Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/6886 C12Q1/6869 C12Q1/6844 A61K31/44 A61P35/00 G01N33/48 

Область техники

Предлагаемое техническое решение относится к тест-системам, имеющим применение в персонализированной медицине для диагностики онкологических заболеваний, а именно, при раке почки, и оценки эффективности терапии данного заболевания препаратом Сорафениб. Применение данного способа позволит выбрать для лечения пациента лекарственное средство на основании анализа объективных индивидуальных изменений, возникших в патологической ткани.

Уровень техники

Имеется ограниченное число платформ, использующих отдельные виды широкомасштабного генетического профилирования для консультирования докторов и пациентов. Примером является система Caris Molecular Intelligence. Использование платформы Caris Molecular Intelligence основано на анализе ограниченного спектра мутаций с ранее показанной клинической значимостью, а также на профилировании биообразцов пациентов на иммуногистохимической панели определения белковых онкомаркеров. Тем не менее, указанная система не адаптирована для предсказания клинического ответа таргетного лекарственного препарата на основе Сорафениба и не предназначена для одновременной обработки мультиомиксных данных. Кроме того, по указанной теме до настоящего времени отсутствуют российские патенты (имеются только международные):

1) США, US20110171633A1, 14 июля 2011г. «Метод оценки уровня экспрессии генов для прогнозирования клинического ответа у пациентов с раком почки». Патент предлагает ряд биомаркеров (наборы генов), анализ экспрессий которых позволяет делать клинические прогнозы, в том числе оценивать риск рецидива рака, вероятность положительного результата от операции или ответа на терапию. Авторы выявили корреляцию между уровнем экспрессии генов из различных представленных наборов с разными предсказываемыми параметрами, а именно, набор из 340 генов, экспрессия которых ассоциирована со сниженным риском рецидива заболевания, а набор, состоящий из 80 генов - с повышенным риском рецидива данного заболевания. Некоторые из разработанных наборов генов позволяют предсказывать пониженную и повышенную вероятность рецидива только с учетом анализа дополнительных факторов, таких как стадия опухоли, уровень злокачественности, размер, наличие некроза и прочее.

2) США, US20160208328A1, 21 июля 2016г. «Применение генной подписи, предсказывающей ответ пациентов, страдающих различными формами онкозаболеваний, на лекарственную терапию с применением ингибиторов киназ, вовлеченными в (MEK)/ERK пути». Метод связан с возможностью предсказывать ответ при лечении онкобольных препаратами, являющимися ингибиторами тирозинкиназ, а именно: Сорафениб, Сунитиниб, Акситиниб, Вандетаниб, Пазопаниб, Кабозантиниб и др. Генетическая подпись в данном исследовании состояла из следующих генов: SEC14L2, H6PD, TMEM140, SLC2A5, ACTA1, IRF8, STAT2, UGT2A1. Указанные гены вошли в состав платформы под названием HuTrial / HuSignature.

В настоящее время ожидаемый клинический результат для пациентов с раком почки основан на субъективных определениях клинических и патологических особенностей опухоли. Например, врачи принимают решения о соответствующих хирургических процедурах и адъювантной терапии на основании стадии, класса и степени некроза почек. Стандартные клинические критерии сами по себе имеют ограниченную способность точно оценивать прогноз пациента. На сегодняшний день в клинической практике не существует эффективных способов прогнозирования эффективности действия существующих противоопухолевых препаратов для конкретного пациента, которые бы учитывали особенности молекулярного дисбаланса, образующегося при развитии конкретной опухоли. Как следствие, большинство пациентов получают стандартные препараты, выбор которых основан на клинических или морфологических параметрах, таких как стадия заболевания, размер опухоли, агрессивность развития заболевания и др., что зачастую приводит к тому, что пациенты не отвечают на терапию, и рост опухоли продолжается. Развитие персонализированного подхода к лечению раковых заболеваний исходя из молекулярных изменений в организме пациента является актуальной задачей, и данное изобретение призвано расширить круг подходов, применяющихся для решения этой задачи.

Сущность изобретения

Техническая задача настоящего изобретения заключалась в разработке новых подходов к лечению рака почки у пациентов, в частности, при помощи классификатора, предсказывающего индивидуальный положительный или отрицательный клинический ответ на лечение препаратом Сорафениб при раке почки (карциномы почек) на основании профилирования экспрессии генов в ткани биоптата опухоли. Разработанный в данном изобретении классификатор использует в анализе изменения уровней экспрессии не менее 4 исследуемых генов для построения индивидуального прогноза клинической эффективности применения препарата Сорафениб у пациентов с раком почки. На основе определяемых уровней экспрессии генов, данный метод моделирует воздействие препарата Сорафениб и оценивает эффективность его воздействия на индивидуального пациента.

Указанная задача решается при помощи способа лечения карциномы почек у пациента, включающий введение сорафениба данному пациенту в том случае, когда данный пациент был определен, как реагирующий на сорафениб при помощи способа, который включает следующие стадии: (а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее двух из десяти генов-мишеней сорафениба: BRAF, RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, PDGFRB, KIT, KDR, RET, а также уровень экспрессии по меньшей мере двух из нормировочных генов, выбранных из списка (ACTB, RPL13A, RPL9, RPS29, ENO1, ENO2, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, ACO1, ACO2, ACO3, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, B2M, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, PPP2CA, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; (б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов; (в) определяют пациента как реагирующего на сорафениб, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.

