира, элюент хлороформ: метанол - 10:1). Отфильтровывают выпавший осадок, промывают 10 мл серного эфира, сушат на воздухе. Выход 336 мг (87.5%), светло-бежевый порошок. Т. пл. 141 - 143°С. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.34 (с, 1Н), 8.66 (с, 1Н), 8.25 (д, J=2.3, 1H), 8.01 (д.д, J=8.7, 2.4, 1Н), 7.68 (д, J=8.7, 1Н), 4.25 (т, J=6.5, 2Н), 1.96 (т, J=7.3, 2Н), 1.78 - 1.63 (м, 2Н), 1.59 - 1.38 (м, 4Н), 1.36 - 1.23 (м, 2Н).. Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 96.9%, ESI-MS, m/z 385.9 [М+Н]⁺, 791.3 [2M+Na]⁺. Найдено, %: С, 45.42; Н, 4.36; N, 11.35. C₁₇H₂₃N₃O₆. Вычислено, %: С, 45.53; Н, 4.33; N, 11.42.

Пример 9

Синтез 6-((6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси-N-гидроксигексанамида (соединение 3)

Металлический натрий 140 мг (6 ммоль) растворяют в 10 мл метанола, добавляют 270 мг (4 ммоль) мелкоизмельченного хлоргидрата гидроксиламина, перемешивают 30 минут. Отфильтровывают осадок, к фильтрату прибавляют раствор 350 мг (1 ммоль) 6-((6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гексаноата в 5 мл метанола. После перемешивания в течение 2-х минут к полученной смеси добавляют DBU (0.28 мл, 2.00 ммоль), выдерживают при комнатной температуре сутки (контроль прохождения реакции по ТСХ до исчезновения исходного эфира, элюент хлороформ: метанол - 10:1). Отфильтровывают выпавший осадок, промывают 10 мл серного эфира, сушат на воздухе. Выход 296 мг (84.3%), светло-бежевый порошок. Т. пл. 75.6 -77.9°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 8.49 (с, 1Н), 7.47 (с, 1Н), 7.18 (с, 1Н), 4.23 (т, J=6.5, 2Н), 3.91 (с, 3Н), 3.88 (с, 3Н), 1.98 (т, J=7.2, 2Н), 1.77 - 1.64 (м, 2Н), 1.63 - 1.48 (м, 2Н), 1.49 - 1.35 (м, 2Н). Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 99.5%, ESI-MS, m/z 703.4 [2М+Н]⁺, 352.1 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 54.69; Н, 6.02; N, 11.96. C₁₆H₂₁N₃O₆. Вычислено, %: С, 54.58; Н, 6.09; N, 12.02.

Пример 10

Синтез 7-[(6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси]-N-гидроксигептанамида (соединение 4)

Металлический натрий 140 мг (6 ммоль) растворяют в 10 мл метанола, добавляют 270 мг (4 ммоль) мелкоизмельченного хлоргидрата гидроксиламина, перемешивают 30 минут. Отфильтровывают осадок, к фильтрату прибавляют раствор 364 мг (1 ммоль) 6-((6,7-диметокси-4-оксохиназолин-3(4H)-ил)окси)гептаноата в 5 мл метанола. После перемешивания в течение 2-х минут к полученной смеси добавляют DBU (0.28 мл, 2.00 ммоль), выдерживают при комнатной температуре сутки (контроль прохождения реакции по ТСХ до исчезновения исходного эфира, элюент хлороформ: метанол - 10: 1). Отфильтровывают выпавший осадок, промывают 10 мл серного эфира, сушат на воздухе. Выход 318 мг (87.3%), светло-бежевый порошок. Т. пл. 105 - 109°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 10.34 (с, 1Н), 8.66 (с, 1Н), 8.50 (с, 1Н), 7.47 (с, 1H), 7.18 (с, 1Н), 4.23 (т, J=6.5, 2Н), 3.91 (с, 3Н), 3.89 (с, 3Н), 1.96 (т, J=7.3, 2Н), 1.76 - 1.61 (м, 2Н), 1.58 - 1.37 (м 4Н), 1.37 - 1.24 (м, 2Н). Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 96.3%, ESI-MS, m/z 366.3 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 55.88; Н, 6.34; N, 11.50. C₁₇H₂₃N₃O₆. Вычислено, %: 55.79; Н, 6.37; N, 11.44.

