Производные 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты с противоопухолевым действием и способ их получения Российский патент 2025 года по МПК C07D239/94 A61K31/517 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицинской и фармацевтической химии и касается производных 4-((арил)(метил)амино)хиназолина, содержащих гидроксамовую кислоту, которые обладают ингибирующей активностью в отношении гистондеацетилазы (HDAC) и могут использоваться в медицине для лечения онкологических заболеваний.

Как известно, гистондеацетилазы (HDAC) - это ферменты, катализирующие удаление ацетильной группы e-N-ацетил-лизина гистонов, белков цитоскелета и регуляторных факторов. HDAC играют важную роль в регуляции экспрессии генов, так как они модифицируют гистоны и изменяют конформацию хроматина, а также контролируют стабильность репрессорных комплексов. В последние годы ингибирование гистондеацетилаз стало одним из важных направлений в области исследований противоопухолевых препаратов. Исследования показали, что ингибиторы HDAC могут эффективно ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, индуцировать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток и противоопухолевый ангиогенез, а также ингибировать миграцию, инвазию и метастазирование опухолевых клеток. Большинство ингибиторов HDAC имеют трехкомпонентную структуру, состоящую из цинк связывающего участка (ZBG), линкера, способного занимать канал фермента, и фрагмента, взаимодействующего с аминокислотными остатками у входа в активный центр фермента (Сар). Ингибиторы классических деацетилаз функционируют путем связывания каталитического иона цинка в активном центре фермента и, таким образом, инактивируют систему смены зарядов. [Eckschlager, Т.; Plch, J.; Stiborova, М.; Hrabeta, J. Histone Deacetylase Inhibitors as Anticancer Drugs. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1414.]

Известно, что эффективными ингибиторами гистондеацетилаз (HDAC) являются производные гидроксамовой кислоты, например, вориностат (SAHA), панобиностат (LBH589) и белиностат.Они одобрены FDA USA для лечения Т-клеточной лимфомы кожи (CTCL) и множественной миеломы [Mottamal М, et al. Molecules. 2015; 20(3):3898-941].

Основным направлением исследований ингибиторов на основе гидроксамовой кислоты является поиск более активных, селективных и безопасных производных. Повышение противоопухолевой активности при одновременном снижении воздействия на нормальные ткани или клетки является основной задачей.

Известно, что хиназолин является важным биоактивным фармакологическим фрагментом. Хиназолиновый цикл присутствует как в различных природных соединениях, так и в молекулах многих лекарственных препаратов. Объединение в одной молекуле хиназолиновой и гидроксамовой фармакофорных групп позволяет создавать новые перспективные биоактивные соединения, что подтверждается многочисленными примерами [Osipov V.N., Khachatryan D.S., Balaev A.N. Biologically active quinazoline-based hydroxamic acids. Med Chem Res (2020)].

Одним из возможных направлений присоединения гидроксаматной группы к прозводному хиназолина является 7-е положение хиназолинового цикла.

Известны примеры присоединения гидроксамовой кислоты с помощью линкера через кислород по 7-му положению хиназолинового цикла. Описанные в патентах US2008221132, А61К31/40, 2008; US2015284340, C07D239/94 соединения, заявлены как ингибиторы гистондеацетилаз:

где R1=Н, R2=3-этинил; R1=3-С1, R2=4-F; п=3-5

Известные примеры подобных соединений, заявленных как ингибиторы гистондеацетилаз, представлены в патенте US2019322643, А61Р35/00:

Известны примеры присоединения углеводородного линкера по 7-му положению хиназолинового цикла, описанные в патентах US2013267542, А61К31/517; US2015196563; RU2629947, C07D239/90:

С другой стороны известно изобретение (WO2009023876A1 -2009-02-19 A01N43/54; А61К31/517), которое обеспечивает способ лечения или профилактики немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), особенно немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), который метастазировал в центральную нервную систему (головной и/или спинной мозг), путем введения пациенту при необходимости лечения терапевтически эффективное количество (4-метоксифенил)-метил-(2-метилхиназолин-4-ил)амина, соединения известного как Верубулин.

В результате испытаний было обнаружено, что Верубулин обладает превосходным проникновением через гематоэнцефалический барьер и очень эффективен в моделях рака молочной железы человека МХ-1 и других моделях рака ксенотрансплантата мышей [Sirisoma N., Pervin A., Zhang Н. et al. J Med Chem. 2009. Vol. 52(8). P. 2341-2351.].

