Способ получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1Н)-онов Российский патент 2021 года по МПК C07D239/91 A61K31/505 

Предлагаемое изобретение относится к способу получения производных хиназолина, содержащих гидроксаматный фрагмент и непосредственно касается производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1H)-онов, а именно N-гидрокси-ω-(2-арил-4-оксо-1,4-дигидрохиназолин-3(2H)-ил)алкиламидов, которые могут быть использоваться в медицине для лечения различных заболеваний, посредством ингибирования гистоновых деацетилаз.

Как известно, гистондеацетилазы (HDAC) - это ферменты, катализирующие удаление ацетильной группы ε-N-ацетил-лизина гистонов. HDAC играют важную роль в регуляции экспрессии генов, так как они модифицируют гистоны и изменяют конформацию хроматина. Поэтому HDAC является важной эпигенетической мишенью при терапии рака, а ингибиторы HDAC демонстрируют успешную картину как цитотоксические агенты. Большинство ингибиторов HDAC имеют трехкомпонентную структуру, состоящую из цинк-связывающего участка, линкера, способного занимать канал фермента, и фрагмента, взаимодействующего с аминокислотными остатками у входа в активный центр HDAC. Ингибиторы классических деацетилаз функционируют путем связывания иона цинка в активном центре фермента и, таким образом, инактивируют систему смены зарядов. [Eckschlager, Т.; Plch, J.; Stiborova, М; Hrabeta, J. Histone

Известно, что эффективными ингибиторами гистондеацетилаз (HDAC) являются производные гидроксамовой кислоты, например, вориностат (SAHA), панобиностат (LBH589) и белиностат.Они одобрены FDA USA для лечения Т-клеточной лимфомы кожи ы [Mottamal М, et al. Molecules. 2015; 20(3):3898-941].

Одной из перспективных стратегий в создании новых фармацевтических препаратов в настоящее время является проектирование и синтез гибридных соединений, состоящих из двух или более различных биоактивных фрагментов, и действующих через активацию/блокирование нескольких мишеней. Совмещение двух активных групп в одной молекуле может приводить к более выраженному терапевтическому эффекту, по сравнению с индивидуальными компонентами при комбинированном применении

Известно, что хиназолин является важным биоактивным фармакологическим фрагментом. Хиназолиновый цикл присутствует как в различных природных соединениях, так и в молекулах многих лекарственных препаратов. Соединение в одной молекуле хиназолиновой и гидроксамовой фармакофорных групп может потенциально приводить к новым перспективным соединениям, что подтверждается многочисленными примерами.

В известных патентных публикациях WO 2009063054, A61K 31/517, 2009; WO 2018005799, A61K 31/517, 2018; US 2008221132, A61K 31/517, 2008; KR 101964810, A61K 31/517, 2019; US 2018098990, A61K 31/517, 2018 описывается ряд соединений, содержащих хиназолиновый цикл и гидроксамовую кислоту, применяемых в качестве бифункциональных ингибиторов тирозинкиназ и гистондеацетилаз

Одним из возможных мест присоединения гидроксаматной группы является атом азота в 3-м положении хиназолинового цикла. Примером таких соединений является серия синтезированных новых N-гидроксибензамидов и N-гидроксипропенамидов, присоединенных по 3-му положению хиназолин-4(3H)-онов [Hieu D.T., Aim D.T., Tuan N.M. et al. Bioorganic Chemistry. - 2018. Vol. 76. - P. 258-267; KR 20190134180, A61K 31/517, 2019]. Несколько соединений из этой серии (например, соединения, представленные на рисунке) показали в несколько раз более высокую цитотоксическую активность, чем ингибитор HDAC - вориностат (SAHA), по отношению к трем линиям раковых клеток человека (рак толстой кишки SW620; рак простаты РС-3; рак легкого NCI-Н23) и ингибировали HDAC со значениями IC₅₀ в субмикромолярном диапазоне:

В статье [Hieu D.T., Anh D.T., Hai Р.Т. et al. Chem Biodivers. 2019. 16(4): e1800502] описывается синтез и биологическая активность различных серий новых гидроксамовых кислот, присоединенных к 3-му положению хиназолин-4-(3H)-онов в качестве новых малых молекул, нацеленных на гистондеацетилазы. Биологическая оценка показала, что эти соединения обладают сильной цитотоксичностью в отношении трех линий раковых клеток человека (SW620, РС-3, NCI-H23).

