ОРТОГОНАЛЬНОЕ ДЕБЛОКИРОВАНИЕ НУКЛЕОТИДОВ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/6874 C12Q1/6876 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В общем, настоящее изобретение относится к анализу нуклеиновых кислот и, в частности, к секвенированию нуклеиновых кислот.

Коммерчески доступные в настоящее время платформы для секвенирования ДНК имеют относительно высокую стоимость. Эти платформы действуют по принципу "секвенирования синтезом", имеющим такое название из-за того, что в процессе синтеза ДНК полимеров производят обнаружение присоединения каждого мономера (т.е. нуклеотида) к растущей полимерной структуре. Поскольку синтез нового ДНК полимера жестко направляется цепочкой (также называемой нитью) матричной ДНК, последовательность матричной ДНК может быть выведена из серии нуклеотидных мономеров, которые присоединяются к растущей цепочке во время синтеза. Способность обнаруживать присоединение мономеров обеспечивается специально сконструированными вариантами биохимических компонентов, которые обычно осуществляют синтез ДНК в биологических системах. Конструирование таких компонентов имеет относительно высокую стоимость, и при секвенировании синтезом они расходуются в относительно больших количествах. Кроме того, для мониторинга реакции применяют относительно дорогостоящее оборудование, такое как лазеры, оптические системы обнаружения и сложные системы доставки текучих сред. В настоящее время, еще даже до начала проведения секвенирования синтезом, в наиболее успешно используемых коммерческих платформах требуется применение дорогостоящих реагентов и оборудования для амплификации ДНК матриц. Сложность и высокая стоимость этих платформ затрудняет их применение в некоторых клинических и исследовательских целях, для которых эта методика необходима.

Таким образом, существует необходимость усовершенствования платформ для секвенирования синтезом, которое позволит сделать их более экономичными, быстрыми и удобными. Настоящее изобретение направлено на введение таких усовершенствований, а также на достижение других полезных эффектов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу идентификации матриц на основе нуклеиновой кислоты. Способ может включать следующие этапы: (а) предоставление массива (множества) сайтов (участков), в котором каждый сайт включает смесь по меньшей мере двух различных матриц на основе нуклеиновой кислоты; (b) достройку (или удлинение; англ. extending) на каждом из сайтов праймеров, гибридизованных с этими различными матрицами на основе нуклеиновой кислоты, различными аналогами нуклеотидов, содержащими, соответственно, различные обратимо блокирующие группы, что приводит к образованию различных продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов; (с) обнаружение различных продуктов достройки праймера для распознавания различных аналогов нуклеотидов, находящихся на каждом сайте; и (d) удаление различных обратимо блокирующих групп с продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов, с помощью первой обработки, которая селективна по отношению к первому виду различных обратимо блокирующих групп, и второй обработки, которая селективна по отношению ко второму виду различных обратимо блокирующих групп. Необязательно, способ может дополнительно включать (е) повторение этапов (b)-(d) с целью определения последовательности различных аналогов нуклеотидов, присоединенных к каждому из различных продуктов достройки, находящихся на каждом из сайтов.

Изобретение также относится к способу секвенирования матриц на основе нуклеиновой кислоты, который может включать следующие этапы: (а) предоставление массива сайтов, в котором каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты, где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты, и где первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и при этом ко второму праймеру присоединена обратимо блокирующая группа; (b) достройку первого праймера посредством добавления первого аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе, причем обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому нуклеотиду, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру; (с) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена к аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру; (d) достройку второго праймера посредством добавления второго аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе, причем обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида; и (е) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов. Необязательно, способ может дополнительно включать следующие этапы: (f) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру; (g) после выполнения этапа (f) достройку первого праймера присоединением третьего аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе; (h) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру; (i) после выполнения этапа (h) достройку второго праймера присоединением четвертого аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе, в то время как обратимо блокирующая группа, которая присоединена к третьему аналогу нуклеотида, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена к четвертому аналогу нуклеотида; и (h) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру при проведении этапа (g), и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру при проведении этапа (i), на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов. Этапы (f)-(h) необязательно могут быть проведены повторно.

Изобретение также относится к способу секвенирования матриц на основе нуклеиновой кислоты, который может включать следующие этапы: (а) предоставление массива сайтов, в котором каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты, где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты; при этом первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и к первому праймеру присоединена обратимо блокирующая группа, а второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и ко второму праймеру присоединена обратимо блокирующая группа, причем обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому праймеру, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру; (b) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру; (с) достройку первого праймера посредством добавления первого аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе; (d) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена к аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру; (е) достройку второго праймера посредством добавления второго аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе, где обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида; и (f) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к массиву нуклеиновых кислот, который включает множество сайтов, находящихся на твердой подложке, причем каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты, где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты, и первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и при этом к первому праймеру присоединена первая обратимо блокирующая группа, второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, ко второму праймеру присоединена вторая обратимо блокирующая группа, и первая обратимо блокирующая группа отличается от второй обратимо блокирующей группы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 представлена диаграмма циклов секвенирования синтезом, выполняемого одновременно для смеси двух матриц на сайте массива, в котором субнаборы маркерных частиц и деблокирующих групп, которые присутствуют на одинаковых продуктах достройки, отщепляются одновременно.

На Фиг. 2 представлена диаграмма циклов секвенирования синтезом, выполняемого одновременно для смеси двух матриц на сайте массива, в котором маркерные частицы, которые присутствуют на различных продуктах достройки (т.е. получаемые как в реакции R1, так и реакции R2), отщепляются одновременно.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу обеспечения высокой плотности обнаружения (определения) нуклеиновых кислот. В конкретных примерах осуществления способов согласно настоящему изобретению применяют известные методики для манипуляций и обнаружения нуклеиновых кислот. Однако раскрытые ниже усовершенствования позволяют проводить ортогональную обработку, в результате которой плотность информации, получаемой с помощью созданных методик, повышается.

Повышение плотности информации, которое может быть достигнуто, показано в примере методики обнаружения, основанной на достройке праймера. В частности, целевая последовательность нуклеиновой кислоты может быть гибридизована с праймером, и праймер достроен ДНК-полимеразой, которая добавляет меченый аналог нуклеотида. Для этой цели может быть применен формат массива, включающего множество сайтов, где каждый сайт включает единственную целевую последовательность, которая отличается от целевых последовательностей, находящихся на других сайтах. Необязательно также используют несколько различных видов аналогов нуклеотидов, каждый из которых имеет распознаваемую метку. Достройка праймера приводит к рекрутингу меченого аналога нуклеотида в нуклеиновую кислоту, имеющую целевую последовательность. В формате массива, в котором применяют различные меченые аналоги нуклеотидов, можно проводить распознавание метки, накопленной на каждом сайте, и использовать эту информацию для идентификации целевой нуклеиновой кислоты, находящейся на этом сайте. Плотность информации, получаемой из такого формата массива, составляет одну идентифицированную целевую последовательность на сайт.

В ортогональном формате согласно настоящему изобретению каждый сайт массива может содержать смесь двух или более различных целевых последовательностей, которые одновременно обрабатывают (например, химическими реагентами или с помощью физических манипуляций) и одновременно наблюдают (например, с помощью детектора, разрешение которого слишком мало для пространственного разрешения нуклеиновых кислот в смеси). Тем не менее, с помощью ортогональных обработок, рассмотренных в настоящей работе, осуществляют дифференцирующее воздействие, которое позволяет отличать друг от друга различные целевые последовательности. В этом случае информация, полученная от массива, может быть по меньшей мере удвоена. Два различных праймера могут быть доставлены в массив, и, благодаря дифференциальной комплементарности, на каждом индивидуальном сайте они будут гибридизоваться с двумя различными матричными последовательностями, соответственно. Первый праймер может содержать первую обратимо блокирующую группу, которая предотвращает его достройку до проведения первой деблокирующей обработки, а второй праймер может содержать вторую обратимо блокирующую группу, которая предотвращает его достройку до проведения второй деблокирующей обработки. В этом примере первая деблокирующая обработка селективна по отношению к первой обратимо блокирующей группе по сравнению со второй обратимо блокирующей группой, а вторая деблокирующая обработка селективна по отношению ко второй обратимо блокирующей группе по сравнению с первой обратимо блокирующей группой. Способность к селективному деблокированию обеспечивает ортогональность, то есть, несмотря на то, что праймеры подвергаются каждой деблокирующей обработке, они могут быть индивидуально модифицированы для проведения достройки и обнаружения. Таким образом, два праймера и, что более важно, матрицы, которые направляют их достройку, могут быть распознаны с помощью такого химического переключения, даже несмотря на то, что сами молекулы могут быть не разделены в степени, достаточной для пространственного распознавания с помощью применяемой системы обнаружения.

Концепция ортогональности, пример которой рассмотрен выше при описании методики обнаружения, основанной на достройке праймера, может быть с успехом применена в методике секвенирования синтезом (англ. sequencing by synthesis, сокращенно SBS). Один из примеров диаграммы циклов ортогонального SBS для двух матриц (R1 и R2), находящихся на сайте, представлен на Фиг. 1. В первой колонке диаграммы представлена обработка, которой подвергается массив (т.е. обе матрицы подвергаются обработке). Во второй и третьей колонках представлено воздействие обработки на первую матрицу и вторую матрицу, соответственно. В первом этапе первого цикла смесь праймеров вводят в контакт с массивом, что приводит к гибридизации с соответствующими сайтами связывания праймера. После выполнения этапа 1 праймер R1, который гибридизован с матрицей R1 блокируется блоком 1, но у праймера R2 блокирующая группа отсутствует (необязательно праймер R2 может быть заблокирован группой для ортогональной блокировки, блоком 2). Таким образом, могут быть произведены отдельные достройки праймеров. Например, при выполнении второго этапа первого цикла, нуклеотид, имеющий блок 2 и метку 2, доставляют в массив, что приводит к селективной достройке незаблокированного праймера R2 (т.е. праймер R1 не достраивается). Затем, при выполнении третьего этапа первого цикла, массив может быть подвергнут обработке, при которой происходит селективное деблокирование праймера R1, например, посредством отщепления блока 1 (т.е. блок 2 не отщепляется). При выполнении четвертого этапа первого цикла нуклеотид, имеющий блок 1 и метку 1, направляют в массив, что приводит к селективной достройке незаблокированного праймера R1 (т.е. праймер R2 не достраивается). Затем массив может быть исследован с помощью устройства обнаружения, позволяющего различать на каждом сайте две метки. Как показано на Фиг. 1, циклы доставки заблокированных и меченых нуклеотидов, отщепления блокирующих групп и меток и обнаружения могут быть многократно полностью повторены.

Как показано в примере, представленном выше и на Фиг. 1, аналоги нуклеотидов, которые применяют для достройки праймеров, могут включать обратимо блокирующие группы, которые могут быть селективно отщеплены, что обеспечивает ортогональное регулирование при проведении множества циклов способа секвенирования синтезом. Таким образом, аналоги нуклеотидов могут быть предоставлены в виде двух групп: первой группы, включающей первую обратимо блокирующую группу (например, идентичную обратимо блокирующей группе на первом праймере, блок 1), и второй группы, включающей вторую обратимо блокирующую группу (например, блок 2). В некоторых примерах осуществления аналоги нуклеотидов первой группы могут иметь метки, отличающиеся от меток, имеющихся на аналогах нуклеотидов второй группы (например, на Фиг. 1 показано, что первая группа имеет метку 1, и вторая группа имеет метку 2). Получаемая ортогональность способности к биохимическим реакциям и управление метками позволяет отличать друг от друга два события достройки праймера на каждом сайте массива. Таким образом, при обнаружении двух целевых последовательностей, их можно отличить друг от друга.

Следует понимать, что ортогональные воздействия и обнаружение также могут быть с успехом применены в других способах, что более подробно рассмотрено ниже. Таким образом, композиции, установка и способы, рассмотренные в настоящей работе, не ограничиваются областью секвенирования.

Ортогональность может быть применена для увеличения плотности сбора информации в 2 раза или более. Например, плотность информации может быть увеличена более чем в 2 раза при использовании более двух наборов ортогональных реагентов. Например, могут быть использованы 3 набора реагентов, обеспечивающих 3 различных деблокирующих обработки, каждая из которых селективна для праймеров и/или аналогов нуклеотидов одного из наборов реагентов.

Как указано выше и как более подробно рассмотрено ниже, полезный эффект настоящего изобретения состоит в сверхвысоком разрешении, достигаемом при визуализации массива, что позволяет одновременно отображать более одной целевой последовательности на данном сайте. Полезным эффектом визуализации со сверхвысоким разрешением может быть одновременное распознавание нескольких различных целевых нуклеиновых кислот, количество которых превышает количество сайтов в массиве. Аналогично, при наличии сверхвысокого разрешения можно различить две различные целевые последовательности на твердофазной подложке с помощь детектора, разрешение которого ниже пространственного разрешения, которое в противном случае требовалось бы для распознавания двух целевых последовательностей, находящихся на подложке.

Конкретные примеры осуществления настоящего изобретения относятся к конфигурациям реагентов и аппаратного обеспечения, предназначенным для эффективного обнаружения (определения) нуклеиновых кислот. В одном из примеров конфигурации количество меток меньше количества разновидностей аналогов нуклеотидов, которые необходимо распознать в этапе достройки праймера. Например, на основании обнаружения одного вида метки могут быть распознаны четыре разновидности аналога нуклеотида. Как более подробно рассмотрено ниже, это может быть осуществлено с помощью первого набора аналогов нуклеотидов, который включает следующие четыре вида частиц: (1) вид частиц, имеющих первую метку, (2) вид частиц, имеющих лиганд, (3) вид частиц, имеющих расщепляемое соединение с первой меткой, и (4) вид частиц, не имеющих ни метки, ни лиганда, применяемых в последующем этапе, где все четыре вида частиц имеют блокирующую группу, которая подвергается селективной деблокировке при первой обработке. Ортогональный набор аналогов нуклеотидов может включать следующие четыре вида частиц: (5) вид частиц, имеющих вторую метку, (6) вид частиц, имеющих смесь первой и второй меток, (7) вид частиц, имеющих расщепляемое соединение со второй меткой, и (8) вид частиц, не имеющих ни метки, ни лиганда, применяемых в последующем этапе, где все четыре вида частиц имеют блокирующую группу, которая подвергается селективной деблокировке при второй обработке. В частности, первая обработка не приводит к существенному деблокированию первого набора аналогов нуклеотидов, а вторая обработка не приводит к существенному деблокированию ортогонального набора аналогов нуклеотидов.

