Конъюгат гесперидина и способ его получения Российский патент 2021 года по МПК C07H17/06 A61K31/353 C07B43/00 

Заявляемое изобретение относится к органической химии, а именно к классу флавоноидов и, в частности, производным гесперидина, а также к фармакологии, а именно к лекарственным препаратам, отличающимся органическими активными ингредиентами.

Флавоноиды представляют собой природные полифенольные соединения, которые могут быть получены из растительного сырья. Благодаря высокой и разносторонней активности, в сочетании с малой токсичностью флавоноиды представляют большой интерес при разработке новых лекарственных препаратов. Многие соединения, относящиеся к данному классу, обладают выраженной антиоксидантной, ангиопротекторной, гепатопротекторной, диуретической, противоопухолевой, противовирусной и нейротропной активностью [Heim K.Е., Tagliaferro A.R., Bobliya D.J. J. Nutr. Biochem. 13: 572-5841, 2002; Cushnie T.P., Lamb A.J. Int. J. Antimicrob. Agents 26: 343-356, 2005; Zandi K., Teoh B.T., Sam S.S., et al. Vir. Jour. 8: 560, 2011].

Одним из важнейших представителей флавоноидов является гесперидин, состоящий из агликона (гесперитин) и углеводной части (рутинозида): 5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метоксифенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-л]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-он.

В настоящее время гесперидин используется как венопротекторное и антиоксидантное средство. Опубликованы данные о возможности применения гесперидина при ревматоидном артрите; его способности снижать диастолическое давление и подавлять распространение и рост раковых клеток [Umar S., Kumar A., Sajad М., et al. Rheumatol. Int. 33: 657-663, 2013; Devi K.P., Rajavel Т., Nabavi S.F. Ind. Crop. Prod., 76: 582-589, 2015; Homayouni F., Haidari F., Hedayati M., et al. Phytother. Res., 32: 1073-1079, 2018].

Известно, что гесперидин может эффективно улавливать реакционноспособные соединения, такие, как глиоксаль и метилглиоксаль, образующиеся в организме при нарушениях метаболизма глюкозы вызванных возрастными изменениями или рядом заболеваний, включая диабет.Повышенная концентрация таких соединений приводит к повреждению и перекрестной сшивке белков, что может вызывать развитие катаракты, нефропатии, ретинопатии, и осложнений, связанных с атеросклерозом [Li D., Mitsuhashi S., Ubukata M. Pharmaceutical Biology, 50: 1531-1535, 2012].

Установлено также наличие антибактериальной и противогрибковой активности; иммуномодулирующего и противовирусного действия гесперидина [Abuelsaad A.S., Mohamed I., Allam G., et al. Life Sci. 93: 714-722,2013; Ilboudo O., Bonzi S., Tapsoba I., et. al. C.R. Chim. 19: 857-862, 2016; W. Dong, X. Wei, F. Zhang, et. al. Sci. Rep. 4: 7237, 2015]. Недавно опубликованные данные компьютерного моделирования свидетельствуют о том, что гесперидин может представлять интерес при разработке препаратов для профилактики и терапии короновирусной инфекции [Utomo R.Y., Ikawati М., Meiyanto Е. 12 March 2020, doi:10.20944/preprints202003.0214.v1].

Существенным недостатком гесперидина, ограничивающим возможности фармакологического применения, является его низкая растворимость в воде (1 г растворяется в 50 л воды). Поэтому был предпринят ряд попыток повысить растворимость гесперидина в водных средах и, соответственно, его биодоступность.

Так, растворимость гесперидина увеличивается приблизительно в 100 раз при добавлении 20% 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина, в результате образования нековалентного комплекса [Majumdar S., Srirangam R. Pharm. Res. 26: 1217-1225, 2009].

Использование микронизации (измельчения частиц до микронного размера, например, с помощью ультразвука) также позволяет повысить биодоступность и эффективность действия гесперидина [ L. Vnitr. Lek. 61(9): 807-814, 2015].

Тем не менее, и в том и в другом случае, возможности практического применения препарата остаются ограниченными, а стоимость лекарственной формы существенно возрастает.

Целью заявляемого изобретения является получение аналога гесперидина, обладающего хорошей растворимостью в водных средах в сочетании с устойчивостью в широком диапазоне значений рН и способностью улавливать различного рода повреждающие агенты такие, как реакционноспособные формы кислорода, восстанавливающие сахара, глиоксаль и метилглиоксаль.

