КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ РАБДОМИОСАРКОМЫ ЧЕЛОВЕКА 862 RMSar KDD Российский патент 2020 года по МПК C12N5/07 

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия эмбриональной рабдомиосаркомы 862 RMSar KDD обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в клеточной иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 791Д.

Рабдомиосаркома является наиболее распространенной формой сарком мягких тканей, на которую приходится 4,5% всех случаев злокачественных новообразований детского возраста. Это третья по распространенности солидная экстракраниальная опухоль у детей после опухоли Вильмса и нейробластомы [Dasgupta R., Fuhs J., Rodeberg D. Rhabdomyosarcoma // Semin Pediatr Surg. - 2016. - Vol. 25(5). - P. 276-283. doi: 10.1053/j.sempedsurg.2016.09.011].

По данным международного регистра детских опухолей 45% всех злокачественных опухолей мягких тканей у детей приходятся на различные гистологические типы рабдомиосаркомы. Эмбриональная рабдомиосаркома обычно наблюдается у детей младше 15 лет, только в 17% случаев - у больных старше этого возраста [Sun X., Guo W., Shen J.K., Mankin H.J., Hornicek F J., Duan Z. Rhabdomyosarcoma: Advances in Molecular and Cellular Biology // Sarcoma. - 2015. - Vol. 2015. - P. 232010. doi: 10.1155/2015/232010]. Данная опухоль характеризуется быстрым инвазивным ростом и системным метастазированием, что обуславливает ограниченную эффективность лечения и плохой прогноз, особенно в запущенных случаях, что диктует необходимость изучения биологических особенностей этого злокачественного новообразования с целью разработки новых эффективных методов терапии.

Рабдомиосаркома возникает как следствие нарушения регуляции роста и дифференцировки миогенных клеток-предшественников, которые находятся в мышцах, и их пролиферация приводит либо к правильному миогенезу, либо к активации аберрантных сигнальных путей, ведущих к развитию этой опухоли [Hawkins D.S., Gupta А.А., Rudzinski E.R. What is new in the biology and treatment of pediatric rhabdomyosarcoma? // Current Opinion in Pediatrics. - 2014. - Vol. 26(1). - P. 50-56. doi: 10.1097/MOP.0000000000000041].

В настоящее время созданы многие животные модели рабдомиосаркомы, для этого использованы такие организмы как Drosophila, Zebrafish и линейные мыши. Эти модели могут способствовать пониманию генетической основы возникновения и прогрессирования опухолей, а также могут помочь в тестировании эффективности новых противоопухолевых препаратов. Однако, использование клеточных линий опухолей человека в ряде случаев обладает рядом преимуществ: важно отметить, что клеточные линии являются важнейшим инструментом в реализации одного из основных гуманных принципов исследований in vivo, связанного с уменьшением количества лабораторных животных, используемых во время первичного скрининга лекарств: замена, сокращение и уточнение [Brodaczewska K.K., Szczylik С., Fiedorowicz М. Et al. Choosing the right cell line for renal cell cancer research // Mol Cancer. - 2016. - Vol. 15(1). - P. 83. doi: 10.1186/sl2943-016-0565-8].

Кроме того, разработка клеточных моделей на основе новых хорошо охарактеризованных клеточных линий опухолей человека необходима для поиска потенциальных терапевтических мишеней, так как персонализированная терапия рака, нацеленная на соматические мутации в опухолях пациентов, все шире применяется в практике [Stewart Е., McEvoy J., Wang H., Chen X., Honnell V. et al. Identification of Therapeutic Targets in Rhabdomyosarcoma through Integrated Genomic, Epigenomic, and Proteomic Analyses // Cancer Cell. - 2018. - Vol. 34(3) - P. 411-426.el9. doi: 10.1016/j.ccell.2018.07.012].

В наши дни работы по приготовлению клеточных линий приобрели систематический характер, однако каждая вновь полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума. В то же время, получение клеточных линий из сарком человека представляет значительные трудности, и количество подобных клеточных линий ограничено в мировом научном сообществе [Hattori Е., Oyama R., Kondo Т. Systematic Review of the Current Status of Human Sarcoma Cell Lines // Cells. - 2019. - Feb 13; 8(2). - pii: E157. doi: 10.3390/cells8020157]. Из 844 клеточных линий сарком, зарегистрированных в базе данных Cellosaurus, только 148 доступны как объект исследования, многие гистологические подтипы сарком вообще не представлены. Поэтому перед мировым научным сообществом стоит задача получения и характеристики новых клеточных линий сарком мягких тканей различных гистологических подтипов, которые можно было бы использовать в клеточных модельных системах для исследования.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии эмбриональной рабдомиосаркомы человека, которую потенциально возможно использовать как клеточную модель для изучения молекулярных основ канцерогенеза и разработки новых инновационных методов лечения этого вида злокачественного новообразования.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении эмбриональной рабдомиосаркомы. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия 862 RMSar KDD из опухолевого образца эмбриональной рабдомиосаркомы человека, экспрессирующая специфические антигены и продуцирующая специфические молекулы. Полученная клеточная линия 862 RMSar KDD обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 791 Д.

Клеточная линия выделена из метастаза эмбриональной рабдомиосаркомы в забрюшинный лимфатический узел больного К.Д.Д., 17 л., проходившего лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования.

Получение клеточной линии 862 RMSar KDD осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 35 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 862 RMSar KDD характеризуются следующим образом.

Культура представлена популяцией сильно вытянутых веретеновидных клеток, образующих плотные тяжи. Клетки содержат крупные светлые ядра овальной формы, насчитывающие до 4 ядрышек. В цитоплазме клеток выявляются иммунохимически: белок S100, продольно ориентированные филаменты, содержащие кальдесмон. 42% клеток экспрессируют маркер пролиферации Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии 862 RMSar KDD следующие.

Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов: HLA А/В/С - 98,8%; HLA DQ/DP/DR - 95,5%.

Методом ПЦР выявлена гиперэкспрессия раково-тестикулярных генов GAGE, PASD1, FRAME.

Методом иммуноферментного анализа супернатанта клеточной культуры выявлена стабильная продукция хемокина CCL2 (до 2,5 нг/мл).

Культуральные свойства клеточной линии 862 RMSar KDD представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляется при 37°C, 5% CO2, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1,5×10⁶ клеток. Пересев 1 раз в 10 дней в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%), DMSO 10%; 3×106 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°C в минуту до -25°C, затем быстрое замораживание до -70°C. Хранение в жидком азоте при температуре -196°C. Размораживание быстрое, при 37°C. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 85%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasmapneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 862 RMSar KDD следующая.

Культура распадается на три основных субклона:

45, X,-Y, -17,-21, marl, mar2 - 55%

46, XY, del(9)(p21), -17,-19, marl, mar2 - 25%

45,XY,-12, mar3 - 1%

Использование клеточной линии 862 RMSar KDD представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 862 RMSar KDD для создания персонализированной модельной системы, позволяющей оценить чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам.

1. Клеточную линию 862 RMSar KDD культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Для оценки химиочувствительности опухолевые клетки линии 862 RMSar KDD высевали предварительно в планшеты E-Plate 16 PET (Acea Bioscience Inc., США) в количестве от 2×10⁴ клеток на лунку в 100 мкл полной питательной среды. Инкубировали в течение 24 часов в условиях автоматического клеточного анализатора в режиме реального времени xCelligence (Acea Bioscience Inc., США), затем добавляли 100 мкл раствора исследуемых химиопрепаратов.

4. В качестве химиотерапевтических агентов использовали ифосфамид, доксорубицин, винкристин. Добавляли химиотерапевтические агенты в конечной концентрации, соответствующей 10% пика концентрации в плазме крови больного. Эта концентрация соответствует терапевтической (Salmon S.E., 1981). Продолжительность инкубации с химиотерапевтическими агентами соответствовала периоду полувыведения препарата из циркуляции.

5. В качестве положительного контроля использовали клетки линии 862 RMSar KDD без воздействия.

6. После добавления в систему цитостатиков вели наблюдение в течение 72 часов. Общее время наблюдения составило 96 часов.

7. Характер воздействия цитостатиков определяли по изменению клеточного индекса - соотношения электрического импеданса в «нулевой» точке к импедансу в данной временной точке. Прибор измеряет электрическое сопротивление сенсорных электродов, которое пропорционально числу клеток, прикрепляющихся к сенсорным датчикам, позволяющим осуществлять измерения роста клеток в различные временные интервалы.

8. Обнаружили, что клеточная линия 862 RMSar KDD обладает химиорезистентностью по отношению к исследованным препаратам в отдельности. При воздействии препаратов в комбинации химиочувствительность клеток линии 862 RMSar KDD составила 52%.

Пример 2. Создание трехмерных клеточных моделей на основе клеточной линии 862 RMSar KDD.

1. Клеточную линию 862 RMSar KDD культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Клетки 862 RMSar KDD в количестве 500, 1000, 3000 помещали в каплю полной питательной среды (DMEM/F12, 20% сыворотки эмбрионов коров, глютамин) объемом 25 мкл, локализующуюся на крышке чашки Петри 35 мм. В саму чашку Петри вносили 0,9% раствор NaCl.

4. Чашки Петри помещали в СО₂-инкубатор (37°C, 100% влажности) на 7 суток. В процессе культивирования на 3-е сутки проводили смену питательной среды в каплях.

5. По окончании культивирования изъятые из капель сфероиды отмывали в однократном растворе фосфатно-солевого буфера, после чего высаживали в ячейки 48-луночного планшета, предварительно покрытого полимеризованным матригелем (100 мкл на лунку), и добавляли 500 мкл питательной среды.

6. Помещали планшеты в автоматическую систему для наблюдения за живыми клетками Cell-IQ (Chip-Man Technologies Ltd, Финляндия) и определяли эффективность образования сфероидов путем подсчета диаметра сфероида и его площади.

7. Произвели следующие измерения: сфероиды, полученные из 5000 клеток 862 RMSar KDD, имели средний диаметр 281,33±8,25 мкм, среднюю площадь 62125,63±213,15 мкм², средний объем 34954381,34±657,12 мкм³; округлость 0,884±0,06. Скорость распространения в матригеле (инвазии) клеток линии 862 RMSar KDD составила 72% поля зрения за 120 часов наблюдения.

Пример 3. Использование клеточной линии 862 RMSar KDD для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток

1. Клеточную линию 862 RMSar KDD культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

3. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

4. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

5. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 862 RMSar KDD проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°C и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

6. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°C до использования.

7. Вносили лизат клеточной линии 862 RMSar KDD в культуру аутологичных незрелых дендритных клеток пациента с рабдомиосаркомой на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°C, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.

Изобретение расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении эмбриональной рабдомиосаркомы. Может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению клеточных линий, используемых для клеточных технологий в медицине. Полученная новая клеточная линия эмбриональной рабдомиосаркомы человека 862 RMSar KDD обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 791Д. Клеточная линия характеризуется экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II классов, гиперэкспрессией раково-тестикулярных генов GAGE, PASD1, PRAME, продукцией хемокина CCL2. Может использоваться для создания биомедицинских клеточных продуктов, клеточных моделей, для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем с целью разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств. 3 пр.

Клеточная линия эмбриональной рабдомиосаркомы человека 862 RMSar KDD, используемая для создания биомедицинских клеточных продуктов, клеточных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, депонированная в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 791 Д.