Синтезированы несколько аналогов Верубулина содержащих гидроксамовую кислоту. Наиболее перспективное соединение SKLB-23bb может стать первым перорально биодоступным агентом двойного действия на HDAC6 и тубулин с высоким потенциалом для лечения опухолей [CN106045923 (А), 2016-10-26, А61К31/517]. В дальнейшем были получены многочисленные аналоги SKLB-23bb, наиболее активны соединения 12b [Yang L., Zhang W., Qiu Q. et al. Journal of Medicinal Chemistry. 2021. Vol. 64(20). P. 15379-15401] и SKLB-14b [Zhang W., Yang L., Si W., Tang M. et al. Bioorg Chem. 2022. Vol. 128. P. 106053].

Известен пример аналога Верубулина с гидроксамовой кислотой, присоединенной по 2-му положению хиназолина через различные линкеры WO 2009036057 A1, 2009-03-19, A01N43/54; А61К31/517. Соединения заявлены как антипролиферативные агенты, применяемые при лечении заболеваний, связанных с ангиогенезом. Указанные производные также могут действовать как ингибиторы HDAC.

Ближайшим прототипом настоящего изобретения является патент RU2779981, А61К 31/517, в котором гидроксамовые кислоты, производные 4-аминохиназолин-7-карбоновой кислоты общей формулы:

заявлены в качестве ингибиторов HDAC различных изоформ и могут применяться для лечения, в частности онкологических и нейродегенеративных заболеваний.

Однако, гидроксамовые кислоты, присоединенные к 7-му положению 4-((арил)(метил)амино)хиназолина, отличающиеся от ближайшего прототипа наличием метального заместителя у атома азота в 4-м положении хиназолина, неизвестны. Введение в структуру по аналогии с Верубулином метильной группы к атому азота в 4-м положении хиназолина улучшает фармакологические свойства препарата, например, может облегчить прохождение через гематоэнцефалитный барьер.

Целью изобретения является создание ингибиторов гистондеацетилазы с улучшенными фармакокинетическими характеристиками за счет оптимизации химической структуры известного прототипа, что позволит улучшить фармакологические свойства и противоопухолевую активность.

Техническим результатом изобретения является создание ингибиторов гистондеацетилазы с улучшенными фармакокинетическими характеристиками.

С этой целью предлагаются новые гидроксамовые кислоты, производные 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты в качестве ингибиторов гистондеацетилаз, имеющие следующую общую формулу:

где R₁ представляет собой водород или метил, R2 представляет собой водород, или ОМе, А представляет собой -(СН₂)₅- или шря-фенилен (-С₄Н₆-).

Также заявляется способ получения новых гидроксамовых кислот, производных 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты формулы I, осуществляемый по следующей схеме (Схема 1): производные метил 4-гидроксихиназолин-7-карбоксилата 1а-,b, получаемые циклизацией производных диметил-2-аминотерефталата в формамиде, взаимодействием с фосфорилхлоридом в присутствии диэтиланилина переводятся в производные метил 4-хлорхиназолин-7-карбоксилата 2а-b, которые при взаимодействии с замещенными N-метиланилинами в диметилфорамиде при комнатной температуре превращаются в производные метил N-арил-N-метил-4-аминохиназолин-7-карбоксилатов 3а-b, последние подвергаются щелочному гидролизу, превращаясь в соответствующие N-арил-N-метил-4-аминохиназолин-7-карбоновые кислоты 4а-b; далее к последним присоединяется метиловый эфир 7-аминогептановой кислоты с использованием 2-{1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторбората (TBTU) в качестве конденсирующего агента и триметиламина в качестве основания, полученные соединения 5 затем подвергают аминолизу 10-ти кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле в присутствии 2-х эквивалентов 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU), осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 часов до образования целевых продуктов 6, выделяемых упариванием реакционной массы в вакууме, нейтрализацией ледяной уксусной кислотой до рН 5, фильтрацией и с последующей промывкой водой на фильтре.

Способ иллюстрируется следующей схемой 1:

Способ получения производных 4-аминохиназолин-7-карбоновой кислоты формулы I, содержащих пара-фениленовый фрагмент, осуществляется по следующей схеме (Схема 2): к производным 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновых кислот 4а-b, присоединяется метиловый эфир 4-аминометилбензойной кислоты с использованием 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторбората (TBTU) в качестве конденсирующего агента и триметиламина в качестве основания, полученные соединения 7а-b затем подвергают аминолизу 10-ти кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле в присутствии 2-х эквивалентов 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU), осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 ч до образования целевых продуктов 8а-с, выделяемых упариванием реакционной массы в вакууме, нейтрализацией ледяной уксусной кислотой до рН 5, фильтрацией и с последующей промывкой водой на фильтре.

Способ иллюстрируется следующей схемой 2:

Заявляемый способ получения новых гидроксамовых кислот, производных N-арил-N-метил-4-аминохиназолин-7-карбоновой кислоты, осуществляется в простых условиях, имеет низкую трудоемкостью процесса, доступность реагентов. Заявляемый способ получения новых гидроксамовых кислот, производных N-арил-N-метил-4-аминохиназолин-7-карбоновой кислоты, также обеспечивает получение целевых соединений с чистотой, удовлетворяющей требованиям фармацевтической промышленности.