Необходимость использования не менее двух генов-мишеней сорафениба обусловлена тем, что ни одного из этих генов в отдельности не достаточно для того, чтобы среди пациентов с раком почки достоверно выявить ответчиков на данный препарат. Так, при исследовании когорты из 26 пациентов с раком почки с известным статусом ответа сорафениб, из которых 12 относились к ответчикам, 14 – к неответчикам, уровень экспрессии любого одного взятого гена из 10 генов мишеней сорафениба не отличался достоверно между группами ответчиков и неответчиков. Достоверность проверялась по критерию Стьюдента. Р-значения для каждого гена при сравнении нормализованных на ген RPL9 экспрессий приведены ниже: BRAF (0,1815), RAF1 (0,3017), FGFR1 (0,8398), FLT1 (0,1073), FLT3 (0,156), FLT4 (0,125), PDGFRB (0,9314), KIT (0,2078), KDR (0,4341), RET (0,2667). В отличие от этого, анализ уровней экспрессии по меньшей мере двух из десяти генов-мишеней сорафениба уже позволяет выявить различия между группами ответчиков и неответчиков, тогда как оптимальным вариантом является анализ уровней экспрессии по меньшей мере четырех из десяти генов-мишеней сорафениба.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая и минимизируя долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на Сорафениб.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК Illumina HiSeq-3000; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * log₁₀(RAF1) + 2 * log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) – log₁₀(HK), где HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; и пороговое значение равно 15,15.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * log₁₀(RAF1) + 2 * log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) – log₁₀(HK), при этом HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; и пороговое значение равно 12,4.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * ΔCt_RAF1 + 2 * ΔCt_FGFR1 + ΔCt_FLT1 + ΔCt_FLT3, при этом ΔCt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23.05.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле log₁₀(RAF1) + log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) + log₁₀(BRAF) + log₁₀(KIT) + log₁₀(KDR) + log₁₀(PDGFRB) + log₁₀(RET) + log₁₀(FLT4) – log₁₀(HK), при этом HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2; и пороговое значение равно 13,14.

Указанная задача также решается путем создания способа определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациента, включающего следующие стадии: (а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее двух генов из списка генов-мишеней Сорафениба: RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR, а также уровни экспрессии по меньшей мере двух нормировочных генов, выбранных из списка (ACTB, RPL13A, RPL9, RPS29, ENO1, ENO2, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, ACO1, ACO2, ACO3, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, B2M, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, PPP2CA, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; (б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов; (в) определяют сорафениб как клинически эффективное средство для лечения карциномы почек у пациента, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая и минимизируя долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб. В некоторых других вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб и минимизируя значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК Illumina HiSeq-3000; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * log₁₀(RAF1) + 2 * log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) – log₁₀(HK), где HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; и пороговое значение равно 15,15.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * log₁₀(RAF1) + 2 * log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) – log₁₀(HK), при этом HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; и пороговое значение равно 12,4.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * ΔCt_RAF1 + 2 * ΔCt_FGFR1 + ΔCt_FLT1 + ΔCt_FLT3, при этом ΔCt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23.05.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле log₁₀(RAF1) + log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) + log₁₀(BRAF) + log₁₀(KIT) + log₁₀(KDR) + log₁₀(PDGFRB) + log₁₀(RET) + log₁₀(FLT4) – log₁₀(HK), при этом HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2; и пороговое значение равно 13,14.

Исследованиями, предоставляющими исходные данные для данного способа, могут быть мультиомиксное генетическое профилирование: высокопроизводительное профилирование экспрессии генов на уровне мРНК с использованием гибридизации на микрочипах, высокопроизводительное секвенирование нового поколения (использование известных специалистам способов секвенирования полного транскриптома или полногеномного секвенирование тотальной РНК), ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) в реальном времени. Настоящее изобретение позволяет повысить степень надежности определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациентов.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Схема работы тест-системы определения клинической эффективности препарата Сорафениб для больных раком почки.

Фиг. 2. ROС-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи микрочипов Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 для двенадцати истинных ответчиков и четырнадцати истинных неответчиков – пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,76.

Фиг. 3. ROС-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат Сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи ОТ-ПЦР для шести истинных ответчиков и семи истинных неответчиков – пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,95.

Фиг. 4. ROС-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи секвенирования нового поколения на платформе Illumina HiSeq-3000 для двух истинных ответчиков и одиннадцати истинных неответчиков – пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,91.

Фиг. 5. ROС-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS, при условии учета всех генов-мишеней Сорафениба и альтернативного от Фиг. 2-4 набора нормировочных генов. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат Сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи микрочипов Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 для двенадцати истинных ответчиков и четырнадцати истинных неответчиков – пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,76.