Возможны несколько путей синтеза гидроксамовых кислот, присоединенных по 3-му положению хиназолин-4(3Н)-онов. Один из них, описанный в известном патенте [US 2009181971, A61K 31/121, 2009], представляет собой трехстадийный синтез, в котором в качестве исходного соединения на первой стадии используется изатовый ангидрид. На последней стадии применяется карбодиимидный метод для получения гидроксамовой кислоты из свободной карбоновой кислоты (Схема 1):

Недостатками этого способа являются низкий суммарный выход конечного продукта (около 10%) и использование дорогостоящих реактивов, таких как N-гидроксибензотриазол (HOBt) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид.

Согласно описанному ранее другому методу синтеза гидроксамовые кислоты, производные хиназолин-4(3H)-она, получают из соответствующих замещенных хиназолин-4(3H)-онов алкилированием метиловыми эфирами 7-бромгептановой кислоты и 8-бромоктановой кислоты, с последующим аминолизом полученных эфиров гидроксиламином [Hieu D.T., Anh D.T., Hai Р.Т. et al. Chem. Biodivers. 2019. 16(4): e1800502]. Процесс протекает по следующей Схеме 2:

Недостатком этого способа является то, что получение гидроксамовой кислоты гидроксиламинолизом метилового эфира проводится на последней стадии в водной среде, в которой возможно протекание побочного процесса гидролиза метиловых эфиров. Выход конечных продуктов в этом случае не очень высокий и составляет 60-70%.

Ближайшим аналогом заявляемого способа получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1Н)-онов, является способ получения N-гидрокси-6-(2-арил-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(2H)-ил)гексамидов описанный в ранее опубликованной статье [Вартанян А.А. и др. Биоорганическая химия, 2020, Т. 46, №2, С. 207-219]. Целевые соединения в цитированном способе получают конденсацией 2-Амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)-бензамида с различными бензальдегидами по Схеме 3:

Реакцию проводят в кипящем метаноле или этаноле в атмосфере аргона и в присутствии каталитических количеств пара-толуолсульфокислоты (ПТСК). Реакция проводится в течение 6 часов при кипении растворителя. Продуктами реакции конденсации 3-метоксибензальдегида и 4-хлорбензальдегида являются N-гидрокси-6-[2-(3-метоксифенил)-4-оксо-1,4-дигидрохиназолин-3(2Н)-ил]гексанамид и N-гидрокси-6-[4-оксо-2-(4-хлорфенил)-1,4-дигидрохиназолин-3(2Н)-ил]гексанамид, выход которых составляет 74% и 78% соответственно.

Недостатками этого способа является длительность проведения процесса (6 часов), высокая температура реакции, вероятность протекания в данных условиях побочных реакций, таких как гидролиз гидроксамовой кислоты и окисление дигидрохиназолинового цикла, приводящих к снижению выхода и чистоты получаемых продуктов.

С целью повышения эффективности процесса предлагается способ получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1H)-онов, имеющих общую формулу:

где R представляет собой водород или галоген;

R₁, R₂, R₃ независимо друг от друга представляют собой водород, галоген, ОМе, где R4 представляет собой галоген во 2-м, 3-м или 4-м положении фенильного кольца;

n=4, 5.

Предлагаемый способ получения соединений, осуществляется с использованием в качестве исходных соединений производных гидроксамовой кислоты, выбранных из группы: 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамид, 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамид, 2-амино-5-фтор-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамид, к растворам которых в тетрагидрофуране в атмосфере аргона прибавляют раствор замещенного бензальдегида в тетрагидрофуране при мольном соотношении производного гидроксамовой кислоты к бензальдегиду 1:1.1, после чего реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 2-3 часа, удаляют растворитель в вакууме, добавляют к остатку диэтиловый эфир, образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат.

Предлагаемым способом синтезированы в частности следующие соединения:

N-гидрокси-6-[2-(4-метоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 1)

N-гидрокси-6-[2-(3-метоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4Н)-ил]гексанамид (соединение 2)

N-гидрокси-6-[4-оксо-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 3)

N-гидрокси-6-[4-оксо-2-(4-хлорфенил)-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 4)

N-гидрокси-7-[2-(4-метокси-3-((2-фторфенокси)метил)фенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гептанамид (соединение 5)

N-гидрокси-7-[2-(4-метоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4Н)-ил]гептанамид (соединение 6)

N-гидрокси-6-[4-оксо-2-(4-хлорфенил)-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гептанамид(соединение 7)

N-гидрокси-7-[2-(4-метоксифенил)-4-оксо-6-фтор-1,2-дигидрохиназолин-3(4Н)-ил]гептанамид (соединение 8)

Полученные соединения могут использоваться в качестве ингибиторов гистондеацетилаз для лечения в частности онкологических заболеваний.