Указанная цель достигается в результате синтеза (1-[(Е)-[5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-ил]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-илиден]амино]гуанидина, имеющего структурную формулу:

Аминогуанидин (2-аминогуанидин), имеющий структурную формулу:

был исследован в качестве потенциального лекарственного средства, препятствующего гликозилированию белков, препарат прошел две стадии клинических испытаний, однако дальнейшее тестирование было прервано по причине потенциальных побочных эффектов. Тем не менее, производные аминогуанидина по-прежнему рассматриваются в качестве перспективных соединений при скрининге новых лекарственных препаратов [Aldini G., Vistoli G., Stefek M., et al. Free Radic. Res., 47 (Suppl. 1): 93-137, 2013].

Включение в структуру заявляемого соединения гидрофильной гуанидиновой группы позволяет повысить растворимость препарата в воде и, вместе с тем не оказывает существенного влияния на антиоксидантную активность гесперидина и его способность улавливать реакционноспособные кето-производные. Более того, наличие аналогичной активности у аминогуанидина позволяет рассчитывать на проявление синергического действия [Courderot-Masuyer С, Dalloz F., Maupoil V., Rochette L. Fundam. Clin. Pharmacol. 13: 535-540, 1999].

Указанная цель достигается также способом получения (1-[(Е)-[5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-ил]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-илиден]амино]гуанидина путем взаимодействия гесперидина с гидрохлоридом аминогуанидина в органическом растворителе в присутствии соляной кислоты.

Синтез конъюгата гесперидина проводят в органическом растворителе, например, в диметилформамиде или диметилсульфоксиде, преимущественно в диметилформамиде.

Использование других, растворимых в указанных органических растворителях, солей аминогуанидина таких, например, как п-толуолсульфонат или тетрафенилборат приводит к значительному снижению выхода целевого продукта.

Один из вариантов получения водорастворимого (1-[(Е)-[5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-ил]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-илиден]амино]гуанидина (далее конъюгата гесперидина) приведен в примере 1.

Пример 1. Синтез конъюгата гесперидина с 2-аминогуанидином

Суспензию 2 г (14.69 мМ) бикарбоната аминогуанидина в воде нейтрализовали концентрированной соляной кислотой. Растворитель удаляли на роторном испарителе. К полученному кристаллическому гидрохлориду аминогуанидина при перемешивании добавляли раствор 5 г (8.19 мМ) гесперидина в 15 мл диметилформамида и 2 капли концентрированной соляной кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч и оставляли на 48 ч. Контроль за ходом реакции с помощью высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии показывает, что полнота превращения исходного гесперидина составляет не менее 80%. Растворитель удаляли на роторном испарителе, к образовавшемуся маслообразному остатку добавляли 100 мл изопропилового спирта и оставляли на ночь при комнатной температуре. Образовавшийся мелкий осадок отфильтровывали и промывали на фильтре диэтиловым эфиром. Продукт растворяли в кипящем этиловом спирте; нерастворимый осадок отфильтровывали, раствор охлаждали до комнатной температуры и оставляли на ночь в холодильнике. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывали, промывали на фильтре диэтиловым эфиром и высушивали в вакуум-эксикаторе. Получено 3 г (52%) продукта.

Полученный продукт, как и другие соединения данного класса, представляет собой смесь геометрических изомеров (син- и анти- формы), что подтверждается данными аналитической высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии. Выделение каждого из изомеров с последующим определением молекулярной массы с помощью масс-спектрометрии, дает один и тот же результат: 666.25 а.е.м., соответствующий расчетной величине. Структура полученного соединения подтверждена данными ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектроскопии.

Была определена растворимость полученного конъюгата в различных водных средах, включая физиологический раствор, буферные растворы и т.п., и она составляет 10-20 мг/мл, что значительно превосходит значения, приводимые в литературе для гесперидина (4.95 мкг/мл [Majumdar S., Srirangam R. Pharm. Res. 26: 1217-1225, 2009]). Таким образом, конъюгация с аминогуанидином позволяет увеличить растворимость препарата в 2000-4000 раз.

Пример 2. Исследование стабильности конъюгата гесперидина при различных значениях рН

Исследования стабильности конъюгата гесперидина проводили методом высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии. При этом продукт выдерживали в растворе при различных значениях рН и температуры:

1. 0.01 N HCl, рН 2.0; 37°С (модель среды желудка).

2. Водный раствор NaHCO₃, рН 8; 37°С (модель среды кишечника).

3. Фосфатно-солевой буфер, рН 7.4; 60°С.

4. Стерильный раствор 0.9% NaCl; 4°С и 30°С (возможные условия хранения препарата).

