Способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах Российский патент 2021 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования преждевременных родов у беременных женщин с угрозой прерывания в сроке гестации 22-34 недели.

Актуальность данного способа определяется тем, что преждевременные роды являются основной причиной перинатальной и младенческой заболеваемости и смертности. Из всех беременностей в мире 5-18% заканчиваются преждевременными родами [Global, regional, and national causes of child mortality: an updated systematic analysis for 2010 with time trends since 2000 / L. Li, H.L. Johnson, S. Cousens [et al.] // Lancet. - 2012. - Vol. 379, Issue 9832. - P. 2151-2161]. По данным Росстата за 2017 год, в России недоношенными родились 6,5% детей [Основные показатели здоровья матери и ребенка, деятельность службы охраны детства и родовспоможения в Российской Федерации. - М., 2018. - 29 с.]. Разработанный способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах позволит обеспечить персонифицированный подход к тактике ведения беременной, тем самым снизить частоту осложнений со стороны плода и улучшить перинатальные исходы.

Известен способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах, включающий исследование периферической крови беременной с 28 недель гестации, в котором до и после проведения курса сохраняющей терапии определяют количественный показатель нитрат-ионов, и при его увеличении относительно первоначального значения на 10% и более, прогнозируют развитие преждевременных родов [Пат. №2272574 Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах / Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Назарова А.О., Кузьменко Г.Н., Воробьева Ю.С. // Изобретения. Полезные модели. - 2006. - №9]. Данный способ имеет недостатки, так как требует повторного забора периферической крови и оценки результата в динамике при проведении сохраняющей терапии.

Известен способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем иммунологического исследования периферической крови беременной, при котором определяют содержание TGFβ, и при его значении, равном или менее 2000 пг/мл, прогнозируют преждевременные роды [Патент №2437097 Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах / Сотникова Н.Ю., Борзова Н.Ю., Крошкина Н.В., Читава И.Г. // Изобретения. Полезные модели. - 2011. - №35]. Однако, данный способ позволяет прогнозировать исход беременности лишь с третьего триместра - с 34 недель беременности.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем определения в периферической крови популяций иммунокомпетентных клеток [Патент №2132069 Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах / Крошкина Н.В., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А., Анциферова Ю.С, Кудряшова А.В. // Изобретения. - 1999. - №17, Ч. 2. - С. 407]. Согласно данному способу в периферической крови беременных женщин с наличием признаков угрожающих преждевременных родов в сроки гестации 24-36 недель определяют содержание CD3+ и CD 16+ клеток и оценивают показатель соотношения данных клеточных популяций по формуле CD16+/CD3+, при показателях соотношения CD16+/CD3+, меньших или равных 0,11, прогнозируют преждевременные роды с точностью 78,26%.

Данный способ был выбран в качестве прототипа, однако он имеет ряд недостатков:

- способ является менее точным (78,26%), чувствительным (75%) и специфичным (82%), чем заявляемый способ;

- не позволяет прогнозировать преждевременные роды, начиная с 22 недель беременности.

Технический результат направлен на прогнозирование исхода беременности при угрожающих преждевременных родах с более ранних сроков беременности, расширение арсенала прогностических средств и повышение точности прогнозирования.

Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической венозной крови беременных с угрожающими преждевременными родами в сроке 22-34 недели гестации до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание GranzymeB-продуцируюших терминально-дифференцированных клеток (GrB+CD62L-CD45RA+) в популяции CD8+ лимфоцитов, и при их значении равном 8,2% или менее прогнозируют преждевременные роды с точностью 87,9%.

Способ осуществляется следующим образом:

1. 1 мл крови из локтевой вены беременной забирают в центрифужную пробирку с 2,7% раствором ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора и подслаивают 1 мл фиколл-велографина с градиентом плотности 1,078. Клеточную фракцию лимфоцитов получают методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 минут.

2. К 50 мкл суспензии клеток (концентрация 1×10⁶ кл/мл) добавляют по 20 мкл анти-CD8+, анти-CD62L+ и анти-CD45RA+мАТ, меченных различными флуорохромами и инкубируют 20 минут в темноте при комнатной температуре. Клетки отмывают в 2 мл фосфатно-солевого буфера центрифугированием при 1500 об/мин. Далее клетки фиксируют в течение 15 минут в 100 мкл фиксирующего буфера из набора «FIX & PERM cell permeabilization reagents», повторяют процедуру отмывки, а затем инкубируют 15 минут со 100 мкл пермеабилизирующего буфера и с 10 мкл анти-GranzymeB-MAT для внутриклеточного окрашивания с последующей отмывкой.

3. Учет реакции проводят на проточном цитофлуориметре, определяя относительное содержание GranzymeB-позитивных терминально-дифференцированных клеток (GrB+CD62L-CD45RA+) в популяции CD8+ лимфоцитов и при их значении равном 8,2% или менее прогнозируют преждевременные роды.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать исход беременности при угрожающих преждевременных родах по определению относительного содержания GranzymeB-продуцирующих клеток в популяции терминально-дифференцированных CD8+ лимфоцитов в периферической крови.

