КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ АЛЬВЕОЛЯРНОЙ САРКОМЫ ЧЕЛОВЕКА 9927 AIS SIO Российский патент 2023 года по МПК C12N5/00 A61K35/12 

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия альвеолярной саркомы человека 9927 AlS SIO обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в клеточной иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 807Д.

Альвеолярная саркома (АС) - это очень редкий вид саркомы мягких тканей, представляющий собой медленно растущее злокачественное новообразование неизвестного происхождения. Медиана возраста заболевших составляет 26 лет, большинство пациентов (56%) моложе 30 лет [Е.Н. Новожилова, А.П. Федотов, В.Н. Гриневич и соавт. Редкое наблюдение альвеолярной саркомы парафарингеального пространства // Опухоли головы и шеи. - 2012. - №4. - С. 66-69]. АС характеризуется относительно медленным ростом (до 5-7 лет) и наиболее часто диагностируется на поздних стадиях. Примером может служить наблюдение, когда из 69 пациентов моложе 30 лет на момент постановки диагноза 28% пациентов имели I стадию заболевания, 10% - II, 7% - III и 55% пациентов - IV стадию [Paoluzzi L, Maki RG. Diagnosis, Prognosis, and Treatment of Alveolar Soft-Part Sarcoma: A Review // JAMA Oncol. - 2019. - Vol. 1;5(2):254-260. doi: 10.1001/jamaoncol.2018.4490].

По опыту специалистов всего мира, редко наблюдается клинический ответ на химиотерапию и/или иммунотерапию (цисплатином, ифосфамидом, доксорубицином, метотрексатом, интерфероном и интерлейкином-2, в различных режимах). Частичный ответ на химиотерапию в различных комбинациях отмечается приблизительно в 30% случаев. Трехлетняя выживаемость составляет не более 25-38%. Окончательный прогноз остается неутешительным. На прогноз заболевания влияют размер опухоли, распространение процесса на костные структуры, наличие метастатического поражения.

В целом, лечение сарком мягких тканей (СМТ) довольно сложное из-за их гистологического разнообразия и генетической неоднородности. Тем не менее, в настоящее время уже имеются протоколы успешного применения инновационных лекарств для лечения СМТ, в том числе АС, зарегистрированные на сайте ClinicalTrials.gov [O'Sullivan Coyne G., Naqash A.R., Sankaran H., Chen A.P. Advances in the management of alveolar soft part sarcoma // Curr Probl Cancer. - 2021. - Vol. 45(4): 100775. doi: 10.1016/j.currproblcancer.2021.100775]. Этот прогресс в разработке новых противоопухолевых препаратов предполагает улучшение клинической эффективности терапии пациентов с АС в ближайшем будущем. Но в тоже время, поскольку уровень успешности разработки лекарств в онкологии в целом остается низким, а количество больных АС, которые могут быть включены в клинические испытания, ограничено низкой частотой встречаемости этих заболеваний, важно проводить доклинические исследования для оценки пригодности потенциальных противораковых препаратов, особенно для таких редких злокачественных новообразований [Hattori Е., Oyama R., Kondo Т. Systematic review of the current status of human sarcoma cell lines // Cells. - 2019. - Feb 13;8(2). pii: E157. doi: 10.3390/cells8020157].