Изобретение иллюстрируется фигурой и таблицей

На фигуре представлены: Вестерн-блот анализ ипгибирующего действия соединений 6 с и 8 на ядерные и цитоплазматические HDAC. (А) Накопление гистона НЗК9/14ас, субстрата HDACs класса I и общее содержание гистона НЗ. (В) Накопление а-тубулина К40ас, субстрата HDAC6 класса IIb и общее содержание α-тубулина.

В таблице представлены: Цитотоксическая активность соединений, IC₅₀, мкМ

Ниже приводятся примеры осуществления изобретения.

Применяемые аналитические методы и оборудование.

Все реактивы получены от Acros Organics, ABCR, Sigma-Aldrich и использовались без дополнительной очистки. Бензиловые эфиры хлоруксусной кислоты получали из хлорацетилхлорида и бензиловых спиртов по известной методике [Lauber B.S., Hardegger L.A., Alam К.А. Chemistry. - 2016. - Vol. 22(1). - P. 211-221.] и использовали далее без дополнительной очистки. Спектры ЯМР 'Н регистрировали на спектрометре Bruker AVANCE III NanoBay с частотой 300 МГц. Спектры получали в режиме стабилизации по дейтерию, термостабилизация 25°С, в растворе DMSO-d₆, в качестве стандарта использовали остаточные сигналы растворителя. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (8). Константа спин-спинового взаимодействия J, Гц. Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографической системе Agilent LC/MS 1200, с использованием колонки Reprosil-Pur Basic C18 (5 мкм), 4.6x240 мм, подвижная фаза: буфер А - 0.1% TFA в воде, буфер Б -0.1% TFA в ацетонитриле, элюирование градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 5 до 100% за 20 мин; скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Масс-спектры с ионизацией электроспреем (ESI-MS) получали на масс-детекторе Agilent Ion Trap 6310. Регистрацию масс-спектров высокого разрешения проводили на масс-спектрометре amaZon Bruker Daltonics с ионной ловушкой в режиме электрораспылительной ионизации. Температуру плавления определяли в открытом капилляре на анализаторе температуры плавления Mettler Toledo MP 90.

Пример 1

Метил 4-оксо-3,4-дигдрохиназолин-7-карбоксилат 1а.

Соединение 1a получено обработкой диметил 2-аминотерефталата формамидом по известной методике [Lauber B.S., Hardegger L.A., Alam К.A. et al. Chemistry. 2016. Vol. 22(1). P. 211-221].

Раствор 20.9 г (0.10 моля) диметилового эфира 2-аминотерефталевой кислоты в 120 мл формамида при перемешивании нагревают при 150°С 8 часов, охлаждают до 0°С.Коричневую суспензию выливают в ледяную воду (400 мл). Осадок отфильтровывают осадок, промывают на фильтре водой (50 мл). Осадок сушат в вакууме при 50°С. Выход 12.3 г (62%), белый порошок. Т.пл. 252-253°С.Спектр ¹Н ЯМР (CD₃OD), δ: 8.29-8.33 (м, 2 Н), 8.16 (с, 1Н), 8.11 (дд, J 8.4, 1.6, 1Н), 3.96 (с, ЗН). Содержание основного продукта по данным ВЭЖХ 99.2%.

Пример 2

Метил 2-метил-4-оксо-3,4-дигдрохиназолин-7-карбоксилат, 1b.

Соединение 1b получено реакцией диметил 2-аминотерефталата с ацетонитрилом по модифицированной методике [Bogolubsky А.V. et al. Journal of Combinatorial Chemistry. 2008. Vol. 10(6). P. 858-862].

Раствор 20.9 г (0.10 моля) диметилового эфира 2-аминотерефталевой кислоты в 300 мл 15%-ного раствора НС1(_Газ) в ацетонитриле кипятят 12 часов, затем охлаждают до комнатной температуры. Отфильтровывают осадок, растворяют его в 200 мл воды, раствор нейтрализуют насыщенным раствором NаНСО₃(100 мл), выпавший осадок отфильтровывают, промывают 50 мл воды. Осадок сушат при комнатной температуре 12 часов. Получают 19.6 г (90%) белых кристаллов, содержание основного продукта по ВЭЖХ 99.8%. Т. пл. 270-272°С.Спектр 'Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 12.42 (с, 1Н), 8.18 (д,J=8.3, Ш), 8.15 (с, 1Н), 8.08 (д,J=1.6, 1H), 7.94 (дд, J=8.3, 1.7, 1Н), 3.90 (с, 3Н).

Пример 3

Метил 4-хлорхиназолин-7-карбоксилат, 2а.

