Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B Российский патент 2021 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, касается способа раздельной видоспецифичной амплификации кДНК энтеровирусов методом «полугнездовой» полимеразной цепной реакции и может быть использовано для дифференциации энтеровирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В.

Энтеровирусы (сем. Picornaviridae, род Enterovirus) характеризуются иммунологическим и генетическим многообразием. В настоящее время известно более 100 типов энтеровирусов, которые могут вызывать заболевания человека, полиморфные по клиническим проявлениям (полиомиелит, нейропатии, серозный менингит, миокардиты, гастроэнтерит, респираторные заболевания, конъюнктивиты и т.д.) и различные по тяжести течения.

На основе особенностей молекулярной организации энтеровирусы, патогенные для человека, разделены на 4 вида: Enterovirus А (ЭВ-А) (Коксаки А 2-8, 10, 12, 14, 16; ЭВ-А71, 76, 89-91, 114, 120), Enterovirus В (ЭВ-В) (Коксаки В1-6; Коксаки А9; ECHO 1-7, 9, 11-21, 24-27, 29-33; ЭВ-В69, 73-75, 77-88,93, 97, 98, 100, 106, 107, 110-114), Enterovirus С (ЭВ-С) (полиовирусы типа 1-3; Коксаки А1, 11, 13, 17, 19-22, 24; ЭВ-С 95, 96, 99, 102, 104,105, 109, 113, 116, 117, 118) и Enterovirus D (ЭВ-D) (ЭBD68, 70, 94, 111, 120) [www.picomaviridae.com]. Циркуляция энтеровирусов наблюдается повсеместно. С конца XX века и до настоящего времени во многих странах фиксируется высокий уровень заболеваемости энтеровирусной инфекцией, обусловленный формированием и распространением эпидемических вариантов энтеровирусов. Наиболее часто у больных с энтеровирусной инфекцией выявляют вирусы видов Enterovirus А и Enterovirus В. Вирусы вида Enterovirus А являются основными возбудителями экзантемных форм энтеровирусной инфекции, вирусы вида Enterovirus В - энтеровирусного менингита.

Общеизвестны классические вирусологические методы дифференциации энтеровирусов, основанные на реакции нейтрализации с применением типоспецифических сывороток. Вирусологические методы являются длительными, трудоемкими, экономически затратными и не обладают чувствительностью в отношении штаммов, не реплицирующихся в культурах ткани. Эти проблемы могут быть решены молекулярно-биологическими методами (амплификация нуклеиновых кислот с использованием полимеразной цепной реакции, секвенирование нуклеиновых кислот, частичное секвенирование областей генома энтеровирусов, кодирующих структурные белки).

Известны способы типирования энтеровирусов путем анализа нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК, полученных методом ОТ-ПЦР непосредственно из исследуемых образцов (первичные пробы клинического материала и объектов внешней среды, культуральные изоляты энтеровирусов) [Casas I., Palacios G.F., Trallero G., Cistema D., Freire M.C., Tenorio A. Molecular characterization of human enteroviruses in clinical samples: comparison between VP2, VP1, and RNA polymerase regions using RT nested PCR assays and direct sequencing of products // J. Med. Virol. - 2002. - Vol. 65. №1. - P. 138-148; Способ генотипирования энтеровирусов методом секвенирования 1А-1В участка генома [Патент РФ №2701145С1. 2019. Бюл. №27. / Резайкин А.В., Шарабрин С.В., Усольцева П.С., Алимов А.В.]. Известные способы при высокой чувствительности не позволяют идентифицировать тип энтеровируса при наличии в исследуемом образце энтеровирусов нескольких видов одновременно. Кроме того, получаемые последовательности генома не могут быть использованы для информативной филогенетической характеристики исследуемых штаммов.

Наиболее близкими к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков являются: способ генотипирования энтеровирусов путем секвенирования фрагмента области VP1 генома, полученного с использованием универсальных для энтеровирусов человека олигонуклеотидных праймеров, позволяющих амплифицировать кДНК фрагмента гена 1D энтеровирусов всех типов, относящихся к видам Enterovirus A-D, который используется при генотипировании вирусов большинством лабораторий проводящих мониторинг энтеровирусной инфекции. [Nix W.A., Oberste M.S. and Pallansch M.A. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 seqences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical spesimens // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. №. 8. - P. 2698-2704]; способ идентификации вида нетипируемых энтеровирусов методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров для дифференциальной амплификации кДНК полной последовательности гена 1D вирусов видов Enterovirus A-D методом однораундовой ПНР [Oberste M.S., Maher K, Williams A.J., Dybdahl-Sissoko N., Brown B.A., Gookin M.S., Penaranda S., Mishrik N., Uddin M., Pallansch M.A. Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses // J. Gen. Virol. - 2006. - Vol. 87(Pt 1). - P. 119-128]. Оба способа позволяют успешно проводить идентификацию типа энтеровирусов, пассированных в клеточных культурах, но недостаточно эффективны для анализа первичного клинического материала или водных концентратов. Наиболее близким к заявляемому способу является любой из обоих способов, но предпочтительным в качестве ближайшего аналога нами рассматривается способ генотипирования вирусов (таблица 1).

Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка способа дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В.

Поставленная задача достигается разработкой способа ОТ-ПЦР фрагмента кДНК области VP1 генома вирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В.

Технический результат заключается в том, что заявляемый способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В позволяет повысить эффективность генотипирования энтеровирусов в результате увеличения выхода продукта амплификации.

Указанный технический результат достигается использованием при проведении «полугнездовой» ПЦР кДНК фрагмента области VP1 генома вирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В обратных видоспецифичных оли-гонуклеотидных праймеров:

EvAR - 5'-TACTGGACCNCCNGGNGGNRCRWACATRTA-3'

EvBR: - 5'-TACTGGACCNCCNGGNGGNAYRTACATNA-3',

(где N - любой из А, Т, G или С, R - А или G, Y - С или Т).

Способ осуществляется следующим образом. Выделенную из образца энтеровирус-содержащего первичного материала РНК используют в качестве матрицы для получения кДНК в реакции обратной транскрипции с последующей амплификацией кДНК вирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В в разных пробирках. В первом раунде ПЦР для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus А используют праймеры 486 и 488, для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus В - праймеры 490 и 492; во втором раунде ПЦР - универсальный прямой праймер AN89 и обратные видоспецифичные праймеры

EvAR - 5'-TACTGGACCNCCNGGNGGNRCRWACATRTA-3'

EvBR: - 5'-TACTGGACCNCCNGGNGGNAYRTAC ATNA-3',

(где N - любой из A, T, G или С, R - А или G, Y - С или T). (таблица 2).

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Осуществление способа.

Для исследования использовали энтеровирус-содержащие образцы первичного материала: ликвор, фекальные экстракты, носоглоточные смывы, водные концентраты. РНК энтеровирусов выделяли при помощи коммерческого набора для выделения вирусной РНК «РИБО-преп» (Интерлабсервис, Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для получения кДНК в реакции обратной транскрипции. Реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мкл РНК, 2 пкмоль каждого праймера (AN32, AN33, AN34 и AN35), буфер для M-MLV-ревертазы, 0,15 мМ каждого дНТФ, 40 ед. РНКа-зина, 20 ед. M-MLV-ревертазы. Смесь инкубировали в течение 30 минут при температуре 42°С и в течение 5 минут при температуре 95°С.

Амплификацию кДНК вирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В проводили отдельно, в разных пробирках.

Первый раунд ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси для 1-ого раунда, содержащей 5 мкл кДНК, буфер для Taq-полимеразы, 0,2 мМ каждого дНТФ, 25 пкмоль каждого из праймеров для 1-го раунда ПЦР (Таблица 2), 1,5 ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводили в режиме (95°С-20 с, 42°С-20 с, 60°С-20 с) × 40 циклов.

Для постановки 2-го раунда ПЦР 5 мкл амплификата 1-го раунда вносили в реакционную смесь содержащую буфер для Taq-полимеразы, 0,2 мМ каждого дНТФ, 25 пкмоль каждого из праймеров для 2-го раунда ПЦР (Таблица 2), 1,5 ед. FastStart Taq-полимеразы или Hot Taq-полимеразы или любой другой Taq-полимеразы для ПЦР с «горячим» стартом. Объем реакционной смеси - 25 мкл. Реакцию проводили в режиме (95°С-20 с, 60°С-20 с, 72°С-20 с) × 40 циклов, 72°С-2 мин. Продукт амплификации (приблизительно 350-400 пар нуклеотидов) визуализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл бромида этидия.

Амплифицированные фрагменты кДНК энтеровирусов секвенировали на любом автоматическом генетическом анализаторе, в соответствии с инструкцией производителя, с использованием для мечения фрагментов кДНК известных универсальных для энтеровирусов праймеров 232 и 233.