Пример 11

Определение цитотоксической активности

Цитотоксическую активность заявляемых соединений определяли с помощью МТТ-теста. Концентрацию полумаксимального ингибирования (IC50) для синтезированных веществ определяли на клетках рака толстой кишки НТС116, карциномы легкого А549, рака предстательной железы РС-3, рака молочной железы MCF-7, рака почки SN12C

Для проведения исследования клетки опухолевых линий человека были нанесены в 96-луночный культуральный планшет (10⁴ клеток в каждой лунке) и после 24 часов инкубации к клеткам были добавлены методом раститровки различные концентрации 14 исследуемых соединений в диапазоне 100±0.1 мкМ. В качестве контроля сравнения использовали препарат Вориностат (SAHA), являющийся гидроксамовой кислотой. Планшет с внесенными веществами помещали в СО₂-инкубатор на 72 часа. После инкубации вносили в каждую лунку по 20 мкл рабочего раствора МТТ. Инкубировали планшет 3 часа в СО₂-инкубаторе. После инкубации заменить в каждой лунке среду на 200 мкл ДМСО.

После растворения кристаллов формазана определяли оптическую плотность каждой лунки при 570 нм, вычитали измеренное фоновое поглощение при 620 нм с помощью планшетного фотометра. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (IC₅₀) (Таблица 1), определяли на основе дозозависимых кривых и/или с помощью программного обеспечения (например, GraphPad Prism 5.0 или OriginPro 9.0)

Пример 12

Исследование влияния производных гидроксамовых кислот на активность ферментов HDAC1 и HDAC6.

Протокол проведения исследования.

Делают навески исследуемых веществ и приготовляют растворы с исходной концентрацией 5×10^-3 М в подходящем растворителе (вода, спирт, ДМСО). Приготовляют стоковые растворы исследуемых веществ в растворителе для получения концентрационной зависимости с учетом того, что конечная концентрация вещества в инкубационной среде меньше в 4 раза (50 мкл раствора вещества в 200 мкл конечного объема пробы). В качестве эталонных веществ использовались препараты Вориностат (SAHA) и Трихостатин А.

Эксперимент выполнялся в 96-луночном планшете. Добавляют 50 мкл раствора исследуемых соединений в лунки планшета, согласно схеме соответствующего эксперимента.

Фермент HDAC разбавляют с использованием буфера HDAC-Glo ™ до желаемой концентрации.

Вносят 50 мкл фермента HDAC в каждую лунку 96-луночного планшета, где уже находятся растворы исследуемых соединений, полученные на предыдущей стадии. Оставляют не менее 3-х лунок без HDAC, для формирования буферного фона, не менее 3-х лунок с HDAC и растворителем, для получения максимального сигнала активности фермента.

Содержимое планшета перемешивают при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, используя орбитальный шейкер при 500-700 об/мин, чтобы обеспечить однородность.

Смесь фермент/исследуемое вещество инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут (но не более 2 часов).

Готовят реагент HDAC-Glo™: 10 мл буфера HDAC-Glo™ добавляют к субстрату HDAC-Glo и осторожно перемешивают. Затем в эту смесь добавляют 10 мкл реагента-проявителя и также осторожно перемешивают.

Равный объем реагента HDAC-Glo™ добавляют в каждую лунку планшета (100 мкл для 96-луночного).

Смешивают содержимое ячеек при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, используя орбитальный шейкер при 500-700 об/мин, чтобы обеспечить однородность. Затем содержимое инкубируют при комнатной температуре в течение 15-45 минут.

По истечению необходимого времени инкубации измеряют люминесценцию на многофункциональном планшетном анализаторе En Vision.

Обработка полученных первичных данных, определение IC₅₀

Так как амплитуды кривых могут различаться от повторения к повторению, полученные абсолютные значения хемилюминесценции нормировали для каждого отдельного повторения. За нулевое значение брали минимальное измеренное значение внутри одной серии разведений, за 100% - максимальное достигнутое значение. Нормированные три повторения вместе аппроксимировали кривой у=у(х), задающейся формулой 7.1

где, у - нормированная интенсивность люминесценции, х - десятичный логарифм

концентрации исследуемого вещества.