Подробное раскрытие изобретения

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

В настоящем изобретении раскрывается создание эффективного подхода к персонализированной терапии для пациентов с раком почки, то есть к выбору противоопухолевого препарата, наиболее подходящего для конкретного пациента. Описанный здесь метод анализа экспрессионных данных решает задачу прогноза клинической эффективности таргетного препарата Сорафениб для больных с раком почки. В основе предлагаемого метода лежит биоинформатический анализ данных экспрессии целевых генов – мишеней сорафениба, а также нормировочных генов. Экспрессия генов измеряется в образце опухоли, полученном от пациента. Для этого предварительно необходимо выделить тотальную фракцию РНК или матричной РНК (мРНК) из данного образца. Данные по генной экспрессии могут быть получены разными методами: ОТ-ПЦР, микрочиповая гибридизация, РНК-секвенирование нового поколения. Предлагаемая тест-система представляет собой классификатор, созданный на основе данных по экспрессии набора генов (генную подпись), которая предсказывают возможный вариант ответа или неответа пациента на терапию препаратом Сорафениб при раке почки.

Под применением сорафениба, введением сорафениба или препаратом Сорафениб в данном изобретении подразумевается применение или введение лекарственного препарата, или сам препарат, содержащий сорафениб в качестве активного ингредиента, а также дополнительно содержащий эксипиенты (неактивные вещества), например, соли, стабилизаторы, регуляторы кислотности и др. Примером таких лекарственных препаратов является, например, разрешенный на территории РФ препарат Нексавар (Nexavar®).

Для применения тест-системы необходимы данные об уровне экспрессии не менее двух из 10 генов – мишеней сорафениба (BRAF, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, KDR, KIT, PDGFRB, RAF1, RET), а также не менее двух из любых генов домашнего хозяйства (ACTB, RPL13A, RPL9, RPS29, ENO1, ENO2, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, ACO1, ACO2, ACO3, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, B2M, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, PPP2CA, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), полученные на основе анализа образца раковой опухоли индивидуального пациента при помощи исследования генной экспрессии методами микрочиповой гибридизации, ОТ-ПЦР или секвенирования нового поколения. Здесь и далее все обозначения генов даны согласно номенклатуре HGNC (Комитет Номеклатуры Генов Европейского Биоинформатического Института: https://www.genenames.org). Гены мишени-сорафениба были отобраны согласно открытой базе данных мишеней лекарственных препаратов Drugbank (https://www.drugbank.ca). Для предсказания ответа пациента на сорафениб были выбраны именно гены-мишени данного препарата по двум причинам: (1) учитывая, что известно более 20000 белок-кодирующих генов человека, но исследуемые выборки пациентов на два-три порядка меньше данного числа и обычно составляют десятки пациентов, существует значительный риск того, что найденные характеристические гены для одной выборки пациентов не будут работать для другой выборки в связи с переобучением модели. Снижение количества признаков, необходимых для разделения ответчиков от неответчиков на препарат позволяет сделать более устойчивую тест-систему; (2) белки-мишени препарата сорафениб охарактериованы в литературе и подтверждены экспериментально (Wilhelm et al., Cancer Res., Oct 1;64(19):7099-109 (2004)). Учитывая, что данный препарат действует в первую очередь на конретные белки-мишени, логично предположить, что уровень экспрессии именно соответсвующих данным мишеням генов в первую очередь важен для предсказания эффективности действия препарата.

Образцы опухолевой ткани, в том числе зафиксированные с помощью формалина и залитые в парафиновые блоки (FFPE), используют для получения срезов на микротоме. Из полученных срезов выделяют тотальную РНК. Затем проводят профилирование генной экспрессии на микрочипах или с помощью ОТ-ПЦР или с помощью секвенирования нового поколения. При этом определяют экспрессию не менее четырех генов, из которых не менее двух являются целевыми и два – нормировочными.

Расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в общем виде, согласно настоящему изобретению, проводится согласно формуле (1):

где i – количество генов-мишеней сорафениба, меняется в диапазоне от 2 до 10, j – количество нормировочных генов, меняется в диапазоне от 1 до 49, а_i – коэффициент целевого гена-мишени сорафениба, который зависит от типа экспериментальной платформы и может принимать любые положительные значения.

Расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) для ОТ-ПЦР, согласно одному из вариантов настоящего изобретения, проводится согласно формуле (2):

DS_PCR = 3 * ΔCt_RAF1 + 2 * ΔCt_FGFR1 + ΔCt_FLT1 + ΔCt_FLT3, где ΔCt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена.

Данная генная подпись применима для анализа генной экспрессии, измеренной с помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР).

Нормировочные гены выбираются индивидуально для каждой экспериментальной платформы исходя из наименьшей вариабельности в уровне экспрессии между всеми образцами рака почки, профилированными на данной платформе. В исследованных нами экспериментальных платформах консенсусно наименее вариабельными оказались следующие 6 генов: ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP, однако это не исключает возможности использования другого набора нормировочных генов.

Расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в случае секвенирования нового поколения или микрочиповой гибридизации (HTGE – High-Throughput Gene Expression profiling – широкомасштабное профилированиие генной экспрессии), согласно одному из вариантов настоящего изобретения, проводится согласно формуле (3):

DS_HTGE = 3 * log₁₀(RAF1) + 2 * log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) – log₁₀(HK), где HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов (ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP).

Предлагаемая генная подпись применима к данным по генной экспрессии, полученным на следующих платформах для измерения генной экспрессии: микрочиповая платформа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2, платформа для секвенирования нового поколения Illumina HiSeq-3000.

Альтернативно, расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в случае секвенирования нового поколения или микрочиповой гибридизации (HTGE – High-Throughput Gene Expression profiling – широкомасштабное профилированиие генной экспрессии), согласно одному из вариантов настоящего изобретения, проводится согласно формуле (4):

DS_HTGE = log₁₀(RAF1) + log₁₀(FGFR1) + log₁₀(FLT1) + log₁₀(FLT3) + log₁₀(BRAF) + log₁₀(KIT) + log₁₀(KDR) + log₁₀(PDGFRB) + log₁₀(RET) + log₁₀(FLT4) – log₁₀(HK), где HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов (KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2). Другими словами, применяется формула (1), где у всех генов мишеней сорафениба коэффициент a_i = 1 и используется аьтернативный набор нормировочных генов (генов домашнего хозяйства).

Также возможны другие варианты расчета коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в случае выбора другой комбинации генов-мишеней и нормировочных генов.

Величина DS позволяет сделать следующее предсказание для каждого индивидуального пациента с раком почки: будет ли наблюдаться клинический ответ по системе RECIST [Критерии оценки ответа солидных опухолей; Eisenhauer EA, et al., New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer. 2009 Jan;45(2):228-47] на лечение препаратом сорафениб или нет. Наблюдаемый клинический ответ будет являться указанием на клиническую эффективность препарата сорафениб. В случае, если данная величина выше порога (-23.05 – для ОТ-ПЦР; 12.4 для микрочипов Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; 15.15 для Illumina HiSeq-3000), то пациент относится к группе ответчиков на терапию. Если величина DS меньше указанного порога, пациент относится к неответчикам. Величина данного порога выбрана таким образом, чтобы суммарное количество ошибок первого рода (ложно идентифицированный ответчик) и второго рода (ложно идентифицированный неответчик) было минимальным, при условии, что ошибкам первого рода придаётся вес втрое превышающий вес ошибок второго рода.

Биоинформатический анализ данных зависит от метода, при помощи которого была измерена генная экспрессия. Так, в случае ОТ-ПЦР для каждого пациента будет рассчитан параметр DS_PCR (формула 2), а в случае микрочиповой гибридизации или РНК секвенирования нового поколения - DS_HTGE (формула 3). Альтернативно, в случае микрочиповой гибридизации или РНК секвенирования нового поколения для каждого пациента будет рассчитан параметр DS_HTGE (формула 4). На основании рассчитанных коэффициентов делается прогноз клинической эффективности препарата сорафениб для индивидуального пациента с раком почки. В случае, если параметр DS превышает заданный порог, пациент относится к группе ответчиков. В обратном случае, пациент считается неответчиком. Подробное описание выбранных порогов для некоторых коммерческих платформ приведено в примерах к данному патенту.

Гены-мишени сорафениба, а также нормировочные гены, выбранные для подсчета уровней экспрессии в образце карциномы почечной ткани, известны из уровня техники. Ниже приведены данные об их нуклеотидных последовательностях, раскрытых в публичных источниках.

Термин «BRAF» или «человеческий BRAF» относится к гену, кодирующему серин-треонин протеинкиназу B-raf (Serine/threonine protein kinase B-raf), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_004333 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004333), а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 1097.

Термин «RAF1» или «человеческий RAF1» относится к гену, кодирующему серин-треонин протеинкиназу Raf-1 (Serine/threonine protein kinase Raf-1), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002880 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_002880), а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 9829.

Термин «FGFR1» или «человеческий FGFR1» относится к гену, кодирующему рецептор фактора роста фиброблостов 1 (fibroblast growth factor receptor 1), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_001174063 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001174063), а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3688.

Термин «FLT1» или «человеческий FLT1» относится к гену, кодирующему тирозин киназу 1, схожую с фактором стимуляции макрофагов (fms related tyrosine kinase 1), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002019, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3763.

Термин «FLT3» или «человеческий FLT3» относится к гену, кодирующему тирозин киназу 3, схожую с фактором стимуляции макрофагов (fms related tyrosine kinase 3), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_004119, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3765.

Термин «FLT4» или «человеческий FLT4» относится к гену, кодирующему тирозин киназу 4, схожую с фактором стимуляции макрофагов (fms related tyrosine kinase 4), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002020, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3767.

Термин «PDGFRB» или «человеческий PDGFRB» относится к гену, кодирующему рецептор тромбоцитарного фактора роста (platelet derived growth factor receptor beta), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002609, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 8804.

Термин «KIT» или «человеческий KIT» относится к гену, кодирующему тирозинкиназный рецептор протоонкоген KIT (KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_000222, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 6342.

Термин «KDR» или «человеческий KDR» относится к гену, кодирующему киназный рецептор (kinase insert domain receptor), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002253, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 6307.

