Штамм Methylobacterium extorquens ВКПМ В-14231 - продуцент микробной белковой массы Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Данный продукт используется как источник белка в белково-витаминных комплексах, предназначенных для балансирования кормов для аквакультуры, сельскохозяйственных и домашних животных.

Различные виды микроорганизмов используются в качестве продуцентов полноценного белка и витаминов.

К продуцентам кормовой биомассы относятся микроорганизмы различных таксономических групп, способные расти на различных субстратах: грибы, дрожжи, бактерии, водоросли.

Известно использование в качестве продуцентов обогащенной белком биомассы метанокисляющих бактерий, которые используют при биосинтезе метан в качестве источника углерода. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают метан, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами, аминокислотами и иными биологически активными веществами.

Известен штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде [патент РФ RU2728345, МПК: C12N 1/20; C12Р 21/00; опубл. 29.07.2020 г.]. Штамм относится к облигатным метанокисляющим бактериям. В качестве единственного источника углерода усваивает метан, в том числе в составе природного газа. В качестве источника азота усваивает аммонийный и нитратный азот. Не растет на органических субстратах. Обладает устойчивостью к пероксиду водорода. Штамм хранится в течение 4-5 мес при температуре +4 - +6°С без природного газа на минерально-агаризованной среде. Допускается хранение в суспензионной культуре в течение 5-6 месяцев.

Известен штамм Methylococcus capsulatus MC19, обладающий способностью продуцировать белковую массу, депонирован в ФГБУН институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ B-3493D. [патент РФ RU 2760288, МПК: C12N 1/20; C12Р 21/00; А23K 10/10, опубл. 23.11.2021 г.]. Штамм позволяет получать биомассу, которая помимо белка содержит антиоксиданты и витамины группы В, повышающие биологическую ценность белковой массы.

Известен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы [патент РФ RU 2745093, МПК: C12N 1/20; C12Р 21/00; опубл. 19.03.2021 г.]. Данный штамм депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт - ГосНИИГенетика» под регистрационным номером ВКПМ В-13764, в качестве продуцента микробного белка для производства белково-витаминных комплексов в составе кормов сельскохозяйственных животных. Активность (продуктивность) штамма составляет до 12 кг×м³/час.

Известно использование генетически модифицированных микроорганизмов Methylobacterium extorquens для производства белков, композиций кормов и пищевых добавок [заявка США US2020/0224236, МПК: C12Р 21/00, C12N 1/20; опубл. 16.07.2020 г.; заявка США US2015/0044327, МПК: А23K 1/16, А23K 1/18, C12N 15/74; опубл. 12.02.2015 г.].

В качестве наиболее близкого аналога выбран немодифицированный штамм метанолокисляющих бактерий Acidomonas methanolica BF 21-05М - продуцент для получения микробной белковой массы по патенту РФ RU2773502 [МПК: C12N 1/20; C12Р 21/00; опубл. 07.06.2022 г.]: Указанный штамм депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14051, и может быть использован в качестве продуцента для получения микробной белковой массы и балансирования кормов сельскохозяйственных животных. Активность (продуктивность) штамма составляет до 9,3 кг×м³/час. Концентрация биомассы при культивировании в течение длительного времен составляла 13-15 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 60-68%. Однако при культивировании указанного штамма необходимо использование дрожжевого автолизата в качестве фактора роста. Добавление дрожжевого автолизата может провоцировать развитие посторонней микрофлоры. Кроме того, культивирование штамма без потери продуктивности возможно в узком диапазоне значений рН (оптимальный рост при рН 4,0-4,5).

Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении изобретения, состоит в создании нового высокопродуктивного штамма метанолокисляющих бактерий для производства кормовой биомассы.

Технический результат заключается в расширении арсенала средств для производства микробной белковой массы, создании нового высокопродуктивного штамма метанолокисляющих бактерий Methylobacterium extorquens, используемого для получения микробной белковой массы с возможностью утилизировать в процессе культивирования опасный органический отход (метанол) без ущерба для окружающей среды. Технический результат заключается также в повышении устойчивости штамма к изменению условий культивирования без снижения продуктивности при изменении температурного режима от 28°С до 32°С и значений рН от 6,0 до 8,0.

Для достижения указанного технического результата предложено использование штамма метанолокисляющих бактерий Methylobacterium extorquens BF 19-02М, депонированного в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14231, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы. Обозначение штамма, присвоенное депозитором BF 19-02М.

Штамм Methylobacterium extorquens BF 19-02М был выделен из дерново-подзолистой почвы (Московская область, Россия). Образец дерново-подзолистой почвы был использован для получения накопительной культуры метанолокисляющих бактерий. После инкубирования в жидкой минеральной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода культуру пересевали, используя метод серийных разведений. После нескольких пассажей культуру высевали на агаризованную минеральную среду для получения изолированных колоний чистой культуры метилотрофных бактерий. Полученный таким образом штамм Methylobacterium extorquens BF 19-02М был селекционирован в процессе длительного (более полугода) пассирования на жидких и агаризованных средах с метанолом.

Штамм бактерии Methylobacterium extorquens ВКПМ В-14231 идентифицирован по культурально-морфологическим, физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Систематическое положение подтверждено результатами анализа гена 16S рРНК, а также расшифровкой генома. Работы проводились компанией SciBear OU (Tartu mnt 67/1-13b, Kesklinna linnaosa, Tallinn, 10115 Harju maakond, Reg. No. 16221849). Полученные последовательности были депонированы в NCBI под номерами MT346348 и JAHKKE000000000 соответственно.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии - не выявлены;

б) устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д. - не выявлены;

в) плазмиды - не выявлены;

г) профаги - не выявлены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Культура грамотрицательна. Клетки имеют форму плеоморфных палочек, размером от 0,5 до 1,5×1,0-10,0 мкм, спор не образуют, неподвижны.

