Ссылка на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №62/018056, поданной 27 июня 2014 г., содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Включение посредством ссылки
Для целей тех юрисдикции, которые разрешают включение в описание изобретения сведений исключительно путем ссылки, текст всех документов, цитируемых в настоящем документе, полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Ранняя 4 (Е4) область аденовируса содержит по меньшей мере 6 открытых рамок считывания (E4ORF). Ранее было показано, что целая область Е4 регулирует ангиогенез и стимулирует выживаемость эндотелиальных клеток (см. Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12): 11760-66). Кроме того, ранее было показано, что в пределах целой области Е4 существует последовательность E4ORF1, которая отвечает за указанные биологические эффекты в эндотелиальных клетках. См. патент США №8465732. См. также Seandel et al. (2008), "Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene," PNAS, 105(49): 19288-93. Тем не менее, насколько известно заявителям настоящей заявки, до настоящего изобретения отсутствовали доказательства, подтверждающие то, что область Е4 аденовируса и, в частности, последовательность E4ORF1 могут оказывать благоприятные эффекты либо на нервные клетки, либо на глиальные клетки.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение частично основано на удивительном открытии того, что экспрессия последовательностей E4ORF1 аденовируса может характеризоваться определенными благоприятными эффектами на нервные клетки и глиальные клетки, которые обобщенно в настоящем документе называют клетки нервной системы. Например, было обнаружено, что глиальные клетки, которые экспрессируют E4ORF1 аденовируса, проявляют увеличенные скорости пролиферации, и их можно пассировать in vitro с большим количеством удвоений популяции по сравнению с глиальными клетками, которые не экспрессируют E4ORF1. Аналогично, было обнаружено, что нервные клетки, которые экспрессируют E4ORF1 аденовируса, проявляют увеличенную длину аксона, увеличенные количества минорных процессов и увеличенные количества ветвлений на один аксон по сравнению с нервными клетками, которые не экспрессируют E4ORF1. Указанные эффекты можно достичь без какой-либо очевидной дедифференциации или трансформации клеток нервной системы - экспрессирующие E4ORF1 нервные и глиальные клетки продолжали экспрессировать определенные специфические для клеточного типа маркеры и поддерживали характеристику клеточной морфологии своего типа клеток. Основываясь на указанных данных, согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к новым способам получения, содержания или культивирования клеток нервной системы без трансформации клеток или нарушения иным образом нормальных фенотипических характеристик клеток и/или идентичности линии дифференцировки. Аналогично, согласно другим вариантам осуществления настоящее изобретение относится к новым сконструированным клеткам нервной системы, которые могут являться применимыми в разнообразных ситуациях, включая в себя без ограничения терапевтические применения. Например, полагают, что способность увеличивать длину аксона и количества минорных процессов и ветвей аксона в нейронах может обеспечивать благоприятные эффекты в терапевтических применениях, включающих в себя регенерацию и/или восстановление нервных клеток. Аналогично, полагают, что способность создавать большие количества глиальных клеток или глиальных клеток, характеризующихся повышенными скоростями пролиферации, также может обеспечивать благоприятные эффекты в терапевтических применениях, включающих в себя регенерацию и/или восстановление глиальных клеток. Указанные и другие аспекты настоящего изобретения описаны более подробно ниже и во всем настоящем раскрытии.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к популяциям сконструированных клеток нервной системы, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик согласно описанию и определению, приведенному в разделе "Подробное раскрытие настоящего изобретения" настоящего раскрытия), или популяциям сконструированных клеток нервной системы, которые содержат полипептид E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик). Согласно некоторым таким вариантам осуществления клетки нервной системы представляют собой нервные клетки. Согласно другим таким вариантам осуществления клетки нервной системы представляют собой глиальные клетки. Согласно другим вариантам осуществления настоящее изобретение относится к популяциям сконструированных нейральных стволовых клеток или сконструированных нейральных клеток-предшественников, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), или популяциям сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, которые содержат полипептид E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик). Согласно некоторым таким вариантам осуществления нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники представляют собой нервные клетки-предшественники. Согласно другим таким вариантам осуществления нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники представляют собой глиальные клетки-предшественники. Согласно некоторым вариантам осуществления популяции сконструированных клеток нервной системы (или популяции сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) представляют собой выделенные клеточные популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления популяции сконструированных клеток нервной системы (или популяции сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) представляют собой по существу чистые клеточные популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления популяции сконструированных клеток нервной системы (или популяции сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) присутствуют in vitro, например, в клеточной культуре. Согласно некоторым вариантам осуществления популяции сконструированных клеток нервной системы (или популяции сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) присутствуют in vivo, например, в живом субъекте.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим популяции сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), описанные в настоящем документе. Такие композиции могут содержать такой раствор-носитель, как физиологический солевой раствор. Согласно некоторым вариантам осуществления такие композиции могут представлять собой терапевтические композиции, содержащие популяцию сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) и раствор-носитель, подходящий для введения такому субъекту, как субъект-человек.
Клеточные популяции и композиции, содержащие такие клеточные популяции, описанные в настоящем документе, могут являться применимыми в разнообразных применениях (описанных дополнительно в других разделах настоящего раскрытия). В общем, сконструированные клетки нервной системы и нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники, предусмотренные в настоящем документе, можно использовать для любого применения, в котором не сконструированные (т.е. не экспрессирующие E4OFR1) клетки нервной системы или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники используют в настоящее время или могли бы использовать, включая в себя без ограничения применения в фундаментальных научных исследованиях, способы культивирования клеток (включая в себя способы сокультивирования нервных/глиальных клеток), модельные системы для заболеваний нервной системы, тканевые модельные системы (такие как модельные системы гематоэнцефалического барьера), изыскание новых мишеней, изыскание новых лекарственных средств и исследование эффективности, токсичности и/или безопасности лекарственных средств. Например, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) могут являться применимыми в терапевтических применениях, включая в себя без ограничения in vivo процедуры трансплантации клеток.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к различным способам, которые предусматривают экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант или фрагмент) в клетках нервной системы, или доставку полипептида E4ORF1 аденовируса (или его варианта, производного, мутанта, фрагмента или пептидомиметика) к клеткам нервной системы. Согласно некоторым таким вариантам осуществления клетки нервной системы представляют собой нервные клетки. Согласно другим таким вариантам осуществления клетки нервной системы представляют собой глиальные клетки. Согласно другим вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способам, которые предусматривают экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), в нейральных стволовых клетках или клетках-предшественниках, или доставку полипептида E4ORF1 аденовируса (или его варианта, производного, мутанта, фрагмента или пептидомиметика) к нейральным стволовым клеткам или клеткам-предшественникам. Согласно некоторым вариантам осуществления нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники могут представлять собой нервные стволовые клетки или клетки-предшественники. Согласно другим вариантам осуществления нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники могут представлять собой глиальные стволовые или клетки-предшественники. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки нервной системы (или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) представляют собой выделенные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки нервной системы (или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) представляют собой по существу чистые клеточные популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки нервной системы (или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) присутствуют in vitro, например, в клеточной культуре. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки нервной системы (или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) присутствуют in vivo, например, в живом субъекте.
Например, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения популяции сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем способ предусматривает следующее: введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), в одну или несколько клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) для получения сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) экспрессируют полипептид E4ORF1. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения популяции сконструированных клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) in vitro, причем способ предусматривает: (а) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), в одну или несколько клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) для получения сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) экспрессируют полипептид E4ORF1, и (b) культивирование сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) in vitro. Аналогично, согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем способ предусматривает: (а) получение популяции сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) экспрессируют полипептид E4ORF1 (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), и (b) культивирование сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников). Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем способ предусматривает: (а) получение одной или нескольких клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), (b) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), в одну или несколько клеток нервной системы (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) для получения сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников), причем сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) экспрессируют полипептид E4ORF1, и (с) культивирование сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников). Согласно еще одному иллюстративному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу, предусматривающему следующее: (а) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), в одну или несколько нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников с образованием сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, и (b) дифференцировка одной или нескольких сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников с получением сконструированных клеток нервной системы, причем сконструированные клетки нервной системы экспрессируют белок E4ORF1. Согласно другому иллюстративному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу, предусматривающему следующее: (а) получение популяции сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, которые экспрессируют белок E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), и (b) дифференцировка одной или нескольких сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников с получением сконструированных клеток нервной системы, причем сконструированные клетки нервной системы экспрессируют белок E4ORF1. Согласно другому иллюстративному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу, предусматривающему следующее: (а) получение популяции нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, (b) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок E4ORF1 аденовируса (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик), в одну или несколько нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников с образованием сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, и (с) дифференцировка одной или нескольких сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников с получением сконструированных клеток нервной системы, причем сконструированные клетки нервной системы экспрессируют белок E4ORF1.
Указанные и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны в других разделах раскрытия настоящего патента. Кроме того, как будет очевидно специалистам в настоящей области техники, определенные модификации и комбинации различных вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, подпадают под объем настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Графики, на которых показаны эффекты экспрессии E4ORF1 на длину аксона (фиг. 1А), число минорных процессов на нейрон (фиг. 1В), и число первичных аксональных ветвлений на аксон (фигура 1С) в гиппокампальных нейронах. Данные получали после трансдукции или с помощью E4ORF1 вместе с GFP ("E4ORF1"), или GFP отдельно ("Контроль"). Символ "*" представляет статистическую значимость (р<0,05). Экспрессирующие E4ORF1 гиппокампальные нейроны проявляли статистически значимое увеличение длины аксона, количества минорных процессов на нейрон и количества первичных аксональных ветвлений на аксон по сравнению с контролями.