К суспензии la (4.3 г, 21 ммоль) в 80 мл толуола добавляют диэтиланилин (6.8 мл, 53 ммоль) и затем приливают фосфорилхлорид (4.9 мл, 53 ммоль). Суспензию кипятят 3.5 часа, охлаждают, промывают последовательно 50 мл воды, 3×50 мл 8%-ной соляной кислотой, 50 мл воды. Органический слой упаривают в вакууме, кристаллический остаток переносят на фильтр и промывают 2×25 мл гексана, сушат на воздухе. Выход 3.9 г (83.5%), бежевые кристаллы, содержание основного продукта по ВЭЖХ 94.6%. ESI-MS, m/z 223.1 [М+Н]⁺.

Пример 4

Метил 2-метил-4-хлорхиназолин-7-карбоксилат, 2b.

К суспензии 1b (4.4 г, 20 ммоль) в 80 мл толуола добавляют диэтиланилин (6.5 мл, 50 ммоль) и затем приливают фосфорилхлорид (4.6 мл, 50 ммоль). Суспензию кипятят 3.5 часа, охлаждают, промывают последовательно 50 мл воды, 3x50 мл 8%-ной соляной кислотой, 50 мл воды. Органический слой упаривают в вакууме, кристаллический остаток переносят на фильтр и промывают 2×25 мл гексана, сушат на воздухе. Выход 3.64 г (77.0%), желтые кристаллы. Т.пл. 139-140°С.Содержание основного продукта по ВЭЖХ 94.4%. ESI-MS, m/z 237.5 [М+Н]⁺.

Пример 5

Метил 4-((метил)(фенил)амино)-хиназолин-7-карбоксилата хлоргидрат, 3а.

К суспензии 2а (445 мг, 2 ммоль) в 5.5 мл ДМФА добавляют N-метиланилин (235 мг, 2.2 ммоль) и перемешивают 3.5 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют 10 мл воды, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой и сушат на воздухе. Выход 530 мг (87.5%), белые кристаллы, содержание основного продукта по ВЭЖХ 99.4%. Т.пл. 209.5-210.5°С. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-δ₆, 8 м. д., J, Гц) 8.83 (s, H), 8.26 (d,J=1.8, 1Н), 7.58 - 7.27 (m, 6Н), 7.32 - 7.24 (m, 1H), 7.03 (d, J=8.7, 1H), 3.87 (s, 3Н), 3.58 (s, 3Н). HRMS: m/z 294.1233 [M]⁺. Вычислено для (С₁₇Н₁₆N₃O₂)⁺: 294.1241.

Пример 6

Метил 4-((метил)(4-метоксифенил)амино)-хиназолин-7-карбоксилата хлоргидрат, 3b.

Получали аналогично соединению 3а из N-метил-4-метоксианилина. Выход 550 мг (85.3%), светло-бежевые кристаллы, содержание основного продукта по ВЭЖХ 97.9%. Т.пл. 122-123°С. Спектр¹Н ЯМР (ДМСO-δ₆, 8 м. д., J, Гц) 8.77 (d, J=0.9, 1H), 8.23 (d, J=1.5_; 1H), 7.60 - 7.50 (m, 1H), 7.30 - 7.18 (m, 2H), 7.10 - 6.94 (m, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.53 (s, 3H). HRMS: m/z 324.1324 [M]⁺. Вычислено для (C₁₈H₁₈N₃O₃)⁺: 324.1347.

Пример 7

Метил 4-((метил)(4-метоксифенил)амино)-2-метилхиназолин-7-карбоксилата хлоргидрат, 3с.

Получали аналогично соединению 3а из метил 2-метил-4-хлорхиназолин-7-карбоксилата (445 мг, 2 ммоль) и N-метил-4-метоксианилина (301 мг, 2.2 ммоль). Выход 527 мг (78.3%), светло-бежевый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 98.8%. Т.пл. 89-90°С.Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 8.13 (d,J=1.8, 1Н), 7.45 (dd, J=8.9, 1.9, 1Н), 7.26 - 7.15 (m, 2H), 7.04 - 6.93 (m, 3Н), 3.85 (s, 3Н), 3.78 (s, 3Н), 3.50 (s, 3Н), 2.59 (s, 3Н). HRMS: m/z 338.1481 [M]⁺. Вычислено для (С₁₉Н₂₀N₃О₃)⁺: 338.1503.

Пример 8

4-((метил)(фенил)амино)хиназолин-7-карбоновая кислота, 4а.