Результаты экспериментов приведены в таблицах ниже:

Полученные данные свидетельствуют о высокой стабильности конъюгата при значениях рН, характерных для среды, как желудка, так и кишечника, что косвенно свидетельствует о возможности его перорального применения. Вместе с тем, недостаточная устойчивость в физиологическом растворе указывает на невозможность длительного хранения водных растворов препарата и предпочтительность его применения в виде твердых лекарственных форм.

Пример 3. Исследование способности конъюгата гесперидина улавливать свободные радикалы

Для оценки антиоксидантной/антирадикальной активности препарата использовали метод колориметрия свободных радикалов, основанный на реакции радикала DPPH* (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), растворенного в диметилсульфоксиде, с антиоксидантом (АН) по схеме:

DPPH*+АН→DPPH-H+А*

В результате взаимодействия DPPH* с антиоксидантом снижается интенсивность пурпурно-синей окраски DPPH*. Ход реакции контролировали по изменению оптической плотности при 517 нм с помощью спектрофотометрии.

Антирадикальную активность (АРА) субстанции (конъюгата гесперидина) рассчитывали по формуле:

Полученные результаты представлены в таблице ниже:

Экспериментальные данные свидетельствуют о наличии у конъюгата гесперидина антирадикальной активности, которая, как минимум, не уступает активности исходного соединения. При этом хорошая растворимость конъюгата в воде (10-20 мг/мл, т.е. в 2000-4000 раз выше, по сравнению с гесперидином) существенно увеличивает его биодоступность.

Пример 4. Исследование способности конъюгата гесперидина предотвращать гликозилирование белков

Способность конъюгата гесперидина предотвращать модификацию белков под действием восстанавливающих Сахаров и продуктов их метаболизма, оценивали в экспериментах с бычьим сывороточным альбумином. Активность конъюгата оценивали при использовании раствора бычьего сывороточного альбумина (0.8 мг/мл) и 40%-ного раствора метилглиоксаля в фосфатно-солевом буфере. Поскольку гесперидин обладает крайне низкой растворимостью в водных средах, а применение высоких концентраций органических растворителей таких, как диметилсульфоксид, приводит к искажению результатов эксперимента, в качестве положительного контроля применяли раствор бикарбоната аминогуанидина в фосфатно-солевом буфере.

Исследуемые растворы инкубировали в закрытых пластиковых ампулах при 37°С, в термостате в течение 70 ч. Специфическую флуоресценцию модифицированного альбумина измеряли на флуориметре ClarioStar при длинах волн 325/440 нм, в соответствии с литературными данными [Sadowska-Bartosz I., Galiniak S., Bartosz G. Molecules 19: 4880-4896, 2014]. Каждая проба была измерена в 3-х повторностях. Полученные результаты приведены в таблице:

Экспериментальные данные свидетельствуют о способности конъюгата гесперидина связывать метилглиоксаль. При этом в дозе 10 мМ активность конъюгата превосходит эффективность действия аминогуанидина более, чем в 2 раза.

Таким образом, из приведенных выше данных следует, что заявляемый конъюгат гесперидина обладает высокой растворимостью и стабильностью в водных средах, не уступает гесперидину в способности улавливать свободные радикалы, а в тесте гликозилирования белков, в ряде случаев превосходит аминогуанидин. При этом способ его получения отличается простотой и сопровождается достаточно высоким выходом целевого продукта, что делает возможной организацию промышленного производства.

Изобретение относится к применимому в биомедицине (1-[(Е)-[5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-ил]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-илиден]амино]гуанидину, имеющему структурную формулу:

а также способу его получения. Способ осуществляют путем взаимодействия гесперидина с гидрохлоридом аминогуанидина в органическом растворителе в присутствии соляной кислоты. Предложено новое соединение, обладающее хорошей растворимостью в водных средах в сочетании с устойчивостью в широком диапазоне значений рН и способностью улавливать различного рода повреждающие агенты, такие как реакционно-способные формы кислорода, восстанавливающие сахара, глиоксаль и метилглиоксаль. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.

1. (1-[(Е)-[5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-ил]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-илиден]амино]гуанидин, имеющий структурную формулу:

2. Способ получения (1-[(Е)-[5-гидрокси-2-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-7-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-[[(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидропиран-2-ил]оксиметил]тетрагидропиран-2-ил]окси-хроман-4-илиден]амино] гуанидина путем взаимодействия гесперидина с гидрохлоридом аминогуанидина в органическом растворителе в присутствии соляной кислоты.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя использовали диметилформамид.