Фиг. 2. Иллюстративные изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии контрольных (фиг. 2А, 2В, и 2С) и экспрессирующих E4ORF1 гиппокампальных нейронов (фиг. 2D, 2Е, и 2F). Нейроны как в контрольной группе, так и в группе E4ORF1 экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP). Полученная зеленая флуоресценция выглядит светлой/белой (на черном фоне) в версиях изображений по серой шкале, предусмотренных в настоящем документе.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
В разделах "Краткое раскрытие настоящего изобретения", "Фигуры", "Краткое описание фигур", "Примеры" и "Формула изобретения" настоящего раскрытия патента описаны некоторые из основных вариантов осуществления настоящего изобретения. В настоящем разделе "Подробное раскрытие настоящего изобретения" предусмотрено дополнительное описание, относящееся к композициям и способам согласно настоящему изобретению, и предусмотрено, что его следует читать вместе со всеми другими разделами настоящего раскрытия патента. Более того и как станет очевидно специалистам в настоящей области техники, различные варианты осуществления, описанные в настоящем раскрытии патента, можно комбинировать, и предусмотрено, что комбинируют другими различными путями. Предусмотрено, что такие комбинации конкретных вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, подпадают под объем настоящего изобретения.
I. Определения
Ниже предусмотренные некоторые определения. Другие термины либо определяют в другом месте в настоящем раскрытии патента, при этом они имеют значение, которое понятно из контекста, в котором их используют, или их используют, согласно их общепринятому в настоящей области техники значению.
Используемые в настоящем документе термины "приблизительно" и "примерно", используемые в отношении числовых значений, означают в пределах + или - 20% от указанного значения.
Используемые в настоящем документе термины "контроль" и "контрольный", используемые в виде существительного или прилагательного для описания клеток или группы клеток (например, контрольные клетки, контрольная группа клеток и т.д.), используют в соответствии с их установленным научным значением. Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены сравнения между "сконструированными" и "контрольными" клетками. Согласно таким вариантам осуществления "сконструированные" клетки, как правило, содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или полипептид E4ORF1 аденовируса, тогда как "контрольные" клетки не содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или полипептид E4ORF1 аденовируса, но в остальном являются сопоставимыми со "сконструированными" клетками в том, что они представляют собой клетки того же типа, что и "сконструированные" клетки (например, если сконструированные клетки представляют собой астроциты, контрольные клетки также должны представлять собой астроциты), и их обрабатывают сопоставимым (или по существу идентично или идентично) со "сконструированными" клетками образом согласно стандартной научной практике. Например, сконструированные клетки и контрольные клетки должны подвергаться манипуляциям и/или культивироваться сопоставимым путем или по существу идентичным путем. Согласно некоторым вариантам осуществления контрольные клетки могут содержать популяцию клеток, из которых произошли сконструированные клетки, например, контрольная группа клеток может содержать исходную клеточную популяцию (например, перед трансдукцией последовательностью E4ORF1), которую впоследствии конструировали с получением сконструированных клеток, например, путем трансдукции последовательностью E4ORF1. Согласно другим вариантам осуществления контрольные клетки могут не содержать исходную клеточную популяцию, из которой происходят сконструированные клетки, но могут вместо этого содержать другую популяцию клеток такого же типа, что и сконструированные клетки.
Используемый в настоящем документе термин "культивирование" относится к размножению клеток на средах или в средах различных типов. "Сокультивирование" относится к размножению двух или более отдельных типов клеток на средах или в средах различных типов, например, согласно некоторым вариантам осуществления, нервные клетки и глиальные клетки можно сокультивировать.
Используемые в настоящем документе термины "E4ORF1" и "E4ORF1 аденовируса" относятся к открытой рамке считывания 1 (или "ORF1") ранней 4 ("Е4") геномной области аденовируса, дополнительные детали которой представлены ниже. Если специально не указано иное, ссылки на "E4ORF1" или "E4ORF1 аденовируса" могут относиться к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют белок/полипептид "E4ORF1", или к белку/полипептиду "E4ORF1". Согласно каждому из вариантов осуществления, предусмотренных в настоящем документе, которые предусматривают нуклеотидную последовательность или полипептид "E4ORF1", такие варианты осуществления также можно выполнить с использованием варианта, производного, мутанта, фрагмента или пептидомиметика таких нуклеотидных последовательностей или полипептидов при условии, что такой вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик характеризуется или сохраняет одно или несколько функциональных свойств, описанных в настоящем документе (которые включают в себя без ограничения способность увеличивать клеточную пролиферацию, будучи экспрессированными в глиальных клетках, и способность увеличивать длину аксона, будучи экспрессированными в нервных клетках). Дополнительные описания и определения, относящиеся к E4ORF1, предусмотрены ниже.
Используемый в настоящем документе термин "эффективное количество" относится к количеству указанного средства или клеточной популяции (например, молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора E4ORF1, или популяции экспрессирующих E4ORF1 клеток нервной системы), согласно приведенному в настоящем документе описанию, которое является достаточным для достижения обнаруживаемого и положительного эффекта на один или несколько требуемых конечных результатов, описанных в настоящем документе. Например, в случае экспрессии E4ORF1 в глиальных клетках эффективное количество нуклеотидной последовательности E4ORF1 (например, в векторе) или полипептида E4ORF1, подлежащих введению/доставке к глиальным клеткам, может представлять собой количество, которое дает в результате обнаруживаемое увеличение скорости пролиферации глиальных клеток по сравнению с этим показателем контрольных (не экспрессирующих E4ORF1) клеток. Аналогично, в случае экспрессии E4ORF1 в нервных клетках эффективное количество нуклеотидной последовательности E4ORF1 (например, в векторе) или полипептида E4ORF1, подлежащих введению/доставке к нервным клеткам, может представлять собой количество, которое дает в результате обнаруживаемое увеличение длины аксонов нервных клеток по сравнению с этим показателем контрольных (не экспрессирующих E4ORF1) клеток. В случае способов, которые предусматривают введение нуклеотидных последовательностей E4ORF1 (например, в векторе), полипептидов E4ORF1 или экспрессирующих E4ORF1 клеток нервной системы субъекту, эффективное количество, подлежащее введению субъекту, может представлять собой количество, которое дает в результате обнаруживаемое улучшение одного или нескольких требуемых биологических или терапевтических показателей (таких как, например, улучшенная регенерация нейронов, улучшенная ремиелинизация и т.д.), например, по сравнению с показателями контролей без E4ORF1. Соответствующее "эффективное количество" в любом индивидуальном случае можно определить эмпирически, например, с использованием стандартных техник, известных в настоящей области техники, таких как исследования с повышением дозы, и можно определить, принимая во внимание такие факторы, как запланированное применение, запланированный путь доставки/введения, требуемая частота доставки/введения и т.д. Более того, "эффективное количество" можно определить с использованием таких анализов, как описаны в разделе «Примеры» настоящего раскрытия патента для оценки эффектов на различные фенотипические характеристики нервных и глиальных клеток.
Термин "сконструированный" при использовании в отношении клеток в настоящем документе относится к клеткам, которые были сконструированы человеком для экспрессии нуклеотидной последовательности E4ORF1 или полипептида E4ORF1 аденовируса. Не предусмотрено, что термин "сконструированные клетки" включает в себя какие-либо встречающиеся в природе клетки, но вместо этого предусмотрено, что он включает в себя клетки, которые представляют собой результат введения в клетки рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид E4ORF1 аденовируса. Дополнительные детали, относящиеся к подходящим рекомбинантным нуклеотидным последовательностям, которые можно использовать для создания таких сконструированных клеток, предусмотрены ниже, например, в отношении подходящих последовательностей E4ORF1 (например, кДНК), подходящих векторов, подходящих промоторов и подобного.
Используемые в настоящем документе термины "размножение" или "наращивание количества клеток" в контексте клеток или клеточной культуры относятся к увеличению количества клеток определенного типа (например, глиальных клеток или нервных клеток) из исходной популяции клеток, которые могут являться идентичными или могут не являться таковыми. Исходные клетки, используемые для размножения, не обязательно должны являться такими же клетками, как клетки, образованные в результате размножения. Например, выращенные клетки можно получить за счет роста и дифференцировки исходной популяции клеток.
"Генетическая модификация" или "генномодифицированный" относится к любому добавлению, делеции или нарушению нормальных нуклеотидных последовательностей клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе клетки нервной системы в дополнение к тому, что они содержат и/или экспрессируют последовательность E4ORF1, также могут содержать одну или несколько других генетических модификаций, если это необходимо. Термин "генетическая модификация" предусматривает применение носителя для доставки гена и включает в себя без ограничения трансдукцию (опосредованный вирусом перенос нуклеиновой кислоты к реципиенту, или in vivo, или in vitro), трансфекцию (поглощение клетками выделенной нуклеиновой кислоты), опосредованный липосомами перенос и другие способы, хорошо известные в настоящей области техники.
Используемый в настоящем документе термин "выделенный" относится к продукту, соединению или композиции, которые отделены по меньшей мере от одного другого продукта, соединения или композиции, с которыми они ассоциированы в своем встречающемся в природе состоянии, независимо от того, являются ли они природными или получены синтетически.
Термины "субъект" и "пациент" в настоящем документе используют взаимозаменяемо, и они относятся, если иное не указано особым образом, к таким млекопитающим, как люди и не являющиеся людьми приматы, а также кролики, крысы, мыши, козы, свиньи и другие виды млекопитающих.
Используемая в настоящем документе в отношении клеточной популяции фраза "по существу чистый" относится к популяции клеток заданного типа (например, что определяют по экспрессии одного или нескольких установленных клеточных маркеров, морфологических характеристик или функциональных характеристик) или заданных типов (множественное число) в вариантах осуществления, в которых два или больше различных клеточных типов используют вместе, который(е) составляет(ют) по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75-80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85-90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% клеток, составляющих общую клеточную популяцию. Таким образом, "по существу чистая клеточная популяция" относится к популяции клеток, которая содержит меньше чем приблизительно 50%, предпочтительно меньше чем приблизительно 20-25%, более предпочтительно меньше чем приблизительно 10-15% и наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 5% клеток, которые не относятся к заданному типу или типам.
II. E4ORF1
Согласно каждому из вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых включена или перечислена последовательность нуклеиновой кислоты E4ORF1 или полипептид E4ORF1, используемая последовательность E4ORF1 может содержать целую последовательность E4ORF1 аденовируса или ее производное, вариант, мутант, фрагмент или пептидомиметик, которые характеризуются одним или несколькими функциональными свойствами, описанными в настоящем документе (например, без ограничения способность к увеличению клеточной пролиферации в глиальных клетках или способность к увеличению длины аксонов в нейронах). Последовательности E4ORF1 аденовируса известны в настоящей области техники, и любую такую последовательность можно использовать согласно настоящему изобретению. Например, последовательность области Е4 типа 5 аденовируса человека (содержащая ORF1) доступна в Genbank (см., например, регистрационный номер D12587). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения используемая последовательность E4ORF1 представляет собой последовательность типа 5 аденовируса человека, которая хорошо известна в настоящей области техники, или последовательность с идентичностью последовательности больше чем 85% относительно последовательности E4ORF1 типа 5 аденовируса человека. Согласно другому варианту осуществления вариант или мутант последовательности E4ORF1 представляет собой последовательность с приблизительно 85% идентичностью по отношению к последовательности E4ORF1 типа 5 аденовируса человека, или приблизительно 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности по отношению к последовательности E4ORF1 типа 5 аденовируса человека, которая сохраняет способность стимулировать выживаемость и пролиферацию различных клеток, описанных в настоящем документе. Согласно другому варианту осуществления фрагмент E4ORF1 представляет собой последовательность, которая варьирует в длину на +-.30 нуклеотидов относительно последовательности E4ORF1 типа 5 аденовируса человека, или приблизительно .+-.28 нуклеотидов, .+-.26 нуклеотидов, .+-.24 нуклеотида, .+-.22 нуклеотида, .+-.20 нуклеотидов, .+-.18 нуклеотидов, .+-.16 нуклеотидов, .+-.14 нуклеотидов, .+-.12 нуклеотидов, .+-.10 нуклеотидов, .+-.9 нуклеотидов, .+-.8 нуклеотидов, .+-.7 нуклеотидов, .+-.6 нуклеотидов, .+-.5 нуклеотидов, .+-.4 нуклеотида, .+-.3 нуклеотида, .+-.2 нуклеотида или .+-.1 нуклеотид относительно последовательности E4ORF1 типа 5 аденовируса человека, все из которых могут сохранять свойства, описанные в настоящем документе, включая в себя без ограничения способность стимулировать выживаемость и пролиферацию различных клеток, описанных в настоящем документе.
Альтернативно, используемая последовательность E4ORF1 может представлять собой или может происходить из других типов или штаммов аденовируса. Примеры других аденовирусных последовательностей E4ORF1 включают в себя без ограничения таковые из типа 9 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank CAI05991), типа 7 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AAR89977), типа 46 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank ААХ70946), типа 52 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank ABK35065), типа 34 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AAW33508), типа 14 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AAW33146), типа 50 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AAW33554), типа 2 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AP.sub.--000196), типа 12 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AP.sub.--000141), типа 35 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AP.sub.--000607), типа 7 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AP.sub.--000570), типа 1 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AP.sub.--000533), типа 11 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank AP.sub.--000474) и типа 3 аденовируса человека (регистрационный номер Genbank ABB 17792).
Согласно некоторым вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно использовать вместе с одной или несколькими другими последовательностями нуклеиновой кислоты из области Е4, такими как последовательности E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 и/или E4ORF6 или их варианты, мутанты или фрагменты. Например, последовательность E4ORF1 можно использовать вместе с одной или несколькими другими последовательностями из области Е4 для получения экспрессирующих E4ORF1 клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательности E4ORF1 не находятся в пределах целой области Е4 или не находятся в пределах каждой из ORF, встречающихся в целой области Е4, или не находятся в пределах областей E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 и/или E4ORF6. Например, несмотря на то, что последовательности E4ORF1 можно использовать в конструктах (таких как вирусные векторы), которые содержат другие последовательности, гены или кодирующие области (такие как маркерные гены, гены устойчивости к антибиотикам и подобное), согласно определенным вариантам осуществления последовательности E4ORF1 используют в конструктах, которые не содержат целую область Е4 или которые не содержат другие ORF из области целой Е4, такие как E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 и/или E4ORF6.
Последовательности E4ORF1 можно использовать в конструктах, которые содержат различные другие последовательности, гены или кодирующие области в зависимости от требуемого применения. Например, последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно использовать вместе с генами устойчивости к антибиотикам, репортерными генами или экспрессионными метками (такими как, например, GFP) или любыми другими последовательностями или генами, которые, возможно, необходимо экспрессировать. Последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 также можно экспрессировать как часть слитых белков. Последовательности E4ORF1 также можно использовать вместе с любой другой требуемой последовательностью нуклеиновой кислоты, геном, кодирующей областью или некодирующей областью, которые могут присутствовать в экспрессионном конструкте или вирусном векторе, который необходимо использовать, или с любой другой последовательностью нуклеиновой кислоты, геном, кодирующей областью или некодирующей областью, которые являются необходимыми.
Согласно некоторым вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 могут находиться под контролем одного или нескольких промоторов для обеспечения экспрессии. Можно использовать любой промотор, способный управлять экспрессией последовательностей нуклеиновой кислоты E4ORF1 в требуемом типе клеток. Примеры подходящих промоторов включают в себя без ограничения промоторы CMV, SV40, RSV, HIV-Ltr и MML. Промотор также может представлять собой промотор из генома аденовируса или его вариант. Например, промотор может представлять собой промотор, используемый для управления экспрессией E4ORF1 в аденовирусе.
Согласно некоторым вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно поместить под контроль индуцируемого промотора так, чтобы экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно было включать или выключать при необходимости. Можно использовать любую подходящую индуцируемую экспрессионную систему, такую как, например, индуцируемая тетрациклином экспрессионная система или индуцируемая гормоном экспрессионная система. Это можно применять для in vivo применений. Например, последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно экспрессировать, пока они являются необходимыми, а затем выключать, когда достигается требуемый конечный результат, например, когда наблюдается достаточный рост или пролиферация экспрессирующих E4ORF1 клеток. Способность выключать экспрессию последовательностей E4ORF1 можно применять для in vivo применений.
Согласно тем вариантам осуществления настоящего изобретения, которые предусматривают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие E4ORF1 аденовируса, последовательность(и) нуклеиновой кислоты может(могут) представлять собой любую(ые) подходящую(ие) последовательность(и) нуклеиновой кислоты, независимо от того, состоит(ят) ли она(и) из встречающихся в природе нуклеотидов, синтетических нуклеотидов или их комбинации. Например, согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая(ые) кислота(ы) может(могут) содержать РНК, такую как синтетическую модифицированную РНК, которая является стабильной внутри клеток и которую можно использовать для управления экспрессией/получением белка напрямую внутри клеток. Согласно другим вариантам осуществления нуклеиновая(ые) кислота(ы) может(могут) содержать ДНК. Согласно вариантам осуществления, в которых используют ДНК, последовательности ДНК, кодирующие E4ORF1, могут являться функционально связанными с одним или несколькими подходящими промоторами и/или регуляторными элементами для обеспечения (и/или облегчения, усиления или регулирования) экспрессии внутри клеток и могут присутствовать в одном или нескольких подходящих векторах или конструктах. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие E4ORF1, можно вводить в эндотелиальные клетки в одном и том же нуклеиновокислотном конструкте или их можно вводить в отдельных нуклеиновокислотных конструктах.
Согласно тем вариантам осуществления настоящего изобретения, которые предусматривают введение в клетки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид E4ORF1 аденовируса, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая E4ORF1, может представлять любую подходящую нуклеиновую кислоту, независимо от того, состоит ли она из встречающихся в природе нуклеотидов, синтетических нуклеотидов или их комбинации. Например, согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая(ые) кислота(ы) может(могут) содержать РНК, такую как синтетическую модифицированную РНК, которая является стабильной внутри клеток и которую можно использовать для управления экспрессией/получением белка напрямую внутри клеток. Согласно другим вариантам осуществления нуклеиновая(ые) кислота(ы) может(могут) содержать ДНК. Согласно другим вариантам осуществления нуклеиновая(ые) кислота(ы) может(могут) содержать ДНК. Согласно вариантам осуществления, в которых используют ДНК, последовательности ДНК, кодирующие E4ORF1, могут являться функционально связанными с одним или несколькими подходящими промоторами и/или регуляторными элементами для обеспечения и/или облегчения, усиления или регулирования экспрессии внутри клеток и могут присутствовать в одном или нескольких подходящих векторах или конструктах. Кодирующую E4ORF1 последовательность нуклеиновой кислоты можно вводить в одно и то же время или отдельно (при этом одну вводят в одно время, а другую вводят в другое время). Кроме того, кодирующую E4ORF1 последовательность нуклеиновой кислоты можно вводить в одном и том же нуклеиновокислотном конструкте или их можно вводить в отдельных нуклеиновокислотных конструктах.
Стадию введения последовательностей E4ORF1 можно проводить с использованием любой подходящей системы, известной в настоящей области техники, включая в себя без ограничения техники трансфекции и техники опосредованной вирусами трансдукции. Трансфекционные способы, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения опосредованную липосомами трансфекцию, опосредованную полибреном трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ (диэтиламиноэтил)-декстраном трансфекцию, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, микроинъекцию и бомбардировку микрочастицами. Способы опосредованной вирусами трансдукции, которые можно использовать, включают в себя без ограничения опосредованную лентивирусом трансдукцию, опосредованную аденовирусом трансдукцию, опосредованную ретровирусом трансдукцию, опосредованную аденоассоциированным вирусом трансдукцию и опосредованную вирусом герпеса трансдукцию.
Можно использовать любые подходящие средства трансфекции или трансдукции клеток последовательностями нуклеиновой кислоты E4ORF1. Например, последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно трансфектировать в клетки с использованием стандартных способов, известных в настоящей области техники, включая в себя без ограничения опосредованную липосомами трансфекцию, опосредованную полибреном трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, микроинъекцию или бомбардировку микрочастицами. Аналогично, последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 можно доставлять к клеткам с использованием такой вирусной системы доставки, как система доставки с помощью лентивируса, аденовируса, ретровируса, аденоассоциированного вируса или вируса герпеса. Согласно одному варианту осуществления последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1 доставляют к клеткам с использованием лентивирусной системы доставки генов.