К раствору соединения 3а (514 мг 1.75 ммоль) в 10 мл метанола добавляют раствор гидроксида натрия (0.21 г, 5.25 ммоль) в 5 мл воды и перемешивают 2.5 часа при 100°С. Реакционную смесь охлаждают, нейтрализуют ледяной уксусной кислотой (0.42 мл, 7 ммоль), добавляют 10 мл воды, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 2×5 мл воды и сушат на воздухе. Выход 435 мг (77.0%), белый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 95.9%. Т.пл. 255°С (разл.). Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-(1₆, 8 м. д., J, Гц) 13.37 (s, 2Н), 8.82 (s, Ш), 8.25 (d,J=1.8, 1Н), 7.57 - 7.39 (m, 4Н), 7.39-7.31 (т, Ш), 7.36 - 7.23 (т, ЗН), 7.02 (d, J=8.9, 1Н), 3.58 (s, 4H). HRMS: m/z 280.1073 [M]⁺. Вычислено для (C₁₆H₁₃N₃O₂)⁺: 280.1085.

Пример 9

4-((метил)(4-метоксифенил)амино)хиназолин-7-карбоновая кислота, 4b.

Получали аналогично соединению 4а. Выход 439 мг (81.2%), бежевый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 98.9%. Т.пл. 258°С (разл.). Спектр 'Н ЯМР (ДМС0^₆, 8 м. д., J, Гц) 13.34 (s, Ш), 8.76 (s, Ш), 8.23 (d, J=1.8, 1Н), 7.54 (dd, J=8.9, 1.9, 1H), 7.29 - 7.18 (m, 2H), 7.09 - 6.94 (m, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.53 (s, 3H). HRMS: m/z 310.1197 [M]⁺. Вычислено для (Ci₇Hi₆N₃0₃)⁺: 310.1190.

Пример 10

4-((метил)(4-метоксифенил)амино)-2-метилхиназолин-7-карбоновая кислота, 4с.

Получали аналогично соединению 4а. Выход 425 мг (75.3%), белые кристаллы, содержание основного продукта по ВЭЖХ 99.1%. Т.пл. 260°С (разл.). Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, 8 м. д., J, Гц) 13.29 (s, 1Н), 8.20- 8.08 (m, 1H), 7.46 (d, J=8.9, 1H), 7.21 (d, J= 8.9, 2Н), 6.99 (d, J=8.8, 3Н), 3.78 (s, 3Н), 3.50 (s, 3Н), 2.60 (s, 3Н). HRMS: m/z 324.1335 [M]⁺. Вычислено для (C₁₈H₁₈N₃0₃)⁺: 324.1347.

Пример 11

Метил 7-(4-(метил)(фенил)амино)хиназолин-7-карбоксамидо)гептаноат, 5а.

К суспензии соединения 4а 210 мг (0.75 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляют TBTU 321 мг (1 ммоль), гидрохлорида метилового эфира 6-аминогексановой кислоты 150 мг (0.83 ммоль), затем добавляют триэтиламин 230 мг (4 ммоль) и перемешивают 3 часа при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляют 10 мл воды, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 2×5 мл воды и сушат на воздухе. Выход 278 мг (88.0%), содержание основного продукта по ВЭЖХ 96.5%. ¹Н ЯМР (ДМС(М₆, 5 м. д., 7 Гц) 8.81 (s, 1H), 8.65 (m, 7=5.6, 1Н), 8.21 (d,7=1.8, 1Н), 7.51 - 7.39 (т, 3Н), 7.44-7.29 (т, 1H), 7.34 -7.23 (т, 2Н), 6.97 (d,7=8.9, 1Н), 3.57 (d, 7=4.0, 6Н), 3.23 (q, 7=6.7, 2Н), 2.28 (t, 7=7.4, 2Н), 1.59 - 1.42 (m, 4Н), 1.33 - 1.19 (m, 4Н). HRMS: m/z 421.2227 [М]⁺. Вычислено для (C₁₆H₁₃N₃O₂)⁺: 421.2238.

Пример 12

Метил 7-(4-(метил)(4-метоксифенил)амино)хиназолин-7-карбоксамидо)гептаноат, 5b.

Получали аналогично соединению 5а. Выход 192 мг (57.0%), светло-желтый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 96.4%. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСO-d₆, δ м. д., 7, Гц) 8.75 (s, 1H), 8.63 (t, 7=5.6, 1Н), 8.18 (d,7=1.8, 1Н), 7.48 (dd, 7=8.9, 1.9, 1Н), 7.29-7.18 (m, 2Н), 7.06 - 6.94 (т, ЗН), 3.79 (s, ЗН), 3.56 (s, ЗН), 3.52 (s, ЗН), 3.23 (q, 7=6.6, 2Н), 2.28 (t,7=7.4, 2Н), 1.50 (td,7=7.7, 4.8, 4Н), 1.33 - 1.19 (т, 4Н). HRMS: m/z 451.2316 [М]⁺. Вычислено для (Ci₆H₁₃N₃0₂)⁺: 451.2343.