В основе получения данных соединений лежит общий способ синтеза, который иллюстрируется следующей схемой реакций (Схема 4):

Промежуточные соединения II, III (Схема 4) могут быть получены любым известным способом, описанным в литературе. Производные гидроксамовой кислоты (III) в данном способе предварительно получали реакцией изатовых ангидридов с эфирами 6-аминогексановой и 7-аминогептановой кислот с последующим аминолизом полученных сложных эфиров гидроксиламином.

Например, соединения II (метил 6-(2-аминобензамидо)гексаноат (II-1), метил 7-(2-аминобензамидо)гептаноат (II-2), метил 7-(2-амино-5-фторбензамидо)гептаноат (II-3)) могут быть получены взаимодействием соответствующих изатовых ангидридов с метил 6-аминогексанатом или метил 7-аминогептанатом в воде, водном спирте, ацетоне или в водном диметилформамиде [Khattab S. et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry. - 2015. - vol. 23; No. 13. - P. 3574-3585]. Соединения III (2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамид (III-1), и 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептилил)бензамид (III-2) и 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептилил)-5-фторбензамид (III-3)) могут быть получены любым известным методом, например, обработкой соединения II гидроксиламином в метаноле [Ganeshpurkar A., Kumar D., Singh S.K.. // Current Organic Synthesis. - 2018. - Vol. 15. - P. 154-165].

Способ получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1H)-ов, имеющих общую Формулу I отличается от известного ближайшего прототипа в использовании на последней стадии в качестве растворителя тетрагидрофурана вместо метанола или этанола, а также снижением температуры процесса и времени протекания процесса.

Существенно на результат синтеза целевых соединений влияют выбранные количественные соотношения исходных продуктов, выбор растворителя, температура и время синтеза.

В заявляемом способе оптимальным является мольное соотношение исходного производного гидроксамовой кислоты (соединения II) к замещенному бензальдегиду равное 1:1.1. Такое соотношение обеспечивает полноту протекания реакции, с вовлечением в реакцию всей гидроксамовой кислоты.

Тетрагидрофуран, выбранный в качестве растворителя для данной реакции, обеспечивает протекание реакции при комнатной температуре и с высоким выходом конечного продукта

На эффективность процесса влияет и временной интервал синтеза (2-3 часа). В случае уменьшения времени процесса (менее 2 часов) происходит снижение выхода, а увеличение длительности процесса синтеза более 3 часов приводит к появлению побочных продуктов и снижению чистоты конечного продукта.

Сушка конечного продукта проводится на воздухе при комнатной температуре.

Преимущества заявляемого способа по сравнению с известными заключаются в большей эффективности процесса синтеза производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1H)-ов, за счет снижения температуры и времени проведения процесса, повышения выхода (более 80%) и чистоты конечных продуктов.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5 μм, 250*4,6 мм. Условия: линейный градиент АВ: 5% В (0 мин) 100% В (20 мин). А - 0.01% ТФУ в воде, В - 0.01% ТФУ в ацетонитриле. Спектры ESI-MS регистрировали на приборе "Agilent LC/MS 1200" при ионизации пробы электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Пробы готовили в системе ацетонитрил/вода = 1/1, концентрация 2 мг/мл. Условия анализа: поток 1 мл/мин, давление на нибулайзере 20 psi, температура 360°С, скорость потока осушающего газа 9 л/мин, напряжение 3500 В, целевая масса от 100 до 2000. Температуру плавления определяли на приборе марки "Melting Point М-565" (BUCHI). Спектры ЯМР ¹Н получены на Фурье ЯМР-спектрометре Bruker A VANCE III NanoBay 300 МГц (для ¹Н-ЯМР). Спектры регистрировали в режиме стабилизации по дейтерию, термостабилизация 25°С, внутренний стандарт - тетраметилсилан) в ДМСО-d6. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (δ), КССВ - в герцах. ТСХ проводили на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254, проявление в УФ и нингидрином.

Ниже приводятся примеры осуществления заявленного способа получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1H)-онов

Пример 1

Синтез метил 6-(2-аминобензамидо)гексаноата (соединение II-1, R=Н, n=4)

Метиловый эфир 6-аминогексановой кислоты 15 г (83 ммоль) растворяют в 20 мл воды, 10%-ным раствором гидрокарбоната натрия доводят рН раствора до 7-8. Полученный раствор приливают к суспензии 10 г (61 ммоль) изатового ангидрида в 100 мл диметилформамида в плоскодонной колбе объемом 250 мл, полученную смесь перемешивают 2 часа при комнатной температуре. Смесь выливают в 200 мл воды, 10%-ным раствором лимонной кислоты доводят рН раствора до 3-4. Экстрагируют диэтиловым эфиром (2 раза по 100 мл), органический слой промывают 50 мл воды. Отгоняют растворитель, остаток кристаллизуют из 50 мл гексана. Выход 15.0 г (92%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 53-55° С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 8.16 (т, 1H, J=5.7) 7.46 (дд, 1H, J=7.9, 1.5), 7.15 - 7.08 (м, 1Н), 6.68 (дд, 1Н, J=8.3, 1.2), 6.50 (дд, 1H, J=8.1, 7.1), 6.36 (с, 2Н), 3.58 (с, 3Н), 3.26 - 3.13 (м, 2Н), 2.30 (т, 2Н, J=7.4), 1.64 - 1.42 (м, 4Н), 1.39- 1.22 (м, 2Н).