Традиционно считается, что CDS+T-лимфоциты являются популяцией лимфоцитов, обладающей высокой цитотоксической активностью, что имеет чрезвычайное значение в условиях инвазии полуалогенных плодовых клеток в эндометрий при беременности. Ранее было показано, что у женщин с привычным выкидышем и угрозой невынашивания на момент обследования в 5-10 недель в периферической крови повышен уровень GranzymeB-продуцирующих клеток в популяции терминально-дифференцированных CD8+ лимфоцитов, независимо от последующего исхода беременности (самопроизвольный выкидыш, преждевременные и своевременные роды) [Иваненкова Н.И., Борзова Н.Ю., Сотникова Н.Ю. Дифференцировка периферических Т-лимфоцитов у женщин с привычным невынашиванием в зависимости от исхода беременности // Материалы XV Всероссийского научного форума с международным участием им. академика В.И. Иоффе // Медицинская иммунология. - 2015. - Т. 17. - С. 180.]. Выявленное нами снижение содержания эффекторных GranzymeB-продуцирующих клеток CD8+ лимфоцитов в периферической крови может быть обусловлено их миграцией в зону плацентации. Так в работе Марсия Аренас-Эрнандес с соавторами отмечалось повышение уровня терминально-дифференцированных GranzymeB-продуцирующих CD8+ клеток на границе «мать-плод» (в базальной децидуальной оболочке) при спонтанных преждевременных родах. [Effector and Activated Т cells Induce Preterm Labor and Birth that is Prevented by Treatment with Progesterone / M. Arenas-Hemandez, R. Romero, B. Panaitescu [et al.] // J. Immunol. - 2019. - Vol. 202, №9. - P. 2585-2608]. Это может вести к увеличению концентрации провоспалительных цитокинов, которые не только усиливают родовую активность, но и ведут к активации клеток врожденного иммунитета, которые также могут принимать непосредственное участие в развязывании родовой деятельности. Кроме того, известно, что материнские цитотоксические Т-лимфоциты могут напрямую контактировать с фетальными антиген-презентирующими клетками, несущими антигены гистосовместимости II класса отцовского происхождения, результатом чего может быть иммунный ответ по типу реакции отторжения трансплантата [Chronic Villitis of Unknown Etiology and Massive Chronic Intervillositis Have Similar Immune Cell Composition / C.A. Labarrere, J.W. Hardin, D.M. Haas, G.S. Kassab // Placenta. - 2015. - Vol. 36. - №6. - P. 681-686. doi: 10.1016/j.placenta.2015.03.008].

Несмотря на то, что блокировать иммунологические реакции в настоящее время не представляется возможным, токолитическая терапия способствует отсрочке родов для проведения профилактики респираторного дистресс-синдрома плода и перевода женщины в акушерский стационар, предназначенный для оказания высокотехнологической помощи недоношенным новорожденным. Таким образом, для определения акушерской тактики существует необходимость прогнозирования наступления родов у женщин с симптомами угрожающих преждевременных родов в сроках гестации 22-34 недели.

Отличительные признаки способа:

в сроке 22-34 недели беременности до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток (GrB+CD62L-CD45RA+) в популяции CD8+ лимфоцитов, и при их значении равном 8,2% или менее прогнозируют преждевременные роды.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Клинический пример 1.

Беременная С., 31 года, встала на учет в женскую консультацию в сроке 7-8 недель. Беременность протекала на фоне хронического гастрита и хронического пиелонефрита вне обострения, мочекаменной болезни, миомы матки малых размеров. В анамнезе своевременные роды, без осложнений. Течение настоящей беременности в первом триместре осложнилась острой респираторной инфекцией с повышением температуры до 38°С.

Поступила в акушерский стационар с симптомами угрожающих преждевременных родов в сроке гестации 33-34 недели. Жалобы на схваткообразные боли внизу живота. По данным объективного осмотра живот увеличен за счет беременной матки, соответствующей сроку беременности 34 недель, матка возбудима. Положение плода продольное, предлежит головка, прижата ко входу в малый таз. Сердцебиение плода ясное, ритмичное 138-140 ударов в минуту. При влагалищном исследовании: шейка матки располагается по проводной оси таза, укорочена до 1 см, размягчена, цервикальный канал свободно проходим для одного исследующего пальца. Околоплодные воды не изливались. По данным ультразвукового исследования размеры плода соответствуют 34 неделям беременности, шейка матки укорочена до 11 мм, цервикальный канал «U»-образный.

При поступлении в стационар проведено определение относительного содержания GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток, которое составило 8,2%, что указывает на исход беременности в виде преждевременных родов.

Диагноз: Беременность 33-34 неделя. Головное предлежание плода. Угрожающие преждевременные роды. Мочекаменная болезнь. Хронический пиелонефрит, хронический гастрит ремиссия.