Пример 13

Метил 7-(4-(метил)(4-метоксифенил)амино)-2-метилхиназолин-7-карбоксамидо)гептаноат, 5с.

Получали аналогично соединению 5а. Выход 239 мг (68.5%), светло-желтый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 97.4%. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 8.57 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.39 (d, J=8.9, 1Н), 7.20 (d, J=8.9, 2H), 6.99 (d, J=8.9, 2H), 6.93 (d, J=8.9, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.56 (s, 3H), 3.50 (s, 3H), 3.22 (d, J=6.1, 2H), 2.59 (s, 3H), 2.28 (t, J=7.3, 2H), 1.49 (s, 4H), 1.27 (s, 4H). HRMS: m/z 465.2498 [M]⁺. Вычислено для (C]6H₁₃N302)⁺: 465.2500.

Пример 14

М-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)-4-((метил)(фенил)амино)хиназолин-7-карбоксамид,

6a.

К раствору соединения 5а 420 мг (1 ммоль) в 10 мл метанола добавляют гидрохлорида гидроксиламина 695 мг (10 ммоль), приливают раствор метилата натрия, приготовленный из 230 мг (10 ммоль) натрия и 5 мл метанола и перемешивают 20 минут. Затем к этому раствору добавляют 456 мг (3 ммоль) TBTU и перемешивают при комнатной температуре. Окончание реакции (исчезновение исходного эфира, примерно 24 часа) определяют с помощью тонкослойной хроматографии (элюент хлороформ-метанол 10:1). Реакционную смесь упаривают в вакууме, добавляют 10 мл воды, нейтрализуют ледяной уксусной кислотой до рН 5, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 2×10 мл воды и сушат на воздухе. Остаток кристаллизуют из ДМФА/вода. Выход 299 мг (71.2%), светло-желтый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 95.8%. Т.пл. 189-190°С.Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 10.32 (s, 1Н), 8.81 (s, 1Н), 8.66 (t, У=5.6, 2Н), 8.21 (d, J=1.9, 1H), 7.51 - 7.39 (m, 3Н), 7.34 (t, J=7.3, 1H), 7.33 - 7.24 (m, 2H), 6.97 (d, J=8.9, 1H), 3.57 (s, 3Н), 3.23 (q, J=6.6, 2H), 1.93 (t, J=7.3, 2H), 1.48 (q, J=6.9, 4H), 1.26 (tt, J=11.4, 7.3, 6.3, 4H). HRMS: m/z 422.2181 [M]⁺. Вычислено для (C₂₃H₂₈N₅O₃)⁺: 422.2190.

Пример 15

N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)-4-((метил)(4-метоксифенил)амино)хиназолин-7- карбоксамид, 6b.

Получали аналогично соединению 6а. Выход 293 мг (65.0%), светло-желтый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 99.4%. Т.пл. 187-188°С.Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 10.31 (d, J=1.6, 1Н), 8.75 (s, 1H), 8.68 - 8.59 (m, 2H), 8.18 (d, J=1.8, 1H), 7.48 (dd, J=8.9, 1.9, 1H), 7.30-7.18 (m, 2H), 7.06-6.94 (m, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.53 (s, 3H), 3.23 (q, J=6.7, 2H), 1.92 (t, J=7.3, 2H), 1.53 - 1.42 (m, 4H), 1.26 (s, 4H). HRMS: m/z 452.2287 [M]⁺. Вычислено для (C₂₄H₃oN₅O₄)⁺: 452,2296.

Пример 16

М-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)-4-((метил)(4-метоксифенил)амино)-2-метилхиназолин-7-карбоксамид, 6с.

Получали аналогично соединению 6а. Выход 269 мг (58.0%), светло-желтый порошок, Светло-желтый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 97.2%. Т.пл. 222-223°С.Спектр ¹Н ЯМР (ДMCO-d₆, δ м. д., J, Гц) 10.32 (s, 1Н), 8.65 (d,J=1.6, 1H), 8.57 (t, J=5.6, 1Н), 8.10 (d, J=1.8, 1H), 7.39 (dd, J=8.9, 1.9, 1H), 7.28-7.15 (m, 2H), 7.05-6.93 (m, 2H), 6.93 (d, J=8.9, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.50 (s, 3H), 3.22 (q, J=6.6, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.93 (t, J=7.3, 2H), 1.55 - 1.40 (m, 4H), 1.32 - 1.21 (m, 4H). HRMS: m/z [M]⁺. Вычислено для (C₂₅H₃₂N₅O₄)⁺: 466.2452.