Настоящее изобретение также относится к векторам, включая в себя экспрессионные векторы и вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты E4ORF1. Согласно некоторым вариантам осуществления указанные последовательности не сопровождаются целой областью Е4. Согласно некоторым вариантам осуществления указанные последовательности не сопровождаются другими E4ORF аденовируса, такими как E4ORF 2-6. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к лентивирусному вектору, содержащему последовательность E4ORF1. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к лентивирусному вектору, содержащему последовательность E4ORF1, не сопровождающуюся целой областью Е4 или не сопровождающуюся E4ORF аденовируса 2, 3, 4, 5 и/или 6
Наряду с тем, что согласно некоторым вариантам осуществления можно использовать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид E4ORF1 (или его вариант, производное, мутант или фрагмент), согласно другим вариантам осуществления можно использовать полипептид E4ORF1 (или его вариант, производное, мутант, фрагмент или пептидомиметик). Пептидомиметик представляет собой подобную небольшому белку цепь, разработанную для имитации пептида. Такую молекулу можно разработать для имитации полипептида E4ORF1. Различные пути модификации пептида для создания пептидомиметика или разработки пептидомиметика иным образом известны в настоящей области техники и их можно использовать для создания пептидомиметика E4ORF1.
Обращение, манипуляция с последовательностями E4ORF1 согласно настоящему изобретению и их экспрессию можно осуществить с использованием общепринятых техник молекулярной биологии и клеточной биологии. Такие техники хорошо известны в настоящей области техники. Например, можно обратиться к идеям, изложенным в Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); серии Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), или любых других стандартных текстах, для получения руководства в отношении подходящих техник для применения в обращении, манипуляции с последовательностями E4ORF1 и их экспрессии.
III. Композиции
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к "сконструированным клеткам нервной системы" и/или "сконструированным нейральным стволовым клеткам или клеткам-предшественникам", которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или которые содержат полипептид E4ORF1 аденовируса, и к композициям, содержащим такие сконструированные клетки. Согласно тем вариантам осуществления настоящего изобретения, в которых предусмотрены сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники, такие клетки можно подвергнуть дифференцировке с образованием сконструированных клеток нервной системы (таких как сконструированные нейроны или глия). Напротив, согласно тем вариантам осуществления настоящего изобретения, в которых предусмотрены сконструированные клетки нервной системы, такие клетки могут происходить из нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, таких как сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки нервной системы и/или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники, предусмотренные в настоящем документе, представляют собой клетки млекопитающего, такие как клетки человека или не являющегося человеком примата или клетки кролика, крысы, мыши, козы, свиньи или другого млекопитающего.
Используемый в настоящем документе термин "клетки нервной системы" обобщенно относится как к нервным клеткам, так и глиальным клеткам. Используемые в настоящем документе термины "нейральные стволовые клетки" и "нейральные клетки-предшественники" используют в соответствии с их принятыми в настоящей области техники значениями. Наряду с тем, что стволовые клетки и клетки-предшественники отличаются по своему дифференцировочному потенциалу (стволовые клетки, как правило, являются по меньшей мере мультипотентными, тогда как клетки-предшественники, как правило, характеризуются более ограниченным дифференцировочным потенциалом), термины "нейральные стволовые клетки" и "нейральные клетки-предшественники" в качестве терминов, используемых в настоящем документе, используют в отношении клеток, которые характеризуются способностью производить как нервные клетки, так и глиальные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены предшественники нервных клеток и предшественники глиальных клеток. Эти используемые в настоящем документе термины относятся к клеткам-предшественникам с более ограниченным потенциалом, чем предшественники клеток нервной системы, при этом предшественники нервных клеток характеризуются способностью производить нервные клетки, а предшественники глиальных клеток характеризуются способностью производить глиальные клетки.
Согласно некоторым вариантам осуществления, предусмотренные в настоящем документе сконструированные клетки нервной системы (или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) представляют собой или происходят из клеток, которые являются генномодифицированными так, чтобы они содержали одну или несколько генетических модификаций в дополнение и помимо экспрессии E4ORF1. Например, такие клетки могут содержать откорректированную версию гена, который, как известно, вовлечен или, как предполагают, вовлечен в заболевание или нарушение, которое поражает клетки нервной системы.
Сконструированные клетки нервной системы согласно настоящему изобретению могут существовать или могут быть предусмотрены в различных формах. Например, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы могут содержать популяцию клеток, такую как выделенная популяция клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы могут содержать популяцию клеток in vitro. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы могут содержать по существу чистую популяцию клеток. Например, согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75-80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85-90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% клеток, составляющих общую клеточную популяцию, будут представлять собой сконструированные клетки нервной системы согласно настоящему изобретению, например, экспрессирующие E4ORF1 клетки нервной системы или экспрессирующие E4ORF1 клетки нервной системы, экспрессирующие по меньшей мере один, два, три или больше маркеров клеток нервной системы, маркеров нервных клеток или маркеров глиальных клеток, таких как один из маркеров клеток нервной системы, нервных или глиальных клеток, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) могут быть предусмотрены в форме композиции, содержащей сконструированные клетки и один или несколько дополнительных компонентов. Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение может относиться к композиции, содержащей популяцию сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) согласно представленному в настоящем документе описанию вместе с раствором-носителем, таким как физиологический солевой раствор, среда для суспендирования клеток, среда для культивирования клеток или подобное. Согласно некоторым вариантам осуществления такие композиции могут представлять собой терапевтические композиции, содержащие популяцию сконструированных клеток нервной системы (или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) и раствор-носитель, который является подходящим для введения субъекту, такому как субъект-человек. Другие терапевтически приемлемые средства можно включить при необходимости. Специалист в настоящей области техники сможет без труда выбрать средства, подходящие для включения в терапевтические композиции в зависимости от предусмотренного применения. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) согласно настоящему изобретению могут быть предусмотрены в форме композиции (например, терапевтической композиции), которая содержит сконструированные клетки нервной системы и один или несколько дополнительных типов клеток. Такие дополнительные типы клеток могут представлять собой, например, типы клеток, применимые в поддержании или культивировании сконструированных клеток нервной системы (такие как "питающие" клетки, клетки, которые производят трофические факторы и подобное), или типы клеток, предусмотренные для использования вместе со сконструированными клетками нервной системы, например, для применения в in vitro модельной системе или для применения в совместном введении субъекту. Примеры таких дополнительных типов клеток включают в себя без ограничения другие клетки нервной системы (такие как астроциты, олигодендроциты, шванновские клетки и/или нейроны), другие нейральные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки и перициты. Если используют эндотелиальные клетки, эндотелиальные клетки могут также сами по себе являться сконструированными для экспрессии полипептида E4ORF1. Например, подлежащие применению экспрессирующие E4ORF1 эндотелиальные клетки можно получить согласно описанию, приведенному в патенте США №8465732, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
i. Нервные клетки
Согласно тем вариантам осуществления настоящего изобретения, которые предусматривают или включают в себя нервные клетки, нервные клетки могут представлять собой любой тип нервных клеток, включая в себя центральные и периферические нейроны. Согласно некоторым вариантам осуществления нервные клетки, в частности, представляют собой гиппокампальные нейроны. Согласно некоторым вариантам осуществления нервные клетки представляют собой или происходят из первичных нервных клеток. Согласно другим вариантам осуществления нервные клетки происходят из стволовых клеток, клеток-предшественников или ненервных клеток. Например, согласно некоторым вариантам осуществления нервные клетки могут происходить из нейральных стволовых клеток, или нейральных клеток-предшественников, или нервных клеток-предшественников. Согласно некоторым вариантам осуществления нервные клетки могут происходить из плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Аналогично, согласно некоторым вариантам осуществления нервные клетки можно получить путем трансдифференцировки из других дифференцированных клеток, таких как дифференцированные ненервные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления нервные клетки представляют собой или происходят из клеток, которые являются генномодифицированными или содержат одну или несколько генетических модификаций в дополнение и помимо экспрессии E4ORF1. Например, такие клетки могут содержать откорректированную версию гена, который, как известно, вовлечен или, как предполагают, вовлечен в заболевание или нарушение, которое поражает нейроны.
Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) нервные клетки согласно настоящему изобретению характеризуются длиной аксона, которая является (или является приблизительно), в среднем, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200% или более чем на 200% большей, чем длина аксонов контрольных нервных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) нервные клетки согласно настоящему изобретению характеризуются количеством аксональных ветвлений на 100 мкм аксона, которое является (или является приблизительно), в среднем, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200% или более чем на 200% большим, чем количество аксональных ветвлений на 100 мкм аксона контрольных нервных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) нервные клетки согласно настоящему изобретению характеризуются количеством процессов на нейрон, которое является (или является приблизительно), в среднем, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200% или более чем на 200% большим, чем количество процессов на нейрон контрольных нервных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) нервные клетки согласно настоящему изобретению характеризуются количеством аксональных ветвлений, которое является (или является приблизительно), в среднем, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200% или более чем на 200% большим, чем количество аксональных ветвлений контрольных нервных клеток. Согласно некоторым таким вариантам осуществления измерения, на которые ссылались выше, получают через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после трансдукции или трансфекции сконструированных клеток с помощью последовательности E4ORF1. Согласно некоторым таким вариантам осуществления измерения, на которые ссылались выше, получают с использованием любого стандартного способа, известного в настоящей области техники для измерения таких характеристик клеток нервной ткани. Согласно некоторым таким вариантам осуществления измерения, на которые ссылались выше, получают с использованием способа, описанного в примере 2 в настоящем документе, или любого подходящего варианта такого способа.