Пример 2

Синтез метил 7-(2-аминобензамидо)гептаноата (соединение II-2, R=Н, n=5)

Получают аналогично Примеру 1 из 8.0 г (50 ммоль) метилового эфира 7-аминогептановой кислоты и 6.0 г (37 ммоль) изатового ангидрида. Выход 94%, светло-бежевые кристаллы, т.пл. 48-50°С.

Пример 3

Синтез метил 7-(2-амино-5-фторбензамидо)гептаноата (соединение II-3, R=F, n=5)

Получают аналогично Примеру 1 из 8.0 г (50 ммоль) метилового эфира 7-аминогептановой кислоты и 7.2 г (40 ммоль) 6-фторизатового ангидрида. Выход 88.2%, бежевые кристаллы, т.пл. 54-56°С.

Пример 4

Синтез 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида (соединение III-1, n=4)

К раствору 2.64 г (0.01 моля) метил 6-((2-аминобензоил)амино)гексаноата в 30 мл метанола прибавляют 30 мл раствора гидроксиламина в метаноле, полученного из 1.15 г (0.05 моля) натрия и 2.10 г (0.03 моля) хлоргидрата гидроксиламина. Перемешивают реакционную смесь 36 часов при комнатной температуре. Отгоняют метанол в вакууме, добавляют 20 мл воды, подкисляют 5%-ной лимонной кислотой до рН 6, отфильтровывают осадок, промывают 10 мл воды. Выход 2.20 г (83.3%), бежевые кристаллы, т.пл. 125-126°С. ¹H ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.28 (с, 1H, NH-OH), 8.60 (с, 1H, NH-OH) 8.11 (т, 1Н, CH₂NH, J=5.6), 7.44 (дд, 1Н, Ar, J=8.0, 1.5), 7.11 (дд, 1Н, Ar, J=8.5, 7.1), 6.67 (дд, 1H, Ar, J=8.2, 1.2), 6.49 (дд, 1Н, Ar, J=8.0, 7.1), 6.30 (д, 1Н, NH, J=7.4), 3.19 (тд, 2Н, NCH₂, J=6.9, 4.7,), 1.95 (т, 2Н, COCH₂, J=7.4), 1.51 (м, 4Н, СН₂), 1.28 (п, 2Н, СН₂, J=7.9). ESI-MS, m/z 553.1 [2M+Na]⁺, 266.1 [М]⁺. Найдено, %: С, 58.85; Н, 7.22; N, 15.84. C₁₃H₁₉N₃O₃. Вычислено, %: С, 58.92; Н, 7.15; N, 15.83.

Пример 5

Синтез 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида (соединение III-2, n=5)

Получают аналогично Примеру 3 из 2.78 г (0.01 моля) метил 7-((2-аминобензоил)амино)гептаноата. Выход 2.41 г (86.3%), бежевые кристаллы, т.пл. 108-110°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.32 (с, 1Н), 8.65 (с, 1H), 8.15 (т, J=5.6, 1Н), 7.44 (дд, J=8.0, 1.5, 1H), 7.17 - 7.05 (м, 1Н), 6.67 (дд, J=8.3, 1.2, 1Н), 6.55 - 6.44 (м, 1Н), 6.31 (с, 2Н), 3.18 (т, J=7.2, 2Н), 1.94 (т, J=7.3, 2Н), 1.55 - 1.39 (м, 4Н), 1.35 - 1.19 (м, 4Н). ESI-MS, m/z 280.2 [M]⁺. Найдено, %: С, 60.20; H, 7.58; N, 15.04. C₁₄H₂₁N₃O₃. Вычислено, %: С, 60.24; Н, 7.61; N, 14.96.