Виды частиц в каждом наборе, указанном выше, можно отличать друг от друга на основании правильного учета того, какая из меток появляется или исчезает после проведения определенных этапов обработки в текучей среде, и два ортогональных набора аналогов нуклеотидов могут быть распознаны с помощью двух различных меток. В частности, виды (1) и (5) частиц можно отличить друг от друга с помощью различных меток, и их можно отличить от всех других видов частиц по их появлению после проведения начального этапа мечения и по их устойчивости к соответствующему отщепляющему агенту; вид (2) частиц можно распознать на основании появления метки после инкубации с меченым рецептором; виды (3) и (7) частиц можно отличить друг от друга с помощью различных меток, и их можно отличить от всех других видов частиц по начальному появлению метки и ее последующему исчезновению после обработки соответствующим отщепляющим реагентом; вид (6) частиц можно отличить от всех других видов по присутствию обеих меток с интенсивностью сигнала, составляющей половину интенсивности полностью меченого вида частиц; и виды (4) и (8) частиц можно отличить на основании заключения об отсутствии любого другого вида частиц в соответствующих уже исследованных наборах. Для изменения количества меток, количества манипуляций с текучими средами при проведении операции обнаружения и/или для изменения сложности устройства обнаружения с целью распознавания определенного количества меток может быть применено множество других возможных конфигураций. Таким образом, конфигурация может быть адаптирована для обеспечения требований конкретного подхода или применения.

Если не указано иное, термины, употребляемые в настоящем описании, имеют свои обычные значения. Примеры некоторых терминов и их определения приведены ниже.

Используемый в настоящем описании термин "ампликон", относящийся к нуклеиновой кислоте, означает продукт копирования нуклеиновой кислоты, причем продукт имеет нуклеотидную последовательность, совпадающую или комплементарную по меньшей мере части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты. Ампликон может быть получен любым из множества способов амплификации, в которых в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту или ее ампликон, и которые включают, например, полимеразное удлинение (достройку), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию по типу катящегося кольца (также называемую рамификацией, англ. rolling circle amplification, сокращенно RCA), удлинение лигированием или цепную реакцию лигирования. Ампликон может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую единственную копию определенной нуклеотидной последовательности (например, продукт ПЦР) или множество копий нуклеотидной последовательности (например, конкатамерный продукт RCA). Первый ампликон целевой нуклеиновой кислоты обычно представляет собой комплементарную копию. Последующие ампликоны представляют собой копии, которые создаются после генерации первого ампликона из целевой нуклеиновой кислоты или из ампликона. Последующий ампликон может иметь последовательность, по существу комплементарную целевой нуклеиновой кислоте или по существу идентичную целевой нуклеиновой кислоте.

Используемый в настоящем описании термин "массив" относится к популяции сайтов, которые могут быть отличены друг от друга по их относительному местонахождению. Различные молекулы или другие объекты, находящиеся в различных сайтах массива, можно отличить друг от друга по локализации сайтов в массиве. Индивидуальный сайт массива может включать одну или более молекул конкретного типа. Например, сайт может включать единственную молекулу целевой нуклеиновой кислоты, содержащую конкретную последовательность, или сайт может включать несколько молекул нуклеиновых кислот, содержащих одинаковую последовательность (и/или комплементарную ей последовательность). В альтернативном варианте сайт может включать смесь последовательностей целевых нуклеиновых кислот, где, например, каждая из индивидуальных молекул содержит две или более различных молекулы, или каждая из двух или более молекул содержит единственную целевую последовательность в смеси. Сайтами массива могут быть различные элементы, локализованные на одной подложке. Примеры элементов включают, без ограничений, лунки в подложке, гранулы (или другие частицы) в или на подложке, выступы на подложке, выступающие ребра на подложке или каналы в подложке. Сайты массива могут представлять собой отдельные подложки, на каждой из которых находится определенная молекула. Различные молекулы, присоединенные к отдельным подложкам, могут быть идентифицированы по местонахождениям подложек на поверхности, с которой эти подложки связаны, или по местонахождениям подложек в жидкости или геле. Примеры массивов, в которых отдельные подложки расположены на поверхности, включают, без ограничений, подложки, содержащие гранулы в лунках.

Используемый в настоящем описании термин "присоединенный" означает состояние двух предметов, которые объединены, скреплены, склеены, соединены или связаны друг с другом. Например, анализируемое вещество, такое как нуклеиновая кислота, может быть присоединено к материалу, такому как гель или твердая подложка, ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется обобществлением пар электронов между атомами. Нековалентная связь представляет собой химическую связь, которая не включает обобществления пар электронов и может включать, например, водородные связи, ионные связи, ван дер Ваальсовы силы, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия. Нуклеиновая кислота может быть присоединена к твердой подложке с помощью гелевого покрытия, нанесенного на твердую подложку.

Используемый в настоящем описании в отношении аналога нуклеотида термин "блокирующая группа" означает часть аналога нуклеотида, которая ингибирует или предотвращает образование ковалентной связи между этим аналогом нуклеотида и вторым аналогом нуклеотида. Например, в случае аналогов нуклеотидов, содержащих пентозный фрагмент, блокирующая группа может предотвращать образование фосфодиэфирной связи между атомом кислорода в положении 3' аналога нуклеотида и фосфатом в положении 5' второго аналога нуклеотида. Блокирующая группа может представлять собой часть аналога нуклеотида, которая представляет собой мономерную единицу, присутствующую в полимере, образованном нуклеиновой кислотой, или блокирующая группа может представлять собой часть свободного (несвязанного) аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата). Блокирующая группа, которая является частью аналога нуклеотида, может быть обратимо присоединяемой, то есть блокирующая группа может быть удалена или модифицирована, что позволяет аналогу нуклеотида образовывать ковалентную связь со вторым аналогом нуклеотида. Особенно подходящими обратимо блокирующими частицами являются фосфаты, сложные фосфоэфиры, алкилазиды, ацетали, сложные эфиры, простые эфиры или подобные частицы. Дополнительные примеры обратимо блокирующих групп, которые могут быть использованы, приведены ниже и в цитируемой литературе, включенной в настоящее описание посредством ссылки, приводимой ниже. В определенных примерах осуществления блокирующая группа, такая как обратимо блокирующая группа, может быть присоединена к 3'-положению или 2'-положению пентозного фрагмента аналога нуклеотида.

Используемый в настоящем описании в отношении нуклеиновых кислот термин "кластер" относится к популяции нуклеиновых кислот, которая присоединена к твердой подложке с образованием элемента или сайта. Нуклеиновые кислоты обычно относятся к одному виду, то есть образуют гомогенный кластер. Однако в некоторых примерах осуществления нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными, то есть на сайте или элементе присутствуют индивидуальные молекулы, имеющие различные последовательности. Нуклеиновые кислоты обычно ковалентно присоединены к твердой подложке, например, через 5'-концы, но в некоторых случаях возможны другие средства присоединения. Нуклеиновые кислоты в кластере могут быть одноцепочечными (однонитевыми) или двухцепочечными (двухнитевыми). В некоторых, но не во всех примерах осуществления кластеры получены способом твердофазной амплификации, известным под названием мостиковой амплификации. Примеры конфигураций кластеров и способов их получения приведены, например, в патенте US 5641658, опубликованной патентной заявке US 2002/0055100, патенте US 7115400, опубликованной патентной заявке US 2004/0096853, опубликованной патентной заявке US 2004/0002090, опубликованной патентной заявке US 2007/0128624 и опубликованной патентной заявке US 2008/0009420, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Используемый в настоящем описании термин "деблокирующий агент" означает катализатор, фермент, реагент или другое вещество, способное модифицировать или удалять блокирующую группу. В определенных примерах осуществления деблокирующий агент может обладать специфичностью по отношению к конкретной блокирующей группе. Таким образом, деблокирующий агент может удалять конкретную блокирующую группу из аналога нуклеотида селективно по сравнению с другой блокирующей группой. Примеры деблокирующих агентов включают, без ограничений, фермент, такой как фосфоэстераза, эстераза, алкилтрансфераза или метилтрансфераза; или химический реагент, такой как фосфин, протон, или химический катализатор, такой как палладиевый катализатор, или подобные вещества. Дополнительные примеры деблокирующих агентов более подробно рассмотрены ниже.

Используемый в настоящем описании в отношении нуклеиновых кислот термин "различный" означает, что нуклеиновые кислоты содержат неодинаковые нуклеотидные последовательности. Две или более нуклеиновые кислоты могут иметь нуклеотидные последовательности, различающиеся на протяжении всей их длины. В альтернативном варианте две или более нуклеиновые кислоты могут иметь нуклеотидные последовательности, различающиеся на существенной части их длины. Например, две или более нуклеиновые кислоты могут иметь целевые части нуклеотидных последовательностей, которые отличаются друг от друга, но при этом также имеют универсальную часть последовательности, одинаковую для двух или более молекул. Обычно, если два вида частиц обозначены в настоящем описании как "различные", то один из видов частиц будет иметь структурное свойство, отличающееся от структурных свойств второго вида частиц. Например, два различных вида полимерных частиц (таких как два белка) могут иметь различные последовательности мономерных субъединиц (таких как различные последовательности аминокислот в двух различных белках).

Используемый в настоящем описании в отношении группы объектов термин "каждый" предназначен для идентификации индивидуального объекта в группе, но не обязательно означает каждый объект в группе. Исключения относятся к тем случаям, если из описания или контекста очевидно иное.

Используемый в настоящем описании термин "нуклеиновая кислота" имеет значение, соответствующее его значению в данной области техники, и включают встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты или их функциональные аналоги. Особенно полезные функциональные аналоги способны гибридизоваться с нуклеиновой кислотой в соответствии с последовательностью или могут применяться в качестве матрицы для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты обычно имеют основную цепь, содержащую сложные фосфодиэфирные связи. В структуре аналога могут находиться альтернативные связи основной цепи, включающие любые из множества связей, известных в данной области техники. Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты обычно включают дезоксирибозный сахар (например, находящийся в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК)) или рибозный сахар (например, находящийся в рибонуклеиновой кислоте (РНК)). Нуклеиновая кислота может содержать любой из множества аналогов фрагментов указанных Сахаров, которые известны в данной области техники. Нуклеиновая кислота может включать природные или не встречающиеся в природе основания. В этом отношении природная дезоксирибонуклеиновая кислота может содержать одно или более оснований, выбранных из группы, состоящей из аденина, тимина, цитозина или гуанина, а рибонуклеиновая кислота может содержать одно или более оснований, выбранных из группы, состоящей из урацила, аденина, цитозина или гуанина. Подходящие не встречающиеся в природе основания, которые могут быть включены в нуклеиновую кислоту, известны в данной области техники. Термин "целевой", используемый в отношении нуклеиновой кислоты, означает семантический идентификатор нуклеиновой кислоты в контексте описания способа или композиции, рассмотренных в настоящей работе, и не обязательно ограничивает структуру или функцию нуклеиновой кислоты сверх того, что указано в предлагаемом описании.

Используемый в настоящем описании термин "матрица на основе нуклеиновой кислоты" относится к нуклеиновой кислоте или ее части, которая может быть использована в качестве направляющей последовательности для репликации, катализируемой полимеразой. Во всей длине молекулы нуклеиновой кислоты может содержаться множество матриц, или в альтернативном варианте в определенных примерах осуществления изобретения может быть использована только одна матрица на одну молекулу. Матрица на основе нуклеиновой кислоты также может служить направляющей последовательностью для достройки праймера, катализируемой лигазой.

Используемый в настоящем описании термин "нуклеотид" или "аналог нуклеотида" включает природные нуклеотиды, неприродные нуклеотиды, рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды и другие молекулы, известные как нуклеотиды. Например, используемые в настоящем описании термины обычно относятся к нуклеозидному фрагменту (как рибозы, так и дезоксирибозы или ее аналогу), включающему фрагмент основания и необязательно присоединенному к одному или более фосфатному фрагменту. Этот термин может быть применен для обозначения мономерной единицы, присутствующей в полимере, например, для обозначения субъединицы, находящейся в цепочке ДНК или РНК. Термин также может быть применен для обозначения мономерной молекулы, которая не обязательно присутствует в полимере, например, молекулы, которая может быть встроена под действием полимеразы в полинуклеотид в соответствии с направляющей ролью матрицы.

Примеры аналогов нуклеотидов включают, без ограничений, рибонуклеотидмонофосфат (иногда называемый рибонуклеозидмонофосфатом), рибонуклеотиддифосфат (иногда называемый рибонуклеозиддифосфатом), рибонуклеотидтрифосфат (иногда называемый рибонуклеозидтрифосфатом), дезоксинуклеотидмонофосфат (иногда называемый дезоксинуклеозидмонофосфатом), дезоксинуклеотиддифосфат (иногда называемый дезоксинуклеозиддифосфатом) и дезоксинуклеотидтрифосфат (иногда называемый дезоксинуклеозидтрифосфатом). Для ясности, в тех случаях, когда необходимо отличить компоненты РНК от компонентов ДНК, для обозначения РНК нуклеотидов может быть использован термин "рибонуклеотид", такой как рибоуридинтрифосфат, рибогуанидинтрифосфат, рибоцитидинтрифосфат или рибоаденозинтрифосфат, а для обозначения ДНК нуклеотидов может быть использован термин "дезоксинуклеотид", такой как дезокситимидинтрифосфат, дезоксигуанидинтрифосфат, дезоксицитидинтрифосфат и дезоксиаденозинтрифосфат.В определенных примерах осуществления нуклеотиды "способны к удлинению", например, не имеют группы, блокирующей достройку, у 3'-гидроксила или в любом другом положении в молекуле нуклеотида. В других примерах осуществления нуклеотиды "блокированы" и включают группу, которая предотвращает участие 3'-положения в достройке посредством присоединения другого нуклеотида или олигонуклеотида.

Используемый в настоящем описании термин "шаг" означает расстояние от центра до центра, определяемое для двух соседних сайтов массива. Схема расположения сайтов может быть регулярной, и в этом случае коэффициент вариации среднего шага невелик, или схема расположения сайтов может быть нерегулярной, и в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере 10 нм, 0,1 мкм, 0,5 мкм, 1 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно средний шаг может составлять, например, не более 100 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм 0,1 мкм или менее. Разумеется, средний шаг в конкретной схеме расположения сайтов может составлять величину, находящуюся между одним из меньших значений и одним из больших значений, выбранных из приведенных выше диапазонов.

Используемый в настоящем описании термин "праймер" означает нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, которая связывается с сайтом связывания праймера на или вблизи матричной последовательности. Обычно праймер связывается в конфигурации, которая допускает протекание репликации матрицы, например, через полимеразную достройку праймера. Праймер может представлять собой первую часть молекулы нуклеиновой кислоты, которая связывается со второй частью молекулы нуклеиновой кислоты, где первая часть представляет собой последовательность праймера, а вторая часть представляет собой последовательность связывания праймера (например, праймер, содержащий шпилькообразную структуру). В альтернативном варианте праймер может представлять собой первую молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывается со второй молекулой нуклеиновой кислоты, включающей матричную последовательность. Праймер может состоять из ДНК, РНК или их аналогов.

Используемый в настоящем описании термин "продукт достройки праймера" означает праймер, который был модифицирован присоединением по меньшей мере одного аналога нуклеотида. Например, праймер может быть модифицирован посредством присоединения одного или более аналогов нуклеотида к 3'-концу праймера (например, при катализирующем действии полимеразы), в результате чего образуется продукт достройки праймера. В альтернативном варианте продукт достройки праймера может быть получен связыванием (лигированием) олигонуклеотида с 3'- или 5'-концом праймера. В этом случае продукт достройки праймера достроен на длину, эквивалентную длине олигонуклеотида. Продукт достройки праймера может быть длиннее праймера по меньшей мере на 1, 2, 5, 10, 500, 1000 или более нуклеотидов. В альтернативном варианте или дополнительно продукт достройки праймера может быть длиннее праймера не более чем на 1, 2, 5, 10, 500 или 1000 нуклеотидов. Например, применение блокированного аналога нуклеотида позволяет получить продукт достройки, который по меньшей мере на 1 нуклеотид длиннее праймера, а также не более чем на 1 нуклеотид длиннее праймера.

Используемый в настоящем описании термин "селективное" манипулирование ("селективная" манипуляция) первым предметом по сравнению со вторым предметом означает, что манипулирование оказывает более сильное воздействие на первый предмет по сравнению с воздействием, оказываемым на второй предмет. Манипуляция не обязательно оказывает воздействие на второй предмет. Манипуляция может оказывать воздействие на первый предмет, которое по меньшей мере на 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% или 99% более эффективно, чем воздействие на второй предмет.Манипуляция может оказывать воздействие на первый предмет, которое по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 100 раз, 1×10³ раз, 1×10⁴ раз или 1×10⁶ раз более эффективно, чем воздействие на второй предмет.Манипуляция может включать, например, модификацию, контакт, обработку, изменение, расщепление (например, химической связи), фотохимическое расщепление (например, химической связи), образование (например, химической связи), фотохимическое образование (например, химической связи), ковалентную модификацию, нековалентную модификацию, разрушение, фотоабляцию, удаление, синтез, полимеризацию, фотополимеризацию, амплификацию (например, нуклеиновой кислоты), копирование (например, нуклеиновой кислоты), удлинение (например, нуклеиновой кислоты), лигирование (например, нуклеиновой кислоты) или другие манипуляции, рассмотренные в настоящей работе или известные в данной области техники.

Используемый в настоящем описании в отношении нуклеиновой кислоты термин "последовательность" означает порядок нуклеотидов (или оснований) в нуклеиновых кислотах. В тех случаях, в которых в нуклеиновой кислоте присутствуют различные виды нуклеотидов, последовательность включает идентификацию вида нуклеотида (или основания) в соответствующих положениях нуклеиновой кислоты. Последовательность является свойством всей или части молекулы нуклеиновой кислоты. Этот термин может быть аналогично использован для описания порядка и идентификации положения мономерных звеньев в других полимерах, таких как аминокислоты, представляющие собой мономерные единицы белковых полимеров.

Используемый в настоящем описании термин "сайт" означает местоположение в массиве, в котором присутствует по меньшей мере одна молекула анализируемого вещества (аналита, англ. analyte). Сайт может содержать только одну молекулу анализируемого вещества, или он может содержать популяцию из нескольких молекул анализируемого вещества одного вида. В некоторых примерах осуществления сайт может включать множество различных типов молекул анализируемого вещества, и каждый тип присутствует в виде одной или более копий. Обычно сайты массива дискретны. Дискретные сайты могут быть расположены непрерывно, или между ними могут располагаться промежутки.

Используемый в настоящем описании термин "вид частиц (или вид, англ. species)" или "тип" применяют для идентификации молекул, обладающих одинаковой химической структурой. Например, смесь аналогов нуклеотидов может включать несколько молекул dCTP (дезоксицитидинтрифосфата, сокращенно от англ. deoxycytidine triphosphate). Очевидно, что все молекулы dCTP представляют собой один и тот же вид или тип частиц, но они относятся к частицам другого вида или типа по сравнению с молекулами dATP (дезоксиаденозинтрифосфата, сокращенно от англ. deoxyadenosine triphosphate), dGTP (дезоксигуанозинтрифосфата, сокращенно от англ. deoxyguanosine triphosphate), dTTP (дезокситимидинтрифосфата, сокращенно от англ. deoxythymidine triphosphate) и т.д. Аналогично, индивидуальные молекулы ДНК, которые имеют одну и ту же последовательность нуклеотидов, относятся к одному виду или типу частиц, в то время как молекулы ДНК, имеющие различные последовательности, относятся к разным видам или типам частиц. В другом примере ДНК-полимераза -это вид или тип полимеразы, который отличается от РНК-полимеразы (даже в том случае, если обе эти полимеразы получены из одного организма).

Используемый в настоящем описании термин "универсальная последовательность" относится к последовательности, одинаковой для двух или более молекул нуклеиновых кислот, даже если эти молекулы также содержат отличающиеся друг от друга области последовательностей. Универсальная последовательность, которая присутствует в различных членах группы молекул, позволяет улавливать множество различных нуклеиновых кислот с помощью популяции универсальных нуклеиновых кислот захвата, которые комплементарны универсальной последовательности. Аналогично, универсальная последовательность, которая присутствует в различных членах группы молекул, позволяет производить репликацию или амплификацию множества различных нуклеиновых кислот с помощью популяции универсальных праймеров, которые комплементарны универсальной последовательности. Таким образом, универсальная нуклеиновая кислота захвата или универсальный праймер включает последовательность, которая может специфично гибридизоваться с универсальной последовательностью. Молекулы целевой нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы для прикрепления универсальных адапторов, например, к одному или к обоим концам различных целевых последовательностей.

Представленные ниже и раскрытые в пунктах формулы изобретения примеры осуществления могут быть поняты с учетом приведенных выше определений.

Настоящее изобретение относится к способу секвенирования матриц на основе нуклеиновых кислот. Способ может включать следующие этапы: (а) предоставление массива сайтов, в котором каждый сайт включает смесь по меньшей мере двух различных матриц на основе нуклеиновой кислоты; (b) достройку праймеров, гибридизованных с различными матрицами на основе нуклеиновой кислоты на каждом из сайтов различными аналогами нуклеотидов, содержащими, соответственно, различные обратимо блокирующие группы, что приводит к образованию различных продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов; (с) обнаружение различных продуктов достройки праймера для распознавания различных аналогов нуклеотидов, находящихся на каждом сайте; (d) удаление различных обратимо блокирующих групп с продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов, с помощью первой обработки, которая селективна по отношению к первому виду различных обратимо блокирующих групп, и второй обработки, которая селективна по отношению ко второму виду различных обратимо блокирующих групп; и (е) повторение этапов (b)-(d) с целью определения последовательности различных аналогов нуклеотидов, присоединенных к каждому из различных продуктов достройки, находящихся на каждом из сайтов.

Как указано выше, способ согласно настоящему изобретению может включать этап предоставления первой и второй матриц на основе нуклеиновой кислоты, причем последовательности этих двух матриц различны. Две матричные последовательности могут быть частями одной молекулы нуклеиновой кислоты, или в альтернативном варианте две матричные последовательности могут находиться в различных молекулах. Как более подробно указано в другой части настоящего описания, две матричные последовательности могут быть расположены настолько близко, что их пространственное разрешение с помощью системы обнаружения невозможно. Тем не менее, способы ортогонального обнаружения согласно настоящему изобретению позволяют распознавать такие матричные последовательности. Схема ортогонального обнаружения рассмотрена на примере двух матричных последовательностей, но она может быть применена для исследования двух или более матричных последовательностей. Соответственно, система или способ, рассмотренные в настоящей работе, могут включать по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10 или более матричных последовательностей, расположенных очень близко друг к другу, например, в одной молекуле нуклеиновой кислоты, на одном сайте массива или иным образом, настолько близко друг к другу, что их пространственное разрешение с помощью системы обнаружения невозможно.

Целевые нуклеиновые кислоты, применяемые согласно изобретению, могут состоять из ДНК, РНК или их аналогов. Источником целевых нуклеиновых кислот может быть геномная ДНК, информационная РНК или другие нуклеиновые кислоты из природных источников. В некоторых случаях целевые нуклеиновые кислоты, полученные из таких источников, перед применением в способе или композиции согласно изобретению могут быть подвергнуты амплификации.

Примеры биологических образцов, из которых могут быть получены целевые нуклеиновые кислоты, включают, например, образцы, отобранные из организма млекопитающего, такого как грызун, мышь, крыса, кролик, морская свинка, копытное, лошадь, овца, свинья, коза, корова, кошка, собака, примат, примат-человек или примат-нечеловек; растения, такого как Arabidopsis thaliana, кукуруза, сорго, овес, пшеница, рис, канола или соевые бобы; водорослей, таких как Chlamydomonas reinhardtii; нематоды, такой как Caenorhabditis elegans; насекомого, такого как Drosophila melanogaster, комар, плодовая мушка, медоносная пчела или паук; рыбы, такой как данио; рептилии; амфибии, такой как лягушка или Xenopus laevis; dictyostelium discoideum; грибков, таких как Pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, дрожжи, Saccharamoyces cerevisiae vim Schizosaccharomyces pombe; или Plasmodium falciparum. Целевые нуклеиновые кислоты также могут быть получены из прокариота, такого как бактерия, Escherichia coli, staphylococci или mycoplasma pneumoniae; простейшего; вируса, такие как вирус гепатита С или вирус иммунодефицита человека; или вироида. Целевые нуклеиновые кислоты могут быть получены из гомогенной культуры или популяции перечисленных выше организмов или в альтернативном варианте из группы нескольких различных организмов, например, из сообщества или экосистемы. Нуклеиновые кислоты могут быть выделены способами, известными в данной области техники, которые включают, например, способы, рассмотренные в следующих публикациях: Sambrook с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство), 3-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001) или Ausubel с соавт., Current Protocols in Molecular Biology (Современные протоколы в молекулярной биологии), John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1998), содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

В определенных примерах осуществления образец нуклеиновой кислоты может быть модифицирован или подготовлен для применения в одном или более способах, рассмотренных в настоящей работе. В некоторых случаях к нуклеиновой кислоте желательно добавить один или более сайтов связывания праймера. Для введения сайтов связывания праймера против хода транскрипции относительно соответствующих матричных последовательностей, например, посредством введения адаптора, имеющего сайт связывания праймера, мутации, приводящей к образованию сайта связывания праймера, лигирования адаптора, имеющего сайт связывания праймера, и т.д., могут быть применены известные методики молекулярной биологии. Подходящие способы рассмотрены в публикации Sambrook с соавт., см. выше, и в публикации Ausubel с соавт., см. выше. В опубликованной патентной заявке US 2015/0031560 А1 (содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки) приведен иллюстративный пример методики на основе тагментации, предназначенной для введения сайтов связывания праймера. Тагментация особенно подходит для введения одного или более сайтов связывания праймера и может быть выполнена, например, в соответствии с методиками, представленными в патентах US 6294385 и US 8383345 и опубликованной патентной заявке РСТ WO 2012/106546, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки. Следует понимать, что в некоторых случаях встречающиеся в природе области последовательности, расположенные против хода транскрипции относительно соответствующих матричных последовательностей, могут служить сайтами связывания праймера для способа, рассмотренного в настоящей работе. Способы, аналогичные рассмотренным выше в отношении сайтов связывания праймера, могут быть применены для введения других требуемых элементов последовательности, таких как элементы-промоторы для достройки с участием РНК-полимеразы или последовательности меток.

Универсальные примирующие (от англ. priming) сайты особенно подходят для мультиплексных вариантов применения способов, рассмотренных в настоящей работе. Универсальные примирующие сайты предоставляют область последовательности, одинаковую для двух или более молекул нуклеиновых кислот, причем эти молекулы также включают матричные или целевые области с различающимися последовательностями. Универсальная примирующая последовательность, присутствующая в различных членах группы молекул, может позволять производить репликацию, амплификацию или обнаружение множества различных последовательностей с помощью единственного вида универсального праймера, который комплементарен универсальной примирующей последовательности. Таким образом, универсальный праймер включает последовательность, которая может специфично гибридизоваться с универсальной примирующей последовательностью. Примеры способов присоединения универсальных последовательностей к группе целевых нуклеиновых кислот, имеются в опубликованной патентной заявке US 2007/0128624 А1, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

В некоторых примерах осуществления целевые нуклеиновые кислоты могут быть получены в виде фрагментов одной или более нуклеиновых кислот большей длины. Фрагментация может быть выполнена с помощью любой из множества методик, известных в данной области техники, которые включают, например, распыление, обработку ультразвуком, химическое расщепление, ферментативное расщепление или физическое разрезание. Фрагментация также может происходить при применении определенной методики амплификации, согласно которой ампликоны создаются копированием лишь части более крупной нуклеиновой кислоты. Например, при ПЦР амплификации получают фрагменты, размер которых определяется длиной фрагмента между фланкирующими праймерами, применяемыми для амплификации.

Популяция целевых нуклеиновых кислот или их ампликонов может иметь среднюю длину цепочки, требуемую или подходящую для конкретного применения способов или композиций, рассмотренных в настоящей работе. Например, средняя длина цепочки может составлять менее приблизительно 100000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В альтернативном варианте или дополнительно средняя длина цепочки может составлять более приблизительно 10 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов или 100000 нуклеотидов. Средняя длина цепочки в популяции целевых нуклеиновых кислот или их ампликонов может находиться в диапазоне между максимальными и минимальными значениями, представленными выше. Следует понимать, что ампликоны, генерируемые на сайте амплификации (или полученные или применяемые иным образом при осуществлении изобретения), могут иметь среднюю длину цепочки, находящуюся в диапазоне между верхней и нижней границами, выбранными из значений, приведенных выше.

В некоторых случаях может быть получена или иным образом собрана популяция целевых нуклеиновых кислот, члены которой имеют максимальную длину. Например, максимальная длина членов популяции, получаемых или применяемых, как рассмотрено в настоящей работе, может составлять менее приблизительно 100000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В альтернативном варианте или дополнительно популяция целевых нуклеиновых кислот или их ампликонов может быть получена в таких условиях или собрана иным образом так, чтобы ее члены имели минимальную длину. Например, минимальная длина членов популяции, применяемых в одном или более этапах способа, рассмотренного в настоящей работе, или членов, которые присутствуют в конкретной композиции, может составлять более приблизительно 10 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов или 100000 нуклеотидов. Максимальная и минимальная длины цепочки целевых нуклеиновых кислот популяции могут находиться в диапазоне между максимальными и минимальными значениями, представленными выше. Следует понимать, что ампликоны, генерируемые на сайте массива (или полученные или применяемые иным образом при осуществлении изобретения), могут иметь максимальную и/или минимальную длины цепочки, величины которых находятся в диапазоне между верхней и нижней границами значений, приведенных выше.

Для увеличения количества матричных последовательностей, участвующих в способе, рассмотренном в настоящей работе, может быть применена любая из множества разнообразных известных методик амплификации. Примеры методик включают, без ограничений, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), амплификацию с множественным вытеснением цепи (англ. multiple displacement amplification, сокращенно MDA) или амплификацию со случайным примированием (англ. random prime amplification, сокращенно RPA) молекул нуклеиновых кислот, содержащих матричные последовательности. Следует понимать, что проведение амплификации целевых нуклеиновых кислот перед их введением в способ или композицию, рассмотренную в настоящей работе, необязательно. Таким образом, в некоторых примерах осуществления способов и композиций, рассмотренных в настоящей работе, целевые нуклеиновые кислоты не подвергают амплификации перед использованием. Целевые нуклеиновые кислоты могут быть необязательно получены из синтетических библиотек. Синтетические нуклеиновые кислоты могут иметь природные составы ДНК или РНК или могут быть их аналогами. Также могут быть применены способы твердофазной амплификации, которые включают, например, кластерную амплификацию, мостиковую амплификацию или другие способы, представленные ниже в контексте способов с применением массивов.

Нуклеиновая кислота, используемая в способе, рассмотренном в настоящей работе, может находиться в растворе или в твердой фазе. Если нуклеиновая кислота находится в фазе раствора, то она обычно растворима; тем не менее, она также может находиться в суспендированной форме, из которой может быть осаждена, как в случае некоторых видов крупных нуклеиновых кислот, таких как хромосомы или нуклеиновые кислоты в наносферах (см., например, опубликованную патентную заявку US 2007/0099208 А1, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки). Нуклеиновая кислота, находящаяся в твердой фазе, может находиться в или на твердофазной подложке. Примеры твердофазных подложек включают подложки, изготовленные из стекла, нитроцеллюлозы, оксида кремния, металла, полимера и других материалов, представленных в настоящем описании, например, при описании форматов массивов и проточных ячеек. Аналогично, нуклеиновая кислота может находиться в или на полутвердой подложке, такой как гель. Примеры подходящих гелей включают, без ограничений, гели, имеющие коллоидную структуру, такие как агароза; полимерную сетчатую структуру, такие как желатин; или поперечно сшитую полимерную структуру, такую как полиакриламид. Особенно подходящими являются гидрогели, такие как гидрогели, представленные в опубликованной патентной заявке US 2011/0059865 А1 и патенте US 9012022, где содержание каждого из упомянутых документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Присоединение нуклеиновой кислоты к подложке, как к жесткой, так и к полужесткой, может происходить за счет образования ковалентной или нековалентной связи (связей). Примеры связей представлены в патентах US 6737236, US 7259258, US 7375234 и US 7427678 и в опубликованной патентной заявке US 2011/0059865 А1, где содержание каждого из упомянутых документов включено в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых примерах осуществления нуклеиновая кислота или другой реакционный компонент может быть присоединен к гелю или другой полутвердой подложке, которая, в свою очередь, присоединена или прикреплена к твердофазной подложке. В таких примерах осуществления нуклеиновая кислота или другой реакционный компонент будут считаться находящимися в твердой фазе.

В мультиплексной реакции может быть применена твердофазная подложка (также называемая твердой подложкой). Твердофазная подложка может быть удобна для разделения индивидуальных реакций, чтобы каждая из них могла быть исследована отдельно или индивидуально. Например, к твердофазной подложке могут быть присоединены несколько различных нуклеиновых кислот, находящихся в смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть присоединены к твердофазной подложке в формате массива.

Некоторые примеры осуществления относятся к массиву сайтов, в котором каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты, где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах осуществления на одном сайте могут находиться более двух различных матриц. Примеры материалов массивов и способы получения, которые могут быть модифицированы для применения согласно настоящему изобретению, включают, без ограничений, массив BeadChip Array, предоставляемый Illumina®, Inc. (San Diego, CA), или массивы, рассмотренные, например, в патентах US 6266459, US 6355431, US 6770441, US 6859570 или US 7622294 или в опубликованной заявке РСТ WO 00/63437, где содержание каждого из упомянутых документов включено в настоящее описание посредством ссылки. Дополнительные примеры коммерчески доступных массивов, которые могут быть применены, включают, например, массив Affymetrix® GeneChip® или другие массивы, синтезированные в соответствии с методиками, иногда называемыми методиками VLSIPS™ (от англ. Very Large Scale Immobilized Synthesis, рус."Синтез иммобилизованных полимеров в очень крупном масштабе"). Согласно некоторым примерам осуществления также может быть применен массив с нанесением в виде пятен. Одним из примеров массива с нанесением в виде пятен является массив CodeLink™, предоставляемый Amersham Biosciences. Другим подходящим массивом является массив, получаемый способами струйной печати, такой как SurePrint™ Technology, предоставляемый Agilent Technologies.

Другие подходящие массивы, которые могут быть применены, например, после модификации сайтов, позволяющей им включать множество различных последовательностей матричных нуклеиновых кислот, включают массивы, применяемые для секвенирования нуклеиновых кислот. Например, особенно подходящими являются массивы, содержащие ампликоны геномных фрагментов (часто называемые кластерами), такие как массивы, рассмотренные в публикации Bentley с соавт., Nature 456:53-59 (2008), опубликованных патентных заявках WO 04/018497, WO 91/06678 или WO 07/123744, патентах US 7057026, US 7329492, US 7211414, US 7315019 или US 7405281, или в опубликованной патентной заявке US 2008/0108082 А1, где содержание каждого из указанных документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Кластеры нуклеиновых кислот могут быть получены способами твердофазной амплификации. Например, нуклеиновая кислота, включающая одну или более матричных последовательностей, которые нудно проанализировать, может быть присоединена к поверхности и амплифицирована способом мостиковой амплификации. Подходящие способы мостиковой амплификации рассмотрены, например, в патентах US 5641658 или US 7115400 или в опубликованных патентных заявках US 2002/0055100 А1, US 2004/0096853 А1, US 2004/0002090 А1, US 2007/0128624 A1 или US 2008/0009420 A1, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки. Другой подходящий способ амплификации нуклеиновых кислот на поверхности представляет собой амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), например, рассмотренную в публикации Lizardi с соавт., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) и опубликованной патентной заявке US 2007/0099208 А1, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Другой подходящий тип массива представляет собой массив частиц, получаемый способом эмульсионной ПЦР амплификации. Примеры таких методик рассмотрены в публикации Dressman с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), международной опубликованной патентной заявке WO 05/010145 или опубликованных патентных заявках US 2005/0130173 А1 или US 2005/0064460 А1, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Несмотря на то, что упоминаемые выше массивы были рассмотрены в контексте применения для секвенирования, следует понимать, что такие массивы могут быть применены в других примерах осуществления, включающих, например, примеры, в которых применяют методику нециклической достройки праймера.

Обнаружение может быть выполнено на уровне ансамбля или уровне единственной молекулы в массиве. Обнаружение на уровне ансамбля представляет собой обнаружение, при котором несколько копий единственной матричной последовательности (например, множество ампликонов матрицы) обнаруживают на каждом индивидуальном сайте, и индивидуальные копии на сайте не отличаются друг от друга. Таким образом, обнаружение на уровне ансамбля дает усредненный сигнал от множества копий конкретной матричной последовательности, находящейся на сайте. Например, сайт может содержать по меньшей мере 10, 100, 1000 или более копий конкретной матричной последовательности. Разумеется, сайт может содержать множество различных матричных последовательностей, каждая из которых присутствует в виде ансамбля. В альтернативном варианте обнаружение на уровне единичной молекулы включает обнаружение, при котором индивидуальные матричные последовательности распознают в массиве индивидуально, каждую на отдельном сайте. Таким образом, обнаружение на уровне единичной молекулы генерирует сигнал от индивидуальной молекулы, который отличается от одного или более сигналов, которые может генерировать популяция молекул, в которой находится индивидуальная молекула. Разумеется, даже в случае массива, составленного из единичных молекул, сайт может содержать несколько различных матричных последовательностей (например, две или более области матричных последовательностей, расположенные в одной молекуле нуклеиновой кислоты).

Массив сайтов может представлять собой сетку из пятен или участков. Сайты могут быть расположены в виде повторяющейся схемы или в виде нерегулярной неповторяющейся схемы. Особенно подходящими схемами являются шестиугольные схемы, прямолинейные схемы, сетчатые схемы, схемы с зеркальной симметрией, схемы, симметричные относительно оси вращения, или подобные схемы. Асимметричные схемы также могут быть подходящими.

Размеры сайтов и/или расстояние между сайтами в массиве может быть различным и соответствовать высокой плотности, средней плотности или низкой плотности массива. Массивы с высокой плотностью отличаются тем, что сайты в них расположены с шагом, который составляет менее приблизительно 15 мкм. Массивы со средней плотностью включают сайты, расположенные с шагом, который составляет приблизительно от 15 до 30 мкм, в то время как массивы с низкой плотностью включают сайты, расположенные с шагом, который составляет более 30 мкм. Массив, подходящий для некоторых примеров осуществления, может включать сайты, расположенные с шагом, который составляет менее 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм или 0,5 мкм. Один из примеров осуществления способов, рассмотренных в настоящей работе, может быть применен для визуализации массива с разрешением, достаточным для распознавания сайтов при указанных выше плотностях или диапазонах плотностей. Однако в этапе обнаружения обычно применяют детектор, пространственное разрешение которого слишком мало для разрешения точек на расстоянии, эквивалентном расстоянию между первой матрицей (или первым продуктом достройки праймера, гибридизованным с ней) и второй матрицей (или вторым продуктом достройки праймера, гибридизованным с ней) на индивидуальном сайте. В определенных примерах осуществления площадь каждого из сайтов массива может превышать приблизительно 100 нм², 250 нм², 500 нм², 1 мкм², 2,5 мкм², 5 мкм², 10 мкм², 100 мкм² или 500 мкм². В альтернативном варианте или дополнительно площадь каждого из сайтов массива может составлять менее приблизительно 1 мм², 500 мкм², 100 мкм², 25 мкм², 10 мкм², 5 мкм², 1 мкм², 500 нм² или 100 нм². В действительности сайт может иметь размер, величина которого находится в диапазоне между верхним и нижним пределами, выбранными из значений, представленных выше.

В способах, рассмотренных в настоящей работе, могут быть применены массивы, в которых сайты расположены с любой из множества плотностей, величины которых включают, например, по меньшей мере приблизительно 10 сайтов/см², 100 сайтов/см², 500 сайтов/см², 1000 сайтов/см², 5000 сайтов/см², 10000 сайтов/см², 50000 сайтов/см², 100000 сайтов/см², 1000000 сайтов/см², 5000000 сайтов/см² или более.

Обычно массив содержит сайты, содержащие различные последовательности нуклеиновых кислот. Соответственно, каждый из сайтов в массиве может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая уникальна по сравнению с последовательностями нуклеиновых кислот на других сайтах массива. Однако в некоторых случаях массив может быть избыточным и на двух или более сайтах содержать одну и ту же нуклеиновую кислоту.

Следует понимать, что этапы способов, рассмотренных в настоящей работе, могут быть выполнены так, что весь сайт или множество сайтов массива подвергаются обработке. Например, этап, который включает достройку праймера, может быть включать доставку реагентов для достройки праймера в массив, при которой происходит контакт множества нуклеиновых кислот (например, смеси различных нуклеиновых кислот) с реагентами для достройки праймера на каждом из сайтов массива. Аналогично этап деблокирования блокированного продукта достройки праймера может включать воздействие на массив с деблокирующей обработки, при которой происходит контакт множества нуклеиновых кислот (например, смеси различных нуклеиновых кислот) с обрабатывающими агентами на каждом из сайтов массива.

На любом заданном этапе в секвенировании синтезом или в другой реакции достройки праймера вид нуклеотида, который присутствует в первой матрице в положении, которое комплементарно сайту достройки праймера, может совпадать с видом нуклеотида, который присутствует во второй матрице в положении, которое комплементарно сайту достройки праймера. Другими словами, первая матрица на основе нуклеиновой кислоты на определенном сайте массива может включать по меньшей мере один фрагмент основания того же вида, что и фрагмент основания во второй матрице на основе нуклеиновой кислоты на том же определенном сайте, и к каждому из праймеров, находящихся в тех положениях матриц, в которых имеются эти фрагменты оснований, может быть добавлен комплементарный аналог нуклеотида. Это может быть так, вне зависимости от того, одинаковы или различны матричные последовательности, с которыми гибридизованы праймеры. Для отличия друг от друга двух матриц могут быть применены методики, более подробно рассмотренные ниже, например, применение различных наборов аналогов нуклеотидов, содержащих взаимно отличающиеся метки.

В способе или композиции, рассмотренных в настоящей работе, может быть применена любая из множества разнообразных полимераз, которые включают, например, ферменты на основе белков, выделенные из биологических систем, и их функциональные варианты. Если не указано иное, то упоминание конкретной полимеразы, такой как полимеразы, указанные ниже, должно включать их функциональные варианты. Особенно полезной функцией полимеразы является способность катализировать полимеризацию цепочки нуклеиновой кислоты, используя существующую нуклеиновую кислоту в качестве матрицы (шаблона). Другие полезные функции также рассмотрены в настоящем описании. Примеры подходящих полимераз включают ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы и РНК-полимеразы.

Для некоторых примеров осуществления может быть подходящей полимераза, обладающая характерной коррекционной (редакторской) 3'-5' экзонуклеазной активностью. Для некоторых примеров осуществления, например, для большинства примеров осуществления секвенирования также подходят полимеразы, которые по существу не имеют коррекционной 3'-5' экзонуклеазной активности. Отсутствие экзонуклеазной активности может быть характеристикой дикого типа или характеристикой, привнесенной вариантом или сконструированной структурой полимеразы. Например, экзо-минус фрагмент Кленова представляет собой мутированную версию фрагмента Кленова, который не имеет коррекционной 3'-5' экзонуклеазной активности.

В зависимости от применяемого примера осуществления, полимераза может быть термофильной или деактивируемой под действием тепла. Термофильные полимеразы обычно подходят для применения при высоких температурах или в условиях термоциклирования, таких как условия, создаваемые при выполнении методик полимеразной цепной реакции (ПЦР). Примеры термофильных полимераз включают, без ограничений 9°N ДНК-полимеразу, Taq ДНК-полимеразу, Phusion^® ДНК-полимеразу, Pfu ДНК-полимеразу, RB69 ДНК-полимеразу, KOD ДНК-полимеразу и VentR^® ДНК-полимеразу. Большинство полимераз, выделяемых из нетермофильных организмов, деактивируются под действием тепла. Примерами являются ДНК-полимеразы фагов. Следует понимать, что полимеразы, полученные из любого из множества разнообразных источников, могут быть модифицированы с целью повышения или понижения их толерантности к высоким температурам. Полимеразы, особенно подходящие для введения аналогов нуклеотидов, которые имеют метки и/или группы обратимой терминации, рассмотрены в патентной публикации US 2006/0281109 А1, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

В определенных примерах осуществления способов и композиций, рассмотренных в настоящей работе, применяют только один вид полимеразы. В таких примерах каждый сайт массива будет взаимодействовать только с одним видом полимеразы в заданный момент времени, несмотря на то, что на сайте может присутствовать множество полимераз и связываться со множеством примированных матриц, находящихся на каждом сайте. Например, все сайты массива могут взаимодействовать с определенным видом ДНК-полимеразы, и массив не будет содержать других полимераз (таких как РНК-полимеразы).

Другой методикой достройки, которая может быть модифицирована для применения в способе или композиции, рассмотренных в настоящей работе, является система на основе лигазы, которая селективна по отношению к встраиванию олигонуклеотидов в сравнении с мономерными нуклеотидами, которые встраиваются с помощью систем достройки на основе полимеразы, рассмотренных выше. Система, включающая реагент на основе ДНК-лигазы, в которой применяют первый набор олигонуклеотидов, включающих обратимо блокирующую группу, которая селективно деблокируется в результате первой деблокирующей обработки, ортогональна системе реагентов, в которой применяют второй набор олигонуклеотидов, включающих обратимо блокирующую группу, которая селективно деблокируется в результате второй деблокирующей обработки. Деблокирование праймеров, достроенных обратимо блокированными олигонуклеотидами, может быть выполнено ортогональным образом, практически аналогично тому, как это рассмотрено в настоящем описании для деблокирования праймеров, достроенных обратимо блокированными аналогами нуклеотидов. В методиках секвенирования может быть выполнена достройка лигированием с использованием популяции частично случайных олигонуклеотидных зондов, содержащих схему кодирования, включающую одно или два основания. Методики достройки на основе лигирования, которые могут быть модифицированы с целью применения согласно настоящему изобретению, например, в контексте секвенирования, представлены в публикациях McKernan с соавт., Genome Research 19 (9): 1527-41 (2009), Shendure с соавт., Science 309:1728-1732 (2005), или в патентах US 5599675 или US 5750341, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Реакция достройки нуклеиновой кислоты или другая циклическая реакция, проводимая способами, рассмотренными в настоящей работе, может включать проведение одного или более циклов. В определенных примерах осуществления мультициклическая реакция может включать по меньшей мере 2 цикла, 5 циклов, 10 циклов, 50 циклов, 100 циклов, 500 циклов, 1000 циклов, 5000 циклов, 10000 циклов или более. В альтернативном варианте или дополнительно реакция может иметь верхний предел количества проводимых циклов, который составляет не более чем 1 цикл, 2 цикла, 5 циклов, 10 циклов, 50 циклов, 100 циклов, 500 циклов, 1000 циклов, 5000 циклов или 10000 циклов. В некоторых примерах осуществления каждый цикл приводит к встраиванию одного аналога нуклеотида в достраиваемый праймер. В этом случае минимальное или максимальное количество циклов, приведенное выше, может рассматриваться как минимальное или максимальное количество нуклеотидов, встраиваемых в продукт достройки при проведении реакции, катализируемой полимеразой.

В некоторых примерах осуществления могут быть применены нециклические реакции достройки, такие как реакции достройки одним основанием (англ. single base extension, сокращенно SBE) или аллель-специфичной достройки праймера (англ. allele specific primer extension, сокращенно ASPE). Для осуществления ортогональной достройки двух различных праймеров в формате нециклической достройки могут быть применены группы обратимых терминаторов. Поскольку проведение этапа деблокирования не является необходимым для продолжения этих нециклических реакций (т.е. после того, как праймеры были достроены), аналоги нуклеотидов, используемые в этапе достройки, могут, напротив, быть подвергнуты необратимой терминации. Например, могут быть применены дидезоксинуклеотиды. Примеры реагентов и соответствующих методик SBE, ASPE и других подходящих методик нециклической достройки рассмотрены, например, в патенте US 7670810 или опубликованных патентных заявках US 2003/0108867, US 2003/0108900, US 2003/0170684, US 2003/0207295 или US 2005/0181394, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки. Примером коммерчески доступного продукта, в котором применена методика нециклической достройки и который может быть модифицирован для повышения содержания информации способами ортогонального обнаружения, рассмотренными в настоящей работе, является продукт Infinium^® genotyping, предоставляемый Illumina, Inc. (San Diego, CA).

Как циклические, так и нециклические реакции могут включать этапы, в которых компоненты реакции должны быть отделены друг от друга или удалены из реакционной среды. Один или более компонентов реакции могут быть отделены, например, отделением твердофазных компонентов от компонентов, находящихся в жидкостной фазе. Для более полного удаления нежелательного жидкофазного компонента (компонентов) от твердофазного компонента (компонентов) необязательно могут быть включены этапы промывки. Особенно подходящей реакционной емкостью для такого разделения является проточная ячейка, такая как ячейки, обычно применяемые в процедурах циклического секвенирования. Примеры проточных ячеек, способов их получения и способов их применения рассмотрены в опубликованных патентных заявках US 2010/0111768 А1 или US 2012/0270305 А1 или в патентной заявке WO 05/065814, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Независимо от того, применяют или нет способы твердофазного разделения, компоненты реакции могут быть удалены любым из множества других способов, известных в данной области техники, которые включают, экстракцию жидкость-жидкость, твердофазную экстракцию, хроматографию, фильтрование, центрифугирование или подобную методику.

Использование обратимо терминирующих групп является удобным способом регулирования реакции достройки так, чтобы до проведения последующего этапа деблокирования к праймеру добавлялся только один нуклеотид. Как указано в настоящей работе, применение ортогональных блокирующих групп и деблокирующей обработки позволяет добиться сверхвысокого разрешения при обнаружении, которое позволяет обнаруживать и отслеживать матрицы более высокой сложности, чем матрицы, которые могут быть обнаружены и отслежены с помощью неортогональных методик. Примеры обратимо блокирующих групп и условий их деблокирования включают, без ограничений, группы, которые могут отщепляться под действием фотонов от 3'-положения, такие как простые орто-нитробензилэфиры и алкил-орто-нитробензилкарбонат; сложноэфирные группы, которые могут быть удалены гидролизом в щелочных условиях; аллильные группы, которые могут быть удалены обработкой NaI, хлортриметилсиланом и Na₂S₂O₃ или Hg(II) в ацетоне/воде; азидометил (-CH₂-N₃), который может быть отщеплен обработкой фосфинами, такими как трис(2-карбоксиэтил)фосфин (англ. tris(2-carboxyethyl)phosphine, сокращенно ТСЕР) или три(гидроксипропил)фосфин (англ. tri(hydroxypropyl)phosphine, сокращенно ТНР); ацетали, такие как трет-бутокси-этокси, которые могут быть отщеплены обработкой в кислой среде; группы МОМ (- СН₂ОСН₃), которые могут быть отщеплены обработкой LiBF₄ и CH₃CN/H₂O; 2,4-динитробензолсульфенил, который может быть отщеплен обработкой нуклеофилами, такими как тиофенол и тиосульфат; простой тетрагидрофуриловый эфир, который может быть отщеплен обработкой Ag(I) или Hg(II); и 3'-фосфат, который может быть отщеплен обработкой фосфатазными ферментами (например, полинуклеотидкиназой). Другие подходящие обратимо блокирующие группы включают простые эфиры, -F, -NH₂, -ОСН₃, -N₃, -NHCOCH₃ и 2-нитробензолкарбонат.Подходящие виды деблокирующей обработки включают облучение светом (например, для проведения фотоотщепления), нагревание, воздействие химических реагентов, воздействие катализаторов, воздействие электрическим током (например, для проведения электролиза) или подобные способы.

В конкретных примерах осуществления способов согласно настоящему изобретению могут быть применены обратимо блокированные праймеры и обратимо блокированные аналоги нуклеотидов, например, при осуществлении мультициклического способа, такого как секвенирование синтезом. Как показано в примере выше, определенный обратимо блокированный праймер и определенный набор обратимо блокированных аналогов нуклеотидов могут быть чувствительны к одинаковым условиям деблокирования. Это может быть обусловлено наличием одного и того же вида частиц обратимо блокирующей группы на праймере и на аналогах нуклеотидов в наборе. Однако также могут быть использованы различные блокирующие группы, которые, тем не менее, чувствительны к одной деблокирующей обработке.

Обратимо блокирующая группа может быть присоединена к 3'-нуклеотиду праймера. Обычно обратимо блокирующая группа присоединена к 3'-положению фрагмента сахара рибозы. Однако вместо этого блокирующая группа может быть присоединена к альтернативным положениям, которые включают, например, 2'-положение рибозы или положение на фрагменте основания. Блокирующая группа также может быть присоединена к 5'-концу праймера, например, к 5'-положению рибозы терминального нуклеотида или к 5'-фрагменту фосфата. Праймеры, блокированные по 5'-концу, могут быть подходящими для примеров осуществления, в которых применяют методики лигирования.

3'- или 5'-конец праймера может быть присоединен к маркерной группе, такой как оптическая метка. Метка может присутствовать независимо от того, имеется ли на праймере обратимо блокирующая группа. В некоторых случаях определенная группа может функционировать и как метка, и как обратимый блок, препятствующий достройке праймера.

Точки присоединения метки и/или обратимо блокирующей группы к праймерам, примеры которых были приведены выше, могут быть подходящими для присоединения индивидуальных нуклеотидов.

Дополнительные примеры руководств, относящихся к блокирующим группам и деблокирующим обработкам, рассмотрены, например, в публикации Bentley с соавт., Nature 456:53-59 (2008), в опубликованных международных заявках WO 04/018497, WO 91/06678 или WO 07/123744, патентах US 7057026, US 7329492, US 7211414, US 7315019, US 8088575 или US 7405281 или в опубликованной патентной заявке US 2008/0108082 А1, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Ортогональные манипуляции и обнаружение согласно настоящему изобретению не требуют того, чтобы две матричные последовательности различались каждым положением по всей их длине. Напротив, одно и то же основание может находиться в положениях, которые определяют в первой матрице и второй матрице, соответственно. Эти два положения могут быть отличены друг от друга на основании распознаваемых характеристик меток, присутствующих в системах ортогональных реагентов, и на основании специфичности систем реагентов по отношению к достройке подходящим образом деблокированного праймера. В свою очередь, эта информация может быть применена для распознавания и отличия друг от друга двух различных матричных последовательностей, даже если два положения обнаруживаются одновременно с помощью детектора, разрешение которого слишком мало для различия точек, разнесенных на расстояние, эквивалентное расстоянию между двумя матричными последовательностями.

Может быть применена любая из множества разнообразных меток (маркеров). Маркерная группа, особенно подходящая для применения при обнаружении аналога нуклеотида, может представлять собой любую часть этого аналога нуклеотида, которая обеспечивает наличие распознаваемой характеристики по сравнению с другими молекулами, находящимися в окружении этого аналога. Распознаваемая характеристика может включать, например, оптический сигнал, такой как поглощение излучения, эмиссия флуоресценции, эмиссия люминесценции, продолжительность флуоресценции, поляризация флуоресценции или подобный сигнал; сродство к связыванию лиганда или рецептора; магнитные свойства; электрические свойства; заряд; массу; радиоактивность или подобные свойства. Примеры маркерных групп включают, без ограничений, флуорофор, люминофор, хромофор, радиоактивный изотоп, массовую метку, зарядовую метку, спиновую метку, рецептор, лиганд или подобную группу. Маркерная группа может быть частью нуклеотида, который представляет собой мономерную единицу, присутствующую в полимере, образованном нуклеиновой кислотой, или маркерная группа может быть частью свободного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата).

Особенно подходящими являются флуорофоры, которые включают, например, флуоресцентные нанокристаллы; квантовые точки, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирол, малахитовый зеленый, Су3, Су5, стильбен, Люцифер желтый (Lucifer Yellow), каскадный синий (Cascade Blue), техасский красный (Texas Red), красители Alexa, красители SETA, красители Atto, фикоэритрин (phycoerythrin), красители BODIPY и аналоги перечисленных веществ. Подходящие оптические зонды рассмотрены в публикациях Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy (Принципы флуоресцентной спектроскопии), 3-е изд. Springer (2006); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (Руководство по флуоресцентным зондам и продуктам для исследований), 9-е изд., Molecular Probes, Inc, (2002); Shapiro, Practical Flow Cytometry (Практическая проточная цитометрия), 4-е изд., John Wiley & Sons (2003); в опубликованных международных патентных заявках WO 98/59066 или WO 91/06678; или в опубликованной патентной заявке US 2010/0092957 А1, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

В различных примерах осуществления способов и композиций, рассмотренных в настоящей работе, могут быть применены другие метки, некоторые из которых не являются оптическими метками. Их примеры включают, без ограничений, изотопную метку, такую как редко встречающийся в природе радиоактивный или тяжелый изотоп; магнитное вещество; обогащенный электронами материал, такой как металл; электрохемолюминесцентную метку, такую как Ru(bpy)³²⁺; или группу, которая может быть обнаружена на основании ее ядерной магнитной, парамагнитной, электрической характеристики, по отношению заряда к массе или по термической характеристике. Метки также могут включать магнитные частицы или оптически закодированные наночастицы. Такие метки могут быть обнаружены подходящими способами, известными специалистам в данной области техники. Например, заряженная метка может быть обнаружена с помощью электрического детектора, такого как детекторы, применяемые в коммерчески доступных системах секвенирования, поставляемых Ion Torrent (Guilford, СТ, дочернее предприятие Life Technologies), или систем обнаружения, рассмотренных в опубликованных патентных заявках US 2009/0026082 А1, US 2009/0127589 А1, US 2010/0137143 А1 или US 2010/0282617 А1, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Следует понимать, что в некоторых примерах осуществления аналог нуклеотида может не содержать одной или более меток (маркеров), рассмотренных в настоящей работе.