Пример 17

Метил 4-((4-((4-метоксифенил)(метил)амино)-2-метилхиназолин-7-карбоксамидо)метил)бензоат

К суспензии соединения 4с 210 мг (0.75 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляют TBTU 321 мг (1 ммоль), гидрохлорида метиловый эфир 4-аминометилбензойной кислоты 161 мг (0.80 ммоль), затем добавляют триэтиламин 230 мг (4 ммоль) и перемешивают 3 часа при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляют 10 мл воды, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 2×5 мл воды и сушат на воздухе. Выход 296 мг (84.0%), содержание основного продукта по ВЭЖХ 94.8%. Т.пл. 151-152°С ¹Н ЯМГ (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 9.23 (т,.J=6.0 Hz, 1Н), 8.16 (d,J=1.9 Hz, 1Н), 7.74-7.65 (m, 2H), 7.44 (dd, J=8.8, 1.9 Hz, 1H), 7.37 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.28 - 7.16 (m, 2H), 7.05 - 6.91 (m, 3H), 4.49 (d, J=5.9 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.52 (s, 3H), 2.60 (s, 3H). ESI-MS, m/z 471.4 [M+H]⁺.

Пример 18

N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-4-((4-метоксифенил)(метил)амино)-2-метилхиназолин-

7-карбоксамид

К раствору соединения 7 471 мг (1 ммоль) в 10 мл метанола добавляют гидрохлорида гидроксиламина 695 мг (10 ммоль), приливают раствор метилата натрия, приготовленный из 230 мг (10 ммоль) натрия и 5 мл метанола и перемешивают 20 мин. Затем к этому раствору добавляют 456 мг (3 ммоль) TBTU и перемешивают при комнатной температуре. Окончание реакции (исчезновение исходного эфира, примерно 24 часа) определяют с помощью тонкослойной хроматографии (элюент хлороформ-метанол 10:1). Реакционную смесь упаривают в вакууме, добавляют 10 мл воды, нейтрализуют ледяной уксусной кислотой до рН 5, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 2×10 мл воды и сушат на воздухе. Остаток кристаллизуют из ДМФА/вода. Выход 325 мг (69.0%), светло-бежевый порошок, содержание основного продукта по ВЭЖХ 98.2%. Т.пл. 222-223°С.

¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м. д., J, Гц) 11.14 (s, 1Н), 9.23 (t,./=6.0 Hz, 1H), 8.99 - 8.93 (m, 1H), 8.16 (d,J=1.9 Hz, 1H), 7.74-7.65 (m, 2H), 7.44 (dd, J=8.8, 1.9 Hz, 1H), 7.37 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.28 - 7.16 (m, 2H), 7.05 - 6.91 (m, 3H), 4.49 (d, J=5.9 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.52 (s, 3H), 2.60 (s, 3H). ESI-MS, m/z 472.4 [M+H]⁺.

Пример 19

Определение цитотоксической активности с помощью МТТ-теста Цитотоксическую активность заявляемых соединений определяли с помощью МТТ-теста. Концентрацию полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для синтезированных веществ определяли на клетках рака толстой кишки НТС-116, карциномы легкого А549, рака предстательной железы РС-3, рака молочной железы MCF-7.

Для проведения исследования клетки опухолевых линий человека были нанесены в 96-луночный культуральный планшет (10⁴ клеток в каждой лунке) и после 24 чассз инкубации к клеткам были добавлены методом раститровки различные концентрации 14 исследуемых соединений в диапазоне 100±0.1 мкМ. В качестве контроля сравнения использовали препараты Вориностат (SAHA), являющийся гидроксамовой кислотой, и Доксорубицин (DOX). Планшет с внесенными веществами помещали в СО₂-инкубатор на 72 часа. После инкубации вносили в каждую лунку по 20 мкл рабочего раствора МТТ. Инкубировали планшет 3 часа в СО₂-инкубаторе. После инкубации заменяли в каждой лунке среду на 200 мкл ДМСО.

После растворения кристаллов формазана определяли оптическую плотность каждой лунки при 570 нм, вычитали измеренное фоновое поглощение при 620 нм с помощью планшетного фотометра. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (IC50), определяли на основе дозозависимых кривых и/или с помощью программного обеспечения (например, GraphPad Pricm 5.0 или OriginPro 9.0). Полученные результаты представлены в таблице.

Пример 20

Исследование влияния производных гидроксамовых кислот на активность ферментов

HDAC1/2/3 и HDAC6. Полученные соединения не исследовались на подавление in vitro активности гистондеацетилаз, так как рекомбинантные ферменты обладают иной селективностью в сравнении с HDAC в составе сложных цитоплазматических и ядерных комплексов.

Наиболее информативным и достоверным методом определения силы и селективности ингибиторов HDAC на данное время является вестерн-блот анализ накопления ацетилированных белков-субстратов - гистона НЗ для HDAC класса I и α-тубулина для HDAC6 класса 11b.