Пример 6

Синтез 2-амино-5-фтор-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида (соединение III-3, R=F, n=5)

К раствору 2.96 г (0.01 моля) метил 7-((2-амино-5-фторбензоил)амино)гептаноата в 20 мл метанола прибавляют 40 мл раствора гидроксиламина в метаноле, полученного из 1.49 г (0.06 моля) натрия и 2.70 г (0.04 моля) хлоргидрата гидроксиламина. Перемешивают реакционную смесь 36 часов при комнатной температуре. Отгоняют метанол в вакууме, добавляют 10 мл воды, подкисляют 5%-ной лимонной кислотой до рН 6, отфильтровывают осадок, промывают 10 мл воды. Выход 2.48 г (83.8%), бежевые кристаллы, т.пл. 117-119°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.32 (с, 1Н), 8.65 (с, 1Н), 8.23 (т, J=5.5, 1Н), 7.30 (д.д, J=10.2, 3.0, 1Н), 7.02 (т.д, J=8.6, 3.0, 1H), 6.69 (д.д, J=9.0, 5.0, 1Н), 6.21 (с, 2Н), 3.17 (т, J=7.0, 2Н), 1.94 (т, J=7.3, 2Н), 1.56 - 1.38 (м, 4Н), 1.35 -1.18 (м, 4Н). ESI-MS, m/z 298.0 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 56.59; Н, 6.82; N, 14.18. C₁₄H₂₁N₃O₃. Вычислено, %: С, 56.55; Н, 6.78; N, 14.13.

Пример 7

N-гидрокси-6-[2-(4-метоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 1)

К раствору 2.65 г (10 ммоль) 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.50 г (11 ммоль) 4-метоксибензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 2 раза по 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.32 г (86.9%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 114 - 116°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.31 (с, 1H, NH-OH); 8,65 (с, 1H, NH-OH); 7.63 (дд, 1Н, Ar, J=1.1, 1.5); 7.25 (д, 2Н, Ph-OMe, J=8.5); 7.18 (т, 1Н, Ar, J=7.8); 6.89 (д, 2Н, Ph-OMe, J=8,4); 6.64 (т, 1H, Ar, J=7.4); 6.62 (д, 1Н, Ar, J=8.1), 5,78 (с, 1Н, N-CH-N); 3,89-3,75(м, 1Н, N-CH₂); 3,71(с, 3Н, О-Ме); 2.78-2.61(м, 1H, N-CH₂); 1.91(т, 2Н, СО-СН₂, J=7.6); 1.62-1.35 (м, 4Н, СН₂-СН₂-СН₂-СН₂); 1.31-1.09(м, 2Н, CH₂-СН₂-СО). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 96.7%. ESI-MS, m/z 384.3 [М+Н]⁺. Найдено, %: С 65.57, Н 6.63, N 10.88. C₂₁H₂₅N₃O₄. Вычислено, %: С 65.78, Н 6.57, N 10.96.

Пример 8

N-гидрокси-6-[2-(3-метоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 2)

К раствору 2.65 г (10 ммоль) 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.50 г (11 ммоль) 3-метоксибензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 2 раза по 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.38 г (88.2%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 115-118°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц). 10.31 (с, 1H, NH-OH), 7.66 (дд, 1Н, Ar, J=1.9, 1.6), 7.28 (тд, 1Н, Ar, J=8.2, 1.8), 7.18 (тд, 1Н, Ar, J=7.6, 1.4), 7.13 (д, 1H, Ar, J=7.6), 7.05 (д, 1Н, Ar, J=8.2), 6.86 (т, 1Н, Ar, J=1.5), 6.70 - 6.60 (м, 2Н, Ar), 6.14 (с, 1Н, N-CH-N), 3.96 - 3.82 (м, 1Н, NCH₂), 3.70 (с, 3Н, ОСН₃), 2.80 - 2.63 (м, 1Н, NCH₂), 1.91 (т, 2Н, СО-СН₂, J=7.3), 1.63 - 1.40 (м, 4Н, -СН₂-СН₂-), 1.37 - 1.17 (м, 2Н, СН₂). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 97.1%. ESI-MS, m/z 384.2 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 65.91; Н, 6.49; N, 10.90. C₂₁H₂₅N₃O₄. Вычислено, %: С, 65.78; Н, 6.57; N, 10.96.

Пример 9

N-гидрокси-6-[2-(3,4,5-триметоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 3)

К раствору 2.65 г (10 ммоль) 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 2.15 г (11 ммоль) 3,4,5-триметоксибензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 2 раза по 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.91 г (90.1%), т.пл. 124.4-126.8°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.28 (с, 1H, NH-OH), 7.64 (d, J=7.7, 1Н), 7.26 - 7.17 (m, 2H), 6.70 - 6.61 (m, 4H), 5.76 (d, J=2.2, 1H), 3.89 - 3.75 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.56 (s, 3H), 2.84 - 2.70 (m, 1H), 2.26 (t, J=7.4, 2H), 1.61 - 1.39 (m, 3H), 1.31 - 1.16 (m, 2H). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 96.3%. ESI-MS, m/z 444.3 [М]⁺. Найдено, %: С, 62.45; Н, 6.39; N, 9.54. C₂₃H₂₉N₃O₆. Вычислено, %: С, 62.29; Н, 6.59; N, 9.47.