Пример 2. Определение сравнительной чувствительности и специфичности способов амплификации фрагмента VP 1 области генома энтеровирусов с использованием способа-прототипа и способа в соответствии с изобретением.

Провели амплификацию и секвенирование 100 образцов первичного клинического материала и водных концентратов с положительным результатом тестирования на РНК энтеровирусов способом-прототипом и способом в соответствии с изобретением (таблица 2). Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, тип вируса был определен в 96 образцах, в 87 из которых содержались вирусы вида Enterovirus А и/или Enterovirus В, в 7 - вирусы вида Enterovirus С, в одном образце - аденовирус, в одном случае - неполиомиелитный энтеровирус. Известным способом было амплифицировано 48 фрагментов кДНК. В результате секвенирования тип вируса был определен в 40 случаях (40%), что составило 41,67% (40 из 96) от всех типированных штаммов. При секвенировании 4-х фрагментов были получены неспецифические последовательности. Последовательности, полученные в результате секвенирования образцов №2335/12, 2107/16, 28487/16, 2850/16 были нетипируемые, поскольку они одновременно содержали кДНК вирусов разных видов. Вирусы видов Enterovirus А и Enterovirus В известным способом были идентифицированы в 31 случае, что составило 35,63% (31 из 87) от числа образцов, содержавших штаммы вирусов этих видов. Способом в соответствии с изобретением тип энтеровируса был установлен в 85 пробах, что составило 88,54% (85 из 96) от всех успешных случаев типирования вирусов и 97,7% (85 из 87) от образцов содержавших вирусы видов Enterovirus А и Enterovirus В.

Пример 3. Исследование образцов, содержавших вирусы Enterovirus А и Enterovirus В.

Провели генотипирование энтеровирусов в 45 образцах клинического материала и водных концентратов, содержавших вирусы видов Enterovirus А и Enterovirus В. Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, миксты энтеровирусов разных типов были выявлены как в пробах, пассированных на клеточных культурах, так и в первичных образцах.

Проведенные исследования подтвердили высокую эффективность молекулярного типирования энтеровирусов при анализе первичных образцов клинического материала и водных концентратов, а также образцов, содержащих по одному типу энтеровирусов разных видов, что свидетельствует о достижении технического результата.

Метод разработан и апробирован на базе лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций с референсцентром по мониторингу энтеровирусных инфекций ФБУН «ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В методом «полугнездовой» полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров: в 1-м раунде ПЦР: 486: 5'-TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNC-3' и 488: 5'-GTIGGRTAICCITCITARAACCAYTG-3' для амплификации к ДНК вирусов вида Enterovirus А, 490: 5'-TGIGTIYTITGYRTICCITGGAT-3' и 492: 5'-GGRTTIGTIGWYTGCCA-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus В; во 2-м раунде ПЦР AN89: 5'-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3' и EvAR - 5'-TACTGGAC-CNCCNGGNGGNRCRWACATRTA-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus A, AN89: 5'-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3' и EvBR: - 5'-TACTGGACCNCCNGGNGGNAYRTACATNA-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus В, где N - любой из А, Т, G или С, R - А или G, Y - С или Т, W - А или Т; I - инозин. 4 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VPI генома энтеровирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В, включающий выделение геномной РНК, проведение реакции обратной транскрипции с использованием олигонуклеотидных праймеров AN32: GTYTGCCA, AN33: GAYTGCCA, AN34: CCRTCRTA, AN35: RCTYTGCCA, «полугнездовой» полимеразной цепной реакции и секвенирования с использованием олигонуклеотидных праймеров 232: CCAGCACTGACAGCA и 233: TACTGGACCACCTGG, отличающийся тем, что при проведении полимеразной цепной реакции в первом раунде используют олигонуклеотидные праймеры: 486: 5'-TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNC-3' и 488: 5'-GTIGGRTAICCITCITARAACCAYTG-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus А, 490: 5'-TGIGTIYTITGYRTICCITGGAT-3' и 492: 5'-GGRTTIGTIG-WYTGCCA-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus В; во втором раунде олигонуклеотидные праймеры: AN89: 5'-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3' и EvAR - 5'-TACTGGAC-CNCCNGGNGGNRCRWACATRTA-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus А и олигонуклеотидные праймеры AN89: 5'-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3' и EvBR: - 5'-TACTGGAC-CNCCNGGNGGNAYRTACATNА-3' для амплификации кДНК вирусов вида Enterovirus В, где N - любой из А, Т, G или С, R - А или G, Y - С или Т, W - А или Т; I - инозин.