Клеточные модели злокачественных опухолей из клеток, полученных от пациентов, являются важным инструментом для разработки новых терапевтических методов. Используя такие модели, можно изучать молекулярные механизмы, лежащие в основе ответов опухолевых клеток на действие противоопухолевых препаратов и различных генетических, эпигенетических стрессовых факторов. Возможна разработка нового применения существующих противоопухолевых препаратов для лечения сарком на основе результатов экспериментов с использованием опухолевых клеточных линий, однако клеточные линии АС, выделенные из биологического материала больных, отсутствуют в общедоступных банках клеток, и в литературе сообщается лишь о нескольких клеточных линиях [Kenney S., Vistica D.T., Stockwin L.H. et al. ASPS-1, a novel cell line manifesting key features of alveolar soft part sarcoma // J Pediatr Hematol Oncol. - 2011. -Vol. 33(5):360-8. doi: 10.1097/MPH.0b013e3182002f9f; Yoshimatsu Y., Noguchi R., Tsuchiya R. et al. Establishment and characterization of NCC-ASPS1-C1: a novel patient-derived cell line of alveolar soft-part sarcoma // Hum Cell. -2020. - Vol. 33(4):1302-1310. doi: 10.1007/s13577-020-00382-2]. Кроме того, было сообщено только об одном исследовании ксенотрансплантатов АС, и данные о ксенотрансплантатах не были размещены в общедоступных биобанках [Conte N., Mason J.C., Halmagyi С.et al. PDX Finder: a portal for patient-derived tumor xenograft model discovery // Nucleic Acids Res. - 2019. -Vol. 47:D1073-D10791079. doi: 10.1093/nar/gky984]. С тех пор, как АС была впервые описана и официально зарегистрирована более 60 лет назад, достигнут незначительный прогресс в разработке эффективной терапии для лечения этой опухоли, и это отсутствие прогресса может быть частично связано с нехваткой адекватных клеточных моделей на основе опухолевых клеток, полученных от пациентов. Поэтому перед мировым научным сообществом стоит задача получения и характеристики новых клеточных линий АС, которые можно было бы использовать в клеточных модельных системах для исследования.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии альвеолярной саркомы человека, которую потенциально возможно использовать как клеточную модель для изучения молекулярных основ канцерогенеза и разработки новых инновационных методов лечения этого вида злокачественного новообразования.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении альвеолярной саркомы. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия 9927 AlS SIO из опухолевого образца метастатической альвеолярной саркомы человека, экспрессирующей специфические антигены. Полученная клеточная линия 9927 AlS SIO обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 807Д. Клеточная линия выделена из метастаза альвеолярной саркомы в легкое больного С.И.О., 21 г., проходившего лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования.

Получение клеточной линии 9927 AlS SIO осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм2) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 40 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 9927 AlS SIO характеризуются следующим образом.

Культура представлена мелкими клетками полигональной формы с крупными овальными ядрами, насчитывающими до 5 ядрышек.

Маркерные признаки клеточной линии 9927 AlS SIO следующие.

Результаты HLA типирования опухолевой культуры с определением гаплотипа HLA I класса методом ПЦР: А*01;*02; В* 07,*35; С*06*07.

Клетки экспрессируют опухолеассоциированные антигены CD99, TFE3, MyoD1, Fli-1, виментин (на основании иммуноцитохимического исследования).

Выявлена гиперэкспрессия генов MAGEA1, SLLP1 и PRAME методом ПЦР. Культуральные свойства клеточной линии 9927 AlS SIO представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% СО2, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Пересевают 1 раз в неделю в соотношении 1:2 с использованием раствора, содержащего смесь равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 93%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР с использованием тест системы Мусо Real-Time (Евроген, Россия) были проведены исследования на наличие ДНК микроорганизмов класса Mollicutes, в т.ч. наиболее часто встречающихся в лабораторных условиях контаминантов клеточных культур: Mycoplasma orale, М. arginini, М. fermentans, М. hominis, М. hyorhinis, М. gallisepticum, М. genitalium, М. penetrans, М. pneumonia, М. salivarium и Acholeplasma laidlawii. Тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 9927 AlS SIO следующая.

46, XY, del(1)(p11).

Данные молекулярно-генетического анализа по видовой

принадлежности и аутентификации данной линии (STR маркеры) следующие:

AMEL XY

D3S1358 - 15,17

ТН01 - 9,9.3

D12S391 - 18,20

D1S1656 - 16,17

D10S1248 - 12,16

D22S1045 - 11,14

D2S441 - 11,14

D7S820 - 10,11

D13S317 - 8,11

FGA - 20,23

ТРОХ - 10,11

D18S51 - 12,14

D16S539 - 11,12

D8S1179 - 12,13

CSF1P0 - 10,13

D5S818 - 12,12

vWA - 15,16

D21S11 - 30.2,32.2

SE33 - 28.2,29.2

Использование клеточной линии 9927 AlS SIO представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 9927 AlS SIO для приготовления клеточного лизата, используемого для активации in vitro дендритных клеток больного синовиальной саркомой.

1. Клеточную линию 9927 AlS SIO культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в СО₂-инкубаторе «Heracel (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:2.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 9927 AlS SIO проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трепанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией 9927 AlS SIO в культуры незрелых дендритных клеток пациента с альвеолярной саркомой на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14-/CD1a-/CD83+/CD80+/CD86+/HLADR+/CD209+/CCR7+.