Пример 10

N-гидрокси-6-[4-оксо-2-(4-хлорфенил)-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гексанамид (соединение 4)

К раствору 2.65 г (10 ммоль) 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.54 г (11 ммоль) 4-хлорбензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 2 раза по 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.62 г (93.3%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 108-110°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.31 (с, 1H, NH-OH), 7.63 (д, 1Н, Ar, J=7.4), 7.45 -7.29 (м, 4Н, Ar), 7.19 (т, 1Н, Ar, J=7.6), 6.70 - 6.57 (м, 2Н, Ar), 5.86 (с, 1H, N-CH-N), 3.96 - 3.79 (м, 1Н, NCH₂), 2.79 - 2.64 (м, 1H, NCH₂), 1.91 (т, 2H, CO-CH₂, J=7.3), 1.61-1.37 (м, 4Н, СН₂-СН₂-СН₂-СН₂), 1.33 - 1.16 (м, 2Н, СН₂-СН₂-СО). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 97.2%. ESI-MS, m/z 388.2 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 62.02; Н, 5.80; N, 10.76. C₂₀H₂₂ClN₃O₃. Вычислено, %: С, 61.93; Н, 5.72; N, 10.83.

Пример 11

N-гидрокси-7-[2-(4-метокси-3-((2-фторфенокси)метил)фенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гептанамид (соединение 5)

К раствору 2.79 г (10 ммоль) 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.54 г (11 ммоль) 3-((2-фторфенокси)метил)-4-метоксибензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 2 раза по 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 4.86 г (95.9%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 102-104°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 7.61 (дд, 1Н, Ar, J=7.8, 1.6), 7.42 (д, 1Н, Ar, J=2.3), 7.32-7.06 (м, 6Н, Ar), 7.03 (д, 1Н, Ar, J=8.6), 6.98-6.88 (м, 1Н, Ar), 6.67-6.58 (м, 2Н, Ar), 5.79 (s, 1Н, N-CH-N), 5.06 (s, 2Н, ОСН₂), 3.88-3.80 (м, 2Н, NCH₂), 3.79 (с, 3Н, ОСН₃), 2.74-2.58 (м, 1Н, NCH₂), 1.90 (т, 2Н, СО-СН₂, J=7.3), 1.60-1.33 (м, 4Н, 2СН₂), 1.25-1.11 (м, 2Н, 2СН₂). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 98.3%. ESI-MS, m/z 508.2 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 66.72; Н, 5.91; N, 8.44. C₂₈H₃₀FN₃O₅. Вычислено, %: С, 66.26; Н, 5.96; N, 8.28.

Пример 12

N-гидрокси-7-[2-(4-метоксифенил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-3(4Н)-ил]гептанамид (соединение 6)

К раствору 2.65 г (10 ммоль) 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.50 г (11 ммоль) 4-метоксибензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 10 мл хлористого метилена, затем 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.76 г (94.8%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 110-113°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.32 (уш.с, 1Н), 8.67 (уш.с, 1Н), 7.64 (д.д, J=7.7, 1.5 Hz, 1Н), 7.26 (д, J=8.7 Hz, 2H), 7.24 - 7.22 (м, 1Н), 7.22 - 7.15 (м, 1Н), 6.90 (д, J=8.7 Hz, 2H), 6.68 - 6.60 (м, 2Н), 5.78 (д, J=2.2 Hz, 1Н), 3.89 - 3.77 (м, 1Н), 3.72 (с, 3Н), 2.78 - 2.65 (м, 1Н), 1.92 (т, J=7.3 Hz, 2Н), 1.57 - 1.38 (м, 4Н), 1.29 - 1.15 (м, 4Н). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 96.3%. ESI-MS, m/z 397.48 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 66.52; Н, 6.89; N, 10.62. C₂₂H₂₇N₃O₄. Вычислено, %: С, 66.48; Н, 6.85; N, 10.57.

Пример 13

N-гидрокси-6-[4-оксо-2-(4-хлорфенил)-1,2-дигидрохиназолин-3(4H)-ил]гептанамид (соединение 7)

К раствору 2.65 г (10 ммоль) 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.54 г (11 ммоль) 4-хлорбензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 10 мл хлористого метилена, затем 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.84 г (95.9%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 77-78°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.31 (уш.с, 1Н), 8.64 (уш.с, 1Н), 7.63 (д.д, J=7.7, 1.6 Hz, 1Н), 7.44 - 7.30 (м, 4Н), 7.24 - 7.15 (м, 1H), 6.72 - 6.57 (м, 2Н), 5.86 (д, J=2.5 Hz, 1Н). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 98.3%. ESI-MS, m/z 402.3 [М+Н]⁺, 825.4 [2M+Na]⁺. Найдено, %: С, 62.81; Н, 6.05; N, 10.49. C₂₁H₂₄ClN₃O₃. Вычислено, %: С, 62.76; Н, 6.02; N, 10.46.