Колонии на 5 сутки культивирования на минеральной агаризованной среде с метанолом (1% об.) при 30°С блестящие, гладкие, выпуклые, сферические, розовые или красные диаметром 1-3 мм. Содержат терминально расположенные гранулы поли-β-гидроксибутирата.

Рост при температуре 15-37°С (оптимум 28-32 °С) и рН 4,0-10,0 (оптимум 6,0-8,0).

Нитраты до нитритов не восстанавливает.

Индол и сероводород не образует.

Гидролиза желатина и крахмала не наблюдается.

Аммиак не производит.

Строгий аэроб, хемоорганотроф и факультативный метилотроф, ассимилирующий соединения C1 по сериновому пути.

В качестве источников углерода и энергии использует янтарную кислоту, этанол, уксусную кислоту, бетаин, метанол, метиламин.

Не утилизирует L-арабинозу, D-ксилозу, D-глюкозу, D-маннозу, D-фруктозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, D-сорбит, D-маннит, инозит, растворимый крахмал, цитрат или метан.

Тесты на оксидазу, каталазу и уреазу положительные.

Не нуждается в витаминах и других стимуляторах роста.

В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты.

В клетках синтезируется убихинон (преимущественно Q₁₀).

Активность (продуктивность) штамма составляет до 5,2 кг×м³/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: на жидкой минеральной среде с добавлением метанола в количестве 20 мл/л.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии; криоконсервация при -80°С в качестве криопротектора применяется 30% раствор глицерина.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Вариант 1

Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,2; NaCl - 0,1; СaСl₂ - 0,05; K₂HPO₄ - 1,2; KH₂PO₄ - 0,62. Микроэлементы (мг/л): MnSO₄×5H₂O - 0,2; FeSO₄×7H₂O - 1; H₃BO₃ - 0,2; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,2; KI - 0,2. Метанол 10 мл/л, рН 6,8-7,0, температура культивирования 30°С.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для ферментации (г/л метанола):

H₃PO₄ (70%) - 40,6 мл;

KCl - 48,0 г;

MgSO₄×7H₂O - 12,7 г;

FeSO₄×7H₂O - 3,4 г;

CuSO₄×5H₂O - 0,28 г;

MnSO₄×5H₂O - 2,5 г;

ZnSO₄×7H₂O - 2,3 г;

CoCl₂×2H₂O - 0,00012 г;

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,002 г.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии нет;

б) фагоустойчив;

в) плазмиды не обнаружены;

г) профаги не обнаружены.

Для заявляемого штамма характерны:

- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры;

- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Культивирование штамма Methylobacterium extorquens BF 19-02М проводили в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,7 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в термостатируемом шейкере-инкубаторе при 30°С. Культивирование вели в течение 24 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 1,2 г/л. Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 30 л (рабочий объем 20 л).

Пример 2

Осуществляли выращивание культуры Methylobacterium extorquens BF 19-02М в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 20 л) с постоянной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (г/л метанола):

H₃PO₄ (70 %) - 40,6 мл;

KCl - 48,0 г;

MgSO₄×7H₂O - 12,7 г;

FeSO₄×7H₂O - 3,4 г;

CuSO₄×5H₂O - 0,28 г;

MnSO₄×5H₂O - 2,5 г;

ZnSO₄×7H₂O - 2,3 г;

CoCl₂×2H₂O - 0,00012 г;

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,002 г.

Процесс выращивания вели в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 28°С до 32°С и рН 6,0-8,0. Исследования были проведены при следующих режимах: t=28°С рН=7,0; t=30°С рН 6,0; t=32 °С рН 7,0; t=30°С рН 8,0. Скорость подачи метанола составляла 100 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН регулировали 5% раствором аммиачной воды или раствором 70% ортофосфорной кислоты. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход воздуха на 1 л культуральной среды составлял 60 л/час.

В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием воды из разных источников, продуктивность культуры оставалась стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляла 15-19 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 62-65%.

Пример 3

Осуществляли выращивание культуры Methylobacterium extorquens BF 19-02М в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 20 л) с непрерывной подачей растворов минеральных солей (как в предыдущем примере). Процесс выращивания осуществляли при температуре 30°С и рН среды 7,0. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. В ферментер подавали воздух в количестве 360 л/ч. Коэффициент скорости протока составлял 0,25 ч^-1. Культуральную жидкость на выходе из ферментера отделяли от клеток в нестерильном режиме и возвращали в ферментационный процесс вместо воды. Доля сопутствующей микрофлоры при таком способе культивирования была неизменной и не превышала 20% от общего количества клеток. Концентрация биомассы на выходе из ферментера составляла 15-19 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе - 62-65%. Полученные данные свидетельствуют о том, что культивирование штамма Methylobacterium extorquens BF 19-02М в минеральной среде указанного состава при непрерывном протоке и в широком диапазоне условий культивирования (температура, рН,) позволяет получать стабильный выход биомассы, сопоставимый с прототипом.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм метанолокисляющих бактерий Methylobacterium extorquens BF 19-02М, депонированный в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14231, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы. Активность штамма составляет до 5,2 кг×м³/час. Концентрация биомассы на выходе из ферментера - 15-19 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 62-65%. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для производства микробной белковой массы. Создан новый высокопродуктивный штамм метанолокисляющих бактерий Methylobacterium extorquens, используемый для получения микробной белковой массы с возможностью утилизации в процессе культивирования опасного органического отхода (метанол) без ущерба для окружающей среды. Штамм устойчив к изменению условий культивирования. 3 пр.

Штамм метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens ВКПМ В-14231 – продуцент микробной белковой массы.