Гематоэнцефалический барьер, содержащий сконструированные эндотелиальные клетки Российский патент 2021 года по МПК C12N5/79 A61K35/30 C07K14/75 A61P25/00 G01N33/50 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/393774, поданной 13 сентября 2016 года, полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки.

Включение путем ссылки

Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, включены путем ссылки во всей своей полноте.

Предпосылки создания изобретения

Гематоэнцефалический барьер (ВВВ) отделяет циркулирующую кровь от внеклеточной жидкости и клеток центральной нервной системы (CNS). Гематоэнцефалический барьер (ВВВ) in vivo образован эндотелиальными клетками головного мозга, соединенными друг с другом плотными контактами, базальной мембраной и астроцитами - типом глиальной клетки. ВВВ обладает высоким электрическим сопротивлением и функционирует таким образом, чтобы ограничить доступ определенных молекул и микроорганизмов (таких как бактерии) к CNS, при этом позволяя воде, некоторым газам и некоторым важным молекулам (таким как глюкоза и аминокислоты) входить в CNS путем пассивной диффузии или селективного активного транспорта.

Несмотря на то что барьерная функция ВВВ обеспечивает важный механизм безопасности in vivo - защиту тканей головного и спинного мозга - эта же самая барьерная функция может представлять проблему для разработки терапевтических агентов для лечения CNS - когда способность лекарственных средств пересекать ВВВ была бы полезной. И, напротив, при разработке лекарственных средств, которые могут оказывать неблагоприятные воздействия на ткани CNS, может быть желательным разработать агенты, которые не могут пересекать ВВВ. Таким образом, в данной области существует потребность в модельных системах, которые можно использовать для изучения способности терапевтических агентов пересекать ВВВ, и для скрининга агентов, которые обладают желаемой способностью преодолевать ВВВ, а также для исследования других биологических свойств ВВВ в нормальных и болезненных состояниях.

В данной области существует также потребность в способах лечения, восстановления или замены повреждения ВВВ, которое возникает in vivo - например, в результате травматического повреждения, заболевания или инфекции.

Настоящее изобретение направлено на решение всех этих проблем.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение отчасти основано на неожиданном открытии того, что эндотелиальные клетки, сконструированные для экспрессии белка E40RF1 аденовируса, могут быть использованы для создания подобной гематоэнцефалическому барьеру ткани, которая не только точно воспроизводит многие важные характеристики гематоэнцефалических барьеров (BBBs) in vivo, но, что важно, превосходит в некоторых важных аспектах системы ВВВ, использующие наивные (т.е. не экспрессирующие E40RF1) эндотелиальные клетки. Например, и как описано более подробно в разделе «Примеры» данной патентной заявки, было продемонстрировано, что сконструированные E40RF1+ эндотелиальные клетки можно использовать для создания ВВВ-подобной ткани, которая обладает значительно улучшенной барьерной функцией (увеличенным трансэндотелиальным электрическим сопротивлением («TEER») и пониженным коэффициентом проницаемости) по сравнению с системой ВВВ, содержащей наивные эпителиальные клетки (ECs). Несмотря на то что было известно ранее, что экспрессия E40RF1 улучшает продолжительность жизни клеток ЕС в культуре (см. патент США №8465732. См. также Seandel et al. (2008), PNAS, 105(49): 19288-93), этот эффект E40RF1 на барьерную функцию эндотелия был неожиданным.

Кроме того, и как описано более подробно в разделе «Примеры» данной патентной заявки, было также обнаружено, что в отличие от наивных ECs, сконструированные E40RF1+ECs могут поддерживаться в течение длительного времени в прямом контакте с астроцитами (т.е. без физического барьера между двумя типами клеток), и что барьерная функция сконструированных E40RF1 + ECs значительно улучшилась, когда клетки совместно культивировали с астроцитами таким образом. И снова этот эффект E40RF1 на взаимодействие эндотелия с астроцитами был неожиданным.

Еще одним преимуществом использования сконструированных E40RF1 + ECs вместо наивных ECs при создании ВВВ-подобных тканей или систем является то, что в отличие от наивных ECs - которые требуют сыворотки и/или факторов роста (таких как VEGF) для длительной выживаемости в культуре - сконструированные E40RF1+ ECs могут поддерживаться в длительной культуре (например, более чем 1-месячной), даже в отсутствие сыворотки и факторов роста. Это обеспечивает особенно важное преимущество в случае ткани/системы ВВВ, поскольку сыворотка и факторы роста (такие как VEGF), как известно, вызывают нежелательную утечку (то есть пониженное сопротивление/повышенную проницаемость) ВВВ - что подтверждается на фигуре 4 настоящей заявки.

Опираясь на эти открытия, а также другие, описанные в разделах «Примеры» и «Фигуры» данной заявки на патент, настоящее изобретение обеспечивает несколько новых и усовершенствованных систем ВВВ, композиций и способов.

Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает in vitro системы гематоэнцефалического барьера (ВВВ), которые могут быть полезными, например, для тестирования/скрининга лекарственных средств и изучения проницаемости ВВВ и функции ВВВ в некоторых болезненных состояниях (например, рак) или в ответ на травму. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает in vitro систему гематоэнцефалического барьера (ВВВ), которая содержит E40RF1+ эндотелиальные клетки. В некоторых таких вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой мышиные эндотелиальные клетки. В других вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой человеческие эндотелиальные клетки. В некоторых таких вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой эндотелиальные клетки головного мозга. В некоторых таких вариантах осуществления система ВВВ in vitro также содержит проницаемую твердую подложку, на которой обычно располагаются эндотелиальные клетки. В некоторых таких вариантах осуществления система ВВВ in vitro также содержит астроциты, которые могут находиться в прямом контакте с эндотелиальными клетками.

В еще других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы скрининга тестирования/скрининга лекарственных средств и/или изучения проницаемости ВВВ и функции ВВВ при определенных болезненных состояниях (например, рак) или в ответ на повреждение.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает композиции, содержащие как E40RF1+ эндотелиальные клетки (такие как E40RF1+ эндотелиальные клетки головного мозга), так и астроциты. В других вариантах осуществления такие композиции могут также содержать один или несколько дополнительных типов клеток, включая, но без ограничения, перициты и/или нервные стволовые клетки/клетки-предшественники (NSPC). В некоторых вариантах осуществления такие композиции содержат по существу чистые популяции указанного клеточного типа или указанных смесей клеточных типов. Такие композиции могут быть полезными в различных ситуациях, в том числе в исследовательских и терапевтических применениях.

В еще других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы лечения дефектов, заболеваний или нарушений, которые поражают гематоэнцефалический барьер, при этом такие способы включают введение E40RF1+ эндотелиальных клеток, таких как E40RF1+ эндотелиальные клетки головного мозга, живому субъекту, такому как субъект-человек.

