Способ обнаружения генетического материала энтеровируса D68 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12N15/41 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и вирусологии. Изобретение позволяет обнаруживать генетический материал энтеровируса D68 (EV-D68) в образцах биологического материала от пациентов. Предназначено для обнаружения генетического материала EV-D68 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием набора праймеров и флуоресцентно меченого зонда (Taqman) следующего состава: прямой праймер qD68-F1 (5'-ACACTGAACCAGARGAAGC-3'), обратные праймеры qD68-R1 (5'-AAAGCTGCTCTACTRAGAA-3') и qD68-R2 (5'-AAGGCTGCCCTRCTRAGAA-3'), флуоресцентно меченый зонд (Taqman) qD68-P1 (5'-ROX-ACTCGCACAGTGATAAATCARCAYGG-BHQ2-3').

Уровень техники

EV-D68 является одним из многочисленных представителей рода Enterovirus, семейства Picornaviridae, безоболочечных вирусов, геном которых представлен рибонуклеиновой кислотой (РНК) положительной полярности [1]. В отличие от ряда других энтеровирусов, EV-D68 передается преимущественно аэрогенно, воздушно-капельным путем [2]. В большинстве случаев вызываемое им заболеванием является легким и излечивается самостоятельно. Однако в отдельных группах риска (включая детей и лиц с иммунодефицитом) EV-D68 вызывает тяжелое поражение нижних дыхательных путей, требующее госпитализации и, в отдельных случаях, искусственной вентиляции легких, что нетипично для других энтеровирусов [3]. Кроме того, возбудитель способен вызывать поражение центральной нервной системы, проявляющееся острым вялым параличом [4].

В отличие от полиовируса (также представителя рода Enterovirus), для профилактики инфекции EV-D68 не существует вакцины, несмотря на способность вируса вызывать неврологические симптомы (включая острый вялый паралич) у детей. Кроме того, поскольку случаи инфекции, вызванной EV-D68, стали массово регистрироваться только с 2014 г., диагностика данного возбудителя до сих пор не является частью рутинной практики [2]. Таким образом, существует потребность в способе обнаружения генетического материала EV-D68 для специфической диагностики вызываемых им заболеваний и надзора за циркуляцией возбудителя.

Известен способ обнаружения генетического материала EV-D68 методом ПЦР-РВ (US 9938588 B2 [5]) с использованием следующих праймеров и флуоресцентно меченого зонда (Taqman), комплементарных участку генома, кодирующего белок VP1:

AN887 (прямой праймер): 5'-CAAACTCGCACAGTGAT-3',

AN893 (обратный праймер): 5'-GTATTATTACTACTACCATTCACNGCNAC-3',

AN890 (зонд): 5'-GTCCATTTGAAAAAGTTCTTGTC-3'.

Недостатком описанного способа является крайне большая длина амлифицируемого участка (272 нуклеотида), что ограничивает эффективность ПЦР и затрудняет оптимизацию температурного режима реакции, а также увеличивает время элонгации и, как следствие, время выполнения исследования. Кроме того, описанный зонд содержит гуанин на 5'- конце последовательности, что ослабляет интенсивность свечения флуоресцентной метки зонда. Наконец, прямой праймер имеет крайне малую длину (17 нуклеотидов) и низкую температуру плавления относительно обратного праймера (58,7°С и 64,2°C соответственно), а оба праймера способны к образованию гетеродимера длиной 5 нуклеотидов с энергией связи свыше 10 ккал/М.

Известен способ, описанный в [6]. В известном способе обнаружения нуклеиновой кислоты EV-D68 методом ПЦР-РВ (US 20160312314 A1) с использованием следующих праймеров и флуоресцентно меченого зонда (Taqman), комплементарных участку генома, кодирующего белок VP1:

L1-2 (прямой праймер): 5'-CACYGAACCAGARGAAGCCA-3',

R2-2 (обратный праймер): 5'-CTAAAGCTGCCCTACTAAGRAA-3',

P1-1 (зонд): 5'-TCGCACAGTGATAAATCAGCACGG-3'.

Недостатком описанного способа является относительно большое количество вырожденных позиций в последовательности прямого праймера (2/20) и недостаточное совпадение с нуклеотидными последовательностями EV-D68, представленными в базе нуклеотидных последовательностей GenBank после 2019 г. (Фиг. 1).

В отличие от вышеописанных, заявляемый способ отличается последовательностями праймеров и флуоресцентно меченого зонда (Taqman) (табл. 1).

Известен патент RU 2441917 C2, в котором раскрыт способ идентификации 5’-НТР5’генома энтеровирусов геногруппы ЭВI и геногруппы ЭВII с использованием полимеразной цепной реакции. Известный способ основан на проведении полимеразной цепной реакции кДНК генома энтеровирусов человека.

Отличия заявляемого технического решения от известного патента: заявляемый способ направлен на специфическое обнаружение генетического материала исключительно энтеровируса D68, и в присутствии генетического материала других генотипов энтеровирусов дает отрицательный результат. Кроме того, вследствие использования технологии ПЦР-РВ с флуоресцентно меченым зондом, заявляемый способ не требует проведения дополнительного этапа электрофореза в агарозном геле.

В сравнении с наиболее близким аналогом, предлагаемый метод нацелен на амплификацию той же области генома EV-D68 (короткий фрагмент гена VP1). В сравнении с наиболее близким аналогом, позиция прямого праймера относительно участка генома возбудителя смещена в сторону более консервативной области и не фланкирует вариабельный участок (позиция нуклеотидной последовательности 2550, Фиг. 1), позиция зонда смещена в сторону более консервативной области и увеличена длина зонда для повышения температуры его плавления, структура зонда содержит вырожденные участки на 3'- конце, один обратный праймер заменен на два обратных праймера с учетом известных вариабельных участков в данной позиции генома возбудителя, при этом обратные праймеры не фланкируют вариабельный участок генома (позиция нуклеотидной последовательности 2628, Фиг. 1).

Раскрытие сущности изобретения

Задачей изобретения является создание способа обнаружения генетического материала EV-D68 в различных видах клинического материала от пациентов путем амплификации специфического фрагмента генома возбудителя с помощью праймеров и флуоресцентно меченого зонда.

Технический результат заявляемого изобретения: способ позволяет обнаружить генетический материал EV-D68 путем амплификации фрагмента гена VP1, кодирующего поверхностный белок EV-D68 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

В ходе реакции происходит гибридизационно-флуоресцентная детекция накопления продукта амплификации в режиме реального времени с применением не охарактеризованных ранее праймеров и флуоресцентно меченого зонда.

Заявляется способ обнаружения генетического материала энтеровируса D68 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, заключающийся в том, что выделяют нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл методом переосаждения, с полученными образцами нуклеиновых кислот ставят реакцию обратной транскрипции с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл. Полученный образец кДНК исследуют с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси, предназначенной для пятикратного разведения, 0,6 мкМ праймера qD68-F1, 0,4 мкМ праймера qD68-R1, 0,4 мкМ праймера qD68-R2, 0,3 мкМ флуоресцентно меченого зонда qD68-P1, 13 мкл воды. Для постановки реакции к полученной смеси добавляют 5 мкл исследуемой кДНК, реакцию проводят в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°C в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°C в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 55°C в течение 45 секунд.

Указанный технический результат достигается использованием впервые описанных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченого зонда, позволяющих специфично обнаруживать генетический материал EV-D68.

Праймеры:

qD68-F1 (прямой праймер): 5'-ACACTGAACCAGARGAAGC-3',

qD68-R1 (обратный праймер): 5'-AAAGCTGCTCTACTRAGAA-3',

qD68-R2 (обратный праймер): 5'-AAGGCTGCCCTRCTRAGAA-3'.

Зонд:

qD68-P1: 5'-ROX-ACTCGCACAGTGATAAATCARCAYGG-BHQ2-3',

где ROX - флуоресцентный краситель карбоксиродамин с длиной волны флуоресценции 610 нм, BHQ-2 (Black Hole Quencher® 2) - гаситель флуоресценции со спектром поглощения 560-670 нм.

Краткое описание иллюстраций

Изобретение поясняется фигурами.

На Фиг.1 представлены последовательности рассматриваемых праймеров и флуоресцентно меченых зондов (Taqman) (US 9938588 B2, US 20160312314 A1, предлагаемый способ) относительно множественного выравнивания последовательностей гена VP1 EV-D68, опубликованных в базе данных GenBank в 2019-2023 гг. (n=990) и их консенсусной последовательности. Вариабельные участки обозначены белым. Последовательность обратного праймера AN893 за пределами поля зрения из-за крайне большой длины фланкируемого участка.

На Фиг.2 представлена диаграмма амплификации образцов, содержащих генетический материал EV-D68, в ПЦР-РВ с использованием предлагаемого способа.

На Фиг.3 представлена диаграмма амплификации образцов, содержащих генетический материал EV-D68 и других энтеровирусов (Coxsackievirus A6 (CVA6), Coxsackievirus A16 (CVA16), Coxsackievirus A9 (CVA9), Coxsackievirus B3 (CVB3), Coxsackievirus B5 (CVB5), Echovirus E6 (E6), Echovirus E30 (E30)), в ПЦР-РВ с использованием предлагаемого способа.

Осуществление изобретения

Обнаружение генетического материала EV-D68 с использованием предлагаемого способа.

Исследуемым клиническим материалом были образцы мазков из ротоглотки (n=5), в которых EV-D68 был обнаружен методов ПЦР с последующим секвенированием согласно ранее описанной методике [7]. Нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл выделяли методом переосаждения с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. С полученными образцами нуклеиновых кислот ставили реакцию обратной транскрипции с использованием набора РЕВЕРТА-L (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл.

Полученный образец кДНК исследовали предлагаемым способом с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси 5X qPCRmix-HS (ЗАО «Евроген»), 0,6 мкМ праймера qD68-F1, 0,4 мкМ праймера qD68-R1, 0,4 мкМ праймера qD68-R2, 0,3 мкМ флуоресцентно меченого зонда qD68-P1, 13 мкл воды. Для постановки реакции к полученной смеси добавляли 5 мкл исследуемой кДНК. Концентрация ионов магния в готовой смеси составила 3мМ, каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов - 0,12 мМ. Реакция ставилась в конечном объеме 25 мкл.

Реакцию проводили в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°C в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°C в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 55°C в течение 45 секунд. Для проведения исследования использовался прибор StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems™, США). Детекцию флуоресцентного сигнала проводили в конце каждого цикла амплификации по каналу ROX. Во всех исследованных образцах была обнаружена флуоресценция, соответствующая амплификации генетического материала EV-D68 (Фиг.2).

Разработанные праймеры и флуоресцентно меченый зонд направлены на типоспецифическое обнаружение фрагмента гена VP1 EV-D68, кодирующего поверхностный белок искомого возбудителя. Праймеры и флуоресцентно меченый зонд являются комплементарными амплифицируемой последовательности кДНК. Прямой и обратный праймеры фланкируют вышеуказанный фрагмент и обеспечивают возможность синтеза дочерней цепи ДНК. При этом происходит активация флуоресцентной метки зонда и нарастание уровня флуоресценции по мере накопления продукта амплификации в режиме реального времени, что позволяет обнаруживать в исследуемом образце нуклеиновую кислоту EV-D68. Длина получаемого ампликона составляет 97 нуклеотидов.

В перспективе возможно создание такого мультиплексного набора праймеров и зондов, который позволит обнаруживать нуклеиновую кислоту любого из представителей рода Enterovirus, EV-D68 и внутренний контрольный образец, предназначенный для контроля качества выделения нуклеиновых кислот из образца. Кроме того, предлагаемый способ может позволить количественное измерение концентрации нуклеиновой кислоты EV-D68 в исследуемом образце с использованием системы количественных стандартов.

Пример 1. Обнаружение генетического материала EV-D68 с использованием предлагаемого способа

Исследуемым клиническим материалом были образцы мазков из ротоглотки (n=13), в 5 из которых методом ПЦР с последующим секвенированием согласно ранее описанной методике [7] был обнаружен генетический материал EV-D68, а в 8 других был обнаружен генетический материал других энтеровирусов (Coxsackievirus A6 (CVA6), Coxsackievirus A16 (CVA16), Coxsackievirus A9 (CVA9), Coxsackievirus B3 (CVB3), Coxsackievirus B5 (CVB5), Echovirus E6 (E6), Echovirus E30 (E30)). Нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл выделяли методом переосаждения с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. С полученными образцами нуклеиновых кислот ставили реакцию обратной транскрипции с использованием набора РЕВЕРТА-L (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл.

Полученный образец кДНК исследовали предлагаемым способом с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси 5X qPCRmix-HS (ЗАО «Евроген»), 0,6 мкМ праймера qD68-F1, 0,4 мкМ праймера qD68-R1, 0,4 мкМ праймера qD68-R2, 0,3 мкМ флуоресцентно меченого зонда qD68-P1, 13 мкл воды. Для постановки реакции к полученной смеси добавляли 5 мкл исследуемой кДНК. Концентрация ионов магния в готовой смеси составила 3мМ, каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов - 0,12 мМ. Реакция ставилась в конечном объеме 25 мкл.

Реакцию проводили в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°C в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°C в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 55°C в течение 45 секунд. Для проведения исследования использовался прибор StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems™, США). Детекцию флуоресцентного сигнала проводили в конце каждого цикла амплификации по каналу ROX. В 5 образцах, заведомо содержащих генетический материал EV-D68, была обнаружена флуоресценция, соответствующая амплификации генетического материала EV-D68. В образцах, заведомо содержащих генетический материал других энтеровирусов, флуоресценция не обнаруживалась, что соответствует отрицательному результату (Фиг.3).

Список литературы

1. Zell R., Delwart E., Gorbalenya A.E., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Picornaviridae // The Journal of General Virology. - 2017. - Vol. 98, № 10. - P. 2421-2422.

2. Sooksawasdi Na Ayudhya S., Laksono B.M., van Riel D. The pathogenesis and virulence of enterovirus-D68 infection // Virulence. - Т. 12, № 1. - С. 2060-2072.

3. Poelman R., Schuffenecker I., Van Leer-Buter C., et al. European surveillance for enterovirus D68 during the emerging North-American outbreak in 2014 // Journal of Clinical Virology. - 2015. - Vol. 71. - P. 1-9.

4. Cassidy H., Poelman R., Knoester M., et al. Enterovirus D68 - The New Polio? // Frontiers in Microbiology. - 2018. - Vol. 9. - P. 2677.

5. Nix W.A., Oberste M.S. Compositions and methods for detecting Enterovirus D68: pat. US 9938588 B2 USA. - 2018.

6. Storch G.A., Wylie T.N., Wylie K.M. Methods and compositions for detection of enterovirus d68: pat. US 20160312314 A1 USA. - 2016.

7. Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, Seminested PCR Amplification of VP1 Sequences for Direct Identification of All Enterovirus Serotypes from Original Clinical Specimens // Journal of Clinical Microbiology. - 2006. - Vol. 44, № 8. - P. 2698-2704.

№ п/п Обозначение праймера / флуоресцентно меченого зонда Краситель Последовательность (5'-3') Гаситель Длина последова-тельности Позиция последовательности относительно генома искомого возбудителя* 1 qD68-F1 - ACACTGAACCAGARGAAGC - 19 2531-2549 2 qD68-P1 ROX ACTCGCACAGTGATAAATCARCAYGG BHQ2 26 2557-2582 3 qD68-R1 - AAAGCTGCTCTACTRAGAA - 19 2608-2626 4 qD68-R2 - AAGGCTGCCCTRCTRAGAA - 19 2608-2626

Таблица 1. Последовательности праймеров и флуоресцентно меченого зонда (Taqman) для обнаружения генетического материала EV-D68

* позиции последовательностей праймеров и зондов определены относительно изолята Fermon (NCBI Reference Sequence: NC_038308.1.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ обнаружения

генетического материала энтеровируса D68 методом полимеразной цепной

реакции в реальном времени.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-03-05">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023131172</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-29</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>W23069127</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023131172</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-29</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ФНИИВИ &quot;Виром&quot;

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBIS FSRIVI &quot;Virome&quot;

Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Чалапа Владислав

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Chalapa Vladislav Igorevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ обнаружения генетического

материала энтеровируса D68 методом полимеразной цепной реакции в

реальном времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Enterovirus D</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acactgaaccagargaagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Enterovirus D</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaagctgctctactragaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Enterovirus D</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggctgccctrctragaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Enterovirus D</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actcgcacagtgataaatcarcaygg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и вирусологии. Описан способ обнаружения генетического материала энтеровируса D68 (EV-D68) методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием набора праймеров и флуоресцентно меченого зонда (Taqman) следующего состава: прямой праймер qD68-F1 (5'-ACACTGAACCAGARGAAGC-3'), обратные праймеры qD68-R1 (5'-AAAGCTGCTCTACTRAGAA-3') и qD68-R2 (5'-AAGGCTGCCCTRCTRAGAA-3'), флуоресцентно меченый зонд (Taqman) qD68-P1 (5'-ROX-ACTCGCACAGTGATAAATCARCAYGG-BHQ2-3'). Способ позволяет обнаружить генетический материал EV-D68 путем амплификации фрагмента гена VP1, кодирующего поверхностный белок EV-D68 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ обнаружения генетического материала энтеровируса D68 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, заключающийся в том, что выделяют нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл методом переосаждения, с полученными образцами нуклеиновых кислот ставят реакцию обратной транскрипции с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл, полученный образец кДНК исследуют с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси, предназначенной для пятикратного разведения, 0,6 мкМ праймера qD68-F1 – 5'-ACACTGAACCAGARGAAGC-3', 0,4 мкМ праймера qD68-R1 – 5'-AAAGCTGCTCTACTRAGAA-3', 0,4 мкМ праймера qD68-R2 – 5'-AAGGCTGCCCTRCTRAGAA-3', 0,3 мкМ флуоресцентно меченого зонда qD68-P1 – 5'-ROX-ACTCGCACAGTGATAAATCARCAYGG-BHQ2-3', 13 мкл воды, для постановки реакции к полученной смеси добавляют 5 мкл исследуемой кДНК, реакцию проводят в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°С в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 55°С в течение 45 секунд.