Многие типы клеток, включая в себя типы нервных клеток, характеризуются тенденцией терять некоторые из своих нормальных фенотипических характеристик при выращивании в культуре и, в частности, при их трансформации для облегчения их роста в культуре. Например, если клетки выращивают в культуре, они могут становиться менее дифференцированными и/или проявляют снижение или потерю одной или нескольких своих обычных фенотипических характеристик. Особое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что сконструированные нервные клетки согласно настоящему изобретению сохраняют определенные типичные специфические для нервных клеток фенотипические характеристики даже при экспрессии в них последовательностей E4ORF1 аденовируса. Например, согласно определенным вариантам осуществления сконструированные нервные клетки согласно настоящему изобретению экспрессируют один или несколько маркеров, в норме экспрессируемых одним или несколькими подтипами нервных клеток, включая в себя без ограничения пан-нейральные маркеры βIII тубулин, МАР2, тау, NeuN и/или нейрофиламент. Сконструированные нервные клетки согласно настоящему изобретению также могут сохранять одну или несколько других характеристик нервных клеток, включая в себя без ограничения идентичность линии дифференцировки, морфологические / структурные характеристики (такие как наличие аксонов, дендритов, синаптических окончаний, синаптических и других соединений между нейронами, морфологических взаимодействий с глиальными клетками и подобного), электрофизиологические или другие физиологические характеристики (включая в себя электрическую возбудимость, активность ионных каналов, активность рецепторов нейромедиаторов, передача потенциала действия, синаптическая передача, синаптическая пластичность, долговременная потенциация и подобное), биохимические характеристики (такие как экспрессия и/или высвобождение нейромедиаторов, экспрессия и/или активация рецепторов нейромедиаторов, экспрессия маркерных белков нервных клеток и подобное) и/или любые другие биологические характеристики нейронов, известные в настоящей области техники.
ii. Глиальные клетки
Согласно тем вариантам осуществления настоящего изобретения, в которых предусмотрены глиальные клетки, глиальные клетки могут представлять собой астроциты, олигодендроциты, эпендимные клетки, радиальную глию, шванновские клетки, клетки-сателлиты, энтеральные глиальные клетки или микроглиальные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления глиальные клетки, в частности, представляют собой астроциты. Согласно некоторым вариантам осуществления глиальные клетки представляют собой или происходят из первичных глиальных клеток. Согласно другим вариантам осуществления глиальные клетки происходят из стволовых клеток, клеток-предшественников или неглиальных клеток. Например, согласно некоторым вариантам осуществления глиальные клетки могут происходить из нейральных стволовых клеток, или нейральных клеток-предшественников, или глиальных клеток-предшественников. Согласно некоторым вариантам осуществления глиальные клетки могут происходить из плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Аналогично, согласно некоторым вариантам осуществления глиальные клетки могут быть получены путем транс дифференцировки из других дифференцированных клеток, таких как дифференцированные неглиальные клетки.
Согласно некоторым вариантам осуществления глиальные клетки представляют собой или происходят из клеток, которые являются генномодифицированными или содержат одну или несколько генетических модификаций в дополнение и помимо экспрессии E4ORF1. Например, такие клетки могут содержать откорректированную версию гена, который, как известно, вовлечен или, как предполагают, вовлечен в заболевание или нарушение, которое поражает глиальные клетки.
Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) глиальные клетки согласно настоящему изобретению характеризуются скоростью пролиферации, которая является, или является приблизительно, или является по меньшей мере, или является по меньшей мере приблизительно, в среднем, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 8 раз, 10 раз или более чем в 10 раз большей, чем это показатель у контрольных глиальных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) глиальные клетки согласно настоящему изобретению проявляют увеличение количества клеток приблизительно через три недели после трансдукции или трансфекции с помощью E4ORF1, которое является, или является приблизительно, или является по меньшей мере, или является по меньшей мере приблизительно в 4 раза, 5 раз, 6 раз или более чем 6 раз большим, чем увеличение количества клеток в контрольных глиальных клетках. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) глиальные клетки согласно настоящему изобретению можно поддерживать в культуре в течение более чем 2, более чем 3 или более предпочтительно более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 пассажей при сохранении ими высокой жизнеспособности и/или при продолжении сохранения ими глиального фенотипа (например, что определяли по морфологии и/или экспрессии таких глиальных маркеров, как глиальные фибриллярный кислый белок (GFAP) в случае астроцитов. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) глиальные клетки согласно настоящему изобретению можно поддерживать в культуре в течение большего количества пассажей без значительного снижения жизнеспособности и/или без существенной потери глиального фенотипа (например, что определяли по морфологии и/или экспрессии таких глиальных маркеров, как GFAP) по сравнению с контрольными глиальными клетками. Согласно некоторым таким вариантам осуществления измерения скоростей пролиферации и количества клеток и оценку успешности пассирования в глиальных клетках можно осуществить с использованием любых стандартных способов, известных в настоящей области техники для измерения/оценки таких характеристик. Согласно некоторым таким вариантам осуществления измерения, на которые ссылались выше, получают с использованием способа, описанного в примере 1 в настоящем документе, или любого подходящего варианта такого способа.
Особое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению сохраняют определенные типичные специфические для глиальных клеток фенотипические характеристики даже при экспрессии в них последовательностей E4ORF1 аденовируса. Например, согласно определенным вариантам осуществления сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению экспрессируют один или несколько маркеров, в норме экспрессируемых одним или несколькими подтипами глиальных клеток, включая в себя без ограничения глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF) и GLT-1. Например, согласно вариантам осуществления, в которых глиальные клетки представляют собой астроциты, глиальные клетки могут экспрессировать GFAP. Сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению также могут сохранять одну или несколько других фенотипических характеристик, типичных для глиальных клеток. Например, в случае сконструированных астроцитов фенотипические характеристики, который могут сохраняться, включают в себя без ограничения морфологические / структурные характеристики (такие как типичная звездчатая морфология ветвления астроцитов, ассоциация с нервными синапасами, "сосудистые ножки", которые соединяют астроциты со стенками капилляров и подобное), электрофизиологические и другие физиологические характеристики (включая в себя активность ионных каналов, регуляцию концентрации ионов во внеклеточном пространстве и подобное), биохимические характеристики (такие как экспрессия и/или высвобождение и/или захват таких нейромедиаторов, как глутамат, экспрессия маркерных белков астроцитов, метаболическая поддержка нейронов и подобное), наведение нервных клеток, формирование глиальной рубцовой ткани и/или любые другие биологические характеристики астроцитов, известные в настоящей области техники.
IV. Способы и применения
Предусмотренные согласно настоящему изобретению сконструированные клетки нервной системы и/или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники характеризуются определенными свойствами, которые могут делать их применимыми в разнообразных применениях. Аналогично, способы, предусмотренные в настоящем документе для получения таких сконструированных клеток нервной системы и/или сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, можно использовать в разнообразных ситуациях. Как правило, предусмотренные в настоящем документе сконструированные клетки нервной системы и нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники можно использовать для любого применения, в котором не сконструированные (т.е. не экспрессирующие E4OFR1) клетки нервной системы или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники используют или могли бы использовать в настоящее время. Например, в случае сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников такие клетки можно использовать для любых применений, в которых нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники используют или могли бы использовать в настоящее время (включая в себя без ограничения для исследовательских целей и/или для терапевтических целей, например, для трансплантации в организм субъекта для регенеративной терапии, например, для лечения болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, рассеянного склероза или других заболеваний или нарушений, поражающих нервную систему), или можно использовать для получения популяции сконструированных дифференцированных клеток нервной системы, которые, в свою очередь, можно использовать для любых применений, для которых дифференцированные клетки нервной системы используют или могли бы использовать в настоящее время, включая в себя без ограничения для исследовательских целей и для терапевтических целей, аналогично применениям, описанным выше для нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников.
Увеличенные скорости клеточной пролиферации и количества пассажей, проявляемые экспрессирующими E4ORF1 глиальными клетками по сравнению с контрольными (т.е. не экспрессирующими E4ORF-1) глиальными клетками могут делать преимущественным использование сконструированных глиальных клеток согласно настоящему изобретению вместо других глиальных клеток в разнообразных способах, включая в себя способы создания или поддержания культур глиальных клеток, способы получения глиальных клеток из стволовых клеток или клеток-предшественников, способы получения глиальных клеток из дифференцированных неглиальных клеток (например, путем трансдифференцировки), применения в фундаментальных научных исследованиях, применения в изыскании новых мишеней, применения в изыскании новых лекарственных средств и применения в изучении эффективности, токсичности и/или безопасности лекарственных средств. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению можно использовать в способах сокультивирования, например, предусматривающих сокультивирование глиальных клеток с нервными клетками. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению можно использовать в моделях заболеваний или других биологических модельных системах, таких как модельные системы гематоэнцефалического барьера. Более того, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные глиальные клетки могут являться применимыми в терапевтических применениях, для которых используют или могли бы использовать не сконструированные глиальные клетки, включая в себя без ограничения in vivo процедуры трансплантации клеток, например, для регенеративных медицинских применений. Например, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные глиальные клетки или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники можно создать или получить применительно к in vivo процедурам трансплантации, например, для лечения заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом глиальных клеток, недостаточностью глиальных клеток или повреждением глиальных клеток. Примеры таких заболеваний, нарушений и состояний включают в себя без ограничения заболевания, нарушения и состояния, связанные со следующим: травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, нейродегенеративные заболевания, заболевания нейроразвития и заболевания, связанные с демиелинизацией или дисмиелинизацией нейронов, включая в себя без ограничения следующее: рассеянный склероз (MS), поствирусная острая демиелинизация, поперечный миелит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (CIDP), синдром Гийена-Барре, прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия (PML), лейкодистрофии, адренолейкодистрофия, лейкодистрофия Краббе, метахроматическая лейкодистрофия, болезнь Александера, болезнь Канавана, синдром Коккейна и болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.
Аналогично, увеличенная длина аксона, увеличенные количества минорных процессов и увеличенное количество ветвлений на аксон, проявляемые экспрессирующими E4ORF1 нервными клетками по сравнению с контрольными (т.е. не экспрессирующими E4ORF-1) нервными клетками, могут делать преимущественным применение сконструированных нервных клеток (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников, которые могут становиться сконструированными нервными клетками) согласно настоящему изобретению вместо других нервных клеток (или нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников) в разнообразных способах, включая в себя способы создания или поддержания культур нервных клеток, способы получения нервных клеток из стволовых клеток или клеток-предшественников, способы получения нервных клеток из дифференцированных ненервных клеток (например, путем трансдифференцировки), применения в фундаментальных научных исследованиях, применения в изыскании новых мишеней, применения в изысканиях новых лекарственных средств и применения в изучении эффективности, токсичности и/или безопасности лекарственных средств. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные нервные клетки согласно настоящему изобретению можно использовать в способах сокультивирования, например, предусматривающих сокультивирование глиальных клеток с нервными клетками. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные нервные клетки согласно настоящему изобретению можно использовать в моделях заболеваний или других биологических модельных системах, таких как модельные системы гематоэнцефалического барьера. Более того, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные нервные клетки (или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники, которые могут становиться сконструированными нервными клетками) могут являться применимыми в терапевтических применениях, для которых используют или могли бы использовать не сконструированные нервные клетки или нейральные стволовые или клетки-предшественники, включая в себя без ограничения регенеративные медицинские применения. Например, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные нервные клетки или нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники можно использовать в in vivo процедуре трансплантации, например, для лечения заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом нервных клеток, недостаточностью нервных клеток или повреждением нервных клеток. Примеры таких заболеваний, нарушений и состояний включают в себя без ограничения заболевания, нарушения и состояния, связанные с травматическим повреждением головного мозга, повреждением спинного мозга, нейродегенеративными заболеваниями и заболеваниями нейроразвития, включая в себя без ограничения болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и амиотрофический латеральный склероз (ALS).
Как упоминалось выше, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки согласно настоящему изобретению можно использовать в различных терапевтических применениях. Таким образом, согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к различным терапевтическим способам, таким как способы лечения нуждающихся в этом субъектов путем введения таким субъектам эффективного количества сконструированных экспрессирующих E4ORF1 клеток нервной системы (или композиции, содержащей сконструированные экспрессирующие E4ORF1 клетки нервной системы) или эффективного количества сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников. В таких способах лечения клетки можно вводить субъектам с использованием любых подходящих средств, известных в настоящей области техники. Например, клетки можно вводить путем инъекции или инфузии в кровоток или ткань в требуемом месте. Например, в случае лечения заболеваний, нарушений или состояний нервной системы сконструированные клетки согласно настоящему изобретению можно вводить непосредственно в пораженные области нервной системы или в непосредственной близости от них. В случае лечения специфических повреждений нервной системы или специфических поражений нервной системы клетки можно вводить напрямую в место повреждения или поражения или в непосредственной близости от них, например, в место повреждения или поражения спинного мозга. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы (или сконструированные нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники) согласно настоящему изобретению можно вводить вместе с одним или несколькими дополнительными типами клеток. Такие дополнительные типы клеток могут представлять собой, например, типы клеток, применимые для поддержания содержания или выживаемости сконструированных клеток нервной системы (такие как "питающие" клетки, клетки, который производят трофические факторы и подобное) и/или типы клеток, которые могут обеспечить некоторый дополнительный терапевтический результат. Примеры таких дополнительных типов клеток включают в себя без ограничения другие клетки нервной системы (такие как астроциты, олигодендроциты, шванновские клетки и/или нейроны), другие нейральные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки и перициты. Если эндотелиальные клетки подлежат применению, эндотелиальные клетки могут также сами по себе являться сконструированными для экспрессии полипептида E4ORF1. Такие экспрессирующие E4ORF1 эндотелиальные клетки можно создать согласно описанию, представленному в патенте США №8465732, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Сконструированные клетки можно вводить в однократной дозе или в многократных дозах. Специалист в настоящей области техники сможет выбрать подходящий способ введения и подходящую схему введения дозировок в зависимости от требуемого применения.
Аналогично, согласно другим вариантам осуществления сконструированные клетки согласно настоящему изобретению можно создать in vivo в различных терапевтических применениях. Таким образом, согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к различным терапевтическим способам, таким как способы лечения нуждающихся в этом субъектов, которые предусматривают введение таким субъектам эффективного количества кодирующей E4ORF1 нуклеотидной последовательности (например, в подходящем векторе и/или под контролем подходящего промотора) так, чтобы клетки нервной системы в организме субъекта были трансфектированы или трансдуцированы последовательностью E4ORF1 и становились сконструированными клетками нервной системы in vivo. В таких способах лечения молекулы нуклеотидов можно вводить субъектам с использованием любых подходящих средств, известных в настоящей области техники. Например, молекулы нуклеотидов (например, в подходящем векторе) можно вводить с помощью инъекции или инфузии в кровоток или ткань в требуемом месте. Например, в случае лечения заболеваний, нарушений или состояний нервной системы молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить непосредственно в пораженные области нервной системы или в непосредственной близости от них. В случае лечения специфических повреждений нервной системы или специфических поражений нервной системы молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить напрямую в место повреждения или поражения или в непосредственной близости от них, например, в место повреждения или поражения спинного мозга. Молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить в однократной дозе или в многократных дозах. Специалист в настоящей области техники сможет выбрать подходящий способ введения и подходящую схему введения дозировок в зависимости от требуемого применения.
Известно, что многие клетки нервной системы тяжело выращивать или поддерживать в культуре без иммортализации или без применения питающих клетки. Посредством экспрессии E4ORF1 аденовируса в таких клетках настоящее изобретение может обеспечить средство для облегчения культивирования таких типов клеток без ухудшения фенотипической целостности клеток или идентичности линии дифференцировки. Например, особое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что сконструированные экспрессирующие E4ORF1 клетки нервной системы характеризуются определенными признаками, которые могут облегчать культивирование клеток или могут приводить в результате к созданию превосходных клеточных культур. Например, сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению характеризуются повышенными скоростями пролиферации по сравнению с контрольными глиальными клетками, и сконструированные глиальные клетки характеризуются определенными улучшенными морфологическими признаками по сравнению с контрольными клетками нервной системы. Способы культивирования клеток хорошо известны в настоящей области техники, и можно использовать любые подходящие способы культивирования клеток. Например, сконструированные глиальные клетки согласно настоящему изобретению можно культивировать с использованием способов, известных как применимые для культивирования не сконструированных глиальных клеток, и сконструированные нервные клетки согласно настоящему изобретению можно культивировать с использованием способов, известных как применимые для культивирования не сконструированных нервных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления культивирование клеток можно осуществить при отсутствии сыворотки, или при отсутствии экзогенных факторов роста, или при отсутствии как сыворотки, так и экзогенных факторов роста. Сконструированные клетки согласно настоящему изобретению также можно криоконсервировать. Специалист в настоящей области техники может без труда культивировать и криоконсервировать клетки, такие как экспрессирующие E4ORF1 клетки нервной системы согласно настоящему изобретению, с использованием способов, известных специалистам в настоящей области техники, таких как способы, описанные R. Ian Freshney ("Freshney") в Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к питающим клеткам, кондиционированной среде и клеточным продуктам, которые содержат или происходят из сконструированных клеток нервной системы согласно настоящему изобретению и которые могут являться применимыми для поддержания выживаемости или роста других клеток, таких как другие клетки нервной системы (включая в себя не сконструированные клетки нервной системы). Например, согласно одному варианту осуществления популяцию сконструированных глиальных клеток можно использовать в качестве питающих клеток для поддержания роста нейронов или популяцию сконструированных нервных клеток можно использовать в качестве питающих клеток для поддержания роста глиальных клеток. Аналогично, согласно другим вариантам осуществления настоящее изобретение может относиться к кондиционированной среде культивирования клеток, полученной из культуры сконструированных клеток нервной системы согласно настоящему изобретению, или к клеточным продуктам (таким как общие клеточные лизаты, клеточные фракции или специфические клеточные продукты), полученным из культуры сконструированных клеток нервной системы согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу сокультивирования для культивирования популяции нейронов, причем способ предусматривает следующее: культивирование популяции нейронов и популяции сконструированных глиальных клеток вместе в одном и том же сосуде для культивирования, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или содержат полипептид E4ORF1 аденовируса. Согласно некоторым таким вариантам осуществления сконструированные глиальные клетки образуют слой питающих клеток на поверхности сосуда для культивирования, и нейроны можно поместить на слой питающих клеток. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу культивирования нейронов, предусматривающему: приведение в контакт популяции нейронов с кондиционированной глиальными клетками средой, причем кондиционированную глиальными клетками среду получают из культуры сконструированных глиальных клеток, и при этом сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или содержат полипептид E4ORF1 аденовируса. Аналогично, согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу культивирования нейронов, предусматривающему: (а) получение популяции сконструированных глиальных клеток, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или содержат полипептид E4ORF1 аденовируса, (b) культивирование сконструированных глиальных клеток в сосуде для культивирования, (с) сбор кондиционированной среды из сосуда для культивирования, (d) добавление кондиционированной среды к культуре нейронов, и (е) культивирование нейронов. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение также относится к кондиционированной среде культивирования клеток, полученной из культуры сконструированных глиальных клеток, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или содержат полипептид E4ORF1 аденовируса.
Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные клетки нервной системы согласно настоящему изобретению могут являться применимыми в in vitro модельной системе гематоэнцефалического барьера. Например, такая система может содержать популяцию сконструированных глиальных клеток, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или содержат полипептид E4ORF1 аденовируса. Аналогично, согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к in vitro модельной системе гематоэнцефалического барьера или набору, содержащим следующее: (а) популяция сконструированных глиальных клеток, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, или содержат полипептид E4ORF1 аденовируса, (b) перициты и (с) эндотелиальные клетки. Согласно каждому из таких вариантов осуществления сконструированные глиальные клетки могут представлять собой астроциты.
V. Наборы
Настоящее изобретение также относится к наборам для проведения различных описанных в настоящем документе способов и/или для получения предусмотренных в настоящем документе сконструированных клеток. Такие наборы могут содержать любой из компонентов, описанных в настоящем документе, включая в себя без ограничения последовательности E4ORF1 (например, в векторе), клетки нервной системы (такие как нейроны или глия), популяции сконструированных клеток нервной системы (такие как сконструированные нейроны или глия), контрольные не сконструированные клетки нервной системы, образцы/стандартные сконструированные клетки нервной системы, средства или композиции для обнаружения последовательностей E4ORF1 или полипептидов E4ORF1 (например, нуклеиновокислотные зонды, антибиотики и т.д.), среды или композиции, применимые для поддержания или размножения клеток нервной системы или сконструированных клеток нервной системы, среды, кондиционированные с помощью сконструированных глиальных клеток, средства или композиции для введения сконструированных клеток нервной системы субъекту или любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к наборам, содержащим сконструированные глиальные клетки, такие как астроциты, для применения в in vitro модельной системе гематоэнцефалического барьера. Например, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему популяцию сконструированных астроцитов согласно приведенному в настоящем документе описанию, а также перициты и эндотелиальные клетки. Все такие наборы могут необязательно содержать инструкции по применению, контейнеры, сосуды для культивирования и подобное. Набор может быть сопровожден этикеткой, и она может включать в себя любой письменный или машинописный материал, который может быть представлен в электронной или машиночитаемой форме (например, в форме диска, оптического диска, запоминающего устройства или пленки), обеспечивающий инструкции или другую информацию по применению компонентов набора.
Определенные аспекты настоящего изобретения можно дополнительно описать в последующих неограничивающих примерах.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Создание и определение характеристик экспрессирующих E4QRF1 астроцитов
Способы. 10-12 Р1 мышат сразу после рождения умерщвляли и головной мозг выделяли в среду для диссекции. Два полушария головного мозга отщипывали пинцетом и оболочки головного мозга и обонятельные луковицы аккуратно удаляли. Остро заточенные ножницы использовали для разрезания тканей на мелкие кусочки (приблизительно 0,5 мм в диаметре). Мелкие кусочки ткани собирали и переносили в среду для диссекции в 15 мл конической пробирке. Кусочкам ткани давали опуститься на дно (~ 1-2 мин) и затем аккуратно удаляли из среды для диссекции. 6-8 мл TrypLE добавляли к конической пробирке и плотно закрывали пробку. Пробирку встряхивали вверх и вниз три раза с последующим помещением пробирки на водяную баню при 37°С в течение 15 минут, при этом пробирку периодически вращали. Затем TrypLE удаляли, не затрагивая подвергнутую диссекции ткань и добавляли 1-2 мл среды для культивирования астроцитов. ДНКазу добавляли в течение 1 мин при перемешивании пробирки путем частого постукивания по пробирке. Кусочки ткани затем промывали 3 раза средой для культивирования астроцитов. Кусочки ткани затем гомогенизировали в ~ 1 мл среды для культивирования астроцитов путем пропускания кусочков ткани и среды 15 раз туда и обратно через пластиковый наконечник пипетки Р1000 с последующей гомогенизацией ткани и среды один раз с использованием отполированной огнем стеклянной пипетки. Гомогенизированную клеточную суспензию затем центрифугировали в течение 5 мин при 400 g и затем удаляли супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл среды для культивирования астроцитов перед помещением клеток в колбу Т25 и затем инкубируя их в обычном инкубаторе для клеточных культур. Среда заменяли свежей средой для культивирования астроцитов каждый день в течение 6 дней после сильных постукиваний по колбам 5-8 раз для удаления слабо прикрепившихся не астроглиальных клеток. На 7 день клетки трансдуцировали с помощью лентивируса E4ORF1 (40-50 мкл концентрированного вируса) с использованием полибрена (8 мкг/мл, среда без антибиотиков). Через 24 часа инфекционную среду заменяли обычной средой для культивирования астроцитов. Клетки пассировали по достижению конфлюэнтности.
Материалы. Использовали P1 В6 мышат сразу после рождения. Среда для диссекции представляла сбой среду L15, дополненную 1X добавкой В27 и 1X пенициллином/стрептомицином. Среда для культивирования астроцитов представляла собой среду MEM, дополненную 10% лошадиной сывороткой, 0,6% глюкозой, 1X GlutaMax и 1X пенициллином/стрептомицином. Кроме того, использовали колбы для культивирования Т25/Т75, TrypLE/аккутазу и ДНКазу.
Результаты. Через одну неделю после трансдукции E4ORF1 экспрессирующие E4ORF1 астроциты проявляли 3-5 - кратное увеличение количества клеток по сравнению с контрольными астроцитами, которых не трансдуцировали с помощью E4ORF1. Через три недели после трансдукции E4ORF1 экспрессирующие E4ORF1 астроциты проявляли 5-6 -кратное увеличение количества клеток по сравнению с контрольными астроцитами. Экспрессирующие E4ORF1 астроциты также можно было пассировать с большими количествами удвоений популяции, чем контроли, не отмечая при этом никаких вредных эффектов. Астроциты E4ORF1 сохраняли высокую жизнеспособность после 4 пассажей и, как оказалось, сохраняли свой астроглиальный фенотип - они экспрессировали глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), и их морфология и морфологическая гетерогенность являлась сопоставимой с этими параметрами у контрольных клеток. Не обнаружили экспрессию ни NG2, ни CD31.
Пример 2: Создание и определение характеристик экспрессирующих E4ORF1 нейронов
Способы. Зародышей мыши на 18 день от зачатия (Е18) умерщвляли и головной мозг выделяли в среду для диссекции. Два полушария головного мозга отщипывали пинцетом и оболочки головного мозга и обонятельные луковицы аккуратно удаляли. Гиппокампы аккуратно отделяли от полушарий головного мозга. Остро заточенные ножницы использовали для разрезания тканей на мелкие кусочки (приблизительно 0,5 мм в диаметре). Мелкие кусочки ткани собирали и переносили в среду для диссекции в 15 мл конической пробирке. Кусочкам ткани давали опуститься на дно (~ 1-2 мин) и затем аккуратно удаляли из среды для диссекции. 6-8 мл TrypLE добавляли к конической пробирке и плотно закрывали пробку. Пробирку встряхивали вверх и вниз три раза с последующим помещением пробирки на водяную баню при 37°С в течение 15 минут, при этом пробирку периодически вращали. Затем TrypLE удаляли, не затрагивая подвергнутую диссекции ткань и добавляли 1-2 мл среды для культивирования нейронов. ДНКазу добавляли в течение 1 мин при перемешивании пробирки путем частого постукивания по пробирке. Кусочки ткани затем промывали 3 раза средой для культивирования нейронов. Кусочки ткани затем гомогенизировали в ~ 1 мл среды для культивирования нейронов путем пропускания кусочков ткани и среды 15 раз туда и обратно через пластиковый наконечник пипетки Р1000 с последующей гомогенизацией ткани и среды один раз с использованием отполированной огнем стеклянной пипетки. Гомогенизированную клеточную суспензию затем центрифугировали в течение 5 мин при 400 g и затем удаляли супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл среды для культивирования нейронов, перед помещением клеток на покрытую поли-L-лизином поверхность 24-луночных планшетов или на покрытые полилизином стеклянные покровные стекла (100000 на покровное стекло или лунку 24-луночного планшета) и затем инкубируя их в обычном инкубаторе для клеточных культур. На следующий день (3 день) клетки трансдуцировали с помощью лентивируса E4ORF1 (2 мкл концентрированного вируса) или с помощью лентивируса E4ORF1 вместе с лентивирусом turboGFP (Evrogen Inc., 5-10 мкл концентрированного вируса в общем) с использованием полибрена (8 мкг/мл, среда без антибиотиков). Нейроны, трансдуцированные только turboGFP, служили в качестве контролей. Через 16 или 24 часа инфекционную среду заменяли обычной средой для культивирования нейронов или средой для культивирования нейронов с ламинином (0,01 мг/мл). Половину объема среды для культивирования заменяли каждые 4-5 дней. Клетки, подлежащие использованию для визуализации, хранили в течение 4-5 дней перед фиксацией и визуализацией с помощью конфокальной микроскопии.
Материалы. Беременная Е18 В6 мышь. Среда для диссекции представляла сбой среду L15, дополненную добавкой 1X В27 и 1X пенициллина/стрептомицина. Среда для культивирования представляла собой нейробазальную среду, дополненную 5% FBS, 0,6% глюкозой, 1X GlutaMax и 1X пенициллином/стрептомицином, 1X добавкой В27. Также использовали 24-луночные планшеты, на которые наносили поли-L-лизин (1 мг/мл), TrypLE и ДНКазу.
Результаты. Обнаружили, что нейроны, экспрессирующие E4ORF1, характеризовались увеличенными длинами аксонов по сравнению с нейронами, не экспрессирующими E4ORF1 (средняя длина аксона составляла 1254,5±137,2 мкм по сравнению с 835,3±146,2 мкм у контролей) (см. фигуру 1А), увеличенными количеством минорных процессов на нейрон по сравнению с нейронами, не экспрессирующими E4ORF1 (5,73±0,43 на нейрон по сравнению с 4,04±0,38 на нейрон у контролей) (см. фигуру 1В) и увеличенным количеством первичных аксональных ветвлений на аксон по сравнению с нейронами, не экспрессирующими E4ORF1 (6,74±0,71 по сравнению с 2,91±0,33 в контрольной группе) (см. фигуру 1С). Все указанные различия являлись статистически значимыми (р<0,05). В таблицах 1, 2, 3 и 4 ниже представлены некоторые дополнительные данные из указанных экспериментов. Обнаружили, что сконструированные (экспрессирующие E4ORF1) гиппокампальные нейроны сохраняли типичную морфологию нейронов и экспрессировали такие пан-нейральные маркеры, как βIII тубулин, МАР2, тау, NeuN и нейрофиламент. На фигуре 2 представлены некоторые иллюстративные изображения контрольных (фигуры 2А, 2В и 2С) и экспрессирующих E4ORF1 нейронов (фигуры 2D, 2Е и 2F).
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к сконструированным клеткам нервной системы, которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, и/или которые содержат полипептид E4ORF1 аденовируса. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения и применения таких сконструированных клеток и композиций, содержащих такие сконструированные клетки. Изобретение позволяет использовать такие клетки в научных целях, а также для лечения заболеваний нервной системы. 17 н. и 35 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр., 2 ил.
1. По существу чистая популяция сконструированных клеток нервной системы для применения в фундаментальных научных исследованиях, где клетки нервной системы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, причем клетки не содержат целую область Е4 аденовируса и не содержат любые последовательности, кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, или аминокислотные последовательности.
2. По существу чистая популяция сконструированных клеток нервной системы для применения в лечении заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом клеток нервной системы, недостаточностью клеток нервной системы или повреждением клеток нервной системы, где клетки нервной системы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, причем клетки не содержат целую область Е4 аденовируса и не содержат любые последовательности, кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, или аминокислотные последовательности.
3. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы представляют собой нервные клетки.
4. Популяция по п. 3, в которой сконструированные нервные клетки представляют собой гиппокампальные нейроны.
5. Популяция по п. 3 или 4, в которой нервные клетки экспрессируют один или несколько маркеров, выбранных из группы, состоящей из βIII тубулина, МАР2, тау, NeuN и нейрофиламента.
6. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы представляют собой глиальные клетки.
7. Популяция по п. 6, в которой глиальные клетки выбраны из группы, состоящей из астроцитов, олигодендроцитов, эпендимных клеток, радиальной глии, шванновских клеток, клеток-сателлитов и энтеральных глиальных клеток.
8. Популяция по п. 6, в которой глиальные клетки представляют собой астроциты.
9. Популяция по п. 6, в которой сконструированные глиальные клетки экспрессируют один или несколько маркеров, выбранных из группы, состоящей из глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF) и GLT-1.
10. Популяция по п. 6, в которой сконструированные глиальные клетки представляют собой GFAP-положительные астроциты.
11. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы представляют собой или происходят из первичных клеток нервной системы.
12. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы происходят из стволовых клеток, клеток-предшественников или ненейральных клеток.
13. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы происходят из плюрипотентных стволовых клеток.
14. Популяция по п. 13, в которой плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
15. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы получены путем перепрограммирования ненейральных клеток.
16. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы получены путем трансдифференцировки из ненейральных клеток.
17. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы, представляют собой клетки млекопитающего.
18. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы, представляют собой клетки человека.
19. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы находятся in vitro.
20. Популяция по пп. 1 или 2, в которой сконструированные клетки нервной системы находятся in vivo в живом субъекте.
21. Применение популяции клеток по пп. 1 или 2 в in vivo процедуре трансплантации.
22. Применение популяции клеток по п. 2 в способе лечения заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом клеток нервной системы, недостаточностью клеток нервной системы или повреждением клеток нервной системы.
23. Способ лечения заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом клеток нервной системы, недостаточностью клеток нервной системы или повреждением клеток нервной системы, причем способ предусматривает введение нуждающемуся в этом субъекту популяции сконструированных клеток нервной системы по п. 2.
24. Способ по п. 23, при котором заболевание, нарушение или состояние выбирают из группы, состоящей из следующего: травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, рассеянный склероз (MS), поствирусная острая демиелинизация, поперечный миелит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (CIDP), синдром Гийена-Барре, прогрессирующая мультифокальная
лейкоэнцефалопатия (PML), лейкодистрофии, адренолейкодистрофия, лейкодистрофия Краббе, метахроматическая лейкодистрофия, болезнь Александера, болезнь Канавана, синдром Коккейна и болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.
25. Способ по п. 23, при котором заболевание, нарушение или состояние представляет собой нейродегенеративное заболевание, заболевание нейроразвития или заболевание, связанное с демиелинизацией или дисмиелинизацией нейронов.
26. Композиция, содержащая эффективное количество клеточной популяции по п. 1 и раствор-носитель для применения в фундаментальных научных исследованиях.
27. Композиция, содержащая эффективное количество клеточной популяции по п. 2 и раствор-носитель для применения в лечении заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом клеток нервной системы, недостаточностью клеток нервной системы или повреждением клеток нервной системы. 28. Терапевтическая композиция, содержащая эффективное количество клеточной популяции по п. 2 и раствор-носитель, подходящий для введения живому субъекту для применения в лечении заболевания, нарушения или состояния, связанного с дефектом клеток нервной системы, недостаточностью клеток нервной системы или повреждением клеток нервной системы.
29. Способ получения популяции сконструированных клеток нервной системы, причем способ предусматривает: введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок E4ORF1 аденовируса, но не содержащей целую область Е4 аденовируса или последовательностей, кодирующих E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6 в одну или несколько клеток нервной системы, тем самым получая сконструированные клетки нервной системы.
30. Способ получения популяции сконструированных клеток нервной системы, причем способ предусматривает: (а) получение популяции сконструированных клеток нервной системы, причем сконструированные клетки нервной системы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержат целую область Е4 аденовируса или последовательности,
кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, и (b) культивирование сконструированных клеток нервной системы.
31. Способ получения популяции сконструированных клеток нервной системы, причем способ предусматривает: (а) получение одной или нескольких клеток нервной системы, (b) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержащей целую область Е4 аденовируса или последовательностей, кодирующих E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, в одну или несколько клеток нервной системы для получения сконструированных клеток нервной системы, и (с) культивирование сконструированных клеток нервной системы.
32. Способ получения популяции сконструированных клеток нервной системы, причем способ предусматривает следующее: (а) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержащей целую область Е4 аденовируса или последовательностей, кодирующих E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, в одну или несколько стволовых клеток или клеток-предшественников с образованием сконструированных стволовых клеток или клеток-предшественников, и (b) дифференцировку сконструированных стволовых клеток или клеток-предшественников в клетки нервной системы, тем самым получая популяцию сконструированных клеток нервной системы.
33. Способ получения популяции сконструированных клеток нервной системы, причем способ предусматривает следующее: (а) получение популяции сконструированных стволовых клеток или клеток-предшественников, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержащей целую область Е4 аденовируса или последовательности, кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, и (b) дифференцировку одной или нескольких сконструированных нейральных стволовых клеток или клеток-предшественников для получения сконструированных клеток нервной системы.
34. Способ по п. 29, 32 или 33, дополнительно предусматривающий культивирование сконструированных клеток нервной системы, нейральных стволовых клеток или нейральных клеток-предшественников.
35. Способ по п. 29, 20, 31, 32 или 33, при котором сконструированные клетки нервной системы экспрессируют полипептид E4ORF1 аденовируса.
36. Способ по п. 29, 30, 31, 32 или 33, при котором молекулу нуклеиновой кислоты вводят в клетки нервной системы, нейральные стволовые клетки или нейральные клетки-предшественники in vitro.
37. Способ по п. 29 или 32, при котором молекулу нуклеиновой кислоты вводят в клетки нервной системы, нейральные стволовые клетки или нейральные клетки-предшественники in vivo.
38. Способ по п. 32 или 33, при котором стволовые или клетки-предшественники представляют собой нейральные стволовые клетки или клетки-предшественники.
39. Способ по п. 32 или 33, при котором стволовые клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки.
40. Способ по п. 39, при котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
41. Способ по пп. 29, 31 или 32, при котором стадию введения проводят с помощью трансфекции.
42. Способ по п. 41, при котором трансфекцию проводят с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из следующего: опосредованная липосомами трансфекция, опосредованная полибреном трансфекция, опосредованная ДЭАЭ-декстраном
трансфекция, электропорация, осаждение фосфатом кальция, микроинъекция и бомбардировка микрочастицами.
43. Способ по пп. 29, 31 или 32, при котором стадию введения проводят с помощью опосредованной вирусом трансдукции.
44. Способ по п. 43, при котором опосредованную вирусом трансдукцию проводят с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из следующего: опосредованная лентивирусом трансдукция, опосредованная аденовирусом трансдукция, опосредованная ретровирусом трансдукция, опосредованная аденоассоциированным вирусом трансдукция и опосредованная вирусом герпеса трансдукция.
45. Способ культивирования популяции нейронов причем способ предусматривает: культивирование популяции нейронов и популяции сконструированных глиальных клеток вместе в одном и том же сосуде для культивирования, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержат целую область Е4 аденовируса или последовательности, кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6.
46. Способ по п. 45, при котором сконструированные глиальные клетки образуют слой питающих клеток на поверхности сосуда для культивирования.
47. Способ по п. 46, при котором нейроны помещают на слой питающих клеток.
48. Способ культивирования нейронов, предусматривающий: приведение в контакт популяции нейронов с кондиционированной глиальными клетками средой, причем кондиционированную глиальными клетками среду получают из культуры сконструированных глиальных клеток, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержат целую область Е4 аденовируса или последовательности, кодирующие E4ORF2, E4QRF3, E4ORF4, E4QRF5 или E4ORF6.
49. Способ культивирования нейронов, причем способ предусматривает: (а) получение популяции сконструированных глиальных клеток, причем сконструированные глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержат целую область Е4 аденовируса или последовательности, кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, (b) культивирование сконструированных глиальных клеток в сосуде для культивирования, (с) сбор кондиционированной среды из сосуда для культивирования, (d) добавление кондиционированной среды к культуре нейронов, и (е) культивирование нейронов.
50. In vitro модельная система гематоэнцефалического барьера, содержащая следующее: (а) популяция сконструированных глиальных клеток, причем сконструированным глиальные клетки содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, но не содержат целую область Е4 аденовируса или последовательности, кодирующие E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 или E4ORF6, (b) перициты, (с) эндотелиальные клетки и d) среду применимую для поддержания или размножения клеток нервной системы.
51. Модельная система по п. 50, в которой сконструированные глиальные клетки представляют собой астроциты.
| US 2010093081 A1, 15.04.2010 | |||
| WO 2012061828 A2, 10.05.2012 | |||
| WO 2008039173 A2, 03.04.2008 | |||
| US 2010003757 A1, 07.01.2010 | |||
| US 2011027235 A1, 03.02.2011 | |||
| ТРАНСПЛАНТАЦИЯ НЕРВНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ СОСТОЯНИЙ | 2005 |
|
RU2434636C2 |