Беременной была назначена токолитическая терапия и глюкокортикостероидная терапия для профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Несмотря на проведение токолитической терапии, на 7 сутки наблюдения началась регулярная родовая деятельность, роды велись через естественные родовые пути. По поводу возникшего дистресс-синдром плода с изменением частоты сердечных сокращений было выполнено экстренное родоразрешение путем операции кесарево сечение. Родился живой недоношенный мальчик массой тела 2000 г, длиной 46 см, с оценкой по шкале Апгар 6-8 баллов.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Клинический пример 2.

Беременная Г., 28 лет встала на учет по беременности в женскую консультацию в сроке 10 недель. Беременность протекала на фоне аутоиммунного тиреоидита, гипотиреоза с медикаментозной компенсацией. В анамнезе прерывание беременности в 20 недель по медицинским показаниям со стороны плода (множественные пороки развития). Данная беременность вторая по счету, протекала с явлениями угрозы прерывания во втором триместре.

Поступила в акушерский стационар со схваткообразными болями в нижних отделах живота в сроке гестации 22-23 недели. По данным объективного осмотра живот увеличен за счет беременной матки, соответствующей сроку беременности 23 недели, матка возбудима. Положение плода продольное, предлежание головное, головка прижата ко входу в малый таз. Сердцебиение плода ритмичное, 142 удара в минуту. При влагалищном исследовании: шейка матки укорочена до 1,5 см, размягчена, цервикальный канал проходим для одного исследующего пальца свободно. Околоплодные воды не изливались. По данным ультразвукового исследования размеры плода соответствуют 23 неделям беременности, шейка матки укорочена до 16 мм, цервикальный канал «U»-образный.

При поступлении в стационар проведено определение относительного содержания GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток, которое составило 3,8%, что указывает на исход беременности в виде преждевременных родов.

Диагноз: Беременность 22-23 недели. Головное предлежание. Угрожающие преждевременные роды. Аутоиммунный тиреоидит. Гипотиреоз, медикаментозная компенсация.

Беременной была назначена токолитическая терапия, глюкокортикостероидная терапия с целью профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Через 2 дня, несмотря на проведение токолитической терапии, произошли преждевременные роды через естественные родовые пути. Родился живой недоношенный ребенок женского пола массой 580 г, ростом 29 см, с оценкой по шкале Апгар 2-5 баллов.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Клинический пример 3.

Беременная Р., 38 лет встала на учет по беременности в женскую консультацию в сроке 7 недель. Беременность протекала на фоне вегето-сосудистой дистонии по гипотоническому типу, тромбофилии. В анамнезе 2 погибшие беременности в сроке 8-9 недель. Данная беременность третья по счету, протекала на фоне гормональной поддержки.

Поступила в акушерский стационар с жалобами на схваткообразные боли внизу живота в сроке гестации 26-27 недель. По данным объективного осмотра живот увеличен за счет беременной матки, соответствующей сроку гестации, возбудимой при пальпации. Положение плода продольное, предлежание головное, головка неплотно прижата ко входу в малый таз. Сердцебиение плода ясное, ритмичное 138 ударов в минуту. При влагалищном исследовании: шейка матки укорочена до 2,0 см, размягчена, проходима для одного исследующего пальца. Околоплодные воды не изливались. По данным ультразвукового исследования размеры плода соответствуют 27 неделям беременности, шейка матки укорочена до 20 мм, цервикальный канал «U»-образный.

При поступлении в стационар определено относительное содержание GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток, которое составило 13%, что указывает на пролонгирование беременности до 34 недель.

Диагноз: Беременность 28 недель. Головное предлежание. Угрожающие преждевременные роды. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (привычное невынашивание беременности). Тромбофилия.

Беременной проводилась токолитическая терапия и глюкокортикостероидная терапия с целью профилактики респираторного дистресс-синдрома плода. Через 10 дней наблюдения пациентка была выписана под наблюдение врача женской консультации в удовлетворительном состоянии. Беременность завершилась своевременными родами путем операции кесарево сечения в 38 недель гестации. Родился живой доношенный мальчик массой 3250 г, ростом 51 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Результаты исследования приведены в таблице 1

Преимущества способа:

1. Способ позволяет с высокой точностью 87,9%, чувствительностью 92,3% и специфичностью 85% прогнозировать исход беременности при угрожающих преждевременных родах в широком диапазоне сроков гестации (24-34 недель) до начала сохраняющей терапии.

2. Представленный способ прост в интерпретации результатов обследования.

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем определения в периферической венозной крови беременной женщины иммунокомпетентных клеток, где в сроке 22-34 недели беременности до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток (GrB+CD62L-CD45RA+) в популяции CD8+ лимфоцитов и при их значении равном 8,2% или менее прогнозируют преждевременные роды. Изобретение обеспечивает высокую точность прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах, выбор правильной тактики ведения беременности и минимизирование осложнения преждевременных родов. 3 пр., 1 табл.

Способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем определения в периферической венозной крови беременной женщины иммунокомпетентных клеток, отличающийся тем, что в сроке 22-34 недели беременности до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток (GrB+CD62L-CD45RA+) в популяции CD8+ лимфоцитов и при их значении равном 8,2% или менее прогнозируют преждевременные роды.