Пример 14

N-гидрокси-7-[2-(4-метоксифенил)-4-оксо-6-фтор-1,2-дигидрохиназолин-3(4Н)-ил]гептанамид (соединение 8)

К раствору 2.97 г (10 ммоль) 2-амино-5-фтор-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида в 30 мл тетрагидрофурана прибавляют 1.54 г (11 ммоль) 4-хлорбензальдегида и 100 мг пара-толуолсульфокислоты. Смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре (окончание реакции контролируют с помощью ТСХ, элюент хлороформ : метанол : уксусная кислота - 6:1:0.1). После завершения реакции отгоняют растворитель в вакууме при 40°С, к остатку добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 10 мл хлористого метилена, затем 10 мл диэтилового эфира и сушат на воздухе. Выход 3.93 г (94.7%), светло-бежевые кристаллы, т.пл. 93-96°С. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 10.30 (с, 1H), 8.65 (с, 1Н), 7.33 (д.д, J=9.1, 3.1, 1H), 7.24 (д, J=8.7, 2Н), 7.08 (т.д, J=8.7, 3.1, 1Н), 6.90 (д, J=8.7, 2Н), 6.65 (д.д, J=8.9, 4.5, 1H), 5.78 (с, 1Н), 3.83 - 3.73 (м, 2Н), 3.71 (с, 3Н), 2.80 - 2.66 (м, 2Н), 1.90 (т, J=7.3, 2Н), 1.59 - 1.32 (м, 3Н), 1.29 - 1.11 (м, 3Н). Содержание основного вещества по ВЭЖХ 99.6%. ESI-MS, m/z 416.3 [М+Н]⁺. Найдено, %: С, 63.75; Н, 6.35; N, 10.07. C₂₂H₂₆FN₃O₄. Вычислено, %: С, 63.60; Н, 6.31; N, 10.11.

Пример 15

Определение цитотоксической активности

Цитотоксическую активность заявляемых соединений определяли с помощью МТТ-теста. Концентрацию полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для синтезированных веществ определяли на клетках рака толстой кишки НТС116, карциномы легкого А549, рака предстательной железы РС-3, рака молочной железы MCF-7, рака почки SN12C.

Для проведения исследования клетки опухолевых линий человека были нанесены в 96-луночный культуральный планшет (10⁴ клеток в каждой лунке) и после 24 часов инкубации к клеткам были добавлены методом раститровки различные концентрации 14 исследуемых соединений в диапазоне 100±0.1 мкМ. В качестве контроля сравнения использовали препарат Вориностат (SAHA), являющийся гидроксамовой кислотой. Планшет с внесенными веществами помещали в СО₂-инкубатор на 72 часа. После инкубации вносили в каждую лунку по 20 мкл рабочего раствора МТТ. Инкубировали планшет 3 часа в СО₂-инкубаторе. После инкубации заменить в каждой лунке среду на 200 мкл ДМСО.

После растворения кристаллов формазана определяли оптическую плотность каждой лунки при 570 нм, вычитали измеренное фоновое поглощение при 620 нм с помощью планшетного фотометра. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (IC₅₀) (Таблица 1), определяли на основе дозозависимых кривых и/или с помощью программного обеспечения (например, GraphPad Prism 5.0 или OriginPro 9.0)

Пример 16

Исследование влияния производных гидроксамовых кислот на активность ферментов HDAC1 и HDAC6.

Протокол проведения исследования.

Делают навески исследуемых веществ и приготовляют растворы с исходной концентрацией 5×10^-3 М в подходящем растворителе (вода, спирт, ДМСО). Приготовляют стоковые растворы исследуемых веществ в растворителе для получения концентрационной зависимости с учетом того, что конечная концентрация вещества в инкубационной среде меньше в 4 раза (50 мкл раствора вещества в 200 мкл конечного объема пробы). В качестве эталонных веществ использовались препараты Вориностат (SAHA) и Трихостатин А.

Эксперимент выполнялся в 96-луночном планшете. Добавляют 50 мкл раствора исследуемых соединений в лунки планшета, согласно схеме соответствующего эксперимента.

Фермент HDAC разбавляют с использованием буфера HDAC-Glo™ до желаемой концентрации.

Вносят 50 мкл фермента HDAC в каждую лунку 96-луночного планшета, где уже находятся растворы исследуемых соединений, полученные на предыдущей стадии. Оставляют не менее 3-х лунок без HDAC, для формирования буферного фона, не менее 3-х лунок с HDAC и растворителем, для получения максимального сигнала активности фермента.

Содержимое планшета перемешивают при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, используя орбитальный шейкер при 500-700 об/мин, чтобы обеспечить однородность.

Смесь фермент/исследуемое вещество инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут (но не более 2 часов).

Готовят реагент HDAC-Glo™: 10 мл буфера HDAC-Glo™ добавляют к субстрату HDAC-Glo и осторожно перемешивают. Затем в эту смесь добавляют 10 мкл реагента-проявителя и также осторожно перемешивают.

Равный объем реагента HDAC-Glo™ добавляют в каждую лунку планшета (100 мкл для 96-луночного).

Смешивают содержимое ячеек при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, используя орбитальный шейкер при 500-700 об/мин, чтобы обеспечить однородность. Затем содержимое инкубируют при комнатной температуре в течение 15-45 минут.

По истечению необходимого времени инкубации измеряют люминесценцию на многофункциональном планшетном анализаторе En Vision.

Обработка полученных первичных данных, определение IC₅₀

Так как амплитуды кривых могут различаться от повторения к повторению, полученные абсолютные значения хемилюминесценции нормировали для каждого отдельного повторения. За нулевое значение брали минимальное измеренное значение внутри одной серии разведений, за 100% - максимальное достигнутое значение. Нормированные три повторения вместе аппроксимировали кривой у=у(х), задающейся формулой 7.1

где, у - нормированная интенсивность люминесценции, х - десятичный логарифм концентрации исследуемого вещества.

Параметры Bottom, Top, HillSlope и lgIC₅₀ подбираются так, чтобы сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от аппроксимирующей кривой была минимальна. Полученные значения IC₅₀ (Таблица 1) и границ 95% доверительных интервалов использовали для анализа результатов работы. Обработка данных выполнена с использованием пакета GraphPad Prism 6.

Некоторые из заявляемых соединений обладают цитотоксической активностью в микромолярном диапазоне на различных линиях опухолевых клеток. Активность ряда соединений по отношению ферментам HDAC1 и HDAC6 превышает активность известного ингибитора гистондеацетилазы - Вориностата (SAHA).

Предлагаемое изобретение относится к способу получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-Дигидрохиназолин-4(1H)-ов, содержащих гидроксамовую кислоту, которые могут использоваться в медицине для лечения различных заболеваний, посредством ингибирования гистоновых деацетилаз. Предлагается способ получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1H)-ов, имеющих нижеприведенную общую формулу, где R представляет собой водород или галоген; R₁, R₂, R₃ независимо друг от друга представляют собой водород, галоген, ОМе, где R₄ представляет собой галоген во 2-м, 3-м или 4-м положении фенильного кольца; n=4, 5. Предлагаемый способ получения соединений осуществляется с использованием в качестве исходных соединений производных гидроксамовой кислоты, а именно 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида, 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида или 2-амино-5-фтор-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)-бензамида, к растворам которых в тетрагидрофуране в атмосфере аргона прибавляют раствор замещенного бензальдегида в тетрагидрофуране в мольном соотношении производного гидроксамовой кислоты к бензальдегиду 1:1.1, после чего реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 2-3 часа, удаляют растворитель в вакууме, добавляют к остатку диэтиловый эфир, образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат. Активность ряда соединений по отношению к ферментам HDAC1 и HDAC6 превышает активность известного ингибитора гистондеацетилазы - Вориностата (SAHA).

16 пр., 1 табл.

Способ получения гидроксамовых кислот, производных 2-арил-2,3-дигидрохиназолин-4(1Н)-ов общей формулы,

где R представляет собой водород или галоген;

R₁, R₂, R₃ независимо друг от друга представляют собой водород, галоген, ОМе, где R₄ представляет собой галоген во 2-м, 3-м или 4-м положении фенильного кольца; n=4, 5, осуществляемый с использованием в качестве исходных соединений производных гидроксамовой кислоты, а именно 2-амино-N-(6-(гидроксиамино)-6-оксогексил)бензамида, 2-амино-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида или 2-амино-5-фтор-N-(7-(гидроксиамино)-7-оксогептил)бензамида, к растворам которых в тетрагидрофуране в атмосфере аргона прибавляют раствор замещенного бензальдегида в тетрагидрофуране при мольном соотношении производного гидроксамовой кислоты к бензальдегиду 1:1.1, после чего реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 2-3 часа, удаляют растворитель в вакууме, добавляют к остатку диэтиловый эфир, образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат.