СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИГАНДОВ НА МАТРИЦАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНДЕКСОВ И ШТРИХКОДОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/10 C12Q1/6827 C12Q1/6869 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США 62/903,108, поданной 20 сентября 2019 г., озаглавленной METHODS AND COMPOSITIONS FOR HIGH-THROUGHPUT GENOTYPING ON ARRAYS USING INDEXES AND BARCODES; и по предварительной заявке на патент США №62/750,370, поданной 25 октября 2018 г., озаглавленной POSITIONAL IDENTIFICATION OF MICROFEATURES IN ARRAYS USING BARCODES, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ [0002]

Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают способы и композиции для обнаружения лигандов-мишеней на матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата специфически связывается с лигандом-мишенью из образца, определяют положение содержащих зонд захвата гранул в матрице и декодируют гранулу для определения зонда захвата и образца. В некоторых вариантах осуществления штрихкод указывает на наличие зонда захвата, прикрепленного к грануле; а индекс указывает на субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления штрихкод и индекс определяют посредством секвенирования.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологической пробе, использовали, например, в качестве способа определения и классификации микроорганизмов, диагностики инфекционных заболеваний, обнаружения и получения характеристик генетических аномалий, определения генетических изменений, связанных с раком, изучения генетической предрасположенности к заболеванию и оценки ответа на различные типы лечения. Распространенной методикой обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей в биологической пробе является секвенирование нуклеиновых кислот.

[0004] Методика секвенирования нуклеиновых кислот в значительной степени развилась от способов химического разложения, используемых Максамом и Гилбертом, и способов удлинения цепи, используемых Сэнгером. В настоящее время используют несколько методик секвенирования, которые позволяют проводить параллельную обработку тысяч нуклеиновых кислот, все на одном чипе. Некоторые платформы включают конфигурации на основе гранул и микрочипов, в которых гранулы диоксида кремния функционализированы зондами в зависимости от использования таких конфигураций в областях применения, включающих секвенирование, генотипирование, профилирование экспрессии генов.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Некоторые варианты осуществления включают способ обнаружения множества лигандов-мишеней, включающий: (а) получение первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, при этом индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции; (b) приведение первых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул; (с) распределение первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфически связанные первый и второй лиганды-мишени, на субстрате; (d) обнаружение зондов захвата, специфически связанных с первым и вторым лигандами-мишенями; и (е) декодирование положений гранул, содержащих обнаруженные зонды захвата, на субстрате.

[0006] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, первый и второй лиганды-мишени содержат нуклеиновые кислоты, а стадия (d) включает удлинение зондов захвата, специфически связанных с первым и вторым лигандами-мишенями.

[0007] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата.

[0008] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности.

[0009] В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул содержат одни и те же нуклеотидные последовательности.

[0010] В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0011] В некоторых вариантах осуществления стадия (d) включает полимеразное удлинение зондов захвата.

[0012] В некоторых вариантах осуществления стадия (d) включает лигазное удлинение зондов захвата.

[0013] В некоторых вариантах осуществления стадия (d) включает однонуклеотидное удлинение зондов захвата.

[0014] В некоторых вариантах осуществления стадия (d) включает удлинение зондов захвата множеством нуклеотидов.

[0015] В некоторых вариантах осуществления удлиненные зонды захвата содержат обнаруживаемую метку.

[0016] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0017] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями.

[0018] В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.

[0019] В некоторых вариантах осуществления обнаружение предусматривает приведение первого и второго лигандов-мишеней, специфически связанных с зондами захвата, в контакт со вторичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит обнаруживаемую метку.

[0020] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера (праймера штрихкода) содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0021] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность.

[0022] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера (праймера индекса) содержат одну и туже нуклеотидную последовательность.

[0023] В некоторых вариантах осуществления приведение первого лиганда-мишени в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул осуществляется в разных реакционных объемах.

[0024] Некоторые варианты осуществления также предусматривают объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения первой и второй субпопуляций гранул на субстрате.

[0025] В некоторых вариантах осуществления первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул.

[0026] В некоторых вариантах осуществления стадию (d) выполняют до стадии (с).

[0027] В некоторых вариантах осуществления обнаруженные зонды захвата содержат обнаруживаемую метку.

[0028] В некоторых вариантах осуществления стадия (d) дополнительно включает определение положения обнаруженных зондов захвата на субстрате.

[0029] В некоторых вариантах осуществления определение положения обнаруженных зондов захвата включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза.

[0030] В некоторых вариантах осуществления стадия (е) включает декодирование положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата, путем секвенирования индексов на субстрате.

[0031] В некоторых вариантах осуществления стадия (е) включает декодирование положения штрихкодов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата, путем секвенирования штрихкодов на субстрате.

[0032] В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.

[0033] В некоторых вариантах осуществления распределенные первая и вторая субпопуляции гранул содержат матрицу.

[0034] В некоторых вариантах осуществления первый и второй лиганды-мишени получают от разных субъектов.

[0035] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 зондов захвата, отличающихся друг от друга.

[0036] Некоторые варианты осуществления также включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

[0037] Некоторые варианты осуществления включают способ обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени, включающий: (а) получение нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей первый участок, способный к гибридизации с первым зондом захвата, и второй участок, способный к гибридизации со вторым зондом захвата; (b) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит: первый зонд захвата, второй зонд захвата, причем второй зонд захвата прикреплен к грануле посредством расщепляемого линкера, при этом второй зонд захвата содержит обнаруживаемую метку, а также первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонд захвата, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода; (с) лигирование первого зонда захвата со вторым зондом захвата, включающее: гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с первым и вторым зондами захвата гранулы популяции гранул для получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей одноцепочечный гэп между первым и вторым зондами захвата, и заполнение гэпа между первым и вторым зондами захвата; (d) расщепление расщепляемого линкера с получением первого зонда захвата, содержащего обнаруживаемую метку; (е) распределение популяции гранул на субстрате; и (f) декодирование положения гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате.

[0038] В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата содержит первый полинуклеотид.

[0039] В некоторых вариантах осуществления стадию (е) выполняют до стадии (d).

[0040] В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на источник нуклеиновой кислоты-мишени, и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса.

[0041] В некоторых вариантах осуществления стадия (f) включает определение положения первого зонда захвата, содержащего обнаруживаемую метку, на субстрате.

[0042] В некоторых вариантах осуществления стадия (f) включает декодирование положения штрихкода гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате путем секвенирования штрихкода на субстрате.

[0043] В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.

[0044] В некоторых вариантах осуществления распределенная популяция гранул содержит матрицу.

[0045] В некоторых вариантах осуществления популяция гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул, каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции.

[0046] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность.

[0047] В некоторых вариантах осуществления стадию лигирования или расщепления с первой субпопуляцией гранул выполняют в объеме реакции, отличающемся от стадии лигирования или расщепления со второй субпопуляцией гранул.

[0048] Некоторые варианты осуществления также предусматривают объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения субпопуляции гранул на субстрате.

[0049] В некоторых вариантах осуществления первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул.

[0050] В некоторых вариантах осуществления стадия (f) включает декодирование положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата, путем секвенирования индексов на субстрате.

[0051] Некоторые варианты осуществления включают набор, содержащий: первую и вторую субпопуляции гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции, при этом первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул.

[0052] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата выбран из нуклеиновой кислоты, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0053] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата.

[0054] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями.

[0055] В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.

[0056] Некоторые варианты осуществления включают способ декодирования положений полинуклеотидов в матрице, включающий: (а) получение субстрата, имеющего матрицу полинуклеотидов, распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит сайт связывания праймера 3' относительно штрихкода, при этом каждый полинуклеотид связан с зондом захвата; (b) гибридизацию множества праймеров с сайтами связывания праймера; и (с) определение последовательностей штрихкодов путем удлинения гибридизованных праймеров, причем последовательность каждого штрихкода указывает на положение полинуклеотида в матрице.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0057] На ФИГ. 1 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего штрихкод, сайт связывания праймера и зонд захвата, присоединенный к грануле посредством 5'-линкера.

[0058] На ФИГ. 2 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего зонд захвата, штрихкод и сайт связывания праймера, присоединенный к грануле посредством 5'-линкера, причем между зондом захвата и штрихкодом обеспечен расщепляемый линкер.

[0059] На ФИГ. 3 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего штрихкод, сайт связывания праймера и зонд захвата, присоединенный к грануле посредством 3'-линкера.

[0060] На ФИГ. 4 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего спейсер, штрихкод, сайт связывания праймера и зонд захвата, присоединенный к грануле посредством 5'-линкера.

[0061] На ФИГ. 5А показан пример осуществления гранулы с прикрепленным первым полинуклеотидом, содержащим штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата, и с прикрепленным вторым полинуклеотидом, содержащим индекс и сайт связывания индексного праймера.

[0062] На ФИГ. 5В показан пример осуществления нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей однонуклеотидный полиморфизм (SNP), гибридизованный к прикрепленному к грануле зонду захвата.

[0063] На ФИГ. 5С изображен пример осуществления зонда захвата, удлиненного обнаруживаемым маркером.

[0064] На ФИГ. 5D показан пример осуществления штрихкодового праймера, гибридизованного с сайтом связывания штрихкодового праймера, и удлинение штрихкодового праймера.

[0065] На ФИГ. 5Е показан пример осуществления индексного праймера, гибридизованного с сайтом связывания индексного праймера, и удлинение индексного праймера.

[0066] На ФИГ. 6А показан пример осуществления: гранулы, содержащей один полинуклеотид, содержащий зонд захвата (слева); гранулы, содержащей зонд захвата нуклеиновой кислоты, полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и полинуклеотид, содержащий индекс, позволяющий отличить одну субпопуляцию гранул от другой субпопуляции гранул (в середине); и гранулы, содержащей зонд захвата, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и полинуклеотид, содержащий индекс, позволяющий отличить одну субпопуляцию гранул от другой субпопуляции гранул (справа).

[0067] На ФИГ. 6В показаны примеры осуществления: гранулы, содержащей первый и второй зонды захвата, гибридизованные с нуклеиновой кислотой-мишенью, причем первый зонд захвата содержит расщепляемый линкер (слева); и гранулы, содержащей зонд захвата белка, который временно связывает субстрат для генерации сигнала, содержащего обнаруживаемую метку (справа).

[0068] На ФИГ. 6С показан пример осуществления двухзондового анализа, в котором нуклеиновая кислота-мишень гибридизована с первым и вторым зондами захвата на грануле, первый зонд захвата лигирован по отношению ко второму зонду захвата, а расщепляемый линкер расщеплен для получения гранулы, содержащей удлиненный первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку.

[0069] На ФИГ. 7А представлена фотография пула гранул, иммобилизованного на проточной кювете.

[0070] На ФИГ. 7В представлена гистограмма количества копий для определенных типов гранул в определенных ячейках.

[0071] На ФИГ. 7С представлен график сравнения средней интенсивности С и средней интенсивности Т. Средняя интенсивность С является интенсивностью флуоресценции, поступающей от меченого цитозина в паре нуклеотидов, а средняя интенсивность Т является интенсивностью флуоресценции от меченого тимидина в паре нуклеотидов.

[0072] На ФИГ. 8 представлена гистограмма количества определенных типов гранул в определенных ячейках для репрезентативной пробы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0073] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают способы и композиции для обнаружения лигандов-мишеней на матрице. В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень может содержать нуклеиновую кислоту, белок или другой антиген. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата специфически связывается с лигандом-мишенью из образца, определяют положение содержащих зонд захвата гранул в матрице и декодируют гранулу для определения зонда захвата и образца. В некоторых вариантах осуществления штрихкод указывает на наличие зонда захвата, прикрепленного к грануле; а индекс указывает на субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления штрихкод и индекс определяют посредством секвенирования. Некоторые варианты осуществления также включают двухзондовый анализ, в котором первый и второй зонды захвата, прикрепленные к грануле, лигируют друг с другом в присутствии нуклеиновой кислоты-мишени, конец продукта лигирования отщепляют от гранулы, а гранулу, содержащую удлиненный зонд захвата, обнаруживают и декодируют на матрице.

[0074] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к высокопроизводительному генотипированию на матрицах. Некоторые варианты осуществления относятся к декодированию положений микроэлементов в матрице. В некоторых вариантах осуществления микроэлементы содержат полинуклеотиды, имеющие штрихкоды и индексы. Некоторые варианты осуществления включают секвенирование штрихкодов и индексов для определения положений полинуклеотидов в матрице.

[0075] Декодирование путем гибридизации включает определение положения зонда захвата в матрице зондов захвата, распределенной случайным образом. Способ обычно включает несколько последовательных циклов гибридизации меченых зондов гибридизации с одним или более участками зонда захвата, визуализацию событий гибридизации и удаление зондов гибридизации. Для декодирования путем гибридизации требуются специальные реагенты, специальные жидкостные устройства и специальные детекторы. В некоторых вариантах осуществления декодирование путем гибридизации может занимать до 8 часов с 7-8 последовательными циклами.

[0076] Варианты осуществления изобретения включают случайным образом распределенные матрицы полинуклеотидов, содержащие сайт связывания праймера и штрихкод. В некоторых вариантах осуществления штрихкод можно быстро секвенировать для декодирования матрицы с использованием высокопроизводительной системы секвенирования. Некоторые варианты осуществления могут существенно сократить время, необходимое для декодирования матрицы без дополнительных реагентов, зондов гибридизации или специализированного декодирующего оборудования.

[0077] Некоторые варианты осуществления включают применение методик секвенирования следующего поколения (NGS) и микрочипов на основе гранул. В некоторых таких вариантах осуществления предложены высокоэффективные недорогие и высокопроизводительные генотипирующие анализы, которые можно выполнять на стандартной платформе для секвенирования NGS с небольшими модификациями субстратов и реагентов.

[0078] В некоторых способах мультиплексирования множество образцов нуклеиновых кислот из разных источников можно обрабатывать параллельно с поддержанием физического разделения каждого образца. Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают способ индексирования нуклеиновой кислоты, который путем индексирования каждого образца по индексу на соответствующей грануле устраняет необходимость в физических барьерах, разделяющих отдельные образцы на всех стадиях. В некоторых вариантах осуществления демультиплексирование индексов выполняют путем секвенирования, и это можно обеспечить на объекте потребителя с использованием стандартного химического секвенирования путем синтеза (SBS). Кроме того, при принятии подхода с использованием декодирования путем секвенирования (DBS), который можно обеспечить на объекте потребителя с использованием стандартной платформы и химического SBS, сокращаются ограничения по затратам, пространству и времени, связанные с внутренним декодированием матрицы гранул.

[0079] Некоторые варианты осуществления содержат пул гранул с индексированным обогащением, содержащий гранулу, изображенную на ФИГ. 5А. В некоторых таких вариантах осуществления гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий локус-специфический зонд захвата, штрихкод для идентификации положения соответствующего зонда на матрице и сайт связывания штрихкодового праймера для считывания штрихкода посредством SBS; и второй полинуклеотид, содержащий индекс для мультиплексирования образца и сайт связывания индексного праймера для считывания индекса посредством SBS.

[0080] В некоторых вариантах осуществления сложность пула гранул определяется количеством зондов захвата или количеством составных (N) и количеством поддерживаемых (S) образцов. Таким образом, пул гранул, поддерживающий количество составных N и образцов S, будет состоять из S × N уникальных типов гранул. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата и/или индексные праймеры включают дополнительные 3'-ортогональные блокаторы для предотвращения интерференции во время SBS на одном из двух олигонуклеотидов.

[0081] Некоторые варианты осуществления включают проведение анализа генотипирования, в котором в многолуночный планшет, содержащий S лунок, загружают S пулов гранул, причем каждый пул гранул имеет уникальный индекс образца, при этом каждая лунка содержит N уникальных типов гранул. После генерирования библиотеки нуклеиновых кислот из образцов такая обработка образца нуклеиновой кислоты на стадиях, включающих случайную амплификацию праймера с последующей ферментативной фрагментацией и очисткой, каждую библиотеку образцов добавляют в индексированную лунку и позволяют гибридизироваться с зондами захвата. После завершения гибридизации путем добавления инкорпорационной смеси, которая включает флуоресцентные нуклеотиды и соответствующую полимеразу, выполняют анализ достройки по одному основанию для зондирования представляющего интерес SNP. В конце встраивания все образцы захвата гранул на планшете объединяют и загружают в проточную кювету. Проточная кювета может быть ровной или структурированной, а поверхность может быть надлежащим образом модифицирована для поддержания иммобилизации гранул при желаемой плотности. В некоторых вариантах осуществления после иммобилизации гранул выполняют считывание SNP, которое включает один цикл сканирования для считывания сигнала, полученного от флуоресцентной инкорпорации на сайте SNP. Этот цикл может включать цикл SBS на устройстве. Для определения зонда захвата и положения конкретной гранулы внутри проточной кюветы также проводят считывание штрихкода, которое включает 12-20 циклов SBS, в зависимости от количества составных пула гранул. В некоторых вариантах осуществления эту стадию можно заменять дополнительными циклами секвенирования после определенного SNP. Кроме того, выполняют считывание индекса образца, которое включает 6-12 циклов SBS для чтения индекса образца. В некоторых вариантах осуществления весь анализ на проточной кювете может включать менее около 30 циклов SBS и может выполняться менее чем за 4 часа.

[0082] В настоящем документе термин «матрица» может относиться к популяции различных микроэлементов, таких как микроэлементы, содержащие полинуклеотиды, которые связаны или прикреплены к поверхности так, что разные микроэлементы можно отличить друг от друга в соответствии с относительным положением. Отдельный элемент матрицы может включать в себя одну копию микроэлемента или же может присутствовать множество копий микроэлемента в виде популяции микроэлементов в отдельном элементе матрицы. Популяция микроэлементов в каждом элементе, как правило, является гомогенной и имеет один вид микроэлементов. Таким образом, на элементе может присутствовать множество копий одной нуклеотидной последовательности, например, множество молекул нуклеиновых кислот, имеющих одинаковую последовательность.

[0083] В некоторых вариантах осуществления на элементе может присутствовать гетерогенная популяция микроэлементов. Таким образом, элемент может, но не обязательно, включать только один вид микроэлемента и может вместо этого содержать множество различных видов микроэлементов, таких как смесь нуклеиновых кислот, имеющих различные последовательности. Соседние элементы матрицы могут отделяться друг от друга без перекрывания. Соответственно, элементы могут быть расположены рядом друг с другом или разделяться гэпом. В вариантах осуществления, в которых элементы разнесены друг от друга, соседние сайты могут быть разнесены, например, на расстояние менее 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм, 100 пм, 50 пм, 1 пм или любое расстояние в пределах диапазона из любых двух вышеперечисленных расстояний. Расположение элементов на матрице также можно понимать с точки зрения межцентровых расстояний между соседними элементами. Используемая в изобретении матрица может иметь соседние элементы с межцентровым расстоянием менее около 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм, 100 пм, 50 пм, 1 пм или любым расстоянием в пределах диапазона из любых двух вышеперечисленных расстояний.

[0084] В некоторых вариантах осуществления значения расстояний, описанные выше или в любом другом месте этого документа, могут представлять собой среднее расстояние между соседними элементами матрицы. Таким образом, не все соседние элементы должны находиться в указанном диапазоне, если иное не указано особо, например, посредством конкретного утверждения о том, что расстояние представляет собой пороговое расстояние между всеми соседними элементами матрицы. Варианты осуществления могут использоваться с матрицами, имеющими элементы с различными значениями плотности. Примеры диапазонов значений плотности для некоторых вариантов осуществления включают от около 10000000 элементов/см² до около 2000000000 элементов/см²; от около 100000000 элементов/см² до около 1000000000 элементов/см²; от около 100000 элементов/см² до около 10000000 элементов/см²; от около 1000000 элементов/см² до около 5000000 элементов/см²; от около 10000 элементов/см² до около 100000 элементов/см²; от около 20000 элементов/см² до около 50000 элементов/см²; от около 1000 элементов/см² до около 5000 элементов/см² или любую плотность в пределах диапазона из любых двух вышеуказанных плотностей.

[0085] В настоящем документе термин «поверхность» может относиться к части субстрата или опорной структуры, которая доступна для контакта с реагентами, гранулами или аналитами. Поверхность может быть по существу ровной или плоской. Альтернативно поверхность может иметь закругленную или контурную форму. Примерами контуров, которые можно использовать на поверхности, являются лунки, выемки, столбики, ребра, каналы или т.п.Примеры материалов, которые можно использовать в качестве субстрата или опорной конструкции, включают стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акриловый, полистироловый или из сополимера стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или ТЕФЛОН; полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Поверхность, пригодная для использования в рамках изобретения, может быть изготовлена из одного материала или смеси нескольких различных материалов. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления опорная конструкция может содержать один или более слоев. Примеры опорных конструкций могут включать чип, пленку, многолуночный планшет и проточную кювету.

[0086] В настоящем документе термин «гранула» может относиться к небольшому телу, изготовленному из жесткого или полужесткого материала. Тело может иметь форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или иную принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. Примеры материалов, которые можно использовать в гранулах, включают стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акриловый, полистироловый или из сополимера стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или ТЕФЛОН; полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; или различные другие полимеры. Примеры гранул включают в себя стеклянные гранулы с контролируемыми порами, парамагнитные гранулы, золь двуокиси тория, гранулы сефарозы, нанокристаллы и другие известные в данной области гранулы. Гранулы могут быть изготовлены из биологических или небиологических материалов. Магнитные гранулы особенно подходят для использования из-за простоты манипуляций с магнитными гранулами с помощью магнитов на различных стадиях способов, описанных в настоящем документе. Гранулы, используемые в определенных вариантах осуществления, могут иметь диаметр, ширину или длину от около 0,1 мкм до около 100 мкм, от около 0,1 нм до около 500 нм. В некоторых вариантах осуществления, гранулы, используемые в определенных вариантах изобретения, могут иметь диаметр, ширину или длину менее около 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм, 100 пм, 50 пм, 1 пм или любой диаметр, ширину или длину в пределах диапазона из любых двух вышеперечисленных значений диаметра, ширины или длины. Размер гранулы можно выбрать таким образом, чтобы она имела уменьшенный размер и, следовательно, можно было обеспечить больше элементов на единицу площади с сохранением при этом достаточного сигнала (копии темплата на элемент) для анализа этих элементов.

[0087] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут быть прикреплены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления гранулы могут быть распределены в лунки на поверхности субстрата. Пример матриц гранул, которые можно использовать в определенных вариантах осуществления, включают технологию произвольного порядка BEADARRAY (Illumina Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния). Такие матрицы гранул описаны в публикациях Michael et al., Anal Chem 70, 1242-8 (1998); Walt, Science 287, 451-2 (2000); Fan et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol 68:69-78 (2003); Gunderson et al., Nat Genet 37:549-54 (2005); Bibikova et al. Am J Pathol 165:1799-807 (2004); Fan et al., Genome Res 14:878-85 (2004); Kuhn et al., Genome Res 14:2347-56 (2004); Yeakley et al., Nat Biotechnol 20:353-8 (2002); и Bibikova et al., Genome Res 16:383-93 (2006), каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0088] В настоящем документе термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» могут использоваться взаимозаменяемо и могут относиться к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК. Термин «полинуклеотид» также относится как к двухцепочечным, так и к одноцепочечным молекулам. Примеры полинуклеотидов включают ген или фрагмент гена, геномную ДНК, фрагмент геномной ДНК, экзон, интрон, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, некодирующую РНК (нкРНК), такую как РНК, взаимодействующую с PIWI (пиРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) и длинную некодирующую РНК (длнкРНК), малую шпилечную (мшРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), микроРНК (мкрРНК), малую ядрышковую РНК (мяшРНК) и вирусную РНК, рибозим, кДНК, рекомбинантный полинуклеотид, разветвленный полинуклеотид, плазмиду, вектор, изолированную ДНК любой последовательности, изолированную РНК любой последовательности, полинуклеотидный зонд, праймер или амплифицированную копию любого из вышеперечисленных вариантов. Полинуклеотид может включать в себя модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, включая нуклеотиды с неприродными основаниями, нуклеотиды с модифицированными природными основаниями, такими как аза- или деазапурины. Полинуклеотид может состоять из конкретной последовательности четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (Ц), гуанина (Г) и тимина (Т). Также может присутствовать урацил (У), например, в качестве естественной замены тимина, если полинуклеотид представляет собой РНК. Урацил также может использоваться в ДНК. Таким образом, термин «последовательность» относится к буквенному представлению полинуклеотида или любой молекулы нуклеиновой кислоты, включая природные и неприродные основания.

[0089] В настоящем документе термин «нуклеиновая кислота-мишень» или его грамматический эквивалент может относиться к молекулам или последовательностям нуклеиновой кислоты, которые необходимо секвенировать, анализировать и/или дополнительно обработать. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть присоединена к матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может быть присоединен к матрице, а матрицу впоследствии можно использовать для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени в образце, который взаимодействует с зондом. В связи с этим следует понимать, что в отношении способов обнаружения нуклеиновых кислот в некоторых вариантах осуществления термины «мишень» и «зонд» могут использоваться взаимозаменяемо.

[0090] В настоящем документе термин «зонд захвата» может относиться к полинуклеотиду, имеющему достаточную комплементарность, чтобы специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Зонд захвата может функционировать как аффинная связывающая молекула для выделения нуклеиновой кислоты-мишени из других нуклеиновых кислот и/или компонентов в смеси. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть специфически связана зондом захвата через промежуточные молекулы. Примеры промежуточных молекул включают линкеры, адаптеры и другие мостиковые нуклеиновые кислоты, имеющие достаточную комплементарность, чтобы специфически гибридизоваться как с целевой последовательностью, так и с зондом захвата.

[0091] В настоящем документе термин «гибридизация», «гибридизировать» или их грамматический эквивалент может относиться к реакции, в которой один или более полинуклеотидов взаимодействуют с образованием комплекса, который по меньшей мере частично образован посредством водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Водородные связи могут возникать посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику, связывания по Хугстину или любым другим специфичным для последовательности способом. Комплекс может иметь две цепочки, образующие дуплексную структуру, три или более цепочки, образующие многоцепочечный комплекс, одну самогибридизующуюся цепь или любую их комбинацию. Кроме водородного связывания цепочки также могут быть поперечно-сшитыми или соединены иными силами.

[0092] В настоящем документе термины «удлиняющий», «удлинение» или их любые грамматические эквиваленты могут относиться к добавлению дНТФ к праймеру, полинуклеотиду или другой молекуле нуклеиновой кислоты ферментом-удлинителем, таким как полимераза. Например, в некоторых способах, описанных в настоящем документе, полученный удлиненный праймер содержит информацию о последовательности РНК. Хотя в некоторых вариантах осуществления описано выполнение удлинения с использованием полимеразы, такой как ДНК-полимераза или обратная транскриптаза, удлинение может быть выполнено любым другим способом, хорошо известным в данной области. Например, удлинение можно выполнять путем лигирования коротких отрезков случайно выбранных олигонуклеотидов друг с другом, например, олигонуклеотидов, которые гибридизовались с представляющей интерес цепью.

[0093] В настоящем документе термины «лигирование», «лигировать» или другие их грамматические эквиваленты могут относиться к соединению двух нуклеотидных цепей фосфодиэфирной связью. Такая реакция может быть катализирована лигазой. Термин «лигаза» относится к классу ферментов, которые катализируют эту реакцию с гидролизом АТФ или аналогичного трифосфата.

Декодирование путем секвенирования

[0094] Варианты осуществления включают декодирование положения микроэлементов матрицы с использованием высокопроизводительного секвенирования. В некоторых вариантах осуществления микроэлементы матрицы содержат полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды можно случайным образом распределить на поверхности субстрата. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать сайт связывания праймера и штрихкод. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать зонд захвата, сайт связывания праймера и штрихкод.

[0095] Некоторые варианты осуществления для декодирования положения полинуклеотидов в матрице могут включать (а) получение субстрата, имеющего матрицу полинуклеотидов, распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит штрихкод и сайт связывания праймера; (b) гибридизацию множества праймеров с сайтами связывания праймера; и (с) определение последовательностей штрихкодов путем удлинения гибридизованных праймеров. В некоторых таких вариантах осуществления последовательность каждого штрихкода может указывать положение полинуклеотида в матрице. Например, в некоторых вариантах осуществления матрицу можно получить с использованием полинуклеотидов, причем известно, что штрихкоды ассоциируются с определенными зондами захвата, так что определение положения штрихкода на матрице может указывать на положение соответствующего зонда захвата. В таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может быть связан с зондом захвата через общий элемент. Например, каждый полинуклеотид и зонд захвата может быть связан с одним и тем же микроэлементом, таким как гранула. В дополнительных таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может содержать зонд захвата.

[0096] В некоторых вариантах осуществления штрихкод может содержать нуклеотидную последовательность, которую можно использовать для определения полинуклеотида в матрице. Штрихкод может содержать уникальную нуклеотидную последовательность, отличимую от других штрихкодов. Она также может быть отличима от других нуклеотидных последовательностей в полинуклеотидах и нуклеиновых кислотах-мишенях по последовательности штрихкода, а также по положению штрихкода в полинуклеотиде, например, по его положению в направлении 5' от сайта связывания праймера. Например, в некоторых вариантах осуществления в множестве нуклеиновых кислот последовательность штрихкода может присутствовать более одного раза, однако штрихкод, расположенный на 5' от сайта связывания праймера, может быть обнаружен. Штрихкод может иметь любую желаемую длину последовательности, достаточную для обеспечения уникальной нуклеотидной последовательности в пределах множества штрихкодов в популяции и/или в пределах множества анализируемых или запрашиваемых полинуклеотидов и нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления штрихкод является нуклеиновой кислотой или областью внутри полинуклеотида в диапазоне около 6-30 нуклеотидов. Штрихкод может содержать, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или он может быть длиннее. Например, штрихкод может содержать 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов, или он может быть длиннее. Подходящие штрихкоды для некоторых вариантов осуществления описаны в патенте США №8,053,192, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать полинуклеотид от другого полинуклеотида в матрице, так что каждый штрихкод отличается от другого штрихкода. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать популяцию полинуклеотидов от другой популяции полинуклеотидов в матрице, так что набор штрихкодов отличается от другого набора штрихкодов.

[0097] В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера может быть 3' относительно штрихкода, так что праймер, гибридизованный с сайтом связывания праймера, можно удлинить с образованием комплемента штрихкода. Например, для получения последовательности штрихкода праймер можно удлинить. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера может находиться непосредственно по соседству со штрихкодом в полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления каждый сайт связывания праймера в популяции полинуклеотидов может иметь одну и ту же последовательность. В некоторых вариантах осуществления субпопуляция полинуклеотидов может содержать сайты связывания праймера с первой последовательностью, а другая субпопуляция полинуклеотидов может содержать сайты связывания праймера со второй последовательностью. В некоторых вариантах осуществления гибридизация различных праймеров с множеством различных сайтов связывания праймера может быть одновременной, последовательной или итеративной.

[0098] Некоторые варианты осуществления включают полинуклеотиды, содержащие зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может содержать последовательность, которая может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления популяция полинуклеотидов может содержать зонды захвата, которые отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления каждый зонд захвата может отличаться друг от друга. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата могут быть похожи друг на друга, например, они могут иметь похожие последовательности и/или похожие последовательности со схожей длиной. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может отличаться от одного другого зонда захвата количеством нуклеотидов менее 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2, причем количество нуклеотидов может быть представлено последовательными нуклеотидами, непоследовательными нуклеотидами, вставленными нуклеотидами или удаленными нуклеотидами в зонде захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может отличаться от одного другого зонда захвата одним нуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера и штрихкод могут быть 5'от зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера и штрихкод могут быть 3' от зонда захвата.

[0099] Некоторые варианты осуществления включают полинуклеотиды, содержащие расщепляемые линкеры. В некоторых таких вариантах осуществления расщепляемый линкер может быть расположен так, чтобы расщепление линкера могло отделять зонд захвата от сайта связывания праймера и штрихкода. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может быть расположен в полинуклеотиде между зондом захвата и сайтом связывания праймера и штрихкодом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может удалять полинуклеотид, содержащий сайт связывания праймера и штрихкод, связанный с зондом захвата. Например, полинуклеотид и зонд захвата могут быть оба связаны с гранулой. Расщепление расщепляемого линкера может приводить к удалению с гранулы полинуклеотида, содержащего сайт связывания праймера и штрихкод.

[0100] В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может иметь длину, соответствующую по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 нуклеотидам, или длину в пределах диапазона любых двух из вышеперечисленных значений длины. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер поддается расщеплению агентами, такими как свет, основание, кислота и ферменты, как, например, специфичные к последовательности рестрикционные ферменты или протеазы. Расщепляемый линкер может включать определенную последовательность нуклеотидов, такую как сайт распознавания фермента, и/или может включать определенные модифицированные нуклеотиды, поддающиеся расщеплению агентом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может содержать урацил, который может расщепляться экзогенным расщепляющим основание агентом, таким как ДНК-гликозилаза (урацил-ДНК-гликозилаза (УДГ)). В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может содержать 8-гидроксигуанин, который может расщепляться 8-гидроксигуанин-ДНК-гликозилазой (белок формамидопиридин-ДНК-гликозилаза (FPG)). Другие примеры расщепляемых линкеров описаны в публикации заявки на патент США 2005/0181394, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0101] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присоединены к субстрату. В некоторых вариантах осуществления субстрат может содержать гранулу. С помощью одноточечной ковалентной связи с поверхностью субстрата на 5'-конце или 3'-конце полинуклеотида или вблизи них полинуклеотиды могут быть иммобилизованы на субстрате, таком как гранула или другая поверхность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать спейсер, который прикреплен к субстрату. В некоторых вариантах осуществления спейсер может иметь длину, соответствующую по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 нуклеотидам, или длину в пределах диапазона любых двух из вышеперечисленных значений длины. С этой целью можно использовать любые подходящие средства ковалентного присоединения, известные в данной области. Выбранный химический состав присоединения будет зависеть от природы твердой подложки и любой примененной к нему дериватизации или функционализации. Полинуклеотид может содержать функциональную группу, которая может представлять собой ненуклеотидную химическую модификацию, для облегчения присоединения. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать серосодержащее нуклеофильное вещество, такое как фосфоротиоат или тиофосфат, например, расположенное на 5'-конце. В случае с полиакриламидными гидрогелями на подложке из твердого вещества этот нуклеофил будет связываться с бромацетамидной группой, присутствующей в гидрогеле. Примером средств присоединения полинуклеотида к твердой подложке является связь посредством 5'-фосфоротиоатного присоединения к гидрогелю, состоящему из полимеризованного акриламида и N-(5-бромацетамидилпентил)акриламида (BRAPA), который описан в патенте США №8,168,388, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0102] В некоторых вариантах осуществления положение полинуклеотидов в матрице может быть декодировано путем секвенирования штрихкодов полинуклеотидов. Например, последовательность штрихкода может быть связана с сайтом на матрице, а сайт может быть связан с конкретным зондом захвата. Некоторые варианты осуществления включают секвенирование следующего поколения (NGS), которое может относиться к способам секвенирования, позволяющим осуществлять массивное параллельное секвенирование клонально амплифицированных молекул и одиночных молекул нуклеиновых кислот. Примеры NGS включают секвенирование путем синтеза (SBS) с использованием обратимых терминаторов-красителей и секвенирование путем лигирования. В SBS выполняется мониторинг удлинения праймера нуклеиновой кислоты вдоль темплата нуклеиновой кислоты для определения последовательности нуклеиновых кислот в темплате. Основополагающим химическим процессом может быть полимеризация. В конкретном варианте осуществления SBS на основе полимеразы для удлинения к праймеру добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды темплатным зависимым образом, чтобы для определения последовательности темплата можно было использовать обнаружение порядка и типа добавляемых к праймеру нуклеотидов.

[0103] Одну или более амплифицированных нуклеиновых кислот можно подвергать воздействию SBS или другой методики обнаружения, которая включает повторную доставку реагентов по циклам. Например, для запуска первого цикла SBS, может быть обеспечено протекание одного или более меченых нуклеотидов, ДНК-полимеразы и т.д. в гидрогелевую гранулу (или сквозь нее), содержащую одну или более амплифицированных молекул нуклеиновой кислоты. Те сайты, в которых удлинение праймера приводит к встраиванию меченого нуклеотида, можно обнаружить. Нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое завершает дополнительное удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру. Например, в праймер можно добавить нуклеотидный аналог, имеющий фрагмент обратимого терминатора, чтобы последующее удлинение не могло происходить до тех пор, пока не будет доставлен разблокирующий агент для удаления фрагмента. Таким образом, для вариантов осуществления, в которых применяется обратимая терминация, доставка разблокирующего реагента в проточную кювету может происходить до или после обнаружения. Между различными стадиями доставки можно проводить промывки. Затем цикл можно повторять n раз для удлинения праймера на п нуклеотидов, таким образом обнаруживая последовательность длиной n.

[0104] Некоторые варианты осуществления SBS включают обнаружение протона, высвобождаемого при встраивании нуклеотида в продукт удлинения. Например, в секвенировании на основе обнаружения высвобожденных протонов может использоваться электрический детектор и соответствующие методики, которые доступны на рынке. Примерами таких систем секвенирования являются пиросеквенирование, например доступная на рынке платформа компании 454 Life Sciences, филиала компании Roche; секвенирование с использованием меченых γ-фосфатом нуклеотидов, например, доступная на рынке платформа компании Pacific Biosciences; и секвенирование с использованием обнаружения протонов, например, доступная на рынке платформа компании Ion Torrent, филиала компании Life Technologies. Некоторые варианты осуществления включают пиросеквенирование, которое описано в публикации заявки на патент США 2005/0130173 и 2006/0134633 и патентах США №№4,971,903; 6,258,568 и 6,210,891, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Некоторые варианты осуществления включают секвенирование путем лигирования, которое описано в патенте США №5,599,675 и патенте США №5,750,341, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0105] В некоторых вариантах осуществления можно использовать способы, включающие контроль активности ДНК-полимеразы в реальном времени. Например, встраивания нуклеотидов можно обнаружить с помощью взаимодействий резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между несущей флуорофор полимеразой и меченными γ-фосфатом нуклеотидами или посредством волновых направляющих нулевого режима (ZMW). Другой полезной методикой секвенирования является секвенирование через нанопоры. В некоторых вариантах осуществления нанопоры нуклеиновая кислота-мишень или отдельные нуклеотиды, удаленные из нуклеиновой кислоты-мишени, проходят через нанопору. По мере прохождения нуклеиновой кислоты или нуклеотида через нанопору каждый тип нуклеотида можно идентифицировать путем измерения колебаний электрической проводимости поры.

[0106] Как показано на ФИГ. 1, в некоторых вариантах осуществления микроэлемент матрицы может содержать полинуклеотид, прикрепленный к грануле 10 посредством 5'-линкера 20. Полинуклеотид может содержать штрихкод 30, сайт 40 связывания праймера и зонд 50 захвата. Праймер 60 может гибридизоваться с сайтом связывания праймера и может быть удлинен с получением последовательности штрихкода для декодирования положения микроэлемента в матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами-мишенями, и зонд захвата может быть удлинен, например, с помощью полимеразы или с помощью лигазы. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может участвовать в мостиковой амплификации. Способы мостиковой амплификации описаны в патентах США №№7,985,565 и 7,115,400, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0107] Как показано на ФИГ. 2, в некоторых вариантах осуществления микроэлемент матрицы может содержать полинуклеотид, содержащий зонд 50 захвата, штрихкод 30 и сайт 40 связывания праймера, причем полинуклеотид присоединен к грануле 10 посредством 5'-линкера 20. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать в себе расщепляемый линкер 70 между зондом захвата и штрихкодом. В некоторых вариантах осуществления праймер 60 может быть гибридизован с сайтом связывания праймера, и может быть определена последовательность штрихкода, тем самым декодируется положение микроэлемента в матрице. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может быть расщеплен, а штрихкод и сайт связывания праймера удалены с микроэлемента, содержащего гранулу и зонд захвата. Некоторые из таких вариантов осуществления обеспечивают декодированные матрицы перед гибридизацией нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть гибридизована с зондом захвата в декодированном положении в матрице. В некоторых вариантах осуществления гибридизованный зонд захвата может быть удлинен, например, с помощью полимеразы или с помощью лигазы. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может участвовать в мостиковой амплификации.

[0108] Как показано на ФИГ. 3, в некоторых вариантах осуществления микроэлемент матрицы может содержать полинуклеотид, содержащий штрихкод 30 и сайт 40 связывания праймера, а также зонд 50 захвата, присоединенный к грануле 10 посредством 3'-линкера 25. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера может примыкать к линкеру, присоединенному к грануле. Некоторые варианты осуществления могут включать использование таких микроэлементов в анализах для скрининга и разработки определенных полимераз. Например, можно проводить скрининг активности полимераз относительно сайтов праймеров, присоединенных к гранулам без спейсеров, по сравнению с сайтами праймеров, присоединенными к гранулам с помощью спейсеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть гибридизована с зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления гибридизованные нуклеиновые кислоты-мишени могут быть удлинены, например, с помощью полимеразы или с помощью лигазы.

[0109] Как показано на ФИГ. 4, некоторые варианты осуществления микроэлемента матрицы могут включать полинуклеотид, содержащий спейсер 80, штрихкод 30, сайт 40 связывания праймера и зонд 50 захвата, присоединенный к грануле 10 посредством 5'-линкера 20.

Секвенирование множества нуклеиновых кислот-мишеней

[0110] Некоторые варианты осуществления включают секвенирование множества нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени могут быть получены из разных источников, таких как разные субъекты, например геномная ДНК от разных субъектов. В некоторых вариантах осуществления разные нуклеиновые кислоты-мишени могут быть связаны с разными индексами, так что индекс может идентифицировать конкретную популяцию нуклеиновых кислот-мишеней, например популяцию, полученную из одного источника.

[0111] Некоторые варианты осуществления включают получение по меньшей мере первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий зонд захвата, штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции.

[0112] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0113] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и/или второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. Например, зонды захвата первой субпопуляции могут отличаться друг от друга; и/или зонды захвата первой субпопуляции могут отличаться друг от друга. В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первых субпопуляций гранул содержит зонды захвата, имеющие одни и те же нуклеотидные последовательности, что и зонды захвата вторых субпопуляций гранул. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может содержать нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0114] Некоторые варианты осуществления также включают гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата первой субпопуляции гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата второй субпопуляции гранул. В некоторых таких вариантах осуществления гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата первой субпопуляции гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата второй субпопуляции гранул выполняют в разных положениях. Например, разные положения предусматривают разные реакционные объемы, такие как разные лунки, например разные лунки в многолуночном планшете. Например, в 96-луночном планшете можно гибридизовать 96 различных субпопуляций гранул с 96 различными нуклеиновыми кислотами-мишенями, в которых каждая различная субпопуляция гранул гибридизуется с различной нуклеиновой кислотой-мишенью в различной лунке.

[0115] В некоторых вариантах осуществления разные субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты, распределены на субстрате, таком как плоский субстрат. В некоторых вариантах распределенные субпопуляции гранул содержат матрицу. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.

[0116] В некоторых вариантах осуществления разные субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени, объединены до распределения на субстрате. В некоторых вариантах осуществления разные субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени, последовательно распределяют на субстрате. Например, первую субпопуляцию гранул, содержащую гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени, распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени.

[0117] В некоторых вариантах осуществления гибридизованные зонды захвата удлинены. В некоторых вариантах осуществления гибридизованные зонды захвата удлиняют перед распределением на субстрате различных субпопуляций гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления гибридизованные зонды захвата удлиняют после распределения на субстрате гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных зондов захвата может предусматривать полимеразное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных зондов захвата может предусматривать удлинение на основе лигазы, например, лигирование зонда удлинения с зондом захвата в присутствии лигазы. В некоторых вариантах осуществления на стадии удлинения к удлиненному зонду захвата можно добавлять обнаруживаемый маркер. В некоторых вариантах осуществления обнаруживаемый маркер может содержать флуоресцентный маркер.

[0118] Некоторые варианты осуществления включают декодирование гранул на субстрате. Некоторые варианты осуществления включают декодирование гранул путем определения положений удлиненных зондов захвата, штрихкодов и индексов на субстрате. В некоторых вариантах осуществления присутствие специфического штрихкода в определенном положении на субстрате указывает на специфический зонд захвата в этом положении. В некоторых вариантах осуществления присутствие определенного индекса в положении на субстрате указывает на то, что нуклеиновая кислота-мишень определенной субпопуляции нуклеиновых кислот- мишеней связана с положением на субстрате. В некоторых вариантах осуществления присутствие удлиненного зонда захвата в положении на субстрате указывает на присутствие определенной нуклеиновой кислоты-мишени в субпопуляциях нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления идентичность штрихкода, идентичность индекса и присутствие удлиненного зонда захвата в одном положении на поверхности указывает на присутствие определенной нуклеиновой кислоты-мишени в определенной субпопуляции нуклеиновых кислот-мишеней.

[0119] В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает обнаружение положений гибридизованных зондов захвата или удлиненных зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления обнаружение положения гибридизованных зондов захвата или удлиненных зондов захвата включает удлинение гибридизованных зондов захвата с обнаруживаемым маркером. В некоторых вариантах осуществления определение положения гибридизованных зондов захвата или удлиненных зондов захвата включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза.

[0120] В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает декодирование положения индексов гранул, содержащих удлиненный зонд захвата. Некоторые варианты осуществления включают гибридизацию множества индексных праймеров с сайтами индексных праймеров и удлинение гибридизованных индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных индексных праймеров включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения индексов гранул включает секвенирование индексов на субстрате.

[0121] В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает декодирование положения штрихкодов гранул, содержащих удлиненный зонд захвата. Некоторые варианты осуществления включают гибридизацию множества штрихкодовых праймеров с сайтами штрихкодовых праймеров и удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров. В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров, включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает декодирование положения штрихкодов гранул, включает секвенирование штрихкодов на субстрате.

[0122] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 100, 200, 300, 400 или 500 или более зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 5000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности.

[0123] Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 100 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

[0124] Аспекты некоторых вариантов осуществления показаны на ФИГ. 5А-ФИГ. 5Е. Как показано на ФИГ. 5А, субпопуляция гранул содержит гранулу с прикрепленным первым полинуклеотидом, содержащим штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата, и с прикрепленным вторым полинуклеотидом, содержащим индекс и сайт связывания индексного праймера. Различные субпопуляции гранул могут включать различные индексы. Различные субпопуляции гранул, причем каждая субпопуляция имеет определенный индекс, может быть распределена по лункам 96-луночного планшета таким образом, чтобы каждая лунка содержала одну субпопуляцию гранул.

[0125] Как показано на ФИГ. 5В, нуклеиновая кислота-мишень из популяции нуклеиновых кислот-мишеней гибридизована с зондом захвата, где нуклеиновая кислота-мишень содержит SNP. В некоторых вариантах осуществления в каждую лунку, содержащую субпопуляцию гранул, добавляют субпопуляцию нуклеиновых кислот-мишеней. Каждая субпопуляция нуклеиновых кислот-мишеней может быть получена из другого источника, такого как другой субъект. Например, субпопуляцию нуклеиновых кислот-мишеней можно получить путем подготовки библиотеки нуклеиновых кислот из одного источника нуклеиновых кислот, например из одного образца нуклеиновых кислот от субъекта. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени не требуют секвенирования адаптера.

[0126] Как показано на ФИГ. 5С, зонд захвата, который гибридизован с содержащей SNP нуклеиновой кислотой-мишенью, может быть удлинен. В некоторых вариантах осуществления удлинение можно выполнять добавлением инкорпорационной смеси, которая содержит флуоресцентные нуклеотиды и соответствующую полимеразу. В некоторых вариантах осуществления удлинение является достройкой по одному основанию.

[0127] В некоторых вариантах осуществления все гранулы объединены и распределены по поверхности проточной кюветы. Проточная кювета может иметь структурированную поверхность, и поверхность можно модифицировать для поддержания иммобилизации гранул при желаемой плотности.

[0128] В некоторых вариантах осуществления проводят считывание SNP. В некоторых вариантах осуществления для считывания сигнала от инкорпорирования зонда захвата на сайте SNP выполняют цикл сканирования. В некоторых вариантах осуществления этот цикл может включать по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления 3'-концы удлиненных зондов захвата отщеплены и заблокированы.

[0129] Как показано на ФИГ. 5D, штрихкодовый праймер гибридизован с сайтом связывания штрихкодового праймера, и штрихкодовый праймер удлинен. В некоторых вариантах осуществления удлинение штрихкодового праймера включает считывание штрихкода. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления количество циклов секвенирования путем синтеза может зависеть от количества различных штрихкодов в субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать 12-20 циклов секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления удлинение позволяет идентифицировать зонд захвата и положение определенной гранулы внутри проточной кюветы.

[0130] Как показано на ФИГ. 5Е, индексный праймер гибридизован с сайтом связывания индексного праймера, и индексный праймер удлинен. В некоторых вариантах осуществления удлинение индексного праймера включает считывание индекса. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления количество циклов секвенирования путем синтеза может зависеть от количества различных индексов в множестве субпопуляций гранул. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать 6-12 циклов секвенирования путем синтеза.

Определенные способы обнаружения лигандов-мишеней

[0131] Некоторые варианты осуществления включают способы обнаружения лигандов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления лиганды-мишени могут содержать нуклеиновые кислоты, белки или другие антигены. В некоторых вариантах осуществления лиганды-мишени получают из разных источников, например из разных образцов, разных отдельных субъектов или разных популяций субъектов.

[0132] В некоторых вариантах осуществления способы обнаружения лигандов-мишеней могут включать получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью. Например, зонд захвата может содержать нуклеиновую кислоту, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула также содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на ≈/-конце относительно индекса. В некоторых вариантах осуществления популяция гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления индексы первой субпопуляции гранул отличаются от индексов второй субпопуляции гранул. Например, индексы первой субпопуляции гранул можно использовать для определения первой субпопуляции гранул по индексам второй субпопуляции гранул.

[0133] Некоторые варианты осуществления включают приведение первых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул. Например, первые лиганды-мишени можно получить из первого образца лигандов, а вторые лиганды-мишени можно получить из второго образца лигандов. Некоторые варианты осуществления также предусматривают распределение на субстрате первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфически связанные первый и второй лиганды-мишени. Некоторые варианты осуществления также включают обнаружение зондов захвата, специфически связанных с первым и вторым лигандами-мишенями, распределенными на субстрате. Некоторые варианты осуществления также включают декодирование положений гранул, содержащих обнаруженные зонды захвата, на субстрате.

[0134] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, а лиганды-мишени содержат нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В других вариантах осуществления зонд захвата отличается от первого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата субпопуляции гранул содержат отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления различные субпопуляции гранул могут содержать одни и те же или различные зонды захвата. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0135] В некоторых таких вариантах осуществления обнаружение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, включает удлинение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать полимеразное удлинение и/или лигазное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает обнаруживаемый нуклеотид, такой как флуоресцентно-меченный нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает однонуклеотидное удлинение зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает удлинение зондов захвата множеством нуклеотидов.

[0136] В некоторых таких вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата субпопуляции гранул специфически связываются с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления различные субпопуляции гранул могут содержать одни и те же или различные зонды захвата. В некоторых таких вариантах осуществления различные зонды захвата субпопуляции гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.

[0137] В некоторых вариантах осуществления обнаружение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, включает иммунологический анализ. Например, лиганды-мишени, специфически связанные с зондами захвата, приводят в контакт со вторичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит обнаруживаемую метку, например флуоресцентную метку.

[0138] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и туже нуклеотидную последовательность.

[0139] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность и позволяют отличать одну субпопуляцию гранул от другой субпопуляции гранул. Например, нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность.

[0140] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0141] В некоторых вариантах осуществления приведение первого лиганда-мишени в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул осуществляется в разных положениях. Например, разные положения могут предусматривать разные реакционные объемы, например разные объемы в разных лунках в микротитрационном планшете.

[0142] Некоторые варианты осуществления также предусматривают объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения первой и второй субпопуляций гранул на субстрате. В других вариантах осуществления первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления субпопуляции гранул распределяют на субстрате до обнаружения зонда захвата, специфически связанного с лигандом.

[0143] В некоторых таких вариантах осуществления обнаружение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, также может включать определение положения зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, на субстрате.

[0144] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения обнаруженных зондов захвата включает декодирование положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата. Некоторые варианты осуществления также включают гибридизацию множества индексных праймеров с сайтами индексных праймеров и удлинение гибридизованных индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных индексных праймеров содержит по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения индексов гранул включает секвенирование индексов на субстрате.

[0145] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения обнаруженных зондов захвата включает декодирование положения штрихкодов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата. Некоторые такие варианты осуществления включают гибридизацию множества штрихкодовых праймеров с сайтами штрихкодовых праймеров и удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения штрихкодов гранул включает секвенирование штрихкодов на субстрате.

[0146] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат. В некоторых вариантах осуществления распределенные первая и вторая субпопуляции гранул содержат матрицу.

[0147] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50, 100, 500, 1000 или 5000 отличающихся друг от друга зондов захвата или любое количество зондов захвата в диапазоне между любыми двумя вышеуказанными количествами. Некоторые варианты осуществления также содержат по меньшей мере 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции, или любое количество разных субпопуляций гранул между любыми двумя вышеуказанными количествами.

[0148] На ФИГ. 6А слева изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200, имеющую полинуклеотид 210, прикрепленный к грануле. Полинуклеотид содержит зонд захвата, который гибридизован с нуклеиновой кислотой-мишенью 220. Зонд захвата удлинен нуклеотидом, содержащим обнаруживаемую метку 230. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и идентификации штрихкода. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид также может включать индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул, и сайт связывания индексного праймера, подходящий для секвенирования и определения индекса. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0149] На ФИГ. 6А в середине изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200 с зондом 240 захвата, прикрепленным к грануле. Зонд захвата гибридизован с нуклеиновой кислотой-мишенью 220. К грануле также прикреплен первый полинуклеотид 260, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и определения штрихкода. К грануле также прикреплен второй полинуклеотид 250, содержащий индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул. Зонд захвата удлинен нуклеотидом, содержащим обнаруживаемую метку 230. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0150] На ФИГ. 6А справа изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200 с зондом 270 захвата, прикрепленным к грануле, причем зонд захвата является антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела. Зонд захвата специфически связан с лигандом 280. Лиганд также связан со вторичным антителом 290, которое содержит обнаруживаемую метку 230. К грануле также прикреплен первый полинуклеотид 260, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и определения штрихкода. К грануле также прикреплен второй полинуклеотид 250, содержащий индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0151] На ФИГ. 6В справа изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200 с зондом 330 захвата, содержащим белок, прикрепленный к грануле. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате. Субстрат 340 для белка используют для контакта с белком, чтобы генерировать сигнал, содержащий обнаруживаемую метку 230. Возможно определение положения сигнала на матрице. В некоторых вариантах осуществления гранула может содержать первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и определения штрихкода, также прикрепленный к грануле. В некоторых вариантах осуществления гранула может содержать второй полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул, также прикрепленный к грануле. В некоторых вариантах осуществления гранулу декодируют на матрице. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

Секвенирование и анализ нуклеиновых кислот-мишеней

[0152] Некоторые варианты осуществления включают секвенирование и/или анализ нуклеиновых кислот-мишеней. Некоторые варианты осуществления включают декодирование положений полинуклеотидов в матрице в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе; гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата; удлинение зондов захвата; и обнаружение удлинения зондов захвата, гибридизованных с нуклеиновой кислотой-мишенью, в положении на матрице. В некоторых вариантах осуществления положения полинуклеотидов на матрице можно декодировать перед гибридизацией нуклеиновой кислоты-мишени с полинуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления положения полинуклеотидов на матрице можно декодировать после обнаружения удлинения зондов захвата, гибридизованных с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид может быть связан с зондом захвата через общий элемент. Например, каждый полинуклеотид и зонд захвата может быть связан с одним и тем же микроэлементом, таким как гранула. В дополнительных таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может содержать зонд захвата.

[0153] Некоторые варианты осуществления включают достройку зондов захвата по одному основанию (SBE). В некоторых вариантах осуществления SBE можно использовать для обнаружения аллели, мутаций или других элементов нуклеиновых кислот-мишеней. Вкратце, в SBE используется зонд захвата, который гибридизуется с геномным фрагментом-мишенью в положении, которое является проксимальном или соседним к положению обнаружения, причем положение обнаружения указывает на конкретный локус. Полимеразу можно использовать для удлинения 3'-конца зонда захвата нуклеотидным аналогом, меченым детекторной меткой. На основании точности фермента нуклеотид встраивается в зонд захвата только в том случае, если он комплементарен положению обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени. При необходимости нуклеотид можно дериватизировать таким образом, что применение блокирующей группы, включая обратимые блокирующие группы, не может приводить к дополнительным удлинениям и, таким образом, происходит добавление только одного нуклеотида. Присутствие в удлиненном зонде захвата меченого нуклеотида может быть обнаружено, например, в конкретном месте матрицы, а добавленный нуклеотид определен для установления идентичности локуса или аллели. SBE может осуществляться при известных условиях, таких как описанные в патентах США №№9,441,267 и US 9,045,796, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0154] Некоторые варианты осуществления включают аллель-специфическое удлинение праймера (ASPE). В некоторых вариантах осуществления ASPE может включать удлинение зондов захвата, которые различаются по нуклеотидной композиции на их 3'-конце. Способ ASPE можно осуществлять с применением нуклеозида или нуклеотида, содержащего расщепляемый линкер, чтобы после обнаружения зонда можно было удалить метку. Это делает возможным дополнительное использование зондов или подтверждение, что обнаруженный сигнал обусловлен меткой, которая теперь удалена. Вкратце, ASPE можно выполнять путем гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с зондом захвата, имеющим участок последовательности 3', который комплементарен положению обнаружения, и участок последовательности 5', который комплементарен последовательности, которая находится по соседству с положением обнаружения. Направляемая темплатом модификация части 3' зонда захвата, например, путем добавления меченого нуклеотида с помощью полимеразы, позволяет получить меченый продукт удлинения, но только в том случае, если темплат включает целевую последовательность. Тогда может быть обнаружено присутствие такого меченого продукта удлинения праймера, например, на основании его положения в матрице, с обозначением присутствия специфической аллели. В некоторых вариантах осуществления ASPE можно выполнять с множеством зондов захвата, которые имеют аналогичные 5'-концы, так что они ренатурируются по соседству с одним и тем же положением обнаружения в нуклеиновой кислоте-мишени, но различные 3'-концы, так что полимеразой модифицируются только зонды захвата, имеющие 3'-конец, который комплементирует положение обнаружения. Зонд захвата, имеющий 3'-концевое основание, которое комплементарно конкретному положению обнаружения, называют зондом идеального соответствия (РМ) для положения, тогда как зонды захвата, которые имеют 3'-концевое несоответствующее основание и не выполнены с возможностью удлинения в ходе реакции ASPE, представляют собой зонды несоответствия (ММ) для положения. Можно обнаружить присутствие меченого нуклеотида в зонде РМ и определить последовательность 3' зонда захвата, определенного для идентификации конкретной аллели в положении обнаружения.

[0155] Некоторые варианты осуществления включают способы для декодирования положений полинуклеотидов в матрице. Некоторые такие способы включают (а) получение субстрата, имеющего матрицу полинуклеотидов, распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит сайт связывания праймера 3' от штрихкода, при этом каждый полинуклеотид связан с зондом захвата; (b) гибридизацию множества праймеров с сайтами связывания праймера; и (с) определение последовательностей штрихкодов путем удлинения гибридизованных праймеров, причем последовательность каждого штрихкода указывает на положение полинуклеотида в матрице. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид связан с зондом захвата посредством гранулы. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата находится 3' относительно сайта связывания праймера. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата находится 5' относительно штрихкода. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит последовательность, отличную от последовательности другого зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата отличается от другого зонда захвата менее чем на 5 различных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления каждый зонд захвата содержит различную последовательность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды случайным образом распределены на поверхности субстрата. В некоторых вариантах осуществления штрихкод содержит последовательность, отличную от другого штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждый штрихкод содержит различную последовательность. В некоторых вариантах осуществления каждый сайт связывания праймера содержит одну и ту же последовательность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присоединены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления гранулы распределены в лунках. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер выполнен с возможностью удаления зонда захвата из сайта связывания праймера и штрихкода. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер прикреплен к субстрату. В некоторых вариантах осуществления спейсер прикреплен к грануле. Некоторые варианты осуществления также включают гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата выполняют после определения последовательностей штрихкодов. В некоторых вариантах осуществления гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата выполняют перед определением последовательностей штрихкодов. Некоторые варианты осуществления также включают удлинение гибридизованной нуклеиновой кислоты-мишени или полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления удлинение предусматривает лигирование. Некоторые варианты осуществления также включают амплифицирование нуклеиновой кислоты-мишени.

[0156] Некоторые варианты осуществления включают способы секвенирования нуклеиновой кислоты-мишени. Некоторыми такими способами является (а) декодирование положений полинуклеотидов в матрице в соответствии с любым из вышеуказанных способов; (b) гибридизация нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата; (с) удлинение зондов захвата, гибридизованных с нуклеиновой кислотой-мишенью; и (d) обнаружение положения удлиненных зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления (d) обнаружение положения удлиненных зондов захвата выполняют до (а) декодирования положений полинуклеотидов в матрице. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата удлиняют с помощью лигазы. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата удлиняют с помощью полимеразы. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата удлиняют добавлением одного нуклеотида. Некоторые варианты осуществления также включают отщепление сайтов связывания праймера и штрихкодов от зондов захвата перед гибридизацией нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата. Некоторые варианты осуществления также включают отщепление сайтов связывания праймера и штрихкодов от зондов захвата после гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата.

Некоторые двухзондовые способы

[0157] Некоторые варианты осуществления включают обнаружение нуклеиновой кислоты-мишени с помощью первого и второго зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень содержит первый участок, способный гибридизоваться с первым зондом захвата, и второй участок, способный гибридизоваться со вторым зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления получают популяцию гранул, в которой каждая гранула содержит первый зонд захвата и второй зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления один из двух зондов захвата присоединен к грануле посредством расщепляемого линкера. В некоторых вариантах осуществления один из зондов захвата содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная метка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень гибридизуется с зондами захвата с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей одноцепочечный гэп. Гэп заполняют и расщепляемый линкер отщепляют. Обнаруживают удлиненный зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления один из зондов захвата содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная метка. В некоторых вариантах осуществления обнаруживаемую метку встраивают в удлиненный зонд захвата во время заполнения гэпа.

[0158] В некоторых вариантах осуществления второй зонд захвата присоединен к грануле посредством расщепляемого линкера, и второй зонд захвата содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная метка. Примеры расщепляемых линкеров включают линкеры, которые можно расщеплять химическим путем, ферментами, такими как эндонуклеазы, и определенными частотами света. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула также содержит первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонд захвата, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата содержит первый полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата отличается от первого полинуклеотида.

[0159] В некоторых вариантах осуществления конец первого зонда захвата лигирован с концом второго зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата лигируют со вторым зондом захвата путем гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с первым и вторым зондами захвата гранулы популяции гранул с получением двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей одноцепочечный гэп между первым и вторым зондами захвата, и заполнение гэпа между первым и вторым зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления заполнение гэпа можно выполнять с помощью полимеразы и/или лигазы. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер расщепляют с получением гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку. В некоторых вариантах осуществления популяция гранул распределена на субстрате. В некоторых вариантах осуществления популяцию гранул распределяют на субстрате после расщепления расщепляемого линкера. В некоторых вариантах осуществления популяцию гранул распределяют на субстрате до расщепления расщепляемого линкера или до лигирования первого зонда захвата со вторым зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления определяют положение гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате.

[0160] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате включает декодирование положения штрихкода гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате. Некоторые такие варианты осуществления могут включать гибридизацию штрихкодового праймера с сайтом штрихкодового праймера и удлинение гибридизованного штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованного штрихкодового праймера включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения штрихкода гранулы включает секвенирование штрихкода на субстрате.

[0161] В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на источник нуклеиновой кислоты-мишени, и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса.

[0162] В некоторых вариантах осуществления популяция гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул, каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0163] В некоторых вариантах осуществления стадию лигирования или расщепления с первой субпопуляцией гранул выполняют в положениях, отличающихся от стадии лигирования или расщепления со второй субпопуляцией гранул. В некоторых вариантах осуществления разные положения предусматривают разные реакционные объемы. В некоторых вариантах осуществления разные положения предусматривают разные лунки.

[0164] Некоторые варианты осуществления также предусматривают объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения субпопуляции гранул на субстрате. В других вариантах осуществления первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул.

[0165] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате включает определение положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонт захвата. Некоторые такие варианты осуществления включают гибридизацию множества индексных праймеров с сайтами индексных праймеров и удлинение гибридизованных индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных индексных праймеров включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения индексов гранул включает секвенирование индексов на субстрате.

[0166] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат. В некоторых вариантах осуществления распределенная популяция гранул содержит матрицу.

[0167] На ФИГ. 6В слева изображен вариант осуществления, в котором гранула 200 содержит первый зонд 300 захвата, прикрепленный к грануле посредством расщепляемого линкера 310. Второй зонд 320 захвата прикреплен к грануле. Нуклеиновая кислота-мишень 220 из определенного образца гибридизована с первым и вторым зондами захвата, и первый зонд захвата удлинен для заполнения гэпа между первым и вторым зондами захвата нуклеотидами, которые содержат обнаруживаемые метки 230. После заполнения гэпа нуклеиновую кислоту-мишень удаляют, а расщепляемый линкер расщепляют с получением удлиненного второго зонда захвата, содержащего обнаруживаемые метки, прикрепленные к грануле. Гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на присоединенный к грануле образец, и полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонды захвата, не показаны. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0168] На ФИГ. 6С изображен вариант осуществления, в котором первый зонд захвата присоединен к грануле 200 посредством его 5'-конца. Второй зонд 360 захвата присоединен к грануле посредством его 3'-конца и расщепляемого линкера 310. Второй зонд захвата содержит обнаруживаемые метки 230. Нуклеиновую кислоту-мишень 220 гибридизована с первым и вторым зондами захвата, первый зонд захвата удлинен и лигирован со вторым зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может содержать структурные варианты (SV). Расщепляемый линкер расщепляют с получением удлиненного первого зонда захвата, содержащего обнаруживаемую метку и присоединенного к грануле. Гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на присоединенный к грануле образец, и полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонды захвата, не показаны. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице. При отсутствии нуклеиновой кислоты-мишени второй зонд захвата и обнаруживаемая метка отщеплены от гранулы.

Наборы и системы

[0169] Некоторые варианты осуществления включают наборы и системы для декодирования микроэлементов, таких как полинуклеотиды на матрице. Некоторые такие наборы и системы могут включать субстрат, такой как чип или жидкостная ячейка, с матрицей полинуклеотидов, случайным образом распределенных на поверхности субстрата. Полинуклеотиды могут содержать сайт связывания праймера 3' относительно штрихкода. В некоторых таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может содержать зонд захвата. В дополнительных таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может быть связан с зондом захвата посредством общего элемента. Например, каждый полинуклеотид и зонд захвата может быть связан с одним и тем же микроэлементом, таким как гранула. Некоторые варианты осуществления включают детектор, выполненный с возможностью обнаружения сигналов от реагентов, гибридизованных с полинуклеотидами в матрице; такие реагенты могут включать реагенты для секвенирования, например, нуклеотиды, содержащие обнаруживаемые метки. Некоторые варианты осуществления включают детектор, выполненный с возможностью обнаружения сигналов, которые могут возникать в результате встраивания нуклеотида в полинуклеотид, например пирофосфат, или изменений в ионах водорода.

[0170] Некоторые варианты осуществления включают наборы или системы, содержащие по меньшей мере первую и вторую субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула субпопуляции может содержать первый полинуклеотид, содержащий зонд захвата, штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула субпопуляции может также содержать второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса. В некоторых вариантах осуществления индекс субпопуляции гранул может указывать на эту конкретную субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции. В некоторых вариантах осуществления наборов и систем, представленных в настоящем документе, первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул.

[0171] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул содержат одни и те же нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0172] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество штрихкодовых праймеров, способных гибридизоваться с сайтами штрихкодовых праймеров.

[0173] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество индексных праймеров, способных гибридизоваться с сайтами индексных праймеров.

[0174] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат. В некоторых вариантах осуществления субстрат выполнен с возможностью образования комбинации первой и второй субпопуляций гранул матрицы гранул на поверхности субстрата и возможностью секвенирования этой матрицы в множестве циклов секвенирования посредством циклов синтеза.

[0175] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 500 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 5000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности.

[0176] Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 100 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

[0177] Некоторые варианты осуществления включают набор, содержащий: матрицу полинуклеотидов, случайным образом распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит сайт связывания праймера 3' относительно штрихкода и связан с зондом захвата, при этом каждый полинуклеотид содержит другой штрихкод и связан с другим зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид связан с зондом захвата посредством гранулы. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления субстрат является плоским. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присоединены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления гранулы распределены в лунках. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит матрицу.

[0178] Некоторые варианты осуществления включают наборы или системы, содержащие первую и вторую субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью. Примеры лигандов-мишеней включают нуклеиновые кислоты, белки или другие антигены. Примеры зондов захвата включают нуклеиновые кислоты, антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса. В некоторых таких вариантах осуществления индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции. Например, индексы первой субпопуляции гранул можно использовать, чтобы отличить первую субпопуляцию гранул от второй субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления первая субпопуляция гранул отделена от второй субпопуляции гранул. Например, первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул.

[0179] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, а лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых таких вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0180] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела.

[0181] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. Например, каждый из зондов захвата первой субпопуляции гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями; и каждый из зондов захвата второй субпопуляции гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями. Например, набор различных зондов захвата первой субпопуляции гранул специфически связывается с теми же лигандами-мишенями, что и набор различных зондов захвата первой субпопуляции гранул.

[0182] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество штрихкодовых праймеров, способных гибридизоваться с сайтами штрихкодовых праймеров.

[0183] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и/или нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и туже нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество индексных праймеров, способных гибридизоваться с сайтами индексных праймеров.

[0184] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат. некоторых вариантах осуществления субстрат выполнен с возможностью образования комбинации первой и второй субпопуляций гранул матрицы гранул на поверхности субстрата и возможностью секвенирования этой матрицы в множестве циклов секвенирования посредством циклов синтеза.

[0185] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50, 100, 500, 1000 или 5000 отличающихся друг от друга зондов захвата или любое количество зондов захвата в диапазоне между любыми двумя вышеуказанными количествами. Некоторые варианты осуществления также содержат по меньшей мере 5,10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции, или любое количество разных субпопуляций гранул между любыми двумя вышеуказанными количествами.

[0186] Некоторые варианты осуществления включают набор, содержащий первую и вторую субпопуляции гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания праймера штрихкода на 3'-конце относительно штрихкода, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции, при этом первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, а лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул содержат одни и те же нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество штрихкодовых праймеров, способных гибридизоваться с сайтами штрихкодовых праймеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество индексных праймеров, способных гибридизоваться с сайтами индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат. В некоторых вариантах осуществления субстрат выполнен с возможностью образования комбинации первой и второй субпопуляций гранул матрицы гранул на поверхности субстрата и возможностью секвенирования этой матрицы в множестве циклов секвенирования посредством циклов синтеза. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 отличающихся друг от друга зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 500 отличающихся друг от друга зондов захвата. Некоторые варианты осуществления также включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Декодирование матрицы путем секвенирования

[0187] Синтезируют множество полинуклеотидов, причем каждый полинуклеотид содержит от 5' до 3': спейсер, уникальный штрихкод, сайт связывания праймера и уникальный зонд захвата. Последовательности штрихкода и зонда захвата известны; последовательность сайта связывания праймера является одинаковой для каждого полинуклеотида. Каждый полинуклеотид прикреплен к грануле. Гранулы случайным образом распределяют в лунки чипа. Матрицу гранул декодируют путем гибридизации праймера с сайтом связывания праймера, удлинения праймера и обнаружения последовательности штрихкода. Положение штрихкода определяет положение соответствующего зонда захвата.

Пример 2. Декодирование штрихкодов на матрице путем секвенирования

[0188] Была подготовлена библиотека нуклеиновых кислот, полученная из человеческой геномной ДНК. Была подготовлена субпопуляция гранул. К каждой грануле был прикреплен первый и второй полинуклеотиды. Первый полинуклеотид содержал зонд захвата, сайт связывания штрихкодового праймера и штрихкод, указывающий на зонд захвата. Второй полинуклеотид содержал индекс и сайт связывания индексного праймера.

[0189] Пул гранул, содержащий 18816 различных типов кодов/зондов, был загружен в проточную кювету HiSeq (ФИГ. 7А). После иммобилизации коды длиной 20 нуклеотидов секвенировали с помощью химической реакции SBS, а идентичность каждой гранулы определяли путем выравнивания кодовых последовательностей со списком типов гранул. На ФИГ. 7В представлена гистограмма количества копий для определенных типов гранул в определенных столбцах, и продемонстрировано, что 97,5% от ожидаемого состава идентифицировано с помощью процесса декодирования на основе секвенирования и что подавляющее большинство типов гранул присутствует на уровне, достаточном для исследований генотипирования.

Пример 3. Производительность генотипирования на HiSeq с использованием обнаружения с помощью нейронной сети с прямым распространением (FFN)

[0190] Для демонстрации характеристик генотипирования на HiSeq с использованием обнаружения FFN олигонуклеотидную ДНК-мишень гибридизовали с суспензией гранул с олигонуклеотидами, конъюгированными с зондом. Гранулы загружали в проточную кювету HiSeq. Зонды, связанные с ДНК-мишенью, достраивали по одному основанию с использованием флуоресцентных нуклеотидов. Проточную кювету с загруженными гранулами визуализировали для получения значений интенсивности генотипирования гранул. Флуоресцентные нуклеотиды расщепляли и гранулы декодировали с использованием химической реакции SBS. Для измерения производительности анализа выравнивали считывание декодирования и генотипирования. Отдельные точки окрашивали в соответствии с ожидаемым генотипом. На ФИГ. 1С представлен график интенсивности С по сравнению с интенсивностью Т, где каждая точка представляет собой среднее значение всех копий для данного типа гранул и окрашена в соответствии с ожидаемым генотипом, и продемонстрировано, что достройка зонда по одному основанию флуоресцентными нуклеотидами обеспечивает точное генотипирование.

Пример 4. Мультиплексирование 12 образцов с 10368-плексным пулом гранул

[0191] Этот пример демонстрирует демультиплексирование множества образцов на одной проточной кювете и, в частности, способность к мультиплексированию 12 образцов с 10 368-плексным пулом гранул. Один пул гранул отдельно гибридизовали с 12 различными индексными последовательностями. После гибридизации образцы объединяли и загружали на проточную кювету HiSeq. Затем проводили два отдельных считывания, одно для идентификации образца на основе гибридизованного индекса и отдельное считывание для идентификации типа гранул на основе считывания-декодирования. На ФИГ. 8 представлена гистограмма для репрезентативного образца ряда определенных типов гранул в определенных связях, и продемонстрировано, что большинство типов гранул присутствует на уровне, достаточном для экспериментов по генотипированию для данного образца. В таблице на Фиг. 7 представлена сводная информация по согласованности демультиплексирования и декодирования гранул для 12 объединенных и загруженных одновременно индексированных образцов, свидетельствующая о том, что представление образцов является равномерным и что большинство зондов присутствует во всех образцах.

[0192] В настоящем документе термин «содержащий» является синонимом терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и имеет включающий, а не ограничительный характер, и не исключает дополнительные неуказанные элементы или этапы способа.

[0193] В описании выше приведены несколько способов и материалов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться модификациям в части способов и материалов, а также изменениям в части способов изготовления и оборудования. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области после изучения настоящего описания или реализации изобретения, описанного в настоящем документе, на практике. Следовательно, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, но предполагается, что оно охватывает все модификации и альтернативные варианты в пределах истинного объема и сущности изобретения.

[0194] Все источники, процитированные в настоящем документе, включая, без ограничений, опубликованные и неопубликованные заявки, патенты и ссылки на литературу, полностью включены в настоящий документ путем ссылки и, следовательно, являются частью настоящего описания. В тех случаях, когда публикации, патенты или заявки на патенты, включенные путем ссылки, противоречат изложению, приведенному в настоящем описании, предполагается, что настоящее описание заменяет и/или имеет приоритет над любым таким противоречащим материалом.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения множества лигандов-мишеней в матрице, включающий: (а) получение субстрата, имеющего матрицу гранул, распределенных на поверхности указанного субстрата, причем указанная матрица гранул содержит первую и вторую субпопуляцию гранул, включающее: (i) получение первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, который способен специфично связываться с лигандом-мишенью, первый полинуклеотид, который содержит штрихкод и сайт связывания праймера на 3′-конце относительно указанного штрихкода, при этом указанный штрихкод указывает на зонд захвата, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3′-конце относительно индекса, причем каждый индекс первой субпопуляции гранул отличается от каждого индекса второй субпопуляции гранул, (ii) обеспечение специфичного связывания первых лигандов-мишеней с указанными зондами захвата указанной первой субпопуляции гранул в первом реакционном объеме и специфичного связывания вторых лигандов-мишеней с зондами захвата указанной второй субпопуляции гранул во втором реакционном объеме и (iii) распределение указанных первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфично связанные первые и вторые лиганды-мишени на субстрате, с получением тем самым субстрата, имеющего матрицу гранул; (b) обнаружение в указанной матрице специфично связанных первых и вторых лигандов-мишеней указанной первой и второй субпопуляций гранул; (c) секвенирование штрихкодов указанных первой и второй субпопуляций гранул путем гибридизации множества праймеров с сайтами связывания праймера штрихкодов указанных первой и второй субпопуляций гранул; и удлинение гибридизованных праймеров с определением тем самым положения зондов захвата указанных первой и второй субпопуляций гранул в указанной матрице; (d) секвенирование индексов указанной первой и второй субпопуляций гранул с определением тем самым положений указанных первой и второй субпопуляций гранул в матрице; и (e) декодирование положений гранул в указанной матрице гранул, включающих обнаруженный лиганд-мишень в матрице, обеспечивая тем самым идентификацию лигандов-мишеней указанных первых лигандов-мишеней или указанных вторых лигандов-мишеней в матрице. Также описан способ идентификации лигандов-мишеней в матрице, включающий: (a) получение первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит: (i) зонд захвата, который способен специфично связываться с лигандом-мишенью, (ii) первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, причем указанный штрихкод указывает на зонд захвата, и (iii) второй полинуклеотид, содержащий индекс, причем каждый индекс первой субпопуляции гранул отличается от каждого индекса второй субпопуляции гранул; (b) обеспечение специфичного связывания первых лигандов-мишеней с указанными зондами захвата указанной первой субпопуляции гранул в первом реакционном объеме и специфичного связывания вторых лигандов-мишеней с зондами захвата указанной второй субпопуляции гранул во втором реакционном объеме; и (c) распределение первой и второй субпопуляции гранул, содержащих специфично связанные первые и вторые лиганды-мишени на поверхности субстрата, с получением тем самым матрицы гранул; (d) обнаружение в указанной матрице специфично связанных первых и вторых лигандов-мишеней указанных первой и второй субпопуляций гранул; (e) секвенирование штрихкодов матрицы гранул; (f) секвенирование индексов матрицы гранул; и (g) декодирование положений гранул в указанной матрице гранул, включающих обнаруженный лиганд-мишень в матрице, обеспечивая тем самым идентификацию лигандов-мишеней в матрице гранул. Изобретение расширяет арсенал способов для обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологической пробе. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 пр.

1. Способ идентификации лигандов-мишеней в матрице, включающий:

(a) получение субстрата, имеющего матрицу гранул, распределенных на поверхности указанного субстрата, причем указанная матрица гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул, включающее:

(i) получение первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит:

зонд захвата, который способен специфично связываться с лигандом-мишенью,

первый полинуклеотид, который содержит штрихкод и сайт связывания праймера на 3'-конце относительно указанного штрихкода, при этом указанный штрихкод указывает на зонд захвата, и

второй полинуклеотид, содержащий индекс и сайт связывания праймера индекса на 3'-конце относительно индекса, причем каждый индекс первой субпопуляции гранул отличается от каждого индекса второй субпопуляции гранул;

(ii) обеспечение специфичного связывания первых лигандов-мишеней с указанными зондами захвата указанной первой субпопуляции гранул в первом реакционном объеме и специфичного связывания вторых лигандов-мишеней с зондами захвата указанной второй субпопуляции гранул во втором реакционном объеме, и

(iii) распределение указанных первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфично связанные первые и вторые лиганды-мишени на субстрате, с получением тем самым субстрата, имеющего матрицу гранул;

(b) обнаружение в указанной матрице специфично связанных первых и вторых лигандов-мишеней указанных первой и второй субпопуляций гранул;

(c) секвенирование штрихкодов указанных первой и второй субпопуляций гранул путем гибридизации множества праймеров с сайтами связывания праймера штрихкодов указанных первой и второй субпопуляций гранул; и удлинение гибридизованных праймеров, с определением тем самым положения зондов захвата указанных первой и второй субпопуляций гранул в указанной матрице,

(d) секвенирование индексов указанных первой и второй субпопуляций гранул с определением тем самым положений указанных первой и второй субпопуляций гранул в матрице; и

(e) декодирование положений гранул в указанной матрице гранул, включающих обнаруженный лиганд-мишень в матрице, обеспечивая тем самым идентификацию лигандов-мишеней указанных первых лигандов-мишеней или указанных вторых лигандов-мишеней в матрице.

2. Способ по п. 1, причем указанные первые и вторые лиганды-мишени, каждый, содержат нуклеиновую кислоту, и причем стадия а) дополнительно включает:

(iv) удлинение зондов захвата, специфично связанных с первыми и вторыми лигандами-мишенями.

3. Способ по п. 2, в котором стадия (iv) включает приведение в контакт первых зондов захвата с полимеразой.

4. Способ по п. 2, в котором стадия (iv) включает приведение в контакт первых зондов захвата с лигазой.

5. Способ по любому из пп. 2-4, причем удлиненный зонд захвата содержит обнаруживаемую метку.

6. Способ по любому из пп. 2-5, в котором стадию (iv) выполняют до стадии (iii).

7. Способ по любому из пп. 2-6, в котором стадия (iv) включает осуществление по меньшей мере одного цикла секвенирования путем синтеза.

8. Способ идентификации лигандов-мишеней в матрице, включающий:

(a) получение первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит:

(i) зонд захвата, который способен специфично связываться с лигандом-мишенью,

(ii) первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, причем указанный штрихкод указывает на зонд захвата, и

(iii) второй полинуклеотид, содержащий индекс, причем каждый индекс первой субпопуляции гранул отличается от каждого индекса второй субпопуляции гранул;

(b) обеспечение специфичного связывания первых лигандов-мишеней с указанными зондами захвата указанной первой субпопуляции гранул в первом реакционном объеме и специфичного связывания вторых лигандов-мишеней с зондами захвата указанной второй субпопуляции гранул во втором реакционном объеме, и

(c) распределение первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфично связанные первые и вторые лиганды-мишени на поверхности субстрата, с получением тем самым матрицы гранул;

(d) обнаружение в указанной матрице специфично связанных первых и вторых лигандов-мишеней указанных первой и второй субпопуляций гранул;

(e) секвенирование штрихкодов матрицы гранул;

(f) секвенирование индексов матрицы гранул; и

(g) декодирование положений гранул в указанной матрице гранул, включающих обнаруженный лиганд-мишень в матрице, обеспечивая тем самым идентификацию лигандов-мишеней в матрице гранул.

9. Способ по п. 8, в котором:

зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту,

первый и второй лиганды-мишени содержат нуклеиновые кислоты, и

стадия (d) включает удлинение зондов захвата, специфично связанных с первым и вторым лигандами-мишенями.

10. Способ по любому из пп. 2-9, в котором первый полинуклеотид содержит зонд захвата.

11. Способ по любому из пп. 2-10, в котором каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности.

12. Способ по любому из пп. 2-11, в котором зонды захвата первой субпопуляции гранул содержат такие же нуклеотидные последовательности, что и зонды захвата второй субпопуляции гранул.

13. Способ по любому из пп. 2-12, в котором зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

14. Способ по п. 1 или 8, в котором зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

15. Способ по п. 14, в котором каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфично связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями.

16. Способ по п. 14 или 15, в котором различные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.

17. Способ по любому из пп. 14-16, в котором обнаружение предусматривает приведение первого и второго лигандов-мишеней, специфически связанных с зондами захвата, в контакт с вторичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит обнаруживаемую метку.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 отличающихся друг от друга зондов захвата.

19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

20. Способ по любому из пп. 1-19, дополнительно включающий объединение первой субпопуляции гранул, содержащей специфично связанные первые лиганды-мишени, и второй субпопуляции гранул, содержащей специфично связанные вторые лиганды-мишени, до распределения на субстрате.

21. Способ по любому из пп. 1-19, в котором первую субпопуляцию гранул, содержащую специфично связанные первые лиганды-мишени, распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул, содержащей специфично связанные вторые лиганды-мишени.

22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором проточная кювета содержит субстрат.

23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором первый и второй лиганды-мишени получены от разных субъектов.

24. Способ по любому из пп. 1-23, дополнительно включающий по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от индекса другой субпопуляции.