Параметры Bottom, Top, HillSlope и lgIC₅₀ подбираются так, чтобы сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от аппроксимирующей кривой была минимальна. Полученные значения IC₅₀ (Таблица 1) и границ 95% доверительных интервалов использовали для анализа результатов работы. Обработка данных выполнена с использованием пакета GraphPad Prism 6.

Заявляемые соединения обладают цитотоксической активностью в микромолярном диапазоне на различных линиях опухолевых клеток. Активность ряда соединений по отношению ферментам HDAC6 превышает или сравнима с активностью известного ингибитора гистондеацетилазы - Вориностата (SAHA), при этом необходимо отметить высокую селективность всех соединений к ферменту HDAC6 по сравнению с HDAC1.

Изобретение относится к производным 3-гидроксихиназолин-4(3H)-она, представленной ниже общей формулы, которые могут использоваться в качестве ингибиторов гистондеацетилаз. В общей формуле производных 3-гидроксихиназолин-4(3H)-она R₁ представляет собой галоген или ОМе; R₂ представляет собой водород, ОMе; n=5, 6. Изобретение относится также к способу получения указанных соединений, который осуществляют по следующей схеме. Раствор производных 2-аминобензгидроксамовой кислоты, например, 2-амино-5-бром-N-гидроксибензамида или 2-амино-4,5-диметокси-N-гидроксибензамида, в пятикратном весовом избытке муравьиной кислоты кипятят в течение 4-6 часов. Затем реакционную массу выливают в смесь воды со льдом, подщелачивают до рН 7 и отфильтровывают выпавший осадок производного 3-гидроксихиназолина, который затем обрабатывают алкилирующим агентом, метил 6-бромгексаноатом или метил 7-бромгептаноатом, в диметилформамиде в присутствии карбоната калия при мольном соотношении производного 3-гидроксихиназолина к алкилирующему агенту и карбонату калия соответственно равном 1:1,1:1 и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-6 часов. После этого полученный продукт алкилирования высаживают добавлением воды, отфильтровывают, промывают водой, высушивают, затем подвергают аминолизу 4-кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле, осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 часов до образования целевого продукта, выделяемого фильтрацией с последующей промывкой серным эфиром. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 12 пр.

1. Производные 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов общей формулы

,

где R₁ представляет собой галоген, ОМе,

R₂ представляет собой водород, ОМе,

n=5, 6,

которые могут использоваться в качестве ингибиторов гистондеацетилаз различных изоформ и применяться для лечения, в частности, онкологических и нейродегенеративных заболеваний.

2. Способ получения производных 3-гидроксихиназолин-4(3Н)-онов общей формулы

,

где R₁ представляет собой галоген, ОМе,

R₂ представляет собой водород, ОМе,

n=5, 6,

осуществляемый по следующей схеме: раствор производных 2-аминобензгидроксамовой кислоты, например, 2-амино-5-бром-N-гидроксибензамида или 2-амино-4,5-диметокси-N-гидроксибензамида, в пятикратном весовом избытке муравьиной кислоты кипятят в течение 4-6 часов, затем реакционную массу выливают в смесь воды со льдом, подщелачивают до рН 7 и отфильтровывают выпавший осадок производного 3-гидроксихиназолина, который затем обрабатывают алкилирующим агентом, метил 6-бромгексаноатом или метил 7-бромгептаноатом, в диметилформамиде в присутствии карбоната калия при мольном соотношении производного 3-гидроксихиназолина к алкилирующему агенту и карбонату калия соответственно равном 1:1,1:1, перемешивают при комнатной температуре в течение 4-6 часов, после чего полученный продукт алкилирования высаживают добавлением воды, отфильтровывают, промывают водой, высушивают, затем подвергают аминолизу 4-кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле, осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 часов до образования целевого продукта, выделяемого фильтрацией с последующей промывкой серным эфиром.

3. Способ получения по п. 2, осуществляемый с использованием 2 эквивалентов 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU) на стадии аминолиза гидроксиламином.