Маркерная группа может быть присоединена к аналогу нуклеотида различным образом. Примеры присоединения и составы меток, подходящих для аналогов нуклеотидов, представлены в публикации Bentley с соавт., Nature 456:53-59 (2008), в опубликованных патентных заявках WO 04/018497, WO 91/06678 или WO 07/123744, в патентах US 7057026, US 7329492, US 7211414, US 7315019, US 8088575 или US 7405281, или в опубликованной патентной заявке US 2008/0108082 А1, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Этап обнаружения в способе, рассмотренном в настоящей работе, может быть выполнен в способе согласно настоящему изобретению с помощью установки, подходящей для конкретной используемой метки. Например, для обнаружения подходящих оптических меток может быть применен оптический детектор, такой как детектор флуоресценции, детектор поглощения, детектор люминесценции или подобный датчик. Особенно подходят системы, сконструированные для обнаружений в формате массива. Например, конструкции оптических систем, предназначенных для применения в способах, рассмотренных в настоящей работе, могут включать различные компоненты и узлы, рассмотренные в патентах US 8241573, US 7329860 или US 8039817, или опубликованных патентных заявках US 2009/0272914 А1 или US 2012/0270305 А1, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Для распознавания различных нуклеотидов, добавленных к каждому праймеру, система ортогонального обнаружения, такая как система, применяемая для секвенирования синтезом, может использовать различные метки. В одном из примеров осуществления каждый вид нуклеотидов имеет уникальную оптическую метку, которая генерирует уникальный сигнал для опознавания этого вида нуклеотидов. Примером является подход "8 красителей". В этом примере первый набор включает 4 различных аналога нуклеотидов, каждый из которых имеет отличающийся от других флуоресцентный краситель, с помощью которого каждый из этих 4 различных аналогов нуклеотидов отличают от других, и при этом 4 различных нуклеотида в первом наборе имеют блокирующие группы, блокировка с которых может быть селективно снята посредством первой обработки. Во втором наборе имеется 4 различных аналога нуклеотидов, каждый из которых имеет отличающийся от других флуоресцентный краситель, с помощью которого каждый из этих 4 различных аналогов нуклеотидов отличают от других, и при этом 4 различных нуклеотида во втором наборе имеют блокирующие группы, блокировка с которых может быть селективно снята посредством второй обработки. В этом случае первая обработка селективна по отношению к блокирующим группам, находящимся в первом наборе нуклеотидов, а вторая обработка селективна по отношению к блокирующим группам, находящимся во втором наборе нуклеотидов. Два набора красителей уникальны тем, что все 8 красителей генерируют 8 распознаваемых сигналов, соответственно.

В тех примерах осуществления, в которых все аналоги нуклеотидов помечены распознаваемым образом, как в рассмотренном выше подходе с 8 красителями, пара матричных последовательностей может быть введена в контакт со всеми аналогами нуклеотидов, после чего может быть выполнено обнаружение. В этом случае возможность распознавания всех аналогов нуклеотидов благодаря уникальным оптическим меткам обеспечивает полезный эффект, состоящий в относительной простоте манипуляций с текучими средами, при котором все аналоги нуклеотидов могут быть доставлены к матричным последовательностям так, чтобы их воздействие было одновременным. В относительно понятном и предпочтительном примере осуществления все 8 аналогов нуклеотидов доставляют одновременно; однако, при необходимости один или более субнаборов могут быть доставлены последовательно. Обнаружение может быть проведено во время или после доставки аналога нуклеотида. Такой относительно простой способ работы с текучими средами снабжен относительно сложным устройством обнаружения, которое способно распознавать все различные сигналы. Например, в способе "8 красителей" может быть применена система обнаружения флуоресценции, способная распознавать 8 различных флуоресцентных сигналов. Специалистам в данной области техники должна быть известна подходящая установка обнаружения флуоресценции, или специалисты в данной области техники могут подобрать установку обнаружения флуоресценции, подходящую для такой дифференциации сигналов. Например, параметры возбуждения и эмиссии флуоресцентных меток могут быть подходящим образом сопоставлены с комбинацией получаемой длины волны возбуждения и длины волны эмиссии, регистрируемой флуориметром. Примеры руководств для подбора оптики и меток, подходящих для обнаружения многоволновой флуоресценции, представлены в публикациях Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3-е изд. Springer (2006); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 9-е изд., Molecular Probes, Inc, (2002); Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4-е изд., John Wiley & Sons (2003), содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Принципы, примеры которых приведены выше при описании системы, в которой все нуклеотиды помечены распознаваемым образом, могут быть легко адаптированы к формату массива. При обработке реакционными системами достройки праймера ожидается, что массив, включающий достаточное количество и многообразие различных матричных последовательностей, включает все меченые нуклеотиды. В частности, в способе, включающем использование массива, на сайтах которого имеется огромное разнообразие нуклеиновых кислот, и в каждом сайте имеется две отличные друг от друга матрицы, ожидается, что после проведения цикла достройки праймера, в котором массив обрабатывают всеми 8 нуклеотидами, в массиве создаются все возможные комбинации 2-краситель-краситель. Сайты могут быть пространственно распознаны с помощью оптических устройств, известных в данной области техники, например, устройств, рассмотренных в патентах US 8241573, US 7329860 или US 8039817, или в опубликованных патентных заявках US 2009/0272914 А1 или US 2012/0270305 А1, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки. Такие системы обнаружения могут быть успешно модифицированы для проведения флуоресцентного обнаружения с 8 красителями, указанного выше. Модифицированная подходящим образом система обнаружения будет способна производить мультиплексное ортогональное обнаружение, с помощью которого можно различить две различные матрицы (например, посредством секвенирования), каждая из которых содержит различающиеся составом последовательности, находящиеся на каждом из множества сайтов.

В некоторых примерах осуществления количество различных сигналов, распознаваемых в определенном способе, меньше количества различных видов аналогов нуклеотидов, применяемых в этом способе. Например, многие различные виды аналогов нуклеотидов могут иметь одинаковую метку, и/или субнабор вида нуклеотидов может быть непомеченным. Примером конфигурации, в которой для множества различных видов нуклеотидов применяют одну и ту же метку, является способ ортогональной достройки праймера, в котором первый набор из 4 различных аналогов нуклеотидов имеет одну и ту же общую первую метку и чувствителен к первой селективной деблокирующей обработке, в то время как второй набор из 4 различных аналогов нуклеотидов имеет одну и ту же общую вторую метку и чувствителен ко второй деблокирующей обработке. В этом примере первая метка отличается при оптическом распознавании от второй метки, первая обработка селективна по отношению к первому набору аналогов нуклеотидов, а вторая обработка селективна по отношению ко второму набору аналогов нуклеотидов. В этой конфигурации 4 различных нуклеотида в первом наборе можно отличить друг от друга посредством проведения последовательных циклов подачи реагентов и обнаружения (т.е. отдельный цикл для каждого из различных аналогов нуклеотидов). При условии, что первая метка и вторая метка в этом примере могут быть отличены друг от друга, члены совместно обнаруживаемого набора нуклеотидов могут быть доставлены парами (единственный вид нуклеотида из первого набора и единственный вид нуклеотида из второго набора, по одному) в виде 4 циклов доставки и обнаружения. Таким образом, члены первого набора аналогов нуклеотидов, применяемого в реакции достройки праймера, могут включать только один тип оптической метки, которую определяют, и второй набор аналогов нуклеотидов, который ортогонален первому набору, также может включать только один тип оптической метки, которую определяют, причем метка, применяемая в первом наборе, отличается при оптическом обнаружении от метки, применяемой во втором наборе.

Представление изображений в оттенках серого цвета позволяет применять множество различных видов аналогов нуклеотидов, которые имеют одинаковую метку. В этом случае различные виды аналогов нуклеотидов можно различить на основании интенсивности обнаруживаемого сигнала метки. Например, каждый вид аналога нуклеотида может быть доставлен в виде смеси, в которой он находится в уникальной пропорции меченых и немеченых частиц. Изменение отношения меченый: немеченый аналог нуклеотида для каждого вида приводит к уникальному сигналу, получаемому в градациях серого цвета для каждой смеси. В более специфичном примере первый аналог нуклеотида может быть помечен полностью (без смешивания меченого и немеченого первого аналога нуклеотида), второй аналог нуклеотида может быть помечен на 75% (смесь из 75% меченого и 25% немеченого второго аналога нуклеотида), третий аналог нуклеотида может быть помечен на 50% (смесь из 50% меченого и 50% немеченого третьего аналога нуклеотида), и четвертый аналог нуклеотида может быть помечен на 25% (смесь из 25% меченого и 75% немеченого четвертого аналога нуклеотида). Эти 4 вида аналогов нуклеотидов можно различить на основании получаемой разности интенсивности сигнала; так, популяция подходящим образом деблокированных праймеров (например, на сайте массива) будет генерировать полный сигнал благодаря включению в нее первого аналога нуклеотида, 75%-ный сигнал благодаря включению второго аналога нуклеотида, 50%-ный сигнал благодаря включению третьего аналога нуклеотида и 25%-ный сигнал благодаря включению четвертого аналога нуклеотида.

В определенных примерах осуществления по меньшей мере один из видов аналогов нуклеотидов может быть полностью непомеченным. Таким образом, в случае, когда в наборе аналогов нуклеотидов оптические метки присутствуют на других аналогах нуклеотидов, также может иметься "темный" аналог нуклеотида. Достройка праймера с введением темного или иным образом непомеченного аналога нуклеотида может быть выведена аналитически на основании отсутствия метки, наличие которой ожидалось бы, если бы в результате реакции достройки произошло введение других аналогов нуклеотидов из набора. Таким образом, в некоторых примерах осуществления только субнабор аналогов нуклеотидов, применяемых в реакции достройки праймера, рассмотренной в настоящей работе, должен содержать метку.

Применение полностью немеченых видов аналогов нуклеотидов может быть скомбинировано с представлением изображений в оттенках серого цвета. Например, три из четырех различных видов аналогов нуклеотидов в наборе (т.е. наборе, который может быть деблокирован в результате общей обработки) могут иметь распознаваемые ненулевые количества определенной метки (например, отношение меченых и немеченых аналогов нуклеотидов в смеси), и четвертый вид аналогов нуклеотидов может не иметь такой метки. В альтернативном варианте или дополнительно представление изображений в оттенках серого цвета может быть скомбинировано с применением нескольких меток, распознаваемых оптическим способом. Например, некоторые виды аналогов нуклеотидов могут присутствовать в реакции достройки в виде смеси нуклеотидов одного типа, но имеющих различные метки. Пример такой конфигурации приведен в опубликованной патентной заявке US 2013/0079232 А1 или опубликованной патентной заявке US 2015/0031560 А1, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

В альтернативном варианте или дополнительно к применению множества различных меток, представления изображений в оттенках серого цвета и/или к применению немеченых частиц, в одном из примеров осуществления изобретения может быть использован аналог нуклеотида, содержащий лиганд, отщепляемый линкер или другую группу, которая обеспечивает приобретение или потерю метки в результате определенной обработки. Системы реагентов этого типа представлены в опубликованных патентных заявках US 2013/0079232 А1 или US 2015/0031560 А1, в которых указано, что некоторые виды аналогов нуклеотидов содержат лиганд, и, таким образом, их можно отличить от других аналогов нуклеотидов на основании первоначального отсутствия сигнала, доступного для обнаружения и последующего появления сигнала после обработки рецептора, помеченного подходящим образом. В цитируемых документах также показано применение аналога нуклеотида, который может быть распознан на основании изначально доступного для обнаружения сигнала, который затем пропадает или по меньшей мере уменьшается в результате обработки реагентом, который модифицирует метку (например, посредством химического отщепления линкера, находящегося между меткой и нуклеотидными частицами). В этом случае другие виды аналогов нуклеотидов в наборе не подвергаются модификации (например, не имеют отщепляемого линкера) и распознаются на основании сохранения генерации сигнала после обработки.

Как показано выше, в некоторых примерах осуществления метка может быть присоединена к аналогу нуклеотида через отщепляемый линкер. В определенных примерах осуществления вместо линкера, отщепляемого химическими способами, упомянутого выше, могут быть применены фотоотщепляемые линкеры. В некоторых примерах осуществления линкер выбран из линкеров, разлагающихся под действием кислот (включающих диалкоксибензильные линкеры, линкеры Зибера (Sieber), индольные линкеры, трет-бутильные линкеры Зибера), линкеры, отщепляемые электрофильными реагентами, линкеры, отщепляемые нуклеофильными реагентами, фотоотщепляемые линкеры, линкеры, которые отщепляются в восстановительных условиях или окислительных условиях, предохранительные линкеры и линкеры, которые отщепляются в соответствии с механизмами элиминирования. В некоторых таких примерах осуществления линкер выбран из дисульфидного линкера (-S-S-), сложного эфира, нитробензола, имина, пептида и полинуклеотида, расщепляемого ферментативным или химическим образом, такого как ДНК.

В некоторых примерах осуществления члены первого набора аналогов нуклеотидов (например, аналоги нуклеотидов, которые подвергаются селективной деблокировке в результате первой общей обработки), применяемые в реакции достройки праймера, включают только один тип определяемой оптической метки, и второй набор аналогов нуклеотидов (например, аналоги нуклеотидов, которые подвергаются селективной деблокировке в результате второй общей обработки), который ортогонален первому набору, также включает только один тип определяемой оптической метки, и метка, применяемая в первом наборе, может быть отличена от метки, применяемой во втором наборе, оптическими средствами. В этом примере осуществления оптическая метка одного типа может быть присоединена по существу ко всем аналогам нуклеотидов первого вида в первом наборе, оптическая метка одного типа может быть присоединена к субнабору аналогов нуклеотидов второго вида в первом наборе, по существу все аналоги нуклеотидов третьего вида в первом наборе могут быть присоединены к лиганду, и по существу все аналоги нуклеотидов четвертого вида в первом наборе не присоединены к оптической метке одного типа или к лиганду.

В другом примере осуществления члены первого набора аналогов нуклеотидов (например, аналоги нуклеотидов, которые подвергаются селективной деблокировке в результате первой общей обработки), применяемые в реакции достройки праймера, включают только два типа оптических меток, которые должны быть обнаружены, и второй набор аналогов нуклеотидов (например, аналоги нуклеотидов, которые подвергаются селективной деблокировке в результате второй общей обработки), который ортогонален первому набору, также включает только два типа оптических меток, которые должны быть обнаружены. В этом примере осуществления первая из двух типов оптических меток может быть присоединена к по существу всем аналогам нуклеотидов первого вида в первом наборе, вторая из двух типов оптических меток может быть присоединена к по существу всем аналогам нуклеотидов второго вида в первом наборе, первая из двух типов оптических меток и вторая из двух типов оптических меток могут быть присоединены к аналогам нуклеотидов третьего вида в первом наборе, и по существу все аналоги нуклеотидов четвертого вида в первом наборе не присоединены ни к одной из двух типов оптических меток, ни ко второй из двух типов оптических меток.

Из приведенных выше примеров ясно, что уменьшение количества различных меток в ортогональной системе обнаружения может создать полезный эффект, заключающийся в снижении сложности устройства обнаружения, необходимого для распознавания присоединения различных нуклеотидов к праймеру, связанному с матрицей. Однако во многих примерах осуществления это достигается за счет повышения сложности этапов работы с текучими средами, то есть количество манипуляций с текучими средами, применяемых при проведении этапов обнаружения, увеличивается по сравнению с количеством этапов работы с текучими средами, применяемых в тех случаях, когда каждый из видов нуклеотидов имеет уникальную метку. Общим полезным эффектом способов согласно изобретению является то, что специалист в данной области техники может выбрать комбинацию меток, этапы работы с текучими средами и устройства обнаружения, подходящие для конкретного применения или обстоятельств.

Как показано в примерах осуществления, представленных выше, в некоторых случаях два или более праймера, которые гибридизованы с двумя или более различными матрицами на основе нуклеиновой кислоты, соответственно, могут одновременно присутствовать на сайте при проведении этапа достройки праймера. В альтернативном варианте первый из двух праймеров, которые гибридизованы с двумя или более различными матрицами, находящимися на сайте, может быть удален с сайта перед достройкой второго из двух или более праймеров, которые гибридизованы с двумя или более различными матрицами, находящимися на сайте.

Кроме того, два или более различных продуктов достройки праймера, получаемых при выполнении приведенных выше этапов, могут одновременно присутствовать на сайте при проведении этапа обнаружения. В альтернативном варианте первый из двух или более различных продуктов достройки праймера может быть удален с сайта перед обнаружением на сайте второго из двух или более различных продуктов достройки праймера.

Кроме того, два или более продукта достройки праймера, каждый из которых содержит различные обратимо блокирующие группы, могут одновременно присутствовать при выполнении этапа деблокирования. Конфигурация этапа деблокирования может включать селективное удаление (или иное модифицирование) одного или единственного субнабора различных обратимо блокирующих групп таким образом, что по меньшей мере одна обратимо блокирующая группа сохраняется (или остается немодифицированной) после проведения обработки. В альтернативном варианте могут быть удалены все различные обратимо блокирующие группы, присутствующие одновременно, например, посредством комбинации деблокирующих обработок или с помощью универсальной деблокирующей обработки. В качестве дополнительной альтернативы первый из двух или более различных продуктов достройки праймера может быть удален с сайта перед проведением деблокирующей обработки второго из двух или более продуктов достройки праймера.

Настоящее изобретение относится к реакционным смесям (в настоящей работе также называемым системами реагентов), которые включают различные комбинации компонентов. В некоторых случаях компоненты реакции и некоторые комбинации компонентов рассмотрены в контексте иллюстративных способов, таких как способы, представленные в приведенном выше тексте. Следует понимать, что реакционные смеси и их компоненты не должны быть ограничены применением в способах, представленных в настоящей работе. Изобретение также включает другие варианты их применения. Соответственно, компоненты могут быть собраны в виде множества разнообразных подходящих комбинаций, например, в комплекты. Комплекты могут быть подходящими для хранения, транспортировки или коммерческих отправлений компонентов, рассмотренных в настоящей работе. Комплекты могут необязательно включать инструкции для выполнения одного или более способов, рассмотренных в настоящей работе.

Конкретные примеры осуществления настоящего изобретения относятся к способу секвенирования матриц на основе нуклеиновой кислоты, который может включать следующие этапы: (а) предоставление массива сайтов, в котором каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты, где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты, где первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и к первому праймеру присоединена обратимо блокирующая группа, где второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и ко второму праймеру присоединена обратимо блокирующая группа, и при этом обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому праймеру, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру; (b) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру; (с) достройку первого праймера посредством добавления первого аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе; (d) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена к аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру; (е) достройку второго праймера посредством добавления второго аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе, где обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида; и (f) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов.

В некоторых примерах осуществления раскрытый выше способ может дополнительно включать следующие этапы: (g) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру; (h) после проведения этапа (g) достройку первого праймера присоединением третьего аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе; (i) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру; (j) после проведения этапа (i) достройку второго праймера присоединением четвертого аналога нуклеотида, который присоединен к обратимо блокирующей группе, причем обратимо блокирующая группа, которая присоединена к третьему аналогу нуклеотида, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена к четвертому аналогу нуклеотида; и (k) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру при проведении этапа (h), и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру при проведении этапа (j), на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов. Этапы (g)-(k) могут быть необязательно повторены.

Следует понимать, что этапы, представленные в приведенном выше примере осуществления и других примерах осуществления настоящего изобретения, не обязательно должны следовать в упомянутом порядке. Например, в примере осуществления, приведенном в предыдущих разделах, этап (f), который включает действия по обнаружению, не обязательно должен быть выполнен после этапа (е). Напротив, первый праймер, достраиваемый в этапе (с), может быть обнаружен до проведения достройки второго праймера в этапе (d). Обычно этап обнаружения может быть выполнен до или после удаления одной или более различных обратимо блокирующих групп.

Для соответствия конкретному применению способов порядок проведения других этапов может быть изменен. Примеры двух способов, в которых могут быть применены аналогичные этапы в другом порядке, показаны сравнением циклических диаграмм, представленных на Фиг. 1 и Фиг. 2. В циклической диаграмме, показанной на Фиг. 1, метки на продуктах достройки праймера определяют перед проведением деблокирования и отщепления меток. Показано, что деблокирование и отщепление меток у нуклеотидов каждого набора происходит одновременно; это может быть удобно, например, если оба набора чувствительны к одной и той же обработке, или если обработки совместимы. Однако деблокирование и отщепление метки могут быть проведены по отдельности. Как показано в примере циклической диаграммы, представленной на Фиг. 2, отщепление метки и деблокирование проводят по отдельности. В этом примере различные метки, которые присутствуют на протяжении двух различных реакций (т.е. R1 и R2), отщепляются одновременно. Это удобно, например, если оба типа меток могут быть отщеплены с помощью одной обработки или при использовании совместимых обработок. Сравнение циклических диаграмм, представленных на Фиг. 1 и Фиг. 2, позволяет выявлять и другие отличия. Например, на Фиг. 1, деблокирование продуктов достройки, полученных в обеих реакциях (R1 и R2), производят после проведения этапа обнаружения предыдущего цикла, в то время как на Фиг. 2 продукт R2 достройки деблокируют перед проведением этапа обнаружения предыдущего цикла, и продукт R1 достройки деблокируют после проведения этапа обнаружения предыдущего цикла. Существует множество различных конфигураций и порядков проведения этапов, которые могут быть применены в способе, рассмотренном в настоящей работе. Специалисты в данной области техники смогут с легкостью выбрать требуемую конфигурацию и порядок на основании информации, изложенной в настоящей работе, и известных характеристик реакционной способности применяемых реагентов.

Кроме того, как показано выше в настоящем описании, этапы способов согласно изобретению могут быть выполнены последовательно или одновременно. Например, селективное удаление различных обратимо блокирующих групп (например, этапы (b) и (d) предыдущих абзацев) может быть выполнено одновременно или последовательно. Аналогично, достройка различных праймеров (например, этапы (с) и (е) предыдущих абзацев), которые были деблокированы с помощью соответствующих различных деблокирующих обработок, может быть произведена одновременно или последовательно.

Для мультиплексных вариантов применения способов, рассмотренных в настоящей работе, особенно подходят универсальные примирующие сайты.

Универсальный примирующий сайт предоставляет область последовательности, которая одинакова для двух или более молекул нуклеиновых кислот, причем эти молекулы также имеют различающиеся последовательности в матричных областях. Универсальная примирующая последовательность, присутствующая в различных членах группы молекул, может способствовать проведению репликации, амплификации или обнаружения множества различных последовательностей с помощью единственного вида универсального праймера, который комплементарен универсальной последовательности. Примеры способов присоединения универсальных последовательностей к группе целевых нуклеиновых кислот имеются в опубликованной патентной заявке US 2007/0128624 А1, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

В примерах осуществления настоящего изобретения первый праймер может иметь первую универсальную последовательность праймера, которая комплементарна первому универсальному примирующему сайту для первой матрицы, находящейся на сайте массива. Тот же самый универсальный примирующий сайт может присутствовать на разных сайтах массива для множества различных первых матриц. Таким образом, один вид первого универсального праймера может быть применен для амплификации или достройки различных первых матриц, находящихся на сайтах. Продолжая описание этого примера, второй праймер может иметь вторую универсальную последовательность праймера, которая комплементарна второму универсальному примирующему сайту для второй матрицы, находящейся на сайте, на котором также находится первая матрица. Тот же самый второй универсальный примирующий сайт может присутствовать на разных сайтах массива для множества различных вторых матриц. Таким образом, один вид второго универсального праймера может быть применен для амплификации или достройки различных вторых матриц, находящихся на сайтах.

Способ ортогонального секвенирования, рассмотренный в настоящей работе, может быть применен в способах секвенирования парных концов. Обычно секвенирование парных концов включает определение последовательностей на двух концах области матричной последовательности, при условии, что длина области матричной последовательности известна. Способы фрагментации образца целевой нуклеиновой кислоты (например, образца геномной ДНК), присоединения праймеров для облегчения прочтений парных концов и прочтения последовательности с концов фрагментов известны и могут быть выполнены как рассмотрено, например, в патентах US 7754429, US 8017335 или US 8192930, содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

В случае примера осуществления секвенирования синтезом могут быть сконструированы фрагменты нуклеиновой кислоты, включающие две матричные последовательности, и прочтения парных концов могут быть получены от каждой из двух матриц, в результате чего получают 4 прочтения одного фрагмента. Один из примеров конструкции для получения 4 прочтений одного фрагмента и способов получения конструкции представлен в опубликованной патентной заявке US 2015/0031560 А1, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение дополнительно относится к массиву нуклеиновых кислот, который включает множество сайтов, находящихся на твердой подложке, где каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты, где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты, где первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и к первому праймеру присоединена первая обратимо блокирующая группа, где второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и ко второму праймеру присоединена вторая обратимо блокирующая группа, и при этом первая обратимо блокирующая группа отличается от второй обратимо блокирующей группы. Массив нуклеиновых кислот может дополнительно включать один или более компонентов, рассмотренных в контексте способов согласно настоящему изобретению. В некоторых примерах осуществления продукты, которые закономерно получаются при выполнении способов, рассмотренных в настоящей работе, также считаются компонентами нуклеиновых кислот.

В определенных примерах осуществления массив нуклеиновых кислот включает первую полимеразу, которая связана с первым праймером и первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, находящимися на сайте. Дополнительно, вторая полимераза может быть связана со вторым праймером и второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, находящимися на сайте. В некоторых случаях первая полимераза и вторая полимераза представляют собой один вид полимеразы. Однако в некоторых примерах осуществления также может быть полезно, чтобы первая и вторая полимеразы относились к разным видам (например, были ДНК-полимеразой и РНК-полимеразой).

Массив нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению может находиться в установке для обнаружения, такой как установка для секвенирования нуклеиновых кислот. Примеры установок для обнаружения рассмотрены в настоящей работе и в цитируемой литературе, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Обычно установка для обнаружения может включать массив нуклеиновых кислот и детектор, установленный для обнаружения одного или более сайтов массива. Обычно пространственное разрешение детектора слишком мало для разнесения точек, находящихся на расстоянии, эквивалентном расстоянию между первым праймером и вторым праймером на каждом из сайтов. Однако, применение ортогонального деблокирования и достройки праймера позволяет различать праймеры. Как показано в настоящем описании, конфигурация детектора может обеспечивать регистрацию любого из множества разнообразных сигналов. Например, в некоторых примерах осуществления детектор представляет собой оптический детектор. Сайты массива могут иметь оптические метки, которые доступны для обнаружения оптическим детектором. При достройке в различные праймеры, находящиеся на каждом из сайтов, могут быть введены различные оптические метки, и конфигурация оптического детектора может обеспечивать оптическое распознавание различных меток (например, благодаря разности в длинах волн поглощения света, длинах волн возбуждения люминесценции или длинах волн эмиссии люминесценции). В некоторых конфигурациях пиксель детектора предназначен для одновременного приема сигналов от первого праймера и от второго праймера.

В настоящей работе цитировались различные публикации, патенты или патентные заявки. Содержание всех этих публикаций полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Термин "включающий" имеет неограничивающее значение и включает не только перечисленные элементы, но также включает любые дополнительные элементы.

Выше был рассмотрен ряд примеров осуществления. Тем не менее, следует понимать, что в них могут быть внесены различные изменения. Соответственно, другие примеры осуществления включены в объем, ограничиваемый прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Данная группа изобретений относится к анализу нуклеиновых кислот. Предложены способы секвенирования матриц на основе нуклеиновой кислоты, которые включают предоставление массива сайтов, включающих смесь различных матриц, и достройку праймеров, которые включают различные обратимо блокирующие группы и гибридизованы с различными матрицами, что приводит к образованию различных продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов, а также обнаружение продуктов достройки праймера и удаление обратимо блокирующих групп с продуктов достройки праймера, причем упомянутые действия повторяют с целью определения последовательности различных аналогов нуклеотидов, присоединенных к каждому из различных продуктов достройки, находящихся на каждом из сайтов, ортогональным образом. Кроме того, предложен массив сайтов нуклеиновых кислот, связанных с упомянутыми праймерами, для использования в указанных способах. Использование селективного и ортогонального деблокирования матриц в одном и том же сайте массива позволяет увеличивать сбор информации от массива по меньшей мере в 2 раза. 3 н. и 71 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ секвенирования матриц на основе нуклеиновой кислоты, который включает:

(a) предоставление массива, содержащего множество сайтов, в котором каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты,

где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты,

где первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и к первому праймеру присоединена первая обратимо блокирующая группа,

где второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и ко второму праймеру присоединена вторая обратимо блокирующая группа, и

при этом обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому праймеру, отличается от обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру;

(b) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена к первому праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру;

(c) достройку первого праймера посредством добавления первого аналога нуклеотида, содержащего первую обратимо блокирующую группу;

(d) селективное удаление обратимо блокирующей группы, которая присоединена ко второму праймеру, при одновременном удержании обратимо блокирующей группы, которая присоединена к аналогу нуклеотида, который добавлен к первому праймеру;

(e) достройку второго праймера посредством добавления второго аналога нуклеотида, содержащего вторую обратимо блокирующую группу, причем обратимо блокирующая группа первого аналога нуклеотида, отличается от обратимо блокирующей группы второго аналога нуклеотида;

(f) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов ортогональным образом путем использования селективного деблокирования нуклеотидов;

(g) селективное удаление первой обратимо блокирующей группы первого аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру, при одновременном удержании второй обратимо блокирующей группы второго аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру;

(h) после проведения этапа (g) достройку первого праймера присоединением третьего аналога нуклеотида, содержащего третью обратимо блокирующую группу;

(i) селективное удаление второй обратимо блокирующей группы второго аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру, при одновременном удержании первой обратимо блокирующей группы первого аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру;

(j) после проведения этапа (i) достройку второго праймера присоединением четвертого аналога нуклеотида, содержащего четвертую обратимо блокирующую группу, причем обратимо блокирующая группа третьего аналога нуклеотида отличается от обратимо блокирующей группы четвертого аналога нуклеотида;

(k) обнаружение аналога нуклеотида, который добавлен к первому праймеру при проведении этапа (h), и аналога нуклеотида, который добавлен ко второму праймеру при проведении этапа (j), на каждом из сайтов, что позволяет определять различные последовательности первой матрицы и второй матрицы на каждом из сайтов ортогональным образом путем использования селективного деблокирования нуклеотидов; и

повторение этапов (g)-(k).

2. Способ по п. 1, в котором для обнаружения применяют детектор, пространственное разрешение которого слишком мало для различения точек, находящихся на расстоянии, эквивалентном расстоянию между первым праймером и вторым праймером, находящимися на каждом из сайтов.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором детектор представляет собой оптический детектор.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором аналоги нуклеотидов включают оптические метки.

5. Способ по п. 4, в котором первый аналог нуклеотида взят из первого набора аналогов нуклеотидов, второй аналог нуклеотида взят из второго набора аналогов нуклеотидов, и в котором оптические метки первого набора аналогов нуклеотидов отличаются от оптических меток второго набора аналогов нуклеотидов.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором первый аналог нуклеотида взят из первого набора аналогов нуклеотидов, второй аналог нуклеотида взят из второго набора аналогов нуклеотидов, и при этом аналоги нуклеотидов из субнабора, находящегося в первом наборе аналогов нуклеотидов, включают оптические метки.

7. Способ по п. 6, в котором аналоги нуклеотидов из субнабора, находящегося во втором наборе аналогов нуклеотидов, включают оптические метки.

8. Способ по п. 7, в котором аналоги нуклеотидов из субнабора, находящегося в первом наборе аналогов нуклеотидов, включают оптические метки, которые отличаются от оптических меток субнабора нуклеотидов, находящегося во втором наборе аналогов нуклеотидов.

9. Способ по любому из пп. 1-5, в котором первый аналог нуклеотида взят из первого набора аналогов нуклеотидов, второй аналог нуклеотида взят из второго набора аналогов нуклеотидов, и при этом аналоги нуклеотидов из первого набора включают только один тип оптической метки, которую определяют при проведении этапа (f), а аналоги нуклеотидов из второго набора включают только один тип оптической метки, которую определяют при проведении этапа (f).

10. Способ по п. 9, в котором один тип оптической метки присоединен к по существу всем аналогам нуклеотидов первого вида, находящимся в первом наборе,

один тип оптической метки присоединен к субнабору аналогов нуклеотидов второго вида, находящихся в первом наборе,

по существу все аналоги нуклеотидов третьего вида, находящиеся в первом наборе, присоединены к лиганду, и

по существу все аналоги нуклеотидов четвертого вида, находящиеся в первом наборе, не присоединены к одному типу оптической метки или к лиганду.

11. Способ по любому из пп. 1-5, в котором первый аналог нуклеотида взят из первого набора аналогов нуклеотидов, второй аналог нуклеотида взят из второго набора аналогов нуклеотидов, причем аналоги нуклеотидов из первого набора включают только два типа оптических меток, определение которых производят при проведении этапа (f), а аналоги нуклеотидов из второго набора включают только два типа оптических меток, определение которых производят при проведении этапа (f).

12. Способ по п. 11, в котором только одна из двух типов оптических меток присоединена к по существу всем аналогам нуклеотидов первого вида, находящимся в первом наборе,

только вторая из двух типов оптических меток присоединена к по существу всем аналогам нуклеотидов второго вида, находящимся в первом наборе,

одна из двух типов оптических меток и вторая из двух типов оптических меток присоединены к аналогам нуклеотидов третьего вида, находящимся в первом наборе, и

по существу все аналоги нуклеотидов четвертого вида, находящиеся в первом наборе, не присоединены ни к одной из двух типов оптических меток, ни ко второй из двух типов оптических меток.

13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором пиксель детектора одновременно принимает сигналы как от первого праймера, так и от второго праймера.

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором первая матрица на основе нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один фрагмент основания, который относится к такому же виду частиц, что и фрагмент основания, имеющийся во второй матрице на основе нуклеиновой кислоты.

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором этапы (b) и (d) выполняют последовательно.

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором этапы (c) и (e) выполняют последовательно.

17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором одна молекула нуклеиновой кислоты содержит первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты.

18. Способ по любому из пп. 1-16, в котором первая матрица на основе нуклеиновой кислоты и вторая матрица на основе нуклеиновой кислоты находятся в разных молекулах нуклеиновых кислот.

19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором площади сайтов составляют 100 мкм² или менее.

20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором сайты включают множество ампликонов первой матрицы на основе нуклеиновой кислоты и множество ампликонов второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты.

21. Способ по п. 20, в котором множество ампликонов включает кластер нуклеиновой кислоты.

22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором множество сайтов имеет шаг, составляющий 10 мкм или менее.

23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором множество сайтов включает по меньшей мере 1 × 10⁶ сайтов.

24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором каждый из сайтов включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая уникальна по сравнению с последовательностями нуклеиновых кислот на других сайтах массива.

25. Способ по любому из пп. 1-24, в котором первый праймер включает первую универсальную последовательность праймера, а первая матрица на основе нуклеиновой кислоты на каждом из сайтов множества сайтов включает первую универсальную последовательность связывания праймера, которая комплементарна первой универсальной последовательности праймера.

26. Способ по п. 25, в котором второй праймер включает вторую универсальную последовательность праймера, а вторая матрица на основе нуклеиновой кислоты на каждом сайте множества сайтов включает вторую универсальную последовательность связывания праймера, которая комплементарна второй универсальной последовательности праймера, причем первая универсальная последовательность связывания праймера отличается от второй универсальной последовательности связывания праймера.

27. Способ по любому из пп. 1-26, в котором для выполнения этапов (c) и (e) применяют одну и ту же полимеразу или один и тот же вид полимеразы.

28. Способ по любому из пп. 1-27, в котором в качестве обратимо блокирующих групп применяют азидометильную и трет-бутокси-этоксигруппу.

29. Способ по п. 28, в котором азидометильную группу селективно удаляют обработкой фосфином, а трет-бутокси-этоксигруппу селективно удаляют обработкой кислотой.

30. Способ по любому из пп. 1-27, в котором селективное удаление обратимо блокирующих групп включает химическую обработку, тепловую обработку, облучение или электрическую обработку.

31. Способ по любому из пп. 1-30, в котором обратимо блокирующая группа, которая присоединена к первому праймеру, представляет собой такую же обратимо блокирующую группу, которая присоединена к первому аналогу нуклеотида.

32. Способ по п. 31, в котором обратимо блокирующая группа, которая присоединена ко второму праймеру, представляет собой такую же обратимо блокирующую группу, которая присоединена ко второму аналогу нуклеотида.

33. Способ секвенирования матриц на основе нуклеиновой кислоты, который включает:

(a) предоставление массива сайтов, в котором каждый сайт включает смесь по меньшей мере двух различных матриц на основе нуклеиновой кислоты;

(b) достройку праймеров, гибридизованных с различными матрицами на основе нуклеиновой кислоты на каждом из сайтов различными аналогами нуклеотидов, которые включают различные обратимо блокирующие группы, соответственно, что приводит к образованию различных продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов; и

(c) либо (i), либо (ii):

(i) обнаружение различных продуктов достройки праймера для распознавания различных аналогов нуклеотидов, находящихся на каждом сайте; и

удаление различных обратимо блокирующих групп с продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов, с помощью множества обработок, каждая из которых селективна для одной из каждой различных обратимо блокирующих групп; и

(ii) удаление различных обратимо блокирующих групп с продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов, с помощью множества обработок, каждая из которых селективна для одной из каждой различных обратимо блокирующих групп; и

обнаружение различных продуктов достройки праймера для распознавания различных аналогов нуклеотидов, находящихся на каждом сайте; и

(d) повторение этапов (b) и (с) с целью определения последовательности различных аналогов нуклеотидов, присоединенных к каждому из различных продуктов достройки, находящихся на каждом из сайтов, ортогональным образом.

34. Способ по п. 33, в котором праймеры, которые гибридизованы с различными матрицами на основе нуклеиновых кислот, одновременно присутствуют при проведении достройки этапа (b).

35. Способ по любому из пп. 33, 34, в котором различные продукты достройки праймера присутствуют одновременно при проведении обнаружения на этапе (c).

36. Способ по любому из пп. 33-35, в котором каждая из различных обратимо блокирующих групп присутствует одновременно на продуктах достройки праймера при проведении удаления на этапе (с).

37. Способ по любому из пп. 33-36, в котором этап (c) представляет собой (ii) удаление различных обратимо блокирующих групп с продуктов достройки праймера, находящихся на каждом из сайтов, с помощью множества обработок, каждая из которых селективна для одной из каждой различных обратимо блокирующих групп; и обнаружение различных продуктов достройки праймера для распознавания различных аналогов нуклеотидов, находящихся на каждом сайте.

38. Способ по любому из пп. 33-37, в котором для обнаружения применяют детектор, пространственное разрешение которого слишком мало для различения точек, находящихся на расстоянии, эквивалентном расстоянию между различными продуктами достройки праймера, находящимися на каждом из сайтов.

39. Способ по любому из пп. 33-38, в котором детектор представляет собой оптический детектор.

40. Способ по любому из пп. 33-39, в котором аналоги нуклеотидов включают оптические метки.

41. Способ по любому из пп. 33-40, в котором первый набор аналогов нуклеотидов добавлен к первому продукту из различных продуктов достройки праймера, а второй набор аналогов нуклеотидов добавлен ко второму продукту из различных продуктов достройки праймера, причем аналоги нуклеотидов из первого набора включают оптические метки, которые отличаются от оптических меток второго набора аналогов нуклеотидов.

42. Способ по любому из пп. 33-41, в котором пиксель детектора одновременно принимает сигналы от каждого из различных продуктов достройки праймера.

43. Способ по любому из пп. 33-42, в котором каждая из матриц на основе нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один фрагмент основания, который относится к такому же виду частиц, что и фрагмент основания, имеющийся в каждой из других матриц на основе нуклеиновой кислоты.

44. Способ по любому из пп. 33-43, в котором одна молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере две различные матрицы на основе нуклеиновой кислоты.

45. Способ по любому из пп. 33-43, в котором каждая из различных матриц на основе нуклеиновой кислоты находятся в разных молекулах нуклеиновых кислот.

46. Способ по любому из пп. 33-45, в котором площади сайтов составляют 100 мкм² или менее.

47. Способ по любому из пп. 33-46, в котором сайты включают множество ампликонов каждой из по меньшей мере двух различных матриц на основе нуклеиновой кислоты.

48. Способ по п. 47, в котором множество ампликонов включает кластер нуклеиновой кислоты.

49. Способ по любому из пп. 33-48, в котором множество сайтов имеет шаг, составляющий 10 мкм или менее.

50. Способ по любому из пп. 33-49, в котором множество сайтов включает по меньшей мере 1 × 10⁶ сайтов.

51. Способ по любому из пп. 33-50, в котором каждый из сайтов включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая уникальна по сравнению с последовательностями нуклеиновых кислот на других сайтах массива.

52. Способ по любому из пп. 33-51, в котором одна и та же полимераза или один и тот же вид полимеразы выполняет на каждом из сайтов достройку праймеров, гибридизованных с различными матрицами на основе нуклеиновой кислоты.

53. Способ по любому из пп. 33-52, в котором селективные обработки включают селективное удаление обратимо блокирующей группы, которое включает удаление азидометильной группы с помощью обработки фосфином, и селективное удаление обратимо блокирующей группы, которое включает удаление трет-бутокси- этоксигруппы с помощью обработки кислотой.

54. Способ по любому из пп. 33-52, в котором селективное удаление обратимо блокирующих групп включает химическую обработку, тепловую обработку, облучение или электрическую обработку.

55. Массив сайтов нуклеиновых кислот для использования в способе по п. 1 или 33, включающий:

множество сайтов на твердой подложке, в котором каждый сайт включает первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты,

где первая матрица на основе нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая отличается от последовательности второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты,

где первый праймер связан с первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и к первому праймеру присоединена первая обратимо блокирующая группа,

где второй праймер связан со второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, ко второму праймеру присоединена вторая обратимо блокирующая группа, и

при этом первая обратимо блокирующая группа отличается от второй обратимо блокирующей группы;

где указанная первая обратимо блокирующая группа является деблокируемой посредством первой деблокирующей обработки, и указанная вторая обратимо блокирующая группа является деблокируемой посредством второй деблокирующей обработки,

где указанная первая деблокирующая обработка является селективной для первой обратимо блокирующей группы по сравнению со второй обратимо блокирующей группой, а указанная вторая деблокирующая обработка является селективной для второй обратимо блокирующей группы по сравнению с первой обратимо блокирующей группой.

56. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 55, в котором каждый сайт занимает на твердой подложке площадь, составляющую 100 мкм² или менее.

57. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 55 или 56, в котором множество сайтов имеет шаг, составляющий 10 мкм или менее.

58. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 55-57, в котором множество сайтов включает по меньшей мере 1 × 10⁶ сайтов.

59. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 58, в котором каждый из сайтов включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая уникальна по сравнению с последовательностями нуклеиновых кислот на других сайтах множества.

60. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 55-59, в котором первая обратимо блокирующая группа присоединена к 3’-нуклеотиду первого праймера.

61. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 60, в котором 3’-нуклеотид первого праймера содержит первую оптическую метку.

62. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 60-61, в котором вторая обратимо блокирующая группа присоединена к 3’-нуклеотиду второго праймера.

63. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 62, в котором 3’-нуклеотид второго праймера содержит вторую оптическую метку, и вторая оптическая метка оптически отличается от первой оптической метки.

64. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 60-63, в котором первая и вторая оптические метки включают флуорофоры.

65. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 58-64, в котором первая матрица на основе нуклеиновой кислоты и вторая матрица на основе нуклеиновой кислоты включают ДНК.

66. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 58-65, в котором одна молекула нуклеиновой кислоты содержит первую матрицу на основе нуклеиновой кислоты и вторую матрицу на основе нуклеиновой кислоты.

67. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 58-66, в котором первая матрица на основе нуклеиновой кислоты и вторая матрица на основе нуклеиновой кислоты находятся в разных молекулах нуклеиновых кислот.

68. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 58-67, в котором сайты включают множество ампликонов первой матрицы на основе нуклеиновой кислоты и множество ампликонов второй матрицы на основе нуклеиновой кислоты.

69. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 68, в котором множество ампликонов включает кластер нуклеиновой кислоты.

70. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 55-69, в котором первый праймер включает первую универсальную последовательность праймера, а первая матрица на основе нуклеиновой кислоты на каждом из сайтов множества сайтов включает первую универсальную последовательность связывания праймера, которая комплементарна первой универсальной последовательности праймера.

71. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 70, в котором второй праймер включает вторую универсальную последовательность праймера, а вторая матрица на основе нуклеиновой кислоты на каждом сайте множества сайтов включает вторую универсальную последовательность связывания праймера, которая комплементарна второй универсальной последовательности праймера, и при этом первая универсальная последовательность связывания праймера отличается от второй универсальной последовательности связывания праймера.

72. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 55-71, в котором первая полимераза связана с первым праймером и первой матрицей на основе нуклеиновой кислоты.

73. Массив сайтов нуклеиновых кислот по п. 72, в котором вторая полимераза связана со вторым праймером и второй матрицей на основе нуклеиновой кислоты, и при этом первая полимераза и вторая полимераза относятся к одному виду полимеразы.

74. Массив сайтов нуклеиновых кислот по любому из пп. 55-73, в котором первая обратимо блокирующая группа включает азидометильную группу, а вторая обратимо блокирующая группа включает трет-бутокси-этоксигруппу.