Пример 2. Использование клеточной линии 9927 AlS SIO для создания модельной системы, позволяющей оценить специфическую противоопухолевую активность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ).

1. Клеточную линию 9927 AlS SIO культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Заблаговременно получали культуру специфически активированных ЦТЛ. Для этого мононуклеарные клетки периферической крови пациентов выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности «Ficoll-Paque Premium» «GE Healthcare» (Великобритания) методом Boyum. Производили разделение моноцитов (CD14+) и лимфоцитов (CD3+) методом адгезии на пластике. Моноциты культивировали в питательной среде CellGro DC в присутствии GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (15 нг/мл) (CellGenix, ФРГ), которые добавляли в 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования. На 7-е сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены, исходя из соотношения 1 ДК / 3 лизированные клетки меланомы кожи, ростовые факторы - GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (15 нг/мл) (CellGenix, ФРГ) и TNF-α (20 нг/мл) (BD Bioscience, США). Через 48 часов ДК собирали, осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10% альбумина человека, производили подсчет и оценку жизнеспособности с помощью 0,4% трепанового синего в автоматическом счетчике клеток «Countess».

4. Фракцию лимфоцитов кокультивировали со зрелыми ДК в присутствии цитокинов GM-CSF (72 нг/мл), IL-4 (15 нг/мл), (CellGenix, ФРГ), IL-2 (50 МЕ/мл), IL-7 (10 нг/мл), TNF-α (20 нг/мл) (BD Bioscience, США) в течение 7 дней, добавляя цитокины каждые 48 часов. Процедуру повторяли дважды.

5. Полученную суспензию лимфоцитов анализировали методом проточной цитофлуорометрии. Выделение антиген-специфических CD8+ ЦТЛ производили методом негативной магнитной сепарации с использованием прибора EasySep™ Magnet. CD8+ ЦТЛ выделяли из клеточной суспензии с помощью набора EasySep™ Human CD8+ Т Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc., Канада).

6. Для оценки эффективности взаимодействия активированных ЦТЛ с клетками линии 9927 AlS SIO в клеточном анализаторе xCelligence клетки опухолевой линии 9927 AlS SIO высевали предварительно в количестве 2×10⁴ на лунку в Е-16 Plate (ACEA Bioscience., USA).

7. Оставляли планшеты в условиях СО₂-инкубатора на 30 мин. для минимизации турбулентных потоков жидкости, затем вносили в систему активированные ЦТЛ в соотношении 1 оп кл/50 лим и помещали планшеты в ячейки прибора, где осуществляли регистрацию электрических сигналов в течение 48 часов.

8. Вычисляли процент клеточного лизиса в процессе взаимодействия Т-лимфоцитов и клеток линии 9927 AlS SIO следующим образом:

(CI опух кл - CI опух кл + ЦТЛ)/ CI опух кл × 100

где CI - клеточный индекс, представляющий собой изменение электрического импеданса относительно контрольных лунок, не содержащих клеток

9. Процент лизиса клеток линии 9927 AlS SIO через 10 часов наблюдения составил 19%, через 25 ч - 35% и через 40 ч достиг 72%.

Клеточная линия 9927 AlS SIO расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, способствует повышению эффективности лечения и увеличению продолжительности жизни при лечении альвеолярной саркомы, может быть использована для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению клеточных линий, используемых для клеточных технологий в медицине. Полученная новая клеточная линия альвеолярной саркомы человека 9927 AlS SIO обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 807Д. Клеточная линия характеризуется экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса гаплотип А*01;*02; В* 07,*35; С*06*07, экспрессией опухолеассоциированных антигенов CD99, TFE3, MyoD1, Fli-1, виментин, раково-тестикулярных антигенов MAGEA1, SLLP1 и PRAME. Изобретение может использоваться для создания биомедицинских клеточных продуктов, клеточных моделей, для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем с целью разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств. 2 пр.

Клеточная линия альвеолярной саркомы человека 9927 AlS SIO, используемая для создания биомедицинских клеточных продуктов, клеточных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, характеризуется индивидуальным гаплотипом HLA I класса А*01;*02; В* 07,*35; С*06*07, экспрессирует опухолеассоциированные антигены CD99, TFE3, MyoD1, Fli-1, виментин, раково-тестикулярные антигены MAGEA1, SLLP1 и PRAME и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 807Д.