Клетки высевали в 6-луночные культуральные планшеты с плотностью 1.4×10⁵ клеток на лунку, культивировали в течение 24 ч (40-50% монослой) и обрабатывали указанными концентрациями соединений в течение указанного времени. После этого среду удаляли, клетки промывали PBS и лнзировали подходящим образом. Белки из супернатантов (в случае α-тубулина) или извлеченные из клеточного осадка (в случае гистона Н3) отделяли электрофорезом в ПААГ подходящего процентного содержания и переносили методом электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану обрабатывали 5% сухим молоком (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) в PBST буфере в течение 60 мин при комнатной температуре. К мембране добавляли первичные антитела к ацетилированному гистону НЗ К9/14 (1:2000), гистону НЗ (1:4000), ацетилированному а-тубулину К40 (1:3000) и а-тубулину (1:7000), а затем путем инкубации в течение ночи при 4°С и промывания PBST буфером. К мембране добавляли соответствующий конъюгат пероксидазы хрена с вторичными специфическими антителами (1:8000) с последующей инкубацией в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем мембрану промывали PBST буфером и визуализировали сигнал инкубацией с хемилюминесцентным субстратом.

Результаты подобного исследования для соединений 6 с и 8 приведены на Фигуре Селективный ингибитор HDAC I класса UFO (4-бром-N'-бутилбензогидразид) (10 мкМ) использовали в качестве положительного контроля.

Сравнение накопления ацетилированных форм гистона НЗ и α-тубулина в зависимости от концентрации соединений 6 с и 8 однозначно говорит о неселективном ингибировании ими, как ядерных, так и цитоплазматических HDAC. Видно, что подавление активности HDAC 1/2/3 и HDAC6 близкое к максимальному уровню происходит уже при концентрациях ингибиторов 1-3 мкМ, что сопоставимо с высокой противоопухолевой активностью данных соединений и других заявляемых соединений на различных линиях раковых клеток.

Производные 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты с противоопухолевым действием и способ их получения

Изобретение относится к производным 4-((арил)(метил)амино)хиназолинам-7-карбоновой кислоты, имеющим следующую общую формулу:

,

где R₁ представляет собой водород или метил, R₂ представляет собой водород или ОМе, А представляет собой -(СН₂)₅- или пара-фенилен (-С₄Н₆-), а также способам их получения. Технический результат: получены новые соединения, которые обладают ингибирующей активностью в отношении гистондеацетилазы (HDAC) и могут использоваться в медицине для лечения онкологических заболеваний. 3 н.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил., 20 пр.

1. Производные 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты с противоопухолевым действием, имеющие следующую общую формулу 1:

где R₁ представляет собой водород или метил, R₂ представляет собой водород или ОМе, А представляет собой -(СН₂)₅- или пара-фенилен (-С₄Н₆-).

2. Способ получения производных 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты общей формулы I, осуществляемый следующим образом: производные метил 4-гидроксихиназолин-7-карбоксилата, получаемые циклизацией производных диметил-2-аминотерефталата в формамиде, взаимодействием с фосфорилхлоридом в присутствии диэтиланилина переводятся в производные метил 4-хлорхиназолин-7-карбоксилата, которые при взаимодействии с замещенными анилинами в диметилфорамиде при комнатной температуре превращаются в производные метил 4-((фенил)амино)хиназолин-7-карбоксилатов, последние подвергаются щелочному гидролизу, превращаясь в соответствующие производные 4-((арил)амино)хиназолин-7-карбоновых кислот; далее к последним присоединяется метиловый эфир 7-аминогептановой кислоты с использованием 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторбората (TBTU) в качестве конденсирующего агента и триметиламина в качестве основания; полученные соединения затем подвергают аминолизу 10-кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле в присутствии 2-х эквивалентов 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU), осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 ч до образования целевых продуктов, выделяемых упариванием реакционной массы в вакууме, нейтрализацией ледяной уксусной кислотой до рН 5, фильтрацией и с последующей промывкой водой на фильтре.

3. Способ получения производных 4 ((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновой кислоты общей формулы I, содержащих пара-фениленовый фрагмент, осуществляемый следующим образом: к производным 4-((арил)(метил)амино)хиназолин-7-карбоновых кислот 4а-b, присоединяется метиловый эфир 4-аминометилбензойной кислоты с использованием 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторбората (TBTU) в качестве конденсирующего агента и триметиламина в качестве основания; полученные соединения затем подвергают аминолизу 10-кратным мольным избытком гидроксиламина в безводном метаноле в присутствии 2-х эквивалентов 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU), осуществляемому при комнатной температуре в течение 20-26 ч до образования целевых продуктов, выделяемых упариванием реакционной массы в вакууме, нейтрализацией ледяной уксусной кислотой до рН 5, фильтрацией и с последующей промывкой водой на фильтре.