Термин «RET» или «человеческий RET» относится к гену, кодирующему протоонкоген ret (ret proto-oncogene), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_020975, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 9967.

Возможные нормировочные гены с соответствующими идентификаторами последовательности в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI), а также идентификаторами генов согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC) приведены ниже: ACTB (NM_001101, HGNC:132), RPL13A (NM_001270491, HGNC:10304), RPL9 (NM_000661, HGNC:10369), RPS29 (NM_001030001, HGNC:10419), ENO1 (NM_001428, HGNC:3350), ENO2 (NM_001975, HGNC:3353), H6PD (NM_004285, HGNC:4795), G6PD (NM_000402, HGNC:4057), KIF1B (NM_015074, HGNC:16636), KIF1A (NM_138483, HGNC:888), NMNAT1 (NM_001297778, HGNC:17877), NMNAT2 (NM_015039, HGNC:16789), NMNAT3 (NM_178177, HGNC:20989), UBE4B (NM_006048, HGNC:12500), UBE4A (NM_004788, HGNC:12499), ACO1 (NM_002197, HGNC:117), ACO2 (NM_001098, HGNC:118), IREB2 (NM_004136, HGNC:6115), KLHL9 (NM_018847, HGNC:18732), KLHL13 (NM_033495, HGNC:22931), PANK1 (NM_138316, HGNC:8598), PANK3 (NM_024594, HGNC:19365), KIF20B (NM_016195, HGNC:7212), KIF20A (NM_005733, HGNC:9787), RPL37A (NM_000998, HGNC:10348), GAPDH (NM_002046, HGNC:4141), RPL13 (NM_000977, HGNC:10303), HPRT1 (NM_000194, HGNC:5157), B2M (NM_004048, HGNC:914), RPL38 (NM_000999, HGNC:10349), UBA52 (NM_003333, HGNC:12458), PSMC1 (NM_002802, HGNC:9547), RPL4 (NM_000968, HGNC:10353), RPL37 (NM_000997, HGNC:10347), SLC25A3 (NM_005888, HGNC:10989), CLTC (NM_004859, HGNC:2092), TXNL1 (NM_004786, HGNC:12436), PSMA1 (NM_002786, HGNC:9530), RPL8 (NM_000973, HGNC:10368), MMADHC (NM_015702, HGNC:25221), PPP2CA (NM_002715, HGNC:9299), MRFAP1 (NM_033296, HGNC:24549), POLR2C (NM_032940, HGNC:9189), PSMB2 (NM_002794, HGNC:9539), DIABLO (NM_019887, HGNC:21528), VCP (NM_007126, HGNC:12666).

Термины «рак» и «карцинома» описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Патология рака включает в себя, например, аномальный или неконтролируемый рост клеток, метастазы, интерференцию нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов на аномальных уровнях, подавление или обострение воспалительного или иммунологического ответа, неоплазию, злокачественность, инвазию в окружающие или отдаленные ткани или органы, такие как лимфатические узлы, кровеносные сосуды и т. д.

Термины «рак почек» или «карцинома почек», используемые в данном описании, относятся к раку, который возникает в эпителиальном слое клеток почечных канальцев. Карцинома почек охватывает несколько относительно распространенных гистологических подтипов: язвенная клеточная карцинома почек, папиллярный (хромофильный) рак почек, карцинома коллекционного протока, медуллярная карцинома и др. (см. Thyavihally Y., et al., Int Semin Surg Oncol 2:18 (2005)).

Термины «хороший прогноз» или «положительный клинический результат» означают желаемый клинический результат. Например, в контексте карциномы почек хороший прогноз может быть ожиданием отсутствия локальных рецидивов или метастазов в течение двух, трех, четырех, пяти или более лет после первоначального диагноза карциномы. Клинический результат можно оценить с использованием любого конечного показателя, включая, без ограничения, (1) агрессивность роста опухоли (например, переход на более высокую стадию); (2) метастазы; (3) локальное повторение; (4) увеличение продолжительности жизни после лечения; и / или (5) снижение смертности в определенный момент времени после лечения. Клинический результат может быть рассмотрен в контексте результата индивидуума относительно исхода популяции пациентов, имеющих сопоставимый клинический диагноз, и может быть оценен с использованием различных конечных показателей, таких как увеличение продолжительности интервала рецидива (RFI) , увеличение продолжительности общей выживаемости (ОС) в популяции, увеличение продолжительности безрецидивной выживаемости (DFS), увеличение продолжительности дистанции без повторения рецидива (DRFI) и тому подобное. Пациентом с раком почки, реагирующим на сорафениб, считают пациента, у которого наблюдается положительный клинический результат по одному из вышеуказанных конечных показателей после приема сорафениба. Методики лечения карциномы почек сорафенибом приведены, например, в обзоре Monzon and Heng, 2014 (Crit Rev Clin Lab Sci 51(2): 85–97 (2014)).

Различные технические подходы для определения уровней экспрессии генов изложены могут включать, без ограничения, обратную транскрипционную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР), микрочиповую гибридизацию, высокопроизводительное секвенирование нового поколения, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE). Микрочиповая гибридизация относится к упорядоченному расположению гибридизуемых элементов массива, предпочтительно полинуклеотидных зондов, на подложке. В конкретных аспектах уровень экспрессии каждого гена может быть определен с помощью различных элементов гена, включая экзоны, интроны и белковые продукты. В предпочтительных вариантах экспрессия генов определяется по уровню соответствующих мРНК или кДНК. Уровни экспрессии генов, идентифицированных в описании, могут быть измерены в опухолевой ткани. Например, опухолевая ткань может быть получена при хирургической резекции опухоли или путем биопсии опухоли. Методики получения образца карциномы почечной ткани от пациента приведены, например (Landolt L. et al., Scand J Clin Lab Invest. Sep;76(5):426-34, 2016). Уровень экспрессии идентифицированных генов также может быть измерен в опухолевых клетках, выделенных из участков, удаленных из опухоли, включая циркулирующие опухолевые клетки или жидкость организма (например, мочу, кровь, фракцию крови и др.). Способы амплификации (например, с помощью ПЦР) нуклеиновых кислот, способы количественной оценки нуклеиновых кислот, общие методы экстракции мРНК из тканей пациентов хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995 and Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.). Экстракция мРНК может быть выполнена с использованием стандартных наборов и реагентов от коммерческих производителей в соответствии с инструкциями производителей.

Количественная ПЦР в реальном времени измеряет накопление продукта ПЦР через двухмеченный флуоресцентный зонд (т. е. зонд TaqMan®). ПЦР в реальном времени совместим как с количественной конкурентной ПЦР, где для нормализации используется внутренний конкурент для каждой целевой последовательности, а также с количественной сравнительной ПЦР с использованием гена нормализации, содержащегося в образце, или эталонного гена для ОТ-ПЦР (более подробно см., например, Dieffenbach, C. W. et al., "General Concepts for PCR Primer Design" in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155).

Чтобы минимизировать вариаций при измерениях экспрессии из-за технических различий в образцах (например, различное количество и качество продукта экспрессии), данные уровня экспрессии, измеренные для продукта гена (например, порог цикла (Ct) полученный с помощью ОТ-ПЦР), могут быть нормированы относительно средних значений уровня экспрессии, полученных для одного или нескольких эталонных генов. В одном из подходов к нормализации небольшое количество генов используется в качестве эталонных генов; гены, выбранные для эталонных генов (housekeeping genes), обычно показывают минимальное количество вариаций экспрессии от образца к образцу как для образцов нормальной ткани, так и для образцов патологической ткани, а уровень экспрессии других генов сравнивают с относительно стабильной экспрессией эталонных генов.

Необработанные данные из ОТ-ПЦР выражаются как порог цикла (Ct) - количество циклов полимеризации, необходимое для того, чтобы детектируемый сигнал превышал определенный порог. Высокое значение Ct указывает на низкую экспрессию, поскольку для обнаружения продукта амплификации требуется больше циклов. Нормализация может быть выполнена таким образом, что одноэтапное увеличение нормализованного уровня экспрессии гена продукта обычно отражает 2-кратное увеличение количества продукта экспрессии, присутствующего в образце (Silva S et al. (2006) BMC Cancer 6, 200). Затем экспрессия гена может быть стандартизована путем деления нормированной экспрессии гена на стандартное отклонение экспрессии для всех пациентов для этого конкретного гена. Специалистам в области известно множество статистических методов, которые подходят для сравнения уровня экспрессии гена в двух группах и определения статистической значимости обнаруженных различий (Motulsky H., Intuitive Biostatistics, Oxford University Press, 1995).

Для оценки предсказательной эффективности предложенного в данном описании подхода было проведено ретроспективное клиническое исследование. Набор образцов был получен от пациентов с раком почки, которые получали лечение Сорафенибом в Московской городской онкологической больнице № 62. Из 26 пациентов у 12 наблюдался положительный эффект от лечения по системе RECIST (частичный или полный ответ), 14 пациентов относились к группе неответчиков (стабилизация или прогрессирование при приеме сорафениба).

В качестве биоматериала для исследования использовались парафинизированные блоки (FFPE) c образцами патологической ткани индивидуальных больных. Из полученных парафиновых блоков выделялись нуклеиновые кислоты при помощи набора SileksMagNA (пр-во Sileks) на магнитных частицах, в соответствии с инструкциями производителя комплекта. Далее препараты РНК, при помощи фермента ДНКазы BlueSorb (пр-во Sileks), были освобождены от примесей ДНК.

Измерение экспрессии генов в образцах опухолей пациентов проводилось следующими методами:

1) Для всех пациентов: методом гибридизации РНК на микрочипах Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2.

2) Для 6 ответчиков и 7 неответчиков: ОТ-ПЦР.

3) Для 11 неответчиков и 2 ответчиков: при помощи РНК-секвенирования нового поколения на платформе Illumina HiSeq-3000.

Результаты биоинформатического анализа и предсказательные характеристики предложенного бинарного классификатора (ответчики на сорафениб против неответчиков) приведены в примерах к данному патенту. Все нижеприведенные примеры свидетельствуют в пользу того, что предложенный подход позволяет предсказывать эффективность препарата сорафениб при раке почки с высокой достоверностью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения получены нижеследующие результаты.

На основании данных профилирования генной экспрессии в тканях рака почки больных с известным статусом ответа на терапию сорафенибом с помощью микрочипов Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2, платформы секвенирования нового поколения Illumina HiSeq-3000, а также с помощью метода ОТ-ПЦР, указанная в настоящем изобретении тест-система, состоящая из 10 генов (4 целевых и шесть нормировочных), показала способность предсказывать индивидуальный ответ больных раком почки на монотерапию препаратом Сорафенибом с высоким значением площади под ROC-кривой (AUC = 0,76 для платформы Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; AUC = 0,95 для ОТ-ПЦР; AUC = 0.91 для платформы Illumina HiSeq-3000).

На основании данных профилирования генной экспрессии в тканях рака почки больных с известным статусом ответа на терапию сорафенибом с помощью микрочипов Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 указанная в настоящем изобретении тест-система, состоящая из 15 генов (10 целевых и 5 нормировочных), показала способность предсказывать индивидуальный ответ больных раком почки на монотерапию препаратом сорафениб с высоким значением площади под ROC-кривой (AUC = 0,76 для платформы Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2).

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом микрочиповой гибридизации.

Микрочиповая гибридизация образцов пациентов с раком почки и известным статусом ответа на сорафениб была проведена с использованием платформы Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно протоколу, рекомендованному производителем. В результате проведенной микрочиповой гибридизации были получены уровни экспрессии для каждого из 10 генов у 26 пациентов со светлоклеточным раком почки. На основании этих данных были рассчитаны индексы DS_HTGE для каждого индивидуального пациента. Было выбрано такое пороговое значение DS_HTGE, при котором сумма ошибок первого и второго рода было минимальным, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было бы минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DS_HTGE было выбрано равным 12,40 (Таблица 1)_. Если значение DS_HTGE больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше – к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,75 (фиг. 2).

Таблица 1. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DS_HTGE, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки. Параметр DS_HTGE был рассчитан по данным микрочиповой гибридизации на платформе Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно формуле 2. Оптимальный порог DS_HTGE выделен серым цветом.

Пример 2. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом ОТ-ПЦР.

Была разработана ОТ-ПЦР-панель для измерения уровня экспрессии четырех целевых и шести нормировочных генов в образцах рака почки. Праймеры, необходимые для детекции генов приведены в таблице 2. Параметры реакции ПЦР приведены ниже:

ПЦР смесь (объемом 25 мкл):

Буфер (HS-qPCRmix-HS SYBR, пр-во ЗАО Евроген) – 5 мкл;

Праймеры по 1 мкл (по 0,4 мкМ);

РНК – 1 – 3 мкл (2-6 нг на реакцию);

MMLV-RT (пр-во ЗАО Евроген) – 2 мкл;

H₂O – 13-15 мкл.

Программа для прохождения ПЦР:

95°С – 5 мин.

95°С – 30 сек.

60°С – 30 сек.

72°С – 30 сек.

Для ОТ-ПЦР был использован ПЦР амплификатор CFX Touch Real-Time PCR Detection System (пр-во BioRad).

Таблица 2. Последовательности пар праймеров для измерения уровня экспрессии 10 генов, необходимых для расчета параметра DS_PCR.

Название гена Последовательность праймеров RAF1 For 5'- CTGGCTCCCTCAGGTTTAAGAA- 3' Rev 5'- AAGCTCCCTGTATGTGCTCC- 3' FLT3 For 5'- CTCAAGGAAACGGCCATCCT- 3' Rev 5'- AACACGGCCATCCACATTCT- 3' FLT1 For 5'- TGTCGTGTAAGGAGTGGACC- 3' Rev 5'- GCACCTGCTGTTTTCGATGT- 3' FGFR1 For 5'- GAGTGACTTCCACAGCCAGA- 3' Rev 5'- GGATGCACTGGAGTCAGCAG- 3' ACTB For 5'- ACAGAGCCTCGCCTTTGC- 3' Rev 5'- CGCGGCGATATCATCATCCA- 3' VCP For 5'- TGGAAGCGTATCGACCCATC- 3' Rev 5'- CTTTGAACTCCACAGCACGC- 3' DIABLO For 5'- AATGGCGGCTCTGAAGAGTT- 3' Rev 5'- AAACTCGAGCCAAGCAGGAA- 3' EIF3B For 5'- GGCGAACACCATCTTCTGGA- 3' Rev 5'- TGTCCACAAACGCTAAGGCA- 3' PSMB2 For 5'- GCAGCAGCTAACTTCACACG- 3' Rev 5'- AGCCAGGAGGAGGTTCACAT- 3' POLR2C For 5'- TCTTCATCGCTGAGGTTCCC- 3' Rev 5'- ATCCAAGCCTGTGAGCAATGA- 3'

В результате проведенной ОТ-ПЦР были получены показатели значений ∆Сt для каждого целевого гена у всех 13 пациентов. На основании этих данных были рассчитаны индексы DS_PCR для каждого индивидуального пациента (формула 1). Было выбрано такое пороговое значение DS_PCR, при котором сумма ошибок первого и второго рода была минимальна, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DS_PCR было выбрано равным -23,05 (Таблица 3)_. Если значение DS_PCR больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше – к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,95 (фиг. 3).

Таблица 3. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DS_PCR, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки. Параметр DS_PCR был рассчитан по данным ОТ-ПЦР. Оптимальный порог DS_PCR выделен серым цветом.

Пример 3. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом РНК-секвенирования нового поколения.

РНК секвенирование нового поколения образцов пациентов с раком почки и известным статусом ответа на Сорафениб было проведено с использованием платформы Illumina HiSeq-3000 согласно протоколу, рекомендованному производителем. В результате были получены файлы в формате FASTQ, содержащие сырые прочтения для каждого образца. Данные прочтения были картированы на эталонный геном (геном человека, сборка GRCh38.89 от сервиса Ensembl, http://www.ensembl.org) при помощи алгоритма STAR [Dobin A, et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013 Jan 1;29(1):15-21]. В результате для каждого пациента были получены файлы, в которых содержится информация о количестве уникально картированных прочтений на гены человека. Образец считали подходящим для дальнейшего исследования в случае, если находилось более 3500000 уникально картированных прочтений на гены человека. Все 13 образцов прошли данный контроль качества. Для дальнейшего анализа были использована информация по 10 генам: 4 целевым и 6 нормировочным. На основании этих данных были рассчитаны индексы DS_HTGE для каждого индивидуального пациента: двух ответчиков и 11 неответчиков. Для этого была использована формула 2. Было выбрано такое пороговое значение DS_HTGE, при котором сумма ошибок первого и второго рода была минимальной, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DS_HTGE было выбрано равным 15,15 (Таблица 4)_. Если значение DS_HTGE больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше – к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,91 (фиг. 4).

Таблица 4. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DS_HTGE, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки. Параметр DS_HTGE был рассчитан по данным РНК-секвенирования нового поколения. Оптимальный порог DS_HTGE выделен серым цветом.

Пример 4. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом микрочиповой гибридизации.

Микрочиповая гибридизация образцов пациентов с раком почки и известным статусом ответа на сорафениб была проведена с использованием платформы Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно протоколу, рекомендованному производителем. В результате проведенной микрочиповой гибридизации были получены уровни экспрессии для каждого из 10 генов у 26 пациентов со светлоклеточным раком почки. На основании этих данных были рассчитаны индексы DS_HTGE для каждого индивидуального пациента согласно формуле (4), т.е. все гены-мишени Сорафениба учитывались при расчете с равными коэффициентами, и был использован альтернативный набор нормировочных генов. Было выбрано такое пороговое значение DS_HTGE, при котором сумма ошибок первого и второго рода была минимальной, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было бы минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DS_HTGE было выбрано равным 13,14 (Таблица 5)_. Если значение DS_HTGE больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше – к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,76 (фиг. 5).

Таблица 5. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DS_HTGE, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки. Параметр DS_HTGE был рассчитан по данным микрочиповой гибридизации на платформе Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно формуле 4. Оптимальный порог DS_HTGE равен 13,14 (выделен серым цветом).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациента. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии карциномы почек. 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Способ определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациента, включающий следующие стадии:

(а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее четырех генов, выбранных из 5 следующего списка генов-мишеней сорафениба: RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR, а также уровни экспрессии по меньшей мере двух нормировочных генов, выбранных из следующего списка: ACTB, RPL13A, RPL9, RPS29, ENO1, ENO2, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, ACO1, ACO2, ACO3, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, B2M, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, PPP2CA, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP, при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции;

(б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов;

(в) определяют сорафениб как клинически эффективное средство для лечения карциномы почек у пациента, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.

2. Способ по п.1, в котором пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб и минимизируя значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.

3. Способ по п.1, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК Illumina HiSeq-3000; в качестве 30 нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * log10(RAF1) + 2 * log10(FGFR1) + log10(FLT1) + log10(FLT3) – log10(HK), где HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; и пороговое значение равно 15,15.

4. Способ по п.1, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * log10(RAF1) + 2 * log10(FGFR1) + log10(FLT1) + log10(FLT3) – log10(5 HK), при этом HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; и пороговое значение равно 12,4.

5. Способ по п.1, в котором измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * ΔCtRAF1 + 2 * ΔCtFGFR1 + ΔCtFLT1 + ΔCtFLT3, при этом ΔCt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов ACTB, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23,05.

6. Способ по п.1, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле log10(RAF1) + log10(FGFR1) + log10(FLT1) + log10(FLT3) + log10(BRAF) + log10(KIT) + log10(KDR) + log10(PDGFRB) + log10(RET) + log10(FLT4) – log10(HK), при этом HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, ACO2; и пороговое значение равно 13,14.

7. Способ по п.1, дополнительно включающий введение пациенту сорафениба в случае определения сорафениба как клинически эффективного.