Эти и другие варианты осуществления изобретения описаны далее в других разделах раскрытия этого патента. Кроме того, как будет очевидно для специалистов в данной области, определенные модификации и комбинации различных вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, подпадают в объем настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Флуоресцентная микрофотография, на которой показано иммуногистохимическое окрашивание монослоя E40RF1+ эндотелиальных клеток (ECs) мышиного головного мозга (полученных из коры головного мозга 3-недельных мышей). Клетки метили с использованием первичных антител, специфичных к маркеру плотных контактов клаудину 5 и CNS-специфическому маркеру ЕС MFSD2A, и флуоресцентно меченых вторичных антител. Белок клаудин-5 был обнаружен на границах клеток, тогда как белок MFSD2A был обнаружен внутри клеток. Эндотелиальные клетки получали из коры головного мозга 3-недельных мышей.

Фиг. 2А-В. (А) График, показывающий измерения TEER в Ом⋅см², записанные на монослойных культурах: ECs головного мозга мышей дикого типа (WT), ECs головного мозга мышей WT, совместно культивированных с мышиными астроцитами, E40RF1 + ECs головного мозга мышей, и E40RF1 + ECs головного мозга мышей, совместно культивированных с мышиными астроцитами. Величины TEER измеряли через 3 дня в культуре. Используемый в настоящем документе термин «WT» относится к ECs, которые не были сконструированы для экспрессии E40RF1. (В) График, показывающий измерения TEER, записанные на монослойных культурах: E40RF1 + ECs головного мозга мышей и E40RF1 + ECs головного мозга мышей, совместно культивированных с мышиными астроцитами. Величины TEER измеряли через 3 дня в культуре. Измерения TEER представлены в виде процента от величины TEER, полученной в отсутствие совместного культивирования с астроцитами. Увеличение приблизительно на 20% величины TEER наблюдалось, когда E40RF1 + ECs совместно культивировали с астроцитами в режиме прямого контакта.

Фиг. 3. График, показывающий измерения TEER в Ом⋅см², записанные на монослойных культурах E40RF1 + ECs, полученных из головного мозга человека, вены пупочного канатика человека («HuVec»), легких человека, почки человека или сердца человека. Термин «VeraVec», используемый в этой фигуре, относится к E40RF1 + ECs. Значения TEER измеряли через 3 дня в культуре.

Фиг. 4. График, показывающий измерения TEER в Ом⋅см², записанные на монослойной культуре E40RF1 + ECs головного мозга человека в течение периода, составляющего примерно 24 дня. Стрелки указывают на момент времени, когда к культуре добавляли VEGF, и момент времени, когда VEGF-содержащую среду заменяли свежей средой, не содержащей VEGF.

Фиг. 5А-В. Графики, показывающие коэффициенты проницаемости (Рс) для: пустых лунок Transwell (т.е. без клеток), монослоя человеческих клеток 293Т, наивных ECs из головного мозга человека/GBM, E40RF1 + ECs из почек человека и E40RF1 + ECs из головного мозга человека/GBM, по данным измерений с использованием Lucifer Yellow (MW=0,4 кДа). (А) Данные Рс выражены в единицах см/сек. (В) Данные Рс выражены в виде процента от значения Рс, полученного в пустых лунках Transwell (т.е. без клеток). Термин «VeraVec», используемый в этой фигуре, относится к E40RF1 + ECs.

Фиг. 6. График, показывающий измерения TEER в Ом⋅см², записанные в течение периода около 8 дней в монослойных культурах E40RF1 + ECs головного мозга человека, полученных из GBM Степени А и Степени В.

Фиг. 7. График, показывающий измерения TEER в Ом⋅см², записанные в течение периода около 8 дней в 3 разных монослойных культурах E40RF1 + ECs головного мозга человека. На день 4 опухолевые клетки GBM добавляли к 2 из 3 культур («+GBM») - как указано. Из двух совместных культур EC/GBM одну поддерживали в бессывороточных условиях («SF»), а другую культивировали в присутствии сыворотки - как указано. Термин «VeraVec», используемый в этой фигуре, относится к E40RF1 + ECs.

Подробное описание изобретения

В разделах «Краткое описание изобретения», «Фигуры», «Краткое описание фигур», «Примеры» и «Формула изобретения» описаны основные варианты осуществления изобретения. Данный раздел «Подробное описание изобретения» обеспечивает конкретное дополнительное описание, относящееся к композициям и способам по настоящему изобретению, и предназначен для прочтения вместе со всеми другими разделами данного раскрытия патента. Кроме того, и как будет очевидно для специалистов в данной области, различные варианты осуществления, описанные в этом раскрытии патента, могут и предполагаются быть комбинированы различными способами. Предполагается, что такие комбинации определенных вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, подпадают в объем настоящего изобретения.

Определения

Определения некоторых терминов приведены ниже. Другие термины определены где-либо в другом месте в этом раскрытии патента, имеют значение, которое понятно из контекста, в котором их используют, или используются в соответствии с их обычным значением в данной области.

Используемые в настоящем документе термины «около» и «приблизительно» при использовании в отношении числовых значений означают в пределах + или - 20% от заявленной величины.

Используемый в настоящем документе термин «культивирование» относится к размножению клеток на поверхности или внутри сред различных типов. «Совместное культивирование» относится к размножению двух или более различных типов клеток на поверхности или внутри сред различных типов, например, в некоторых вариантах осуществления могут быть совместно культивированы эндотелиальные клетки и астроциты.

Используемый в настоящем документе термин «эффективное количество» относится к количеству указанного агента или популяции клеток (например, полипептида E40RF1, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид E40RF1, или популяции сконструированных E40RF1+ эндотелиальных клеток), как описано в настоящем документе, которое является достаточным для достижения обнаруживаемого эффекта на одну или несколько конечных точек, описанных в настоящем документе. Например, в случае экспрессии E40RF1 в эндотелиальных клетках, эффективное количество молекулы нуклеиновой кислоты (например, в векторе), подлежащей введению/доставке в эндотелиальные клетки, может представлять собой такое количество, которое приводит к обнаруживаемому увеличению барьерной функции эндотелиальных клеток в модели ВВВ по сравнению с барьерной функцией любого подходящего контроля (например, E40RF1^- эндотелиальные клетки).

В случае способов, которые включают введение субъекту E40RF1⁺ эндотелиальных клеток, эффективное количество может представлять собой такое количество, которое вызывает обнаруживаемое улучшение одного или нескольких желательных биологических или терапевтических показателей (таких как, например, улучшенная функция ВВВ) по сравнению с показателями любого подходящего контроля (например, E40RF1^- эндотелиальные клетки). Соответствующее «эффективное количество» в любом индивидуальном случае может быть определено эмпирически, например, с использованием стандартных методов, известных в данной области, таких как исследования с эскалацией дозы, и может быть определено с учетом таких факторов, как планируемое применение, планируемый способ доставки/введения, желаемая частота доставки/введения и т.д. Кроме того, «эффективное количество» может быть определено с использованием анализов, таких как анализы, описанные в разделе «Примеры» данного раскрытия патента, для оценки эффектов на функцию ВВВ.

Термин «сконструированные» при использовании в отношении клеток в настоящем документе относится к клеткам, которые были сконструированы человеком для получения указанного фенотипа (например, E40RF1⁺) или для экспрессии указанной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Термин «сконструированные клетки» не предназначен для включения встречающихся в природе клеток, а предназначен для включения, например, клеток, содержащих рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, или клеток, искусственно измененных иным образом (например, путем генетической модификации), например, таким образом, что они экспрессируют полипептид, который они не экспрессировали бы в ином случае, или таким образом, что они экспрессируют полипептид на значительно более высоких уровнях по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в не сконструированных эндотелиальных клетках.

Используемый в настоящем документе термин «выделенный» относится к продукту, соединению или композиции, который отделен по меньшей мере от одного другого продукта, соединения или композиции, с которым он связан в своем естественном состоянии, природном или полученным синтетически.

Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный» относится к молекулам нуклеиновой кислоты, созданным человеком (в том числе с помощью машины) с использованием способов молекулярной биологии и генной инженерии (например, молекулярного клонирования), и содержащим нуклеотидные последовательности, которые в ином случае не могли бы существовать в природе. Таким образом, рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот следует отличать от молекул нуклеиновых кислот, существующих в природе - например, в геноме организма. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая комплементарную или копию ДНК «кДНК» последовательности мРНК без каких-либо промежуточных интронных последовательностей, таких как встречающиеся в соответствующей последовательности геномной ДНК, будет, таким образом, считаться рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты. В качестве примера, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты E40RF1 может содержать последовательность, кодирующую E40RF1, функционально связанную с промотором и/или другими генетическими элементами, с которыми эта кодирующая последовательность обычно не связана в природном геноме аденовируса.

Термины «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся, если не указано иное, к млекопитающим, таким как люди и приматы, не относящиеся к людям, а также кроликам, крысам, мышам, козам, свиньям и другим видам млекопитающих.

Выражение «по существу чистая», используемое в настоящем документе в отношении клеточной популяции, относится к популяции клеток указанного типа (например, как определено по экспрессии одного или нескольких указанных клеточных маркеров, морфологическим характеристикам или функциональным характеристикам) или указанных типов (множество) в вариантах осуществления, где два или более различных клеточных типа используются вместе, то есть по меньшей мере около 50%, предпочтительно по меньшей мере около 75-80%, более предпочтительно по меньшей мере около 85-90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 95% клеток составляют общую клеточную популяцию. Таким образом, «по существу чистая клеточная популяция» относится к популяции клеток, которая содержит менее чем около 50%, предпочтительно менее чем около 20-25%, более предпочтительно менее чем около 10-15% и наиболее предпочтительно менее чем около 5% клеток, которые не относятся к указанному типу или типам. Молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды.

Несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, включают сконструированные эндотелиальные клетки, которые являются E40RF1+. E40RF1+ клетки экспрессируют полипептид E40RF1 аденовируса, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты E40RF1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает полипептиды и/или молекулы нуклеиновых кислот E40RF1, которые кодируют полипептид E40RF1 аденовируса.

Полипептиды по изобретению и молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут иметь аминокислотные последовательности или нуклеотидные последовательности, указанные в настоящем документе или известные в данной области, или могут иметь аминокислотные или нуклеотидные последовательности, являющиеся вариантами, производными, мутантами или фрагментами таких аминокислотных или нуклеотидных последовательностей - при условии, что такие варианты, производные, мутанты или фрагменты имеют или кодируют полипептид, который обладает одним или несколькими из функциональных свойств, описанных в настоящем документе (которые включают, но без ограничения, свойства, связанные с функцией ВВВ).

В тех вариантах осуществления, которые включают полипептиды E40RF1 аденовируса, используемая полипептидная последовательность может быть получена из любого подходящего типа или штамма аденовируса, такого как аденовирус человека типа 2, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 34, 35, 46, 50 или 52. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления используемая полипептидная последовательность получена из аденовируса человека 5 типа. Аминокислотные последовательности таких аденовирусных полипептидов и последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют такие полипептиды, хорошо известны в данной области и содержатся в общеизвестных доступных базах данных, таких как база данных Genbank. Например, подходящие последовательности включают следующее: аденовирус человека типа 9 (номер доступа CAI05991 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 7 (номер доступа AAR89977 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 46 (номер доступа ААХ70946 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 52 (номер доступа ABK35065 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 34 (номер доступа AAW33508 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 14 (номер доступа AAW33146 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 50 (номер доступа AAW33554 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 2 (номер доступа АР.sub.-000196 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 12 (номер доступа АР.sub.-000141 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 35 (номер доступа АР.sub.-000607 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 7 (номер доступа АР.sub.-000570 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 1 (номер доступа АР.sub.-000533 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 11 (номер доступа АР.sub.-000474 в базе данных Genbank), аденовирус человека типа 3 (номер доступа ABB 17792 в базе данных Genbank) и аденовирус человека типа 5 (номер доступа D12587b базе данных Genbank).

В некоторых вариантах осуществления полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот по изобретению имеют такие же аминокислотные или нуклеотидные последовательности, как последовательности, специально указанные в настоящем документе или известные в данной области (например, в открытых базах данных последовательностей, таких как база данных Genbank). В некоторых вариантах осуществления полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут иметь аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые представляют собой варианты, производные, мутанты или фрагменты таких последовательностей, например, варианты, производные, мутанты или фрагменты, имеющие более 85% идентичности с такими последовательностями. В некоторых вариантах осуществления варианты, производные, мутанты или фрагменты имеют около 85% идентичности с известной последовательностью, или около 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с известной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления используется вариант, производное, мутант или фрагмент известной нуклеотидной последовательности, который отличается по длине на около 50 нуклеотидов или около 45 нуклеотидов, или около 40 нуклеотидов, или около 35 нуклеотидов, или около 30 нуклеотидов, или около 28 нуклеотидов, 26 нуклеотидов, 24 нуклеотида, 22 нуклеотида, 20 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 16 нуклеотидов, 14 нуклеотидов, 12 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 9 нуклеотидов, 8 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 5 нуклеотидов, 4 нуклеотида, 3 нуклеотида, 2 нуклеотида или 1 нуклеотид относительно известной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления используется вариант, производное, мутант или фрагмент известной аминокислотной последовательности, который отличается по длине на около 50 аминокислот или около 45 аминокислот, или около 40 аминокислот, или около 35 аминокислот, или около 30 аминокислот, или около 28 аминокислот, 26 аминокислот, 24 аминокислоты, 22 аминокислоты, 20 аминокислот, 18 аминокислот, 16 аминокислот, 14 аминокислот, 12 аминокислот, 10 аминокислот, 9 аминокислот, 8 аминокислот, 7 аминокислот, 6 аминокислот, 5 аминокислот, 4 аминокислоты, 3 аминокислоты, 2 аминокислоты или 1 аминокислоту относительно известной аминокислотной последовательности.

В тех вариантах осуществления, где используется последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты E40RF1, в некоторых вариантах осуществления такие последовательности используются без других последовательностей из области Е4 аденовируса - например, не в контексте нуклеотидной последовательности всей области Е4, или не вместе с другими полипептидами, кодируемыми областью Е4. Однако в некоторых других вариантах осуществления такие последовательности могут быть использованы в сочетании с одной или несколькими другими последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот из области Е4, такими как последовательности E40RF2, E40RF3, E40RF4, E40RF5 или E40RF6, или их варианты, мутанты или фрагменты. Например, хотя последовательности E40RF1 могут быть использованы в конструкциях (таких как вирусные векторы), которые содержат другие последовательности, гены или кодирующие области (такие как промоторы, маркерные гены, гены устойчивости к антибиотикам и т.п.), в определенных вариантах осуществления последовательности E40RF1 используются в конструкциях, которые не содержат всю область Е4, или которые не содержат других ORE из всей области Е4, таких как E40RF2, E40RF3, E40RF4, E40RF5 и/или E40RF6.

Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть использованы в конструкциях, которые содержат различные другие последовательности нуклеиновых кислот, гены или кодирующие области, в зависимости от желаемого применения, например, гены устойчивости к антибиотикам, репортерные гены или экспрессионные метки (такие как, например, нуклеотидные последовательности, кодирующие GFP), или любые другие нуклеотидные последовательности или гены, которые могут быть желательны. Полипептиды по изобретению могут быть экспрессированы отдельно или как часть белков слияния.

В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут находиться под контролем одного или нескольких промоторов для обеспечения возможности экспрессии. Может быть использован любой промотор, способный управлять экспрессией последовательностей нуклеиновых кислот в желаемом типе клеток. Примеры подходящих промоторов включают, но без ограничения, промоторы CMV, SV40, RSV, HIV-Ltr и MML. Промотор может также представлять собой промотор из генома аденовируса или его вариант. Например, где используются E40RF1, промотор может представлять собой промотор, используемый для управления экспрессией соответствующих генов в аденовирусе.

В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть помещены под контроль индуцируемого промотора, таким образом, что экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот может быть по желанию включена или выключена. Может быть использована любая подходящая индуцируемая система экспрессии, такая как, например, система экспрессии, индуцируемая тетрациклином, или система экспрессии, индуцируемая гормоном. Например, молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут быть экспрессированы, когда они необходимы, а затем выключены, когда достигнут желаемый результат, например, когда произошел достаточный рост или пролиферация эндотелиальных клеток. Возможность включать или выключать экспрессию может быть особенно полезной для применений in vivo.

Молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут содержать встречающиеся в природе нуклеотиды, синтетические нуклеотиды или их комбинации. Например, в некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут содержать РНК, такую как синтетическая модифицированная РНК, которая является стабильной в клетках и может быть использована для направления экспрессии/продукции белка непосредственно в клетках. В других вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут содержать ДНК. В вариантах осуществления, где используется ДНК, последовательности ДНК могут быть функционально связаны с одним или несколькими подходящими промоторами и/или регуляторными элементами для обеспечения (и/или облегчения, усиления или регулирования) экспрессии в клетках, и могут присутствовать в одном или нескольких подходящих векторах или конструкциях. Молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут быть введены в эндотелиальные клетки в одной и той же конструкции нуклеиновых кислот или они могут быть введены в отдельные конструкции нуклеиновых кислот.

Молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут быть введены в эндотелиальные клетки с использованием любой подходящей системы, известной в данной области, включая, но без ограничения, методы трансфекции и методы опосредованной вирусом трансдукции. Способы трансфекции, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают, но без ограничения, опосредованную липосомами трансфекцию, опосредованную полибреном трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, электропорацию, осаждение фосфата кальция, микроинъекцию и бомбардировку микрочастицами. Опосредованные вирусом способы трансдукции, которые могут быть использованы, включают, но без ограничения, лентивирус-опосредованную трансдукцию, аденовирус-опосредованную трансдукцию, ретровирус-опосредованную трансдукцию, опосредованную аденоассоциированным вирусом трансдукцию, и опосредованную вирусом герпеса трансдукцию.

Настоящее изобретение обеспечивает также векторы, включая векторы экспрессии, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот по изобретению. Например, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид E40RF1. В некоторых таких вариантах осуществления вектор экспрессии представляет собой лентивирусный вектор.

В некоторых вариантах осуществления может быть использован пептидомиметик. Пептидомиметик представляет собой небольшую подобную белку цепь, сконструированную, чтобы имитировать полипептид. Такая молекула может быть сконструирована, чтобы имитировать любой из полипептидов по изобретению (например, полипептид E40RF1). Различные способы модификации пептида для создания пептидомиметика или конструирования пептидомиметика иным образом известны в данной области и могут быть использованы для создания пептидомиметика одного из полипептидов по изобретению.

Переработка, манипулирование и экспрессия полипептидов и молекул нуклеиновых кислот по изобретению могут быть выполнены с использованием традиционных методов молекулярной биологии и биологии клетки. Такие методы хорошо известны в данной области. Например, можно сослаться на учения Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); серии Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), или любые другие стандартные тексты для получения руководства по подходящим методам для использования в переработке, манипулировании и экспрессии нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей. Дополнительные аспекты, относящиеся к переработке или экспрессии последовательностей E40RF1, описаны в патенте США 8465732, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

Эндотелиальные клетки

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает сконструированные эндотелиальные клетки, такие как сконструированные E40RF1+ эндотелиальные клетки. Сконструированные эндотелиальные клетки могут быть получены из любого подходящего источника эндотелиальных клеток, известного в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой сосудистые эндотелиальные клетки. В некоторых вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой первичные эндотелиальные клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки представляют собой клетки млекопитающих, такие как клетки человека или примата, не относящегося к человеку, или клетки кролика, крысы, мыши, козы, свиньи или других млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой первичные эндотелиальные клетки человека. В некоторых вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой эндотелиальные клетки пупочной вены (UVEC), такие как эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Другие подходящие эндотелиальные клетки, которые можно использовать, включают клетки, описанные ранее как подходящие для экспрессии E40RF1 в патенте США 8465732, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. В предпочтительных вариантах осуществления эндотелиальные клетки представляют собой эндотелиальные клетки головного мозга, такие как микроваскулярные эндотелиальные клетки головного мозга.

В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки генетически модифицированы таким образом, что они содержат одну или более генетических модификаций, дополнительно и помимо экспрессии специфических указанных молекул (например, E40RF1). Например, такие клетки могут содержать исправленную версию гена, который, как известно или предполагается, вовлечен в заболевание или нарушение, которое поражает эндотелиальные клетки или функцию ВВВ, или любого другого гена, такого как терапевтически полезный ген, который может быть желательно обеспечить в эндотелиальных клетках, или же ввести или доставить с использованием сконструированных эндотелиальных клеток.

Сконструированные эндотелиальные клетки по настоящему изобретению могут существовать или быть представлены в различных формах. Например, в некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки могут содержать популяцию клеток, такую как изолированная популяция клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки могут содержать популяцию клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки могут содержать по существу чистую популяцию клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере около 50%, предпочтительно по меньшей мере около 75-80%, более предпочтительно по меньшей мере около 85-90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 95% клеток, составляющих общую популяцию клеток, будут представлять собой сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению. В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки могут быть обеспечены в форме композиции, содержащей сконструированные клетки и один или несколько дополнительных компонентов. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может обеспечить композицию, содержащую популяцию сконструированных эндотелиальных клеток, как описано в настоящем документе, вместе с раствором-носителей, таким как физиологический солевой раствор, среда для суспензионных клеточных культур, среда для культивирования клеток или т.п. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут представлять собой терапевтические композиции - содержащие популяцию сконструированных эндотелиальных клеток и раствор-носитель, который является подходящим для введения субъекту, такому как субъект-человек. По желанию могут быть включены другие терапевтически приемлемые агенты. Специалист в данной области может легко выбрать подходящие агенты для включения в терапевтические композиции в зависимости от предполагаемого применения.

В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению могут быть обеспечены в форме композиции (например, терапевтической композиции), которая содержит сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению и один или несколько дополнительных типов клеток. Такие дополнительные типы клеток могут представлять собой, например, типы клеток, которые можно поддерживать, культивировать или размножать в присутствии сконструированных эндотелиальных клеток (например, с использованием сконструированных эндотелиальных клеток по изобретению в качестве «питающих» клеток), или любой другой тип клеток, которые желательно использовать вместе с сконструированными эндотелиальными клетками по изобретению - например, для использования в модельной системе in vitro или для совместного введения субъекту. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению могут быть обеспечены в композиции (например, терапевтической композиции), которая содержит сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению и астроциты.

Астроциты

Некоторые из вариантов осуществления настоящего изобретения включают астроциты. Могут быть использованы любые подходящие астроциты. В некоторых вариантах осуществления астроциты представляют собой мышиные астроциты. В некоторых вариантах осуществления они представляют собой астроциты человека. Астроциты могут представлять собой первичные астроциты (например, выделенные из ткани CNS) или они могут представлять собой культивированные линии астроцитов. Способы получения и культивирования астроцитов известны в данной области, и любые такие способы могут быть использованы в сочетании с настоящим изобретением.

Модельные системы, способы и применения

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает модельные системы ВВВ, композиции и наборы, используемые в таких системах, и способы скрининга, в которых используются такие модельные системы ВВВ. Использование модельных систем ВВВ для скрининга лекарственных средств и/или для биологических исследований известно в данной области, и новые модельные системы ВВВ по настоящему изобретению можно использовать так же или аналогично системам, известным в данной области. Например, E40RF1 + эндотелиальные клетки можно использовать вместо наивных (не E40RF1+) эндотелиальных клеток, обычно используемых в других модельных системах ВВВ. Как правило, такие системы будут содержать конфлюэнтный монослой эндотелиальных клеток, выращенных на твердой проницаемой подложке, таким образом, что эндотелиальные клетки образуют барьер, который физически отделяет две камеры по обе стороны от слоя эндотелиальных клеток. Таким образом, можно исследовать способность агентов проходить из одного физического отделения в другое физическое отделение через барьер эндотелиальных клеток.

Как отмечается выше, такие модельные системы ВВВ могут быть использованы в скрининге лекарственных средств. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы оценки способности агента-кандидата проникать сквозь гематоэнцефалический барьер, при этом такие способы включают приведение в контакт E40RF1 + эндотелиальных клеток в модельной системе ВВВ с одним или несколькими агентами-кандидатами. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы оценки эффекта одного или нескольких агентов-кандидатов на проницаемость гематоэнцефалического барьера, при этом такие способы включают приведение в контакт E40RF1+ эндотелиальных клеток в модельной системе ВВВ с одним или несколькими агентами-кандидатами. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы оценки эффекта одного или более тестируемых типов клеток на проницаемость гематоэнцефалического барьера, при этом такие способы предусматривают включение одного или более тестируемых типов клеток в модельную систему ВВВ, содержащую E40RF1+ эндотелиальные клетки, как описано в настоящем документе, и тестирование эффектов этого тестируемого типа клеток на барьерную функцию и проницаемость ВВВ. Дополнительные подробности каждого из таких способов скрининга/тестирования (включая подходящие анализы для оценки барьерной функции и проницаемости ВВВ) описаны в других местах в этой патентной заявке - в том числе в разделах «Примеры» и «Формула изобретения».

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает различные терапевтические способы, такие как способы лечения субъектов, нуждающихся в этом, путем введения таким субъектам эффективного количества сконструированных эндотелиальных клеток по изобретению (или композиции, содержащей такие сконструированные эндотелиальные клетки). В таких способах лечения клетки можно вводить субъектам с использованием любых подходящих способов, известных в данной области. Например, клетки можно вводить путем инъекции или инфузии в кровоток или ткань в желаемом месте. Например, в случае лечения заболеваний, нарушений или состояний CNS сконструированные клетки в соответствии с настоящим изобретением можно вводить непосредственно внутрь или вблизи пораженных участков головного или спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки могут быть введены вместе с одним или более дополнительными типами клеток. Такими дополнительными типами клеток могут являться, например, астроциты. Сконструированные эндотелиальные клетки можно вводить в виде единичной дозы или множества доз. Специалист в данной области сможет выбрать подходящий способ введения и подходящий режим дозирования в зависимости от желаемого применения.

В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки по настоящему изобретению могут быть созданы in vivo, например, в исследовательских целях или для терапевтических применений. Например, в некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает различные терапевтические способы, такие как способы лечения субъектов, нуждающихся в этом, которые включают введение таким субъектам эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид E40RF1 (например, в подходящем векторе и/или под контролем подходящего промотора), таким образом, что эндотелиальные клетки субъекта трансфицируются или трансдуцируются этими молекулами нуклеиновой кислоты и становятся сконструированными эндотелиальными клетками in vivo. В таких способах нуклеотидные молекулы можно вводить субъектам с использованием любых подходящих способов, известных в данной области. Например, нуклеотидные молекулы (например, в подходящем векторе) можно вводить путем инъекции или инфузии в кровоток или ткань в желаемом месте. Молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить в виде единичной дозы или множества доз. Специалист в данной области сможет выбрать подходящий способ введения и подходящий режим дозирования в зависимости от желаемого применения.

В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению митотически инактивируют перед применением (например, терапевтическим применением), таким образом, что они не могут реплицироваться. Это может быть достигнуто, например, путем использования химического агента, такого как митомикон С, или путем облучения сконструированных эндотелиальных клеток.

Способы культивирования клеток

Способы культивирования клеток хорошо известны в данной области и любые подходящие способы культивирования клеток могут быть использованы. Например, сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению можно культивировать способами, которые, как известно, пригодны для культивирования других эндотелиальных клеток, или способами, которые, как известно, пригодны для культивирования эндотелиальных клеток, экспрессирующих E40RF1, например, как описано в патенте США 8465732, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению можно культивировать в отсутствие сыворотки или в отсутствие экзогенных факторов роста, или в отсутствие как сыворотки, так и экзогенных факторов роста. Сконструированные эндотелиальные клетки по изобретению могут быть также криоконсервированы. Специалистам в данной области известны различные способы культивирования клеток и криоконсервации клеток, такие как способы, описанные в работе Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000) by R. Ian Freshney ("Freshney"), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы совместного культивирования, например, включающие совместное культивирование E40RF1+ эндотелиальных клеток и астроцитов. Такие способы совместного культивирования могут включать культивирование E40RF1+ эндотелиальных клеток и астроцитов вместе в одном и том же сосуде для культивирования. В некоторых вариантах осуществления E40RF1+ эндотелиальные клетки и астроциты могут находиться в непосредственном клеточном контакте (без какого-либо барьера, например мембраны, отделяющей E40RF1+ эндотелиальные клетки от астроцитов). В некоторых таких вариантах осуществления сконструированные эндотелиальные клетки могут образовывать конфлюэнтный монослой на поверхности сосуда для культивирования или какой-либо другой твердой, но проницаемой подложки, и астроциты могут быть нанесены на монослой эндотелиальных клеток.

Наборы

Настоящее изобретение также обеспечивает наборы для изготовления модельных систем ВВВ по изобретению и/или для изготовления, применения или осуществления любой из композиций или способов, описанных в настоящем документе. Такие наборы могут содержать любой из компонентов, описанных в настоящем документе, включая, но без ограничения, нуклеотидные последовательности (например, в векторе), сконструированные эндотелиальные клетки, астроциты, среды или композиции, полезные для поддержания или размножения сконструированных эндотелиальных клеток или астроцитов, твердые проницаемые подложки для культивирования монослоев эндотелиальных клеток или любую их комбинацию. Все такие наборы могут необязательно содержать инструкции по применению, контейнеры, сосуды для культивирования и т.п. Этикетка может сопровождать набор и может включать любой написанный или записанный материал, который может быть представлен в электронной или машиночитаемой форме (например, диск, оптический диск, чип памяти или пленка), содержащий инструкции или другую информацию по применению содержимого набора.

Некоторые аспекты настоящего изобретения будут дополнительно описаны в следующем неограничивающих примере.

ПРИМЕР

Выделение и культивирование микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга мышей

Пять-восемь трехнедельных мышей умерщвляли, и головной мозг изолировали в среду для препарирования. Два полушария головного мозга извлекали по отдельности, и мозговые оболочки и обонятельные луковицы осторожно удаляли. Тонкие ножницы использовали для измельчения тканей на мелкие кусочки (диаметром около 0,5 мм). Маленькие кусочки ткани собирали и переносили со средой для препарирования в коническую пробирку объемом 15 мл. Кусочки ткани оставляли для осаждения приблизительно на 1-2 минуты, после чего осторожно удаляли из среды для препарирования. В коническую пробирку добавляли 6-8 мл TrypLE и крышку плотно закрывали. Пробирку переворачивали вверх-вниз 3 раза, после чего пробирку помещали в водяную баню при 37°С на 15 минут, время от времени вращая пробирку. Затем TrypLE удаляли, не касаясь нарезанной ткани, и добавляли 1-2 мл мышиной эндотелиальной среды (http://angiocrinebioscierice.com/wp-coritent/uploads/VeraVec-Mouse-Brain-Instmction-Sheet.pdf). Добавляли ДНКазу в течение 1 минуты при встряхивании пробирки путем частого постукивания. Затем кусочки ткани 3 раза промывали мышиной эндотелиальной средой. Затем кусочки ткани растирали приблизительно в 1 мл мышиной эндотелиальной среды, переворачивая кусочки ткани и среду вверх и вниз 10 раз с последующим растиранием ткани и среды с использованием полированной пламенем стеклянной пипетки. Затем растертую клеточную суспензию центрифугировали в течение 5 минут при 400 g и супернатант затем удаляли. Клеточный осадок ресуспендировали в полной мышиной эндотелиальной среде и вносили в колбы Т75, покрытые фибронектином. Среду заменяли свежей мышиной эндотелиальной средой через день, пока культура не достигла конфлюэнтности. Антитело CD31 использовали для очистки микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Клетки, полученные после сортировки, повторно высевали на лунки, покрытые фибронектином (6-луночный планшет), с плотностью приблизительно 400000 клеток на лунку. На следующий день клетки трансдуцировали лентивирусом E40RF1 (40-50 мкл концентрированного вируса) с использованием полибрена (8 мкг/мл, среда без антибиотиков). Через 24 часа инфицирующую среду заменяли обычной мышиной эндотелиальной средой. Клетки пересевали после достижения конфлюэнтности.

Выделение и культивирование микроваскулярных эндотелиальных клеток головного мозга человека

Ткань головного мозга человека получали путем хирургического удаления у пациентов с эпилепсией или у пациентов с глиобластомой (GBM). Человеческую ткань затем обрабатывали и культивировали, как описано выше для мышиной ткани. Анализы трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) и проницаемости с использованием Lucifer Yellow.

На день 0 эндотелиальные клетки высевали во вставки Transwell (Coining Inc., 353180), которые соответствовали 12-луночным планшетам. Клетки достигали конфлюэнтности на следующий день (приблизительно 200000-400000 клеток/вставку). На день 1 начинали ежедневные измерения трансэндотелиального электрического сопротивления («TEER»). Среду заменяли на среду «TEER booster)), содержащую гидрокортизон, сАМР, РКА, ингибитор фосфодиэстеразы, ретиноевую кислоту, инсулин, трансферрин и селенит натрия. Для экспериментов по совместному культивированию с астроцитами на день 2 (после образования монослоя ECs во вставках Transwell) во вставки Transwell добавляли астроциты при плотности 50000 клеток на вставку, таким образом, что астроциты находились в прямом контакте с эндотелиальными клетками. Для экспериментов по совместному культивированию с клетками GBM, на день 4 клетки GBM высевали на дно лунок, содержащих вставки Transwell (с монослоями ЕС).

Для анализа проницаемости с использованием Lucifer Yellow (LY) выполняли следующий протокол. На день 1 клетки высевали во вставки, которые соответствовали 12-луночным планшетам, таким образом, что они достигали конфлюэнтности на следующий день (~200000-400000 клеток/вставка). На день 2 среду заменяли средой «TEER booster)), содержащей гидрокортизон, сАМР, РКА, ингибитор фосфодиэстеразы, ретиноевую кислоту, инсулин, трансферрин и селенит натрия. На день 3 среду заменяли бессывороточной средой «TEER booster)) (среда нейронного предшественника с N2 и В27). На день 4 измерения TEER проводили до выполнения анализа проницаемости на основе LY. Анализ на основе LY выполняли с использованием коммерчески доступного анализа, в основном следуя инструкциям производителя (http://ebiotrade.com/buvf/productsf/BD%20Falcon/insert protocol lucifer yellow permeabi litv_assav.pdf). Анализ на основе LY использовали в соответствии с инструкциями производителя для определения коэффициента проницаемости или «Рс» (см/сек). Рс=(V/(A×Ci))×(Cf/T), где V представляет собой объем основной камеры (мл), А представляет собой площадь мембранной вставки (см²), Ci представляет собой начальную концентрацию LY, Cf представляет собой конечную концентрацию LY, и Т представляет собой время анализа в секундах (Т составило 1 час (3600 секунд) и/или 4 часа). Значение Рс, рассчитанное с использованием этой системы, обеспечило количественный показатель целостности и функции барьера. В целом, Рс<2,5×10^-6 см/сек в анализе на основе Lucifer yellow указывает на качество барьерной функции ВВВ.

Иммуноцитохимия

Монослои E40RF1+ эндотелиальных клеток мышиного головного мозга (ECS) фиксировали 4% параформальдегидом перед выполнением иммуногистохимического исследования с использованием антител, специфичных к клаудину 5 и MFSD2A.

Результаты

Было обнаружено, что монослои E40RF1+ эндотелиальных клеток головного мозга мышей экспрессируют маркер плотного контакта клаудин-5 и CNS-специфический ЕС MFSD2A (см. Фиг. 1).

Было обнаружено, что экспрессия E40RF1 в эндотелиальных клетках головного мозга мышей увеличивает значения TEER по сравнению со значениями, наблюдаемыми в наивных (не E40RF1+) ECs головного мозга мышей, и совместное культивирование E40RF1+ эндотелиальных клеток головного мозга мышей с астроцитами еще больше повышает значения TEER/барьерную функцию (см. Фиг. 2А и 2В - измерения TEER на день 3 культивирования). Астроциты были способны образовывать монослой в прямом контакте с E40RF1+ECs, тогда как при использовании наивных (не E40RF1+) ECs астроциты образовывали «островки» астроцитов в «море» ECs (в отличие от формирования многослойной структуры астроцит/ЕС, наблюдаемой при использовании E40RF1+ECs), и значения TEER (показатель барьерной функции) были более низкими при культивировании астроцитов с наивными (не E40RF1+) ECs, в отличие от E40RF1+ECs (см. Фиг. 2А).

Как показано на Фиг. 3, E40RF1+ эндотелиальные клетки головного мозга человека проявили уникально высокое значение TEER (~200 ОМ⋅см² на день 2) по сравнению с E40RF1+ECs, происходящими из человеческой пуповины, легкого, почки или сердца (~25 OM⋅см²). (Примечание - на Фиг. 3 термин «VeraVec» относится к E40RF1+ECs.). Кроме того, значения TEER E40RF1+ монослоев эндотелиальных клеток головного мозга оставались высокими (около 200 ОМ⋅см²) в течение 6 недель. Кроме того, проницаемость E40RF1+монослоев эндотелиальных клеток головного мозга человека, как было показано, была восприимчивой к внеклеточным стимулам, которые, как известно, влияют на проницаемость ВВВ - таким как VEGF (см. Фиг. 4).

На Фиг. 5 показаны результаты эксперимента, в котором E40RF1+ эндотелиальные клетки головного мозга человека сравнивали с наивными (не экспрессирующими E40RF1) эндотелиальными клетками головного мозга человека, E40RF1+ эндотелиальными клетками почки человека, клетками 293 Т человека и пустыми лунками Transwell (т.е. без клеток) в анализах для измерения значений TEER и определения коэффициентов проницаемости (Рс). (Примечание - на Фигуре 5 термин «VeraVec» относится к E40RF1+ клеткам) Полученные значения Рс и TEER представляли собой следующие: (а) вставка без клеток Рс=7,11±1,07×10^-6 см/сек; TEER=0; (b) клетки 293Т-Рс=4,86±0,44×10^-6 см/сек, TEER=~50 М⋅см², (с) наивные ECs GBM человека - Рс=4,26±0,40×10^-6 см/сек, TEER=~50 ОМ⋅см², (d) E40RF1+ECs почки человека - Рс=3,57±0,13×10^-6 см/сек, TEER=-35 ОМ⋅см², и (е) E40RF1+ECs GBM человека - Рс=1,69±0,12×10^-6 см/сек, TEER=~120 ОМ⋅см². E40RF1+ эндотелиальные клетки мозга человека показали самое низкое значение Рс - то есть лучшую барьерную функцию.

В другом эксперименте E40RF1+ эндотелиальные клетки головного мозга человека получали из двух разных образцов GBM - одного, полученного из центра/ядра опухоли (обозначается как Степень В), и другого, полученного с периферии опухоли в области, прилегающей к нормальной ткани (обозначается как Степень А). Как показано на Фиг. 6, наблюдалось значительное различие в значениях TEER между E40RF1+ эндотелиальными клетками головного мозга Степени А и Степени В.

На Фиг. 7 показаны результаты эксперимента, в котором E40RF1+ эндотелиальные клетки головного мозга человека, полученные от пациентов с эпилепсией, совместно культивировали с опухолевыми клетками GBM человека. Значения TEER падали при совместном культивировании с опухолевыми клетками GBM. Когда совместное культивирование выполняли в отсутствие сыворотки, значения TEER падали примерно на 50% от значения, наблюдаемого при культивировании E40RF1+ эндотелиальных клеток головного мозга отдельно - без опухолевых клеток GBM. Когда совместное культивирование проводили в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), значения TEER понижались в течение двух дней, но восстанавливались на третий день совместного культивирования. Была выдвинута гипотеза о том, что это восстановление могло быть связано с дифференцировкой клеток GBM, вызванной обработкой FBS.

Эти результаты показали, что модельная система по настоящему изобретению проявляет многие из ключевых функциональных свойств ВВВ - включая, но без ограничения, обеспечение барьера с высоким сопротивлением, проницаемость которого является восприимчивой к разнообразным внешним стимулам.

Настоящее изобретение далее описано с помощью следующей формулы изобретения.

Настоящее изобретение отчасти относится к биотехнологии и раскрывает систему гематоэнцефалического барьера (ВВВ) in vitro для оценки способности агента-кандидата проникать сквозь гематоэнцефалический барьер, а также способы и применения такой системы. ВВВ включает конфлюэнтный монослой эндотелиальных клеток, экспрессирующих E4ORF1 полипептид, и астроциты, находящиеся в прямом контакте с монослоем эндотелиальных клеток. Настоящее изобретение позволяет получить ВВВ-подобную ткань, которая обладает значительно улучшенной барьерной функцией, а именно увеличенным трансэндотелиальным электрическим сопротивлением и пониженным коэффициентом проницаемости. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 пр.

1. Система гематоэнцефалического барьера (ВВВ) in vitro для оценки способности агента-кандидата проникать сквозь гематоэнцефалический барьер, причем система содержит: (а) конфлюэнтный монослой эндотелиальных клеток, экспрессирующих E4ORF1 полипептид и (б) астроциты, находящиеся в прямом контакте с монослоем эндотелиальных клеток.

2. Система по п. 1, отличающаяся тем, что (а) эндотелиальные клетки представляют собой мышиные эндотелиальные клетки, или человеческие эндотелиальные клетки, или эндотелиальные клетки головного мозга, или микроваскулярные эндотелиальные клетки головного мозга, или из опухоли головного мозга, или из глиомы, или из глиобластомы (GBM).

3. Система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что (б) астроциты представляют собой мышиные астроциты или человеческие астроциты.

4. Система по п. 1, отличающаяся тем, что эндотелиальные клетки расположены на проницаемой твердой подложке.

5. Система по п. 4, отличающаяся тем, что проницаемая твердая подложка: (а) представляет собой мембрану или фильтр, или (б) содержит полиэфир, поликарбонат, нитроцеллюлозу, целлюлозу или стекловолокно, или (в) покрыта одним или несколькими компонентами внеклеточного матрикса, или (г) покрыта внеклеточным матриксом астроцитами, ламинином, витронектином, фибронектином, коллагеном и матригелем.

6. Система по п. 1, кроме того, содержащая дополнительный тип клеток, выбранный из группы, состоящей из астроцитов, перицитов и нервных стволовых клеток/клеток-предшественников (NSPC).

7. Система по п. 1, отличающаяся тем, что монослой эндотелиальных клеток имеет трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) более чем около 25 Ом·см² или более чем около 50 Ом·см², или более чем около 75 Ом·см², или более чем около 100 Ом·см², или более чем около 125 Ом·см², или более чем около 150 Ом·см², или более чем около 175 Ом·см², или более чем около 200 Ом·см².

8. Система по п. 1, отличающаяся тем, что монослой эндотелиальных клеток имеет коэффициент проницаемости (PC), полученный с помощью Lucifer Yellow менее чем около 2,5 x 10-6 см/сек.

9. Применение системы по п. 1 в способе оценки способности агента-кандидата проникать через гематоэнцефалический барьер.

10. Способ оценки способности агента-кандидата проникать через гематоэнцефалический барьер, при этом способ включает приведение в контакт эндотелиальных клеток в системе по п. 1 с агентом-кандидатом.

11. Способ оценки способности агента-кандидата проникать через гематоэнцефалический барьер, при этом способ включает: (а) приведение в контакт одной стороны монослоя эндотелиальных клеток в системе ВВВ по п. 1 с агентом-кандидатом, и (b) определение присутствия агента-кандидата на другой стороне монослоя эндотелиальных клеток, при этом, если агент-кандидат присутствует на другой стороне монослоя эндотелиальных клеток, то агент способен пересекать гематоэнцефалический барьер, и при этом, если агент-кандидат не присутствует на другой стороне монослоя эндотелиальных клеток, то агент не способен пересекать гематоэнцефалический барьер.

12. Применение системы по п. 1 в способе оценки эффекта агента на проницаемость гематоэнцефалического барьера.

13. Способ оценки эффекта агента на проницаемость гематоэнцефалического барьера, при этом способ включает: приведение в контакт эндотелиальных клеток в системе по п. 1 с агентом-кандидатом.

14. Способ оценки эффекта агента на проницаемость гематоэнцефалического барьера, при этом способ включает: (а) приведение в контакт эндотелиальных клеток в системе ВВВ по п. 1 с агентом-кандидатом, и (b) определение трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) системы BBB, при этом, если агент-кандидат понижает значение TEER системы BBB по сравнению со значением TEER в отсутствие агента-кандидата, то этот агент-кандидат увеличивает проницаемость BBB, и если агент-кандидат повышает значение TEER системы BBB по сравнению со значением TEER в отсутствие агента-кандидата, то этот агент-кандидат уменьшает проницаемость BBB.

15. Способ оценки эффекта агента на проницаемость гематоэнцефалического барьера, при этом способ включает: приведение в контакт эндотелиальных клеток в системе ВВВ по п. 1 с агентом-кандидатом и определение коэффициента проницаемости (Pc) системы ВВВ, при этом, если агент-кандидат понижает значение Pc системы ВВВ по сравнению со значением Pc в отсутствие агента-кандидата, то этот агент-кандидат уменьшает проницаемость ВВВ, и если агент-кандидат повышает значение Pc системы ВВВ по сравнению со значением Pc в отсутствие агента-кандидата, то этот агент-кандидат увеличивает